Salamat sa pagbisita sa Nature.com. Limitado ang suporta sa CSS sa bersyon ng browser na iyong ginagamit. Para sa pinakamahusay na karanasan, inirerekomenda namin na gumamit ka ng updated na browser (o i-disable ang Compatibility Mode sa Internet Explorer). Samantala, upang matiyak ang patuloy na suporta, ire-render namin ang site nang walang mga style at JavaScript.
Mga bagong pamamaraan ng immunological at mass spectrometric para sa kumplikadong pagsusuri ng mga persistent oligosaccharides sa corn stover na pretreated gamit ang AFEX. Ang lignocellulosic biomass ay isang napapanatiling alternatibo sa mga fossil fuels at malawakang ginagamit upang bumuo ng mga biotechnologies para sa produksyon ng mga produkto tulad ng pagkain, feed, fuels at kemikal. Ang susi sa mga teknolohiyang ito ay ang pagbuo ng mga prosesong cost-competitive para sa pag-convert ng mga complex carbohydrates na nasa plant cell wall tungo sa mga simpleng asukal tulad ng glucose, xylose at arabinose. Dahil ang lignocellulosic biomass ay napakatigas ng ulo, kailangan itong sumailalim sa mga thermochemical treatment (hal., ammonia fiber exfoliation (AFEX), dilute acids (DA), ionic liquids (IL)) at biological treatments (hal., enzymatic hydrolysis at microbial fermentation) nang magkasama upang makuha ang ninanais na produkto. Gayunpaman, kapag ang mga komersyal na fungal enzymes ay ginamit sa proseso ng hydrolysis, 75-85% lamang ng mga natutunaw na asukal na nabuo ay monosaccharides, at ang natitirang 15-25% ay natutunaw, hindi matitinag na oligosaccharides, na hindi laging magagamit ng mga mikroorganismo. Dati, matagumpay naming naihiwalay at napurong ang mga natutunaw na matigas ang ulong oligosaccharides gamit ang kombinasyon ng carbon at diatomaceous earth separation at size exclusion chromatography, at sinuri rin ang kanilang mga enzyme inhibitory properties. Natuklasan namin na ang mga oligosaccharides na naglalaman ng mas mataas na antas ng polymerization (DP) methylated uronic acid substitutions ay mas mahirap iproseso gamit ang mga komersyal na enzyme blends kaysa sa low DP at neutral oligosaccharides. Dito namin iniuulat ang paggamit ng ilang karagdagang pamamaraan, kabilang ang glycan profiling gamit ang monoclonal antibodies (mAbs) na partikular sa mga glycan ng biomass ng halaman upang makilala ang mga glycan bond sa mga plant cell wall at enzymatic hydrolysates, matrix-assisted laser desorption ionization, time-of-flight mass-spectrometry. Ang MALDI-TOF-MS) ay gumagamit ng mga structure-informative diagnostic peak na nakuha sa pamamagitan ng spectroscopy pagkatapos ng secondary decay ng mga negative ion, gas chromatography at mass spectrometry (GC-MS) upang makilala ang mga oligosaccharide bonds na mayroon at walang derivatization. Dahil sa maliit na sukat ng mga oligosaccharide (DP 4–20), ang mga molekulang ito ay mahirap gamitin para sa mAb binding at characterization. Upang malampasan ang problemang ito, naglapat kami ng isang bagong biotin conjugation-based oligosaccharide immobilization method na matagumpay na nag-label sa karamihan ng mga low DP soluble oligosaccharide sa ibabaw ng microplate, na pagkatapos ay ginamit sa isang high throughput mAb system para sa partikular na ligation analysis. Ang bagong pamamaraang ito ay magpapadali sa pagbuo ng mas advanced na high throughput glycome assays sa hinaharap na maaaring magamit upang ihiwalay at makilala ang mga oligosaccharide na nasa mga biomarker para sa mga layuning diagnostic.
Ang lignocellulosic biomass, na binubuo ng mga materyales na pang-agrikultura, panggugubat, damo, at makahoy, ay isang potensyal na feedstock para sa produksyon ng mga produktong bio-based, kabilang ang pagkain, feed feed, panggatong, at mga kemikal na precursor upang makagawa ng mga produktong mas may mataas na halaga1. Ang mga carbohydrates (tulad ng cellulose at hemicellulose) na nasa mga plant cell wall ay inaalisan ng polymerisasyon tungo sa mga monosaccharide sa pamamagitan ng pagproseso ng kemikal at biotransformation (tulad ng enzymatic hydrolysis at microbial fermentation). Kabilang sa mga karaniwang pre-treatment ang ammonia fiber expansion (AFEX), dilute acid (DA), ionic liquid (IL), at steam explosion (SE), na gumagamit ng kombinasyon ng mga kemikal at init upang mabawasan ang produksyon ng lignocellulose sa pamamagitan ng pagbubukas ng mga plant cell wall3,4. katigasan ng materya, 5. Ang enzymatic hydrolysis ay isinasagawa sa mataas na solids load gamit ang commercial active carbohydrate-containing enzymes (CAZymes) at microbial fermentation gamit ang transgenic yeasts o bacteria upang makagawa ng mga bio-based fuels at kemikal6.
Ang mga CAZyme sa mga komersyal na enzyme ay binubuo ng isang kumplikadong halo ng mga enzyme na synergistically pumipigil sa mga complex carbohydrate-sugar bonds upang bumuo ng mga monosaccharide2,7. Gaya ng aming iniulat kanina, ang kumplikadong network ng mga aromatic polymer ng lignin na may mga carbohydrate ay ginagawa silang lubhang mahirap lutasin, na humahantong sa hindi kumpletong conversion ng asukal, na nag-iipon ng 15-25% ng mga sex oligosaccharide na hindi nalilikha sa panahon ng enzymatic hydrolysis ng pretreated biomass. Ito ay isang karaniwang problema sa iba't ibang mga pamamaraan ng pretreatment ng biomass. Ang ilang mga dahilan para sa bottleneck na ito ay kinabibilangan ng enzyme inhibition sa panahon ng hydrolysis, o ang kawalan o mababang antas ng mahahalagang enzyme na kinakailangan upang masira ang mga sugar bond sa biomass ng halaman. Ang pag-unawa sa komposisyon at mga katangian ng istruktura ng mga asukal, tulad ng mga sugar bond sa oligosaccharide, ay makakatulong sa amin na mapabuti ang conversion ng asukal sa panahon ng hydrolysis, na ginagawang cost-competitive ang mga prosesong biotechnological sa mga produktong nagmula sa petrolyo.
Ang pagtukoy sa istruktura ng mga carbohydrate ay isang hamon at nangangailangan ng kombinasyon ng mga pamamaraan tulad ng liquid chromatography (LC)11,12, nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR)13, capillary electrophoresis (CE)14,15,16 at mass spectrometry (MS)17. ,labingwalong. Ang mga pamamaraan ng MS tulad ng time-of-flight mass spectrometry na may laser desorption at ionization gamit ang isang matrix (MALDI-TOF-MS) ay isang maraming gamit na pamamaraan para sa pagtukoy ng mga istruktura ng carbohydrate. Kamakailan lamang, ang Collision-Induced Dissociation (CID) tandem MS ng sodium ion adducts ang pinakamalawak na ginagamit upang matukoy ang mga fingerprint na naaayon sa mga posisyon ng pagkabit ng oligosaccharide, mga anomeric configuration, mga sequence, at mga branching position 20, 21.
Ang pagsusuri ng glycan ay isang mahusay na kasangkapan para sa malalimang pagtukoy ng mga carbohydrate bonds22. Ang pamamaraang ito ay gumagamit ng mga monoclonal antibodies (mAbs) na nakadirekta sa glycan sa dingding ng selula ng halaman bilang mga probe upang maunawaan ang mga complex carbohydrate linkages. Mahigit sa 250 mAbs ang makukuha sa buong mundo, na idinisenyo laban sa iba't ibang linear at branched oligosaccharides gamit ang iba't ibang saccharides24. Maraming mAbs ang malawakang ginamit upang makilala ang istraktura, komposisyon, at mga pagbabago sa dingding ng selula ng halaman, dahil may mga makabuluhang pagkakaiba depende sa uri ng selula ng halaman, organ, edad, yugto ng pag-unlad, at kapaligiran sa paglaki25,26. Kamakailan lamang, ang pamamaraang ito ay ginamit upang maunawaan ang mga populasyon ng vesicle sa mga sistema ng halaman at hayop at ang kani-kanilang mga papel sa transportasyon ng glycan gaya ng tinutukoy ng mga subcellular marker, yugto ng pag-unlad, o environmental stimuli, at upang matukoy ang enzymatic activity. Ilan sa iba't ibang istruktura ng glycans at xylans na natukoy ay ang pectin (P), xylan (X), mannan (M), xyloglucans (XylG), mixed bond glucans (MLG), arabinoxylan (ArbX), galactomannan (GalG), glucuronic acid-arabinoxylan (GArbX) at arabino-galactan (ArbG)29.
Gayunpaman, sa kabila ng lahat ng mga pagsisikap sa pananaliksik na ito, kakaunti lamang na mga pag-aaral ang nakatuon sa katangian ng akumulasyon ng oligosaccharide sa panahon ng high solids load (HSL) hydrolysis, kabilang ang paglabas ng oligosaccharide, mga pagbabago sa haba ng oligomeric chain sa panahon ng hydrolysis, iba't ibang low DP polymers, at ang kanilang mga kurba. distribusyon 30,31,32. Samantala, bagama't napatunayang isang kapaki-pakinabang na kasangkapan ang glycan analysis para sa isang komprehensibong pagsusuri ng istruktura ng glycan, mahirap suriin ang mga water-soluble low DP oligosaccharides gamit ang mga pamamaraan ng antibody. Ang mas maliliit na DP oligosaccharides na may molecular weight na mas mababa sa 5-10 kDa ay hindi nagbibigkis sa mga ELISA plate 33, 34 at nahuhugasan bago idagdag ang antibody.
Dito, sa unang pagkakataon, ipinapakita namin ang isang ELISA assay sa mga avidin-coated plate gamit ang mga monoclonal antibodies, na pinagsasama ang isang one-step biotinylation procedure para sa soluble refractory oligosaccharides at glycome analysis. Ang aming diskarte sa glycome analysis ay napatunayan sa pamamagitan ng MALDI-TOF-MS at GC-MS based analysis ng mga complementary oligosaccharide linkages gamit ang trimethylsilyl (TMS) derivatization ng mga hydrolyzed sugar compositions. Ang makabagong diskarteng ito ay maaaring mabuo bilang isang high-throughput na paraan sa hinaharap at makahanap ng mas malawak na aplikasyon sa biomedical research35.
Ang mga post-translational na pagbabago ng mga enzyme at antibodies, tulad ng glycosylation,36 ay nakakaapekto sa kanilang biological na aktibidad. Halimbawa, ang mga pagbabago sa glycosylation ng mga serum protein ay may mahalagang papel sa inflammatory arthritis, at ang mga pagbabago sa glycosylation ay ginagamit bilang mga diagnostic marker37. Iba't ibang glycans ang naiulat sa literatura na madaling lumitaw sa iba't ibang sakit, kabilang ang mga talamak na nagpapaalab na sakit ng gastrointestinal tract at atay, mga impeksyon sa viral, kanser sa obaryo, suso, at prostate38,39,40. Ang pag-unawa sa istruktura ng mga glycans gamit ang mga pamamaraan ng glycan ELISA na nakabatay sa antibody ay magbibigay ng karagdagang kumpiyansa sa diagnosis ng sakit nang hindi gumagamit ng mga kumplikadong pamamaraan ng MS.
Ipinakita ng aming nakaraang pag-aaral na ang mga matigas na oligosaccharide ay nanatiling hindi na-hydrolyze pagkatapos ng pretreatment at enzymatic hydrolysis (Larawan 1). Sa aming naunang nailathalang gawain, bumuo kami ng isang activated charcoal solid-phase extraction method upang ihiwalay ang mga oligosaccharide mula sa AFEX-pretreated corn stover hydrolyzate (ACSH)8. Pagkatapos ng unang pagkuha at paghihiwalay, ang mga oligosaccharide ay karagdagang pinagpira-piraso sa pamamagitan ng size exclusion chromatography (SEC) at kinolekta ayon sa molecular weight. Ang mga sugar monomer at oligomer na inilabas mula sa iba't ibang pretreatment ay sinuri sa pamamagitan ng sugar composition analysis. Kapag inihambing ang nilalaman ng mga sugar oligomer na nakuha sa pamamagitan ng iba't ibang paraan ng pretreatment, ang pagkakaroon ng mga matigas na oligosaccharide ay isang karaniwang problema sa conversion ng biomass sa mga monosaccharide at maaaring humantong sa pagbawas sa sugar yield na hindi bababa sa 10-15% at maging hanggang 18%. US. Ang pamamaraang ito ay ginagamit para sa karagdagang malawakang produksyon ng mga oligosaccharide fraction. Ang nagresultang ACH at ang mga kasunod na fraction nito na may iba't ibang molecular weight ay ginamit bilang experimental material para sa paglalarawan ng mga oligosaccharide sa gawaing ito.
Pagkatapos ng pretreatment at enzymatic hydrolysis, ang mga persistent oligosaccharide ay nanatiling hindi na-hydrolyze. Narito ang (A) isang paraan ng paghihiwalay ng oligosaccharide kung saan ang mga oligosaccharide ay inihihiwalay mula sa AFEX-pretreated corn stover hydrolysate (ACSH) gamit ang isang naka-pack na bed ng activated carbon at diatomaceous earth; (B) Paraan para sa paghihiwalay ng mga oligosaccharide. Ang mga oligosaccharide ay pinaghiwalay pa sa pamamagitan ng size exclusion chromatography (SEC); (C) Mga monomer at oligomer ng Saccharide na inilabas mula sa iba't ibang pretreatment (diluted acid: DA, ionic liquid: IL at AFEX). Mga kondisyon ng enzymatic hydrolysis: mataas na solids loading na 25% (w/w) (humigit-kumulang 8% glucan loading), 96 na oras na hydrolysis, 20 mg/g commercial enzyme loading (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 ratio) at (D) Mga monomer at oligomer ng asukal ng glucose, xylose at arabinose na inilabas mula sa AFEX pre-treated corn stover (ACS).
Napatunayang isang kapaki-pakinabang na kasangkapan ang pagsusuri ng glycan para sa isang komprehensibong pagsusuri ng istruktura ng mga glycan sa mga katas na nakahiwalay mula sa mga solidong residue ng biomass. Gayunpaman, ang mga water-soluble saccharide ay kulang sa representasyon gamit ang tradisyonal na pamamaraang ito41 dahil ang mga low molecular weight oligosaccharide ay mahirap i-immobilize sa mga ELISA plate at nahuhugasan bago idagdag ang antibody. Samakatuwid, para sa pagbubuklod at paglalarawan ng antibody, isang one-step biotinylation method ang ginamit upang pahiran ang mga soluble, non-compliant oligosaccharide sa mga avidin-coated ELISA plate. Sinubukan ang pamamaraang ito gamit ang aming dating ginawang ACSH at isang fraction batay sa molecular weight nito (o antas ng polymerization, DP). Ginamit ang one-step biotinylation upang mapataas ang oligosaccharide binding affinity sa pamamagitan ng pagdaragdag ng biotin-LC-hydrazide sa reducing end ng carbohydrate (Fig. 2). Sa solusyon, ang hemiacetal group sa reducing end ay tumutugon sa hydrazide group ng biotin-LC-hydrazide upang bumuo ng isang hydrazone bond. Sa presensya ng reducing agent na NaCNBH3, ang hydrazone bond ay nababawasan tungo sa isang matatag na biotinylated end product. Sa pamamagitan ng pagbabago sa sugar reducing end, naging posible ang pagbubuklod ng mga low DP oligosaccharides sa mga ELISA plate, at sa aming pag-aaral, ito ay ginawa sa mga avidin-coated plate gamit ang glycan-targeted mAbs.
Pagsusuri ng mga monoclonal antibodies batay sa ELISA para sa mga biotinylated oligosaccharides. Dito (A) pinagsamang biotinylation ng mga oligosaccharides at kasunod na pagsusuri ng ELISA gamit ang mga glycan-targeted mAbs sa mga NeutrAvidin coated plates at (B) ay nagpapakita ng isang one-step na pamamaraan para sa biotinylation ng mga produkto ng reaksyon.
Ang mga plate na pinahiran ng avidin na may oligosaccharide-conjugated antibodies ay idinagdag sa mga pangunahin at pangalawang antibodies at hinugasan sa isang medium na sensitibo sa liwanag at oras. Pagkatapos makumpleto ang pagbubuklod ng antibody, idinagdag ang TMB substrate upang i-incubate ang plate. Ang reaksyon ay tuluyang itinigil gamit ang sulfuric acid. Ang mga incubated plate ay sinuri gamit ang isang ELISA reader upang matukoy ang lakas ng pagbubuklod ng bawat antibody upang matukoy ang antibody-specific cross-linking. Para sa mga detalye at parameter ng eksperimento, tingnan ang kaukulang seksyon na "Mga Materyales at Paraan".
Ipinakikita namin ang gamit ng bagong binuong pamamaraang ito para sa mga partikular na aplikasyon sa pamamagitan ng paglalarawan sa mga natutunaw na oligosaccharide na nasa ACSH pati na rin sa mga krudo at dalisay na mga fraction ng oligosaccharide na nakahiwalay mula sa mga lignocellulosic hydrolysate. Gaya ng ipinapakita sa Figure 3, ang pinakakaraniwang epitope-substituted xylan na natukoy sa ACSH gamit ang mga pamamaraan ng bioacylated glycome assay ay karaniwang uronic (U) o methyluronic (MeU) at pectic arabinogalactans. Karamihan sa mga ito ay natagpuan din sa aming nakaraang pag-aaral sa pagsusuri ng mga glycan ng mga non-hydrolyzed solids (UHS)43.
Pagtuklas ng mga recalcitrant oligosaccharide epitopes gamit ang isang monoclonal antibody na nakadirekta sa cell wall glycan. Ang "neutral" na fraction ay ang ACN fraction at ang "acidic" na fraction ay ang FA fraction. Ang mas matingkad na pula sa heatmap ay nagpapahiwatig ng mas mataas na nilalaman ng epitope, at ang mas matingkad na asul ay nagpapahiwatig ng blangkong background. Ang mga halaga ng kulay sa iskala ay batay sa mga hilaw na halaga ng OD para sa mga pormulasyon na N=2. Ang mga pangunahing epitope na kinikilala ng mga antibodies ay ipinapakita sa kanan.
Ang mga istrukturang hindi-cellulose na ito ay hindi maaaring hatiin ng mga pinakakaraniwang cellulase at hemicellulase sa sinubukang komersyal na pinaghalong enzyme, na kinabibilangan ng mga pinakakaraniwang ginagamit na komersyal na enzyme. Samakatuwid, kinakailangan ang mga bagong auxiliary enzyme para sa kanilang hydrolysis. Kung wala ang mga kinakailangang non-cellulose accessory enzyme, ang mga non-cellulose bond na ito ay pumipigil sa kumpletong conversion sa mga monosaccharide, kahit na ang kanilang mga magulang na sugar polymer ay malawakang na-hydrolyze sa mas maiikling mga fragment at natutunaw gamit ang mga komersyal na pinaghalong enzyme.
Ipinakita ng karagdagang pag-aaral sa distribusyon ng signal at sa lakas ng pagbigkis nito na ang mga binding epitope ay mas mababa sa mga high DP sugar fraction (A, B, C, DP hanggang 20+) kaysa sa mga low DP fraction (D, E, F, DP) sa mga dimer (Fig. 1). Ang mga acid fragment ay mas karaniwan sa mga non-cellulose epitope kaysa sa mga neutral fragment. Ang mga phenomena na ito ay naaayon sa pattern na naobserbahan sa aming nakaraang pag-aaral, kung saan ang mga high DP at acid moieties ay mas lumalaban sa enzymatic hydrolysis. Samakatuwid, ang pagkakaroon ng mga non-cellulose glycan epitope at mga U at MeU substitution ay maaaring lubos na makapag-ambag sa katatagan ng mga oligosaccharide. Dapat tandaan na ang kahusayan sa pagbigkis at pagtuklas ay maaaring maging problema para sa mga low DP oligosaccharide, lalo na kung ang epitope ay isang dimeric o trimeric oligosaccharide. Maaari itong masubukan gamit ang mga komersyal na oligosaccharide na may iba't ibang haba, na ang bawat isa ay naglalaman lamang ng isang epitope na nagbibigkis sa isang partikular na mAb.
Kaya naman, ang paggamit ng mga structure-specific antibodies ay nagpakita ng ilang uri ng recalcitrant bonds. Depende sa uri ng antibody na ginamit, ang naaangkop na ligation pattern, at ang lakas ng signal na nalilikha nito (pinakamarami at pinakakaunti), ang mga bagong enzyme ay maaaring matukoy at maidagdag nang semi-quantitatively sa pinaghalong enzyme para sa mas kumpletong glycoconversion. Gamit ang pagsusuri ng ACSH oligosaccharides bilang halimbawa, makakagawa tayo ng database ng mga glycan bonds para sa bawat biomass material. Dapat tandaan dito na ang iba't ibang affinity ng mga antibodies ay dapat isaalang-alang, at kung ang kanilang affinity ay hindi alam, lilikha ito ng ilang mga kahirapan kapag inihahambing ang mga signal ng iba't ibang antibodies. Bilang karagdagan, ang paghahambing ng mga glycan bonds ay maaaring pinakamahusay na gumana sa pagitan ng mga sample para sa parehong antibody. Ang mga stubborn bond na ito ay maaaring iugnay sa CAZyme database, kung saan maaari nating matukoy ang mga enzyme, pumili ng mga candidate enzyme at subukan ang mga bond-breaking enzyme, o bumuo ng mga microbial system upang ipahayag ang mga enzyme na ito para magamit sa mga biorefineries44.
Upang masuri kung paano kinukumpleto ng mga pamamaraang immunological ang mga alternatibong pamamaraan para sa paglalarawan ng mga low molecular weight oligosaccharides na nasa lignocellulosic hydrolysates, isinagawa namin ang MALDI (Fig. 4, S1-S8) at pagsusuri ng mga TMS-derived saccharides batay sa GC-MS sa parehong panel (Fig. 5) na bahagi ng oligosaccharide. Ginagamit ang MALDI upang ihambing kung ang mass distribution ng mga oligosaccharide molecule ay tumutugma sa nilalayong istruktura. Sa fig. 4 ay ipinapakita ang MS ng mga neutral na bahagi na ACN-A at ACN-B. Kinumpirma ng pagsusuri ng ACN-A ang isang hanay ng mga pentose sugar mula DP 4–8 (Fig. 4) hanggang DP 22 (Fig. S1), na ang mga timbang ay tumutugma sa MeU-xylan oligosaccharides. Kinumpirma ng pagsusuri ng ACN-B ang serye ng pentose at glucoxylan na may DP 8-15. Sa mga karagdagang materyal tulad ng Figure S3, ang mga mapa ng distribusyon ng masa ng FA-C acidic moiety ay nagpapakita ng hanay ng (Me)U substituted pentose sugars na may DP na 8-15 na naaayon sa mga substituted xylans na matatagpuan sa ELISA-based mAb screening. Ang mga epitope ay pare-pareho.
Ang spectrum ng MALDI-MS ng mga natutunaw na non-compliant oligosaccharides na nasa ACS. Dito, (A) Mga fraction ng ACN-A low weight range na naglalaman ng methylated uronic acid (DP 4-8) substituted glucuroxylan oligosaccharides at (B) ACN-B xylan at methylated uronic acid oligosaccharides na pinalitan ng glucuroxylan (DP 8-15).
Pagsusuri ng komposisyon ng glycan residue ng mga refractory oligosaccharides. Dito (A) Komposisyon ng TMS saccharide ng iba't ibang oligosaccharide fractions na nakuha gamit ang GC-MS analysis. (B) Mga istruktura ng iba't ibang asukal na nagmula sa TMS na nasa mga oligosaccharides. ACN – acetonitrile fraction na naglalaman ng neutral oligosaccharides at FA – ferulic acid fraction na naglalaman ng acid oligosaccharides.
Isa pang kawili-wiling konklusyon ang nakuha mula sa pagsusuri ng LC-MS ng oligosaccharide fraction, gaya ng ipinapakita sa Figure S9 (makikita ang mga pamamaraan sa elektronikong pandagdag na materyal). Paulit-ulit na naobserbahan ang mga fragment ng hexose at -OAc groups habang ini-ligate ang ACN-B fraction. Hindi lamang kinukumpirma ng natuklasang ito ang fragmentation na naobserbahan sa glycome at MALDI-TOF analysis, kundi nagbibigay din ito ng bagong impormasyon tungkol sa mga potensyal na carbohydrate derivatives sa pretreated lignocellulosic biomass.
Nagsagawa rin kami ng pagsusuri ng komposisyon ng glycan ng mga oligosaccharide fraction gamit ang TMS glycan derivatization. Gamit ang GC-MS, natukoy namin ang komposisyon ng neural (non-derivative) at acidic sugars (GluA at GalA) sa oligosaccharide fraction (Fig. 5). Ang glucuronic acid ay matatagpuan sa acidic components na C at D, habang ang galacturonic acid ay matatagpuan sa acidic components na A at B, na parehong high DP components ng acidic sugars. Ang mga resultang ito ay hindi lamang nagpapatunay sa aming ELISA at MALDI data, kundi naaayon din sa aming mga nakaraang pag-aaral ng oligosaccharide accumulation. Samakatuwid, naniniwala kami na ang mga modernong immunological methods gamit ang biotinylation ng mga oligosaccharides at kasunod na ELISA screening ay sapat na upang matukoy ang mga soluble recalcitrant oligosaccharides sa iba't ibang biological sample.
Dahil ang mga pamamaraan ng screening ng mAb na nakabatay sa ELISA ay napatunayan na sa pamamagitan ng iba't ibang pamamaraan, nais naming higit pang tuklasin ang potensyal ng bagong quantitative method na ito. Dalawang komersyal na oligosaccharides, ang xylohexasaccharide oligosaccharide (XHE) at 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX), ang binili at sinubukan gamit ang isang bagong mAb approach na naka-target sa cell wall glycan. Ipinapakita ng Figure 6 ang isang linear correlation sa pagitan ng biotinylated binding signal at ang log concentration ng oligosaccharide concentration, na nagmumungkahi ng isang posibleng Langmuir adsorption model. Sa mga mAbs, ang CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148, at CCRC-M151 ay may kaugnayan sa XHE, at ang CCRC-M108, CCRC-M109, at LM11 ay may kaugnayan sa A2XX sa hanay na 1 nm hanggang 100 nano. Dahil sa limitadong availability ng mga antibodies sa panahon ng eksperimento, limitadong mga eksperimento ang isinagawa sa bawat konsentrasyon ng oligosaccharide. Dapat pansinin dito na ang ilang mga antibody ay may ibang reaksyon sa parehong oligosaccharide bilang isang substrate, marahil dahil ang mga ito ay nagbibigkis sa bahagyang magkakaibang mga epitope at maaaring magkaroon ng ibang-iba na mga affinity ng pagbubuklod. Ang mga mekanismo at implikasyon ng tumpak na pagtukoy ng epitope ay magiging mas kumplikado kapag ang bagong pamamaraan ng mAb ay inilapat sa mga totoong sample.
Dalawang komersyal na oligosaccharides ang ginamit upang matukoy ang saklaw ng pagtuklas ng iba't ibang glycan-targeting mAbs. Dito, ang mga linear na ugnayan na may log concentration ng oligosaccharide concentration ay nagpapahiwatig ng mga pattern ng adsorption ng Langmuir para sa (A) XHE na may mAb at (B) A2XX na may mAb. Ang mga katumbas na epitope ay nagpapahiwatig ng mga istruktura ng mga komersyal na oligosaccharides na ginamit bilang mga substrate sa assay.
Ang paggamit ng mga glycan-targeted monoclonal antibodies (glycocomic analysis o ELISA-based mAb screening) ay isang makapangyarihang kasangkapan para sa malalimang paglalarawan ng karamihan sa mga pangunahing cell wall glycans na bumubuo sa biomass ng halaman. Gayunpaman, ang classical glycan analysis ay nagpapakilala lamang sa mas malalaking cell wall glycans, dahil karamihan sa mga oligosaccharides ay hindi mahusay na na-immobilize sa mga ELISA plate. Sa pag-aaral na ito, ang AFEX-pretreated corn stover ay enzymatically hydrolyzed sa mataas na solids content. Ginamit ang sugar analysis upang matukoy ang komposisyon ng recalcitrant cell wall carbohydrates sa hydrolyzate. Gayunpaman, ang mAb analysis ng mas maliliit na oligosaccharides sa mga hydrolysate ay minamaliit, at kailangan ng mga karagdagang kasangkapan upang epektibong ma-immobilize ang mga oligosaccharides sa mga ELISA plate.
Inilalahad namin dito ang isang bago at mahusay na paraan ng oligosaccharide immobilization para sa mAb screening sa pamamagitan ng pagsasama ng oligosaccharide biotinylation na sinundan ng ELISA screening sa mga NeutrAvidin™ coated plates. Ang mga immobilized biotinylated oligosaccharides ay nagpakita ng sapat na affinity para sa antibody upang paganahin ang mabilis at mahusay na pagtuklas ng mga recalcitrant oligosaccharides. Kinumpirma ng pagsusuri ng komposisyon ng mga matigas na oligosaccharides na ito batay sa mass spectrometry ang mga resulta ng bagong pamamaraang ito sa immunoscreening. Kaya, ipinapakita ng mga pag-aaral na ito na ang kumbinasyon ng oligosaccharide biotinylation at ELISA screening na may glycan-targeted monoclonal antibodies ay maaaring gamitin upang matukoy ang mga crosslink sa mga oligosaccharides at maaaring malawakang ilapat sa iba pang mga biochemical studies na nagpapakilala sa istruktura ng mga oligosaccharides.
Ang pamamaraang ito ng biotin-based glycan profiling ang unang ulat na may kakayahang mag-imbestiga sa mga recalcitrant carbohydrate bond ng mga soluble oligosaccharides sa biomass ng halaman. Nakakatulong ito upang maunawaan kung bakit ang ilang bahagi ng biomass ay napakatigas pagdating sa produksyon ng biofuel. Pinupunan ng pamamaraang ito ang isang mahalagang puwang sa mga pamamaraan ng glycome analysis at pinapalawak ang aplikasyon nito sa mas malawak na hanay ng mga substrate na lampas sa mga oligosaccharides ng halaman. Sa hinaharap, maaari naming gamitin ang robotics para sa biotinylation at gamitin ang pamamaraang aming binuo para sa high-throughput analysis ng mga sample gamit ang ELISA.
Ang dayami ng mais (corn straw o corn straw o CS) na itinanim mula sa mga hybrid na buto ng Pioneer 33A14 ay inani noong 2010 mula sa Kramer Farms sa Ray, Colorado. Sa pahintulot ng may-ari ng lupa, ang biomass na ito ay maaaring gamitin para sa pananaliksik. Ang mga sample ay itinago nang tuyo (< 6% moisture) sa mga zip-lock bag sa temperatura ng kuwarto. Ang mga sample ay itinago nang tuyo (< 6% moisture) sa mga zip-lock bag sa temperatura ng kuwarto. Образцы хранились сухими при влажности < 6% sa пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре. Ang mga sample ay itinago nang tuyo sa <6% na humidity sa mga zippered bag sa temperatura ng silid.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < 6%. Ang mga sample ay iniimbak sa mga zipper bag sa temperatura ng silid na may humidity na < 6%.Ang pag-aaral ay sumunod sa mga lokal at pambansang alituntunin. Ang pagsusuri ng komposisyon ay isinagawa gamit ang NREL protocol. Ang komposisyon ay natuklasang naglalaman ng 31.4% glucan, 18.7% xylan, 3.3% arabinan, 1.2% galactan, 2.2% acetyl, 14.3% lignin, 1.7% protina at 13.4% abo.
Ang Cellic® CTec2 (138 mg protina/ml, lot VCNI 0001) ay isang komplikadong halo ng cellulase, β-glucosidase at Cellic® HTec2 (157 mg protina/ml, lot VHN00001) mula sa Novozymes (Franklinton, NC, USA)). Ang Multifect Pectinase® (72 mg protina/mL), isang komplikadong timpla ng mga enzyme na nagpapababa ng pectin, ay ibinigay ng DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, USA). Ang mga konsentrasyon ng protina ng enzyme ay natukoy sa pamamagitan ng pagtantya sa nilalaman ng protina (at pagbabawas ng kontribusyon ng non-protein nitrogen) gamit ang Kjeldahl nitrogen analysis (AOAC method 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA). Ang diatomaceous earth 545 ay binili mula sa EMD Millipore (Billerica, MA). Ang activated carbon (DARCO, 100 mesh granules), Avicel (PH-101), beech xylan, at lahat ng iba pang kemikal ay binili mula sa Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
Isinagawa ang pre-treatment ng AFEX sa GLBRC (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, USA). Isinagawa ang pre-treatment sa 140° C sa loob ng 15 minuto. 46 na oras ng paninirahan sa 1:1 ratio ng anhydrous ammonia sa biomass sa 60% (w/w) loading sa isang stainless steel benchtop batch reactor (Parr Instruments Company). Inabot ito ng 30 minuto. Ang reactor ay pinainit sa 140°C at ang ammonia ay mabilis na inilabas, na nagpapahintulot sa biomass na mabilis na bumalik sa temperatura ng silid. Ang komposisyon ng AFEX pre-treated corn stover (ACS) ay katulad ng sa untreated corn stover (UT-CS).
Ang mataas na solidong ACSH 25% (w/w) (humigit-kumulang 8% dextran loading) ay inihanda bilang panimulang materyal para sa malawakang produksyon ng mga oligosaccharides. Ang enzymatic hydrolysis ng ACS ay isinagawa gamit ang isang komersyal na pinaghalong enzyme kabilang ang Cellic® Ctec2 10 mg protein/g glucan (sa pretreated biomass), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg protein/g glucan, at Multifect Pectinase (Genencor Inc, USA). ), 5 mg protein/g dextran. Ang enzymatic hydrolysis ay isinagawa sa isang 5-litrong bioreactor na may working volume na 3 litro, pH 4.8, 50°C at 250 rpm. Pagkatapos ng hydrolysis sa loob ng 96 na oras, ang hydrolyzate ay kinolekta sa pamamagitan ng centrifugation sa 6000 rpm sa loob ng 30 minuto at pagkatapos ay sa 14000 rpm sa loob ng 30 minuto upang alisin ang mga hindi na-hydrolyzed na solid. Ang hydrolyzate ay isinailalim sa isterilisadong pagsasala sa pamamagitan ng isang 0.22 mm filter beaker. Ang sinalang hydrolyzate ay itinago sa mga isterilisadong bote sa 4° C at pagkatapos ay pinagpira-piraso sa carbon.
Pagsusuri ng komposisyon ng mga sample ng biomass na nakabatay sa katas ayon sa mga pamamaraan ng pagsusuri sa laboratoryo ng NREL: paghahanda ng mga sample para sa pagsusuri ng komposisyon (NREL/TP-510-42620) at pagtukoy ng mga structural carbohydrates at lignin sa biomass (NREL/TP-510 – 42618)47.
Ang pagsusuri ng oligosaccharide ng hydrolyzate stream ay isinagawa sa isang 2 ml na iskala gamit ang isang autoclave-based acid hydrolysis method. Paghaluin ang hydrolyzate sample na may 69.7 µl ng 72% sulfuric acid sa isang 10 ml na screw cap culture tube at i-incubate sa loob ng 1 oras sa isang benchtop sa 121 °C, palamigin sa yelo at i-filter sa isang high performance liquid chromatography (HPLC) vial. Ang konsentrasyon ng mga oligosaccharide ay natukoy sa pamamagitan ng pagbabawas ng konsentrasyon ng mga monosaccharide sa non-hydrolyzed sample mula sa kabuuang konsentrasyon ng asukal sa acid-hydrolyzed sample.
Ang mga konsentrasyon ng glucose, xylose, at arabinose sa acid hydrolysed biomass ay sinuri gamit ang isang Shimadzu HPLC system na nilagyan ng autosampler, column heater, isocratic pump, at refractive index detector sa isang Bio-Rad Aminex HPX-87H column. Ang column ay pinanatili sa 50°C at nilagyan ng 0.6 ml/min 5 mM H2SO4 sa tubig.
Ang hydrolyzate supernatant ay diluted at sinuri para sa nilalaman ng monomer at oligosaccharide. Ang mga monomeric sugar na nakuha pagkatapos ng enzymatic hydrolysis ay sinuri gamit ang HPLC na nilagyan ng Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P column at isang ash guard column. Ang temperatura ng column ay pinanatili sa 80°C, ang tubig ay ginamit bilang mobile phase na may flow rate na 0.6 ml/min. Ang mga oligosaccharide ay natukoy sa pamamagitan ng hydrolysis sa dilute acid sa 121°C ayon sa mga pamamaraang inilarawan sa refs. 41, 48, 49.
Isinagawa ang pagsusuri ng Saccharide sa mga hilaw, pre-treated na AFEX at lahat ng hindi hydrolyzed na biomass residue (kabilang ang produksyon ng mga serial cell wall extract at ang kanilang mAb screening) gamit ang mga naunang inilarawang pamamaraan 27, 43, 50, 51. Para sa pagsusuri ng glycome, ang mga alcohol-insoluble residue ng materyal ng plant cell wall ay inihanda mula sa mga biomass residue at isinailalim sa serial extraction gamit ang lalong agresibong mga reagent tulad ng ammonium oxalate (50 mM), sodium carbonate (50 mM at 0.5% w/v), CON. (1M at 4M, parehong may 1% w/v sodium borohydride) at acid chlorite gaya ng naunang inilarawan 52,53. Ang mga extract ay isinailalim sa ELISA laban sa isang kumplikadong panel ng mAb50s na nakadirekta sa cell wall glycan, at ang mga mAb binding reaction ay ipinakita bilang isang heat map. Ang mga mAb na nagta-target sa plant cell wall glycan ay binili mula sa mga stock ng laboratoryo (CCRC, JIM at MAC series).
Isang-hakbang na biotinylation ng mga oligosaccharide. Ang conjugation ng carbohydrates sa biotin-LC-hydrazide ay isinagawa gamit ang sumusunod na pamamaraan. Ang Biotin-LC-hydrazide (4.6 mg/12 μmol) ay tinunaw sa dimethyl sulfoxide (DMSO, 70 μl) sa pamamagitan ng masiglang paghahalo at pagpapainit sa 65° C sa loob ng 1 minuto. Idinagdag ang glacial acetic acid (30 µl) at ang timpla ay ibinuhos sa sodium cyanoborohydride (6.4 mg/100 µmol) at tuluyang tinunaw pagkatapos painitin sa 65° C sa loob ng humigit-kumulang 1 minuto. Pagkatapos, mula 5 hanggang 8 μl ng reaction mixture ay idinagdag sa pinatuyong oligosaccharide (1-100 nmol) upang makakuha ng 10-tiklop o higit pang molar excess ng label sa ibabaw ng reducing end. Ang reaksyon ay isinagawa sa 65°C sa loob ng 2 oras, pagkatapos nito ay agad na pinadalisay ang mga sample. Walang sodium cyanoborohydride na ginamit sa mga eksperimento sa paglalagay ng label nang walang reduction, at ang mga sample ay ni-react sa 65° C. sa loob ng 2.5 oras.
Pagbabalot at paghuhugas ng mga sample ng biotinylated oligosaccharides gamit ang ELISA. 25 μl ng mga biotinylated sample (100 μl ng bawat concentrated sample na diluted sa 5 ml ng 0.1 M Tris buffer solution (TBS)) ang idinagdag sa bawat well ng avidin-coated plate. Ang mga control well ay binalutan ng 50 μl ng biotin sa konsentrasyon na 10 μg/ml sa 0.1 M TBS. Ang deionized water ay ginamit bilang patong para sa mga blankong sukat. Ang tableta ay in-incubate sa loob ng 2 oras sa temperatura ng silid sa dilim. Hugasan ang plato nang 3 beses gamit ang 0.1% skimmed milk sa 0.1 M TBS gamit ang program no. 11 para sa Grenier flat 3A.
Pagdaragdag at paghuhugas ng mga pangunahing antibody. Magdagdag ng 40 µl ng pangunahing antibody sa bawat balon. I-incubate ang microplate sa loob ng 1 oras sa temperatura ng silid sa dilim. Ang mga plato ay hinugasan ng 3 beses gamit ang 0.1% na gatas sa 0.1M TBS gamit ang wash program #11 para sa Grenier Flat 3A.
Magdagdag ng pangalawang antibody at hugasan. Magdagdag ng 50 µl ng pangalawang antibody ng daga/daga (pinalabnaw ng 1:5000 sa 0.1% gatas sa 0.1 M TBS) sa bawat balon. I-incubate ang microplate sa loob ng 1 oras sa temperatura ng silid sa dilim. Pagkatapos ay hinugasan ang mga microplate nang 5 beses gamit ang 0.1% gatas sa 0.1 M TBS gamit ang Grenier Flat 5A plate wash program #12.
Pagdaragdag ng substrate. Magdagdag ng 50 µl ng 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) sa base substrate (sa pamamagitan ng pagdaragdag ng 2 patak ng buffer, 3 patak ng TMB, 2 patak ng hydrogen peroxide sa 15 ml ng deionized na tubig). Ihanda ang TMB substrate. at i-vortex bago gamitin). I-incubate ang microplate sa temperatura ng kuwarto sa loob ng 30 minuto. Sa dilim.
Kumpletuhin ang hakbang at basahin ang tableta. Magdagdag ng 50 µl ng 1 N sulfuric acid sa bawat balon at itala ang absorbance mula 450 hanggang 655 nm gamit ang isang ELISA reader.
Maghanda ng 1 mg/ml na solusyon ng mga analyte na ito sa deionized na tubig: arabinose, rhamnose, fucose, xylose, galacturonic acid (GalA), glucuronic acid (GlcA), mannose, glucose, galactose, lactose, N-acetylmannosamine (manNAc), N-acetylglucosamine (glcNAc), N-acetylgalactosamine (galNAc), inositol (internal standard). Dalawang pamantayan ang inihanda sa pamamagitan ng pagdaragdag ng 1 mg/mL na solusyon ng asukal na ipinapakita sa Table 1. Ang mga sample ay pinapalamig at ini-lyophilize sa -80° C hanggang sa maalis ang lahat ng tubig (karaniwan ay mga 12-18 oras).
Magdagdag ng 100–500 µg ng sample sa mga tubo ng screw cap na nasa isang analytical balance. Itala ang dami ng idinagdag. Pinakamainam na tunawin ang sample sa isang partikular na konsentrasyon ng solvent at idagdag ito sa tubo bilang isang liquid aliquot. Gumamit ng 20 µl ng 1 mg/ml inositol bilang internal standard para sa bawat tubo ng sample. Ang dami ng internal standard na idinagdag sa sample ay dapat kapareho ng dami ng internal standard na idinagdag sa standard tube.
Magdagdag ng 8 ml ng anhydrous methanol sa isang vial na may screw cap. Pagkatapos ay magdagdag ng 4 ml ng 3 N. methanolic HCl solution, takpan at alugin. Ang prosesong ito ay hindi gumagamit ng tubig.
Magdagdag ng 500 µl ng 1 M HCl methanol solution sa mga oligosaccharide sample at mga karaniwang TMS tube. Ang mga sample ay in-incubate magdamag (168 oras) sa 80° C. sa isang thermal block. Patuyuin ang produktong methanolysis sa temperatura ng silid gamit ang drying manifold. Magdagdag ng 200 µl MeOH at patuyuin muli. Ang prosesong ito ay inulit nang dalawang beses. Magdagdag ng 200 µl ng methanol, 100 µl ng pyridine at 100 µl ng acetic anhydride sa sample at haluing mabuti. I-incubate ang mga sample sa temperatura ng silid sa loob ng 30 minuto. at patuyuin. Magdagdag ng 200 µl ng methanol at patuyuin muli.
Magdagdag ng 200 µl ng Tri-Sil at painitin ang tubo na may takip sa loob ng 20 minuto. 80°C, pagkatapos ay palamigin sa temperatura ng silid. Gumamit ng drying manifold upang higit pang patuyuin ang sample sa dami na humigit-kumulang 50 µl. Mahalagang tandaan na hindi namin hinayaan na matuyo nang tuluyan ang mga sample.
Magdagdag ng 2 ml ng hexane at haluing mabuti sa pamamagitan ng vortexing. Punuin ang mga dulo ng Pasteur pipette (5-8 mm) ng isang piraso ng glass wool sa pamamagitan ng pagpasok ng glass wool sa ibabaw ng isang 5-3/4 pulgadang diyametrong pipette. Ang mga sample ay isinailalim sa centrifuge sa 3000 g sa loob ng 2 minuto. Anumang hindi matutunaw na residue ay ipinupipi. Patuyuin ang sample hanggang sa 100-150 µl. Isang volume na humigit-kumulang 1 μl ang itinurok sa GC-MS sa panimulang temperatura na 80 °C at panimulang oras na 2.0 minuto (Talahanayan 2).