Nature.com saýtyna gireniňiz üçin sag boluň. Ulanýan brauzeriňiziň wersiýasynda CSS goldawy çäkli. Iň gowy tejribe üçin täzelenen brauzer ulanmagyňyzy maslahat berýäris (ýa-da Internet Explorer-de Gatnaşyklyk Režimini öçüriň). Şol bir wagtyň özünde, yzygiderli goldawy üpjün etmek üçin saýty stillersiz we JavaScript-siz görkezeris.
AFEX bilen öňünden işlenilen mekgejöwen ojagynda dowamly oligosaharidleriň toplumlaýyn analiziniň täze immunologiki we massa spektrometrik usullary. Lignosellyulozaly biomassa gazylyp alynýan ýangyçlara durnukly alternatiwa bolup, iýmit, iým, ýangyç we himiki maddalar ýaly önümleri öndürmek üçin biotehnologiýalary işläp düzmekde giňden ulanylýar. Bu tehnologiýalaryň açary ösümlik öýjük diwarlarynda bar bolan çylşyrymly uglewodlary glýukoza, ksiloza we arabinoza ýaly ýönekeý şekerler öwürmek üçin çykdajy taýdan bäsdeşlikli prosesleri işläp düzmekdir. Lignosellyulozaly biomassa örän berk bolany üçin, islenýän önümi almak üçin ony termohimiki bejergilere (meselem, ammiak süýüminiň eksfoliasiýasyna (AFEX), suwuk kislotalara (DA), ion suwuklyklaryna (IL)) we biologik bejergilere (meselem, fermentatiw gidroliz we mikrobial fermentasiýa) birleşdirip geçirmeli. Şeýle-de bolsa, gidroliz prosesinde täjirçilik göbelek fermentleri ulanylanda, emele gelen ereýän şekerler diňe 75-85% monosaharidler, galan 15-25% bolsa mikroorganizmler üçin hemişe elýeterli bolmadyk ereýän, çözülmeýän oligosakkaridlerdir. Mundan öň, biz uglerod we diatom toprak bölmek we ölçegleri aýyrmak hromatografiýasynyň utgaşmasyny ulanyp, ereýän berk oligosakkaridleri üstünlikli bölüp aldyk we arassaladyk, şeýle hem olaryň fermentleriň inhibitiw häsiýetlerini öwrendik. Biz ýokary derejeli polimerleşme (DP) metillenen uron turşusynyň ornuny tutýan oligosakkaridleriň pes DP we neýtral oligosakkaridlere garanyňda täjirçilik ferment garyndylary bilen işlenilmeginiň has kyndygyny anykladyk. Bu ýerde biz ösümlik öýjük diwarlaryndaky glikan baglanyşyklaryny we fermentatiw gidrolizatlary häsiýetlendirmek üçin ösümlik biokütlesi glikanlaryna mahsus monoklonal antitelalary (mAbs) ulanyp glikan profilini döretmek, matrisa kömekli lazer desorbsiýa ionizasiýasyny, uçuş wagtynyň massa spektrometriýasyny öz içine alýan birnäçe goşmaça usullaryň ulanylyşyny habar berýäris. . MALDI-TOF-MS) oligosaharid baglanyşyklaryny deriwatizasiýa bilen we deriwatizasiýasyz häsiýetlendirmek üçin negatiw ionlaryň ikinji derejeli dargamagyndan soň spektroskopiýa, gaz hromatografiýasy we massa spektrometriýasy (GC-MS) arkaly alnan gurluş-informatiw diagnostiki pikleri ulanýar. Oligosaharidleriň kiçi ölçegleri (DP 4–20) sebäpli, bu molekulalary mAb baglanyşygy we häsiýetlendirmesi üçin ulanmak kyn. Bu meseläni çözmek üçin, biz mikroplastinka ýüzünde pes DP ereýän oligosaharidleriň köpüsini üstünlikli belliklän täze biotin konýugasiýasyna esaslanýan oligosaharid immobilizasiýa usulyny ulandyk, soňra ol ýörite ligasiýa seljermesi üçin ýokary geçirijilikli mAb ulgamynda ulanyldy. Bu täze usul geljekde biomarkerlerde bar bolan oligosaharidleri anyklaýyş maksatlary üçin bölüp almak we häsiýetlendirmek üçin ulanylyp bilinjek has ösen ýokary geçirijilikli glikom analizleriniň işlenip düzülmegine ýardam eder.
Oba hojalyk, tokaý hojalygy, ot we agaç materiallaryndan ybarat bolan lignosellyuloza biomassasy, ýokary gymmatly önümleri öndürmek üçin iýmit, iým, ýangyç we himiki prekursorlar ýaly bio esasly önümleri öndürmek üçin potensial çig maldyr1. Ösümlik öýjük diwarlarynda bar bolan uglewodlar (sellýuloza we gemisellýuloza ýaly) himiki gaýtadan işlemek we biotransformasiýa (fermentatiw gidroliz we mikrobial fermentasiýa ýaly) arkaly monosaharidlere depolimerleşdirilýär. Öňünden işlenilýän umumy işlere ammiak süýüminiň giňelmegi (AFEX), suwuk kislota (DA), ion suwuklygy (IL) we bug partlamasy (SE) girýär, olar ösümlik öýjük diwarlaryny açmak arkaly lignosellyuloza önümçiligini azaltmak üçin himiki maddalaryň we ýylylygyň utgaşmasyny ulanýar3,4. maddanyň berkligi, 5. Enzimatik gidroliz ýokary gaty maddalar ýükünde täjirçilik işjeň uglewod saklaýan fermentler (CAZymes) we bio esasly ýangyçlary we himiki maddalary öndürmek üçin transgenik drožžalary ýa-da bakteriýalary ulanyp mikrobial fermentasiýa arkaly amala aşyrylýar6.
Söwda fermentlerindäki KAZimler monosaharidleri emele getirmek üçin çylşyrymly uglewod-şeker baglanyşyklaryny sinergiki taýdan bölýän fermentleriň çylşyrymly garyndysyndan emele gelýär2,7. Öň habar berşimiz ýaly, ligniniň uglewodlar bilen aromatik polimerleriniň çylşyrymly ulgamy olary örän çylşyrymly edýär, bu bolsa şekeriň doly däl öwrülmegine getirýär, öňünden işlenen biomassanyň fermentatiw gidrolizi wagtynda öndürilmeýän jyns oligosaharidleriniň 15-25% -ni jemleýär. Bu dürli biomassanyň öňünden işlenen usullarynda umumy mesele. Bu päsgelçilikleriň käbir sebäplerine gidroliz wagtynda fermentleriň tormozlanmagy ýa-da ösümlik biomassasynda şeker baglanyşyklaryny bozmak üçin zerur bolan möhüm esasy fermentleriň ýoklugy ýa-da pes derejesi girýär. Şekerleriň düzümini we gurluş aýratynlyklaryny, mysal üçin, oligosaharidlerdäki şeker baglanyşyklaryny düşünmek, gidroliz wagtynda şekeriň öwrülmegini gowulandyrmaga kömek eder we biotehnologik prosesleri nebitden alynýan önümler bilen baha taýdan bäsdeşlige ukyply eder.
Uglewodlaryň gurluşyny kesgitlemek kyn we suwuk hromatografiýa (LC)11,12, ýadro magnit-rezonans spektroskopiýasy (NMR)13, kapillýar elektroforez (CE)14,15,16 we massa spektrometriýasy (MS)17 ýaly usullaryň utgaşmasyny talap edýär. ,18. Uçuş wagty massa spektrometriýasy, lazer desorbsiýasy we matrisa (MALDI-TOF-MS) ulanyp ionlaşdyrma ýaly MS usullary uglewod gurluşlaryny kesgitlemek üçin köpugurly usuldyr. Soňky döwürde natriý ionlarynyň çaknyşyk bilen bölünýän (CID) tandem MS-i oligosaharidleriň birikdiriliş pozisiýalaryna, anomer konfigurasiýalaryna, yzygiderliklerine we şahalanma pozisiýalaryna 20, 21 laýyk gelýän barmak yzlaryny kesgitlemek üçin iň giňden ulanylýar.
Glikan analizi uglewod baglanyşyklaryny çuňňur kesgitlemek üçin ajaýyp guraldyr22. Bu usul çylşyrymly uglewod baglanyşyklaryny düşünmek üçin ösümlik öýjük diwarynyň glikanyna gönükdirilen monoklonal antitelalary (mAbs) zond hökmünde ulanýar. Dünýäde dürli saharidleri ulanyp dürli çyzykly we şahalanan oligosaharidlere garşy döredilen 250-den gowrak mAbs bar24. Ösümlik öýjük diwarynyň gurluşyny, düzümini we üýtgeşmelerini häsiýetlendirmek üçin birnäçe mAbs giňden ulanyldy, sebäbi ösümlik öýjükleriniň görnüşine, organyna, ýaşyna, ösüş tapgyryna we ösüş gurşawyna baglylykda möhüm tapawutlar bar25,26. Soňky döwürde bu usul ösümlik we haýwan ulgamlaryndaky wezikula populýasiýalaryny we olaryň glikan daşamakdaky degişli rollaryny, subhüjre markerleri, ösüş tapgyrlary ýa-da daşky gurşawyň stimullary bilen kesgitlenýändigini düşünmek we fermentatiw işjeňligi kesgitlemek üçin ulanyldy. Glikanlaryň we ksilanlaryň anyklanan dürli gurluşlarynyň käbirine pektin (P), ksilan (X), mannan (M), ksiloglukanlar (XylG), garyşyk baglanyşyk glýukanlary (MLG), arabinoksilan (ArbX), galaktomannan (GalG), glýukuron turşusy-arabinoksilan (GArbX) we arabino-galaktan (ArbG) girýär29.
Şeýle-de bolsa, şu ylmy-barlag işleriniň ählisine garamazdan, diňe birnäçe gözleg ýokary gaty ýük (HSL) gidrolizi wagtynda oligosaharidleriň toplanmagynyň tebigatyna, şol sanda oligosaharidleriň bölünip çykmagyna, gidroliz wagtynda oligomer zynjyrynyň uzynlygynyň üýtgemegine, dürli pes DP polimerlerine we olaryň egrilerine gönükdirilendir. paýlanmalar 30,31,32. Şol bir wagtyň özünde, glikan analiziniň glikan gurluşynyň toplumlaýyn analizi üçin peýdaly gural bolup çykandygyna garamazdan, suwda ereýän pes DP oligosaharidlerini antitel usullary arkaly bahalandyrmak kyn. Molekulýar agramy 5-10 kDa-dan az bolan kiçi DP oligosaharidleri ELISA plastinkalaryna 33, 34 baglanmaýar we antitel goşulmazdan öň ýuwulýar.
Bu ýerde, ilkinji gezek, biz ereýän refrakter oligosaharidler üçin bir tapgyrly biotinilleşdirme prosedurasyny glikom analizi bilen birleşdirýän monoklonal antitelalary ulanyp, awidin bilen örtülen plastinkalarda ELISA synagyny görkezýäris. Glikom analizine çemeleşmegimiz gidrolizlenen şeker düzümleriniň trimetilsilil (TMS) türewleşdirilmegini ulanyp, MALDI-TOF-MS we GC-MS esasynda goşmaça oligosaharid baglanyşyklarynyň analizi bilen tassyklanyldy. Bu innowasion çemeleşme geljekde ýokary öndürijilikli usul hökmünde işlenip düzülip, ​​biolukmançylyk barlaglarynda has giň ulanylyş tapyp bilner35.
Fermentleriň we antitelalaryň glikozilleşme ýaly terjimeden soňky üýtgeşmeleri,36 olaryň biologik işjeňligine täsir edýär. Mysal üçin, syworotka beloklarynyň glikozilleşmesindäki üýtgeşmeler iltihaply artritde möhüm rol oýnaýar we glikozilleşmedäki üýtgeşmeler diagnostiki alamatlar hökmünde ulanylýar37. Edebiýatda dürli glikanlaryň aşgazan-içege ýolunyň we bagyryň dowamly iltihaply kesellerinde, wirus infeksiýalarynda, ýumurtgalyklaryň, döşüň we prostata rak kesellerinde 38,39,40 ýaly dürli kesellerde aňsatlyk bilen ýüze çykýandygy habar berildi. Antitela esasly glikan ELISA usullaryny ulanyp, glikanlaryň gurluşyny düşünmek, çylşyrymly MS usullaryny ulanmazdan keseli anyklamakda goşmaça ynam döreder.
Öňki gözlegimizde berk oligosaharidleriň öňünden işlenilenden we fermentatiw gidrolizden soň gidrolizlenmän galandygy görkezildi (1-nji surat). Öň çap edilen işimizde, AFEX bilen öňünden işlenilen mekgejöwen pyçak gidrolizatyndan (ACSH)8 oligosaharidleri bölüp almak üçin aktiwleşdirilen kömüriň gaty fazaly ekstraksiýa usulyny işläp düzdik. Ilkinji ekstraksiýadan we bölünenden soň, oligosaharidler ölçegleri aýyrmak hromatografiýasy (SEC) arkaly has köp fraksiýalaşdyryldy we molekulýar agramynyň tertibinde ýygnaldy. Dürli öňünden işlenilenden bölünip çykan şeker monomerleri we oligomerler şeker düzüminiň seljermesi arkaly seljerildi. Dürli öňünden işlenilen usullar bilen alnan şeker oligomerleriniň mazmunyny deňeşdirende, berk oligosaharidleriň bolmagy biomassanyň monosaharidlere öwrülmeginde umumy mesele bolup durýar we şekeriň hasyllylygynyň azyndan 10-15% we hatda 18% çenli azalmagyna getirip biler. ABŞ-da bu usul oligosaharid fraksiýalarynyň mundan beýläk-de uly möçberde öndürilmegi üçin ulanylýar. Netijede dörän ACH we ondan soňky dürli molekulýar agramly fraksiýalar bu işde oligosaharidleriň häsiýetnamasy üçin tejribe materialy hökmünde ulanyldy.
Öňünden işlenilen we fermentatiw gidrolizlenenden soň, dowamly oligosaharidler gidrolizlenmedik galdy. Bu ýerde (A) oligosaharidleri aktiwleşdirilen kömür we diatom topragyň gaplanan gatlagy arkaly AFEX bilen öňünden işlenilen mekgejöwen gidrolizatyndan (ACSH) bölünip alýan oligosaharidleri bölmek usuly; (B) Oligosaharidleri bölmek usuly. Oligosaharidler ölçegleri aýyrmak hromatografiýasy (SEC) arkaly has-da bölündi; (C) Dürli öňünden işlenilenlerden bölünip çykýan saharid monomerleri we oligomerleri (suýulan kislota: DA, ion suwuklygy: IL we AFEX). Fermentatiw gidroliz şertleri: 25% (w/w) (takmynan 8% glýukan ýüklenmesi) ýokary gaty maddalaryň ýüklenmesi, 96 sagat gidroliz, 20 mg/g täjirçilik ferment ýüklenmesi (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 gatnaşygy) we (D) AFEX öňünden işlenen mekgejöwen ojagyndan (ACS) bölünip çykýan glýukozanyň, ksilozanyň we arabinozanyň şeker monomerleri we oligomerleri.
Glikan analizi gaty biomassa galyndylaryndan bölünip alnan ekstraktlardaky glikanlaryň toplumlaýyn gurluş analizi üçin peýdaly gural bolup çykdy. Şeýle-de bolsa, bu däp bolan usuly ulanmak bilen suwda ereýän saharidler az görkezilýär41, sebäbi pes molekulýar agramly oligosaharidleri ELISA plastinkalarynda hereketsizleşdirmek kyn we antitel goşulmazdan öň ýuwulýar. Şonuň üçin, antitel baglanyşygy we häsiýetlendirmesi üçin, awidin bilen örtülen ELISA plastinkalarynda ereýän, laýyk gelmeýän oligosaharidleri örtmek üçin bir ädimli biotinilleşdirme usuly ulanyldy. Bu usul öň öndürilen ACSH we onuň molekulýar agramyna (ýa-da polimerleşme derejesine, DP) esaslanýan bölegi ulanyp synagdan geçirildi. Bir ädimli biotinilleşdirme uglewodyň gaýtaryjy ujuna biotin-LC-gidrazidi goşmak arkaly oligosaharid baglanyş ýakynlygyny ýokarlandyrmak üçin ulanyldy (2-nji surat). Eritmede gaýtaryjy ujundaky hemiasetal topar biotin-LC-gidrazidiň gidrazid topary bilen reaksiýa girip, gidrazon baglanyşygyny emele getirýär. NaCNBH3 reduksasiýa agentiniň gatnaşmagynda gidrazon baglanyşygy durnukly biotinleşdirilen soňky önüme öwrülýär. Şeker reduksasiýa ediji ujunyň üýtgedilmegi bilen, pes DP oligosaharidleriniň ELISA plastinkalaryna baglanmagy mümkin boldy we biziň gözlegimizde bu glikan nyşana alnan mAbs ulanyp, awidin bilen örtülen plastinkalarda edildi.
Biotinleşdirilen oligosaharidler üçin ELISA esasynda monoklonal antitelalaryň skriningi. Bu ýerde (A) oligosaharidleriň utgaşdyrylan biotinilleşdirilmegi we soňra NeutrAvidin bilen örtülen plastinkalarda glikan nyşana alnan mAbs bilen ELISA skriningi we (B) reaksiýa önümleriniň biotinilleşdirilmegi üçin bir ädimli prosedura görkezilýär.
Oligosaharid bilen birleşdirilen antitelalary bolan Awidin bilen örtülen plastinkalar soňra esasy we ikinji derejeli antitelalara goşuldy we ýagtylyga we wagta duýgur gurşawda ýuwuldy. Antitela baglanyşygy tamamlanandan soň, plastinkany inkubasiýa etmek üçin TMB substratyny goşuň. Reaksiýa ahyrsoňy kükürt kislotasy bilen togtadyldy. Inkubasiýa edilen plastinkalar antitelalara mahsus özara baglanyşygy ýüze çykarmak üçin her bir antitela baglanyş güýjüni kesgitlemek maksady bilen ELISA okaýjysy arkaly seljerildi. Tejribäniň jikme-jiklikleri we parametrleri üçin degişli "Materiallar we usullar" bölümine serediň.
Biz ACSH-da, şeýle hem lignosellyuloz gidrolizatlardan bölünip alnan çig we arassalanan oligosakkarid fraksiýalarynda bar bolan ereýän oligosakkaridleri häsiýetlendirmek arkaly bu täze işlenip düzülen usulyň belli bir ulanylyşlar üçin peýdalydygyny görkezýäris. 3-nji suratda görkezilişi ýaly, bioasillenen glikom synag usullaryny ulanyp ACSH-da anyklanan iň köp duş gelýän epitop bilen çalşyrylan ksilanlar adatça uron (U) ýa-da metiluron (MeU) we pektik arabinogalaktanlardyr. Olaryň köpüsi gidrolizlenmedik gaty maddalaryň (UHS) glikanlarynyň analizi boýunça öňki gözlegimizde hem tapyldy43.
Öýjük diwarynyň glikanyna gönükdirilen monoklonal antitela ulanyp, ters hereket edýän oligosaharid epitoplaryny ýüze çykarmak. "Neýtral" fraksiýa ACN fraksiýasy, "kislotaly" fraksiýa bolsa FA fraksiýasydyr. Gyzgynlyk kartasyndaky has ýagty gyzyllar epitopyň ýokary mukdaryny, has ýagty gök reňkler bolsa boş fony görkezýär. Şkaladaky reňk gymmatlyklary N=2 formulalary üçin çig OD gymmatlyklaryna esaslanýar. Antitela tarapyndan tanalýan esasy epitoplar sag tarapda görkezilen.
Bu sellýuloza däl gurluşlary synagdan geçirilen täjirçilik ferment garyndysyndaky iň köp ýaýran sellýulozalar we gemisellulazalar bölüp bilmedi, bu garyndy iň köp ulanylýan täjirçilik fermentlerini öz içine alýar. Şonuň üçin olaryň gidrolizi üçin täze kömekçi fermentler gerek. Zerur sellýuloza däl goşmaça fermentler bolmasa, bu sellýuloza däl baglanyşyklar, hatda olaryň esasy şeker polimerleri has gysga böleklere giňden gidrolizlenip, täjirçilik ferment garyndylary arkaly eredilse-de, monosaharidlere doly öwrülmeginiň öňüni alýar.
Signal paýlanyşynyň we onuň baglanyş güýjüniň mundan beýläk öwrenilmegi, baglanyş epitoplarynyň ýokary DP şeker fraksiýalarynda (A, B, C, DP 20+ çenli) dimerlerde pes DP fraksiýalaryna (D, E, F, DP) garanyňda has pesdigini görkezdi (1-nji surat). Kislota bölekleri selýuloza däl epitoplarda neýtral böleklere garanyňda has köp duş gelýär. Bu hadysalar öňki gözlegimizde syn edilen nusga bilen gabat gelýär, onda ýokary DP we kislota bölekleri fermentatiw gidrolize has çydamlydy. Şonuň üçin selýuloza däl glikan epitoplarynyň we U we MeU orunbasarlarynyň bolmagy oligosaharidleriň durnuklylygyna uly goşant goşup biler. Baglanyş we anyklaýyş netijeliliginiň pes DP oligosaharidleri üçin, esasanam epitop dimerik ýa-da trimerik oligosaharid bolsa, problema döredip biljekdigini bellemeli. Muny dürli uzynlykdaky täjirçilik oligosaharidlerini ulanyp synagdan geçirip bolýar, her biri belli bir mAb-a baglanýan diňe bir epitopy öz içine alýar.
Şeýlelik bilen, gurluşa mahsus antitelalaryň ulanylmagy belli bir görnüşli ters baglanyşyklary ýüze çykardy. Ulanylýan antitela görnüşine, degişli ligasiýa nusgasyna we öndürýän signalyň güýjüne (iň köp we iň az mukdarda) baglylykda, täze fermentleri anyklap we has doly glikokonwersiýa üçin ferment garyndysyna ýarym mukdarda goşup bolýar. Mysal hökmünde ACSH oligosaharidleriniň analizini alyp, her bir biokütle materialy üçin glikan baglanyşyklarynyň maglumat bazasyny döredip bileris. Bu ýerde antitelalaryň dürli ýakynlygynyň göz öňünde tutulmalydygyny we olaryň ýakynlygy belli däl bolsa, bu dürli antitelalaryň signallaryny deňeşdirende belli bir kynçylyklary döreder diýip bellemeli. Mundan başga-da, glikan baglanyşyklaryny deňeşdirmek şol bir antitela üçin nusgalaryň arasynda iň gowy işläp biler. Soňra bu berk baglanyşyklary CAZyme maglumat bazasyna baglanyşdyryp bolýar, şondan biz fermentleri anyklap, kandidat fermentleri saýlap we baglanyşygy bozýan fermentleri synagdan geçirip ýa-da biorefineriýa zawodlarynda ulanmak üçin bu fermentleri ekspressiýa etmek üçin mikrob ulgamlaryny işläp düzüp bileris44.
Immunologiki usullaryň lignosellyuloza gidrolizatlarynda bar bolan pes molekulýar agramly oligosaharidleri häsiýetlendirmek üçin alternatiw usullary nähili doldurýandygyny bahalandyrmak üçin, biz şol bir panelde (5-nji surat) GC-MS esasynda TMS-den alynýan saharidleriň MALDI (4-nji surat, S1-S8) we analizini geçirdik. MALDI oligosaharid molekulalarynyň massa paýlanyşynyň niýetlenen gurluşa laýyk gelýändigini deňeşdirmek üçin ulanylýar. 4-nji suratda ACN-A we ACN-B neýtral komponentleriniň MS-i görkezilýär. ACN-A analizi DP 4-8-den (4-nji surat) DP 22-ä (S1-nji surat) çenli pentoza şekerleriniň toplumyny tassyklady, olaryň agramlary MeU-ksilan oligosaharidlerine gabat gelýär. ACN-B analizi DP 8-15 bilen pentoza we glýukoksilan tapgyryny tassyklady. S3 surat ýaly goşmaça materiallarda FA-C kislotaly bölek massa paýlanyş kartalary ELISA esasyndaky mAb barlagynda tapylan çalyşylan ksilanlar bilen gabat gelýän DP 8-15 bolan (Me)U çalşyrylan pentoza şekerleriniň diapazonyny görkezýär. Epitoplar yzygiderli.
ACS-de bar bolan ereýän laýyk gelmeýän oligosaharidleriň MALDI-MS spektri. Bu ýerde, (A) metillenen uron turşusyny (DP 4-8) orunbasar glýukuroksilan oligosaharidlerini öz içine alýan ACN-A pes agramly fraksiýalary we (B) glýukuroksilan bilen orunbasar ACN-B ksilan we metillenen uron turşusy oligosaharidleri (DP 8-15).
Refrakter oligosaharidleriň glikan galyndysynyň düzüminiň seljermesi. Bu ýerde (A) GC-MS analizi arkaly alnan dürli oligosaharid fraksiýalarynyň TMS saharid düzümi. (B) Oligosaharidlerde bar bolan dürli TMS-den alynýan şekerleriň gurluşlary. ACN – neýtral oligosaharidleri öz içine alýan asetonitril fraksiýasy we FA – kislota oligosaharidleri öz içine alýan ferul turşusy fraksiýasy.
S9 suratda görkezilişi ýaly, oligosaharid fraksiýasynyň LC-MS analizinden başga bir gyzykly netije çykaryldy (usullary elektron goşmaça materiallarda görmek bolýar). ACN-B fraksiýasynyň baglanmagy wagtynda geksoza we -OAc toparlarynyň bölekleri gaýta-gaýta syn edildi. Bu açyş diňe bir glikom we MALDI-TOF analizinde syn edilen böleklenmäni tassyklamak bilen çäklenmän, eýsem öňünden işlenen lignosellyuloz biomassasyndaky mümkin bolan uglewod türewleri barada täze maglumat berýär.
Şeýle hem, biz TMS glikan deriwatizasiýasyny ulanyp, oligosaharid fraksiýalarynyň glikan düzüminiň analizini geçirdik. GC-MS ulanyp, biz oligosaharid fraksiýasyndaky nerw (deriwat däl) we kislotaly şekerleriň (GluA we GalA) düzümini kesgitledik (5-nji surat). Glýukuron turşusy kislotaly C we D komponentlerinde, galakturon turşusy bolsa kislotaly şekerleriň ýokary DP komponentleri bolan A we B kislotaly komponentlerinde tapylýar. Bu netijeler diňe bir biziň ELISA we MALDI maglumatlarymyzy tassyklamak bilen çäklenmän, eýsem oligosaharidleriň toplanmagy baradaky öňki barlaglarymyz bilen hem gabat gelýär. Şonuň üçin, biz oligosaharidleriň biotinilleşdirilmegini we soňraky ELISA barlagyny ulanýan häzirki zaman immunologiki usullaryň dürli biologik nusgalarda ereýän kalsitrant oligosaharidleri ýüze çykarmak üçin ýeterlikdigine ynanýarys.
ELISA esasyndaky mAb skrining usullary birnäçe dürli usullar bilen tassyklanandygy sebäpli, biz bu täze mukdary usulyň mümkinçiliklerini has-da öwrenmek isledik. Iki sany täjirçilik oligosaharidleri, ksilogeksasaharid oligosaharid (XHE) we 23-α-L-arabinofuranosil-ksilotrioza (A2XX) satyn alyndy we öýjük diwarynyň glikanyna gönükdirilen täze mAb usuly arkaly synagdan geçirildi. 6-njy suratda biotinleşdirilen baglanyşyk signaly bilen oligosaharid konsentrasiýasynyň log konsentrasiýasynyň arasyndaky çyzykly korrelýasiýa görkezilýär, bu bolsa mümkin bolan Langmuir adsorbsiýa modelini görkezýär. mAbs-laryň arasynda CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 we CCRC-M151 XHE bilen, CCRC-M108, CCRC-M109 we LM11 bolsa 1 nm-den 100 nano aralygynda A2XX bilen korrelýasiýa edildi. Synag wagtynda antitelalaryň elýeterliliginiň çäkli bolmagy sebäpli, her bir oligosakkarid konsentrasiýasy bilen çäkli synaglar geçirildi. Bu ýerde käbir antitelalaryň substrat hökmünde şol bir oligosakkaride örän dürli reaksiýa berýändigini bellemek gerek, sebäbi olar birneme tapawutly epitoplara baglanýar we örän dürli baglanyş gatnaşyklaryna eýe bolup bilýärler. Täze mAb çemeleşmesi hakyky nusgalara ulanylanda, epitoplary takyk kesgitlemegiň mehanizmleri we netijeleri has çylşyrymly bolar.
Dürli glikan nyşana alýan mAb-laryň anyklaýyş aralygyny kesgitlemek üçin iki sany täjirçilik oligosaharid ulanyldy. Bu ýerde, oligosaharid konsentrasiýasynyň log konsentrasiýasy bilen çyzykly korrelýasiýalar (A) mAb bilen XHE we (B) mAb bilen A2XX üçin Lengmuir adsorbsiýa nusgalaryny görkezýär. Degişli epitoplar synagda substrat hökmünde ulanylan täjirçilik oligosaharidleriniň gurluşlaryny görkezýär.
Glikan nyşana alnan monoklonal antitelalaryň ulanylmagy (glikokomik analiz ýa-da ELISA esasyndaky mAb skriningi) ösümlik biomassasyny düzýän esasy öýjük diwar glikanlarynyň köpüsini çuňňur häsiýetlendirmek üçin güýçli guraldyr. Şeýle-de bolsa, klassiki glikan analizi diňe has uly öýjük diwar glikanlaryny häsiýetlendirýär, sebäbi oligosaharidleriň köpüsi ELISA plastinkalarynda netijeli immobilizasiýa edilmeýär. Bu barlagda AFEX bilen öňünden işlenen mekgejöwen otu ýokary gaty maddalaryň düzüminde fermentatiw gidroliz edildi. Gidrolizatdaky ters hereket edýän öýjük diwar uglewodlarynyň düzümini kesgitlemek üçin şeker analizi ulanyldy. Şeýle-de bolsa, gidrolizatlardaky kiçi oligosaharidleriň mAb analizi kem baha berilýär we ELISA plastinkalaryndaky oligosaharidleri netijeli immobilizasiýa etmek üçin goşmaça gurallar gerek.
Biz bu ýerde NeutrAvidin™ örtülen plastinkalarda oligosaharid biotinilleşdirilmegini we soňra ELISA skriningini utgaşdyrmak arkaly mAb skriningi üçin täze we netijeli oligosaharid immobilizasiýa usulyny habar berýäris. Immobilizirlenen biotinilleşdirilen oligosaharidler, ters hereket edýän oligosaharidleri çalt we netijeli anyklamaga mümkinçilik berýän antitela üçin ýeterlik derejede ýakynlyk görkezdi. Bu berk oligosaharidleriň düzüminiň massa spektrometriýasyna esaslanýan seljermesi immunskriningiň bu täze usulynyň netijelerini tassyklady. Şeýlelik bilen, bu barlaglar oligosaharid biotinilleşdirilmeginiň we ELISA skrininginiň glikan nyşana alnan monoklonal antitela bilen utgaşdyrylmagynyň oligosaharidlerdäki özara baglanyşyklary anyklamak üçin ulanylyp bilinjekdigini we oligosaharidleriň gurluşyny häsiýetlendirýän beýleki biohimiki barlaglarda giňden ulanylyp bilinjekdigini görkezýär.
Bu biotin esasyndaky glikan profilleme usuly ösümlik biomassasyndaky ereýän oligosaharidleriň ters uglewod baglanyşyklaryny öwrenmäge ukyply ilkinji hasabatdyr. Bu biomassanyň käbir bölekleriniň bioýangyç öndürmekde näme üçin şeýle berk durýandygyny düşünmäge kömek edýär. Bu usul glikom analiz usullarynda möhüm boşlugy doldurýar we onuň ulanylyşyny ösümlik oligosaharidlerinden başga-da has giň substratlara giňeldýär. Geljekde biz biotinilleşdirmek üçin robot tehnikasyny ulanyp bileris we ELISA ulanyp nusgalaryň ýokary öndürijilikli analizi üçin işläp düzen usulymyzy ulanyp bileris.
Pioneer 33A14 gibrid tohumlaryndan ösdürilip ýetişdirilen mekgejöwen samany (KS) 2010-njy ýylda Kolorado ştatynyň Reý şäherindäki Kramer fermalaryndan ýygnaldy. Ýer eýesiniň rugsady bilen bu biokütle ylmy-barlag üçin ulanylyp bilner. Nusgalar otagyň temperaturasynda zip-lock haltalarda gurak we 6% -den az çyglylykda saklandy. Nusgalar otagyň temperaturasynda zip-lock haltalarda gurak we 6% -den az çyglylykda saklandy. Об чинцы хранились сухим при влажности <6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной шее. Nusgalar otag temperaturasynda fermuarly haltalarda <6% çyglylykda gurak ýagdaýda saklandy.样品在室温下以干燥 <6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥 <6% Об кацы хранят в пакетх с застежкой-молнией при комнатной че с влажностью <6%. Nusgalar fermuarly haltalarda otagyň temperaturasynda, çyglylyk < 6% bolan ýagdaýda saklanýar.Bu gözleg ýerli we milli görkezmelere laýyk geldi. Kompozisiýa seljermesi NREL protokoly arkaly geçirildi. Kompozisiýanyň düzüminde 31,4% glýukan, 18,7% ksilan, 3,3% arabinan, 1,2% galaktan, 2,2% asetil, 14,3% lignin, 1,7% belok we 13,4% kül bardygy anyklandy.
Cellic® CTec2 (138 mg belok/ml, lot VCNI 0001) Novozymes (Franklinton, NC, ABŞ) kompaniýasyndan selýulaza, β-glýukozidaza we Cellic® HTec2 (157 mg belok/ml, lot VHN00001) garyndysydyr. Pektini dargadýan fermentleriň çylşyrymly garyndysy bolan Multifect Pectinase® (72 mg belok/ml) DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, ABŞ) tarapyndan sowgat berildi. Ferment belogynyň konsentrasiýalary Kjeldahl azot analizini (AOAC usuly 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, ABŞ) ulanyp, belogyň mukdaryny kesgitlemek (we belog däl azotyň goşandyny aýyrmak) arkaly kesgitlenildi. Diatomaceous earth 545 EMD Millipore (Billerica, MA) kompaniýasyndan satyn alyndy. Aktiwleşdirilen kömür (DARCO, 100 mesh granulalar), Awicel (PH-101), buk ksilan we beýleki ähli himiki maddalar Sigma-Aldrich (Sent-Luis, MO) kompaniýasyndan satyn alyndy.
AFEX öňünden işleniş GLBRC-de (Biomassa konwersiýa barlaghanasy, MSU, Lansing, MI, ABŞ) geçirildi. Öňünden işleniş 140° C-da 15 minutlap geçirildi. Suwsuz ammiagyň biomassa bilen 1:1 gatnaşygynda, 60% (w/w) ýüklenme bilen, poslamaýan polatdan ýasalan stol üsti tapgyrlaýyn reaktorda (Parr Instruments Company) 46 minut saklandy. Bu 30 minut wagt aldy. Reaktor 140°C-a getirildi we ammiak çalt çykaryldy, bu bolsa biomassanyň otagyň temperaturasyna çalt gaýdyp gelmegine mümkinçilik berdi. AFEX öňünden işlenilen mekgejöwen peçiniň (ACS) düzümi işlenilmedik mekgejöwen peçiniň (UT-CS) düzümine meňzeýärdi.
Oligosaharidleriň uly möçberde öndürilmegi üçin başlangyç material hökmünde ýokary derejeli gaty maddalar ACSH 25% (w/w) (takmynan 8% dekstran ýüklenmesi) taýýarlanyldy. ACS-iň fermentatiw gidrolizi Cellic® Ctec2 10 mg belok/g glýukan (öňünden işlenen biomassada), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg belok/g glýukan we Multifect Pectinase (Genencor Inc, ABŞ) öz içine alýan täjirçilik ferment garyndysy ulanylyp geçirildi. Enzimatik gidroliz 3 litr iş göwrümi, pH 4.8, 50°C we 250 aýlaw/minut bolan 5 litrlik bioreaktorda geçirildi. 96 sagat gidrolizden soň, gidrolizat gidrolizlenmedik gaty maddalary aýyrmak üçin 6000 aýlaw/minutda 30 minutlap, soňra 14000 aýlaw/minutda 30 minutlap santrifuga arkaly ýygnaldy. Soňra gidrolizat 0,22 mm süzgüç stakan arkaly steril süzgüçden geçirildi. Süzgüçden geçirilen gidrolizat steril çüýşelerde 4°C temperaturada saklandy we soňra uglerodda fraksiýalaşdyryldy.
NREL laboratoriýasynyň analiz usullaryna laýyklykda ekstrakt esasynda biomassa nusgalarynyň düzümini analiz etmek: nusgalary düzüm seljermesi üçin taýýarlamak (NREL/TP-510-42620) we biomassadaky gurluş uglewodlaryny we lignini kesgitlemek (NREL/TP-510 – 42618)47.
Gidrolizat akymynyň oligosakkarid analizi awtoklaw esasly kislota gidroliz usuly arkaly 2 ml ölçegde geçirildi. Gidrolizat nusgasyny 10 ml-lik burçly gapakly medeniýet turbasynda 69,7 µl 72% kükürt turşusy bilen garyşdyryň we 121 °C-da stol üstünde 1 sagatlap inkubasiýa ediň, buzda sowadyň we ýokary öndürijilikli suwuk hromatografiýa (HPLC) flakonyna süzüň. Oligosakkaridleriň konsentrasiýasy gidrolizlenmedik nusgadaky monosaharidleriň konsentrasiýasyny kislota-gidrolizlenen nusgadaky umumy şeker konsentrasiýasyndan aýyrmak arkaly kesgitlenildi.
Kislota gidrolizlenen biomassadaky glýukoza, ksiloza we arabinoza konsentrasiýalary Bio-Rad Aminex HPX-87H sütununda awtosampler, sütun gyzdyryjy, izokratik nasos we döwülme görkeziji detektory bilen enjamlaşdyrylan Shimadzu HPLC ulgamy arkaly seljerildi. Sütun 50°C-de saklandy we suw akymynda 0,6 ml/min 5 mM H2SO4 bilen elýut edildi.
Gidrolizat üstki gatlagy suwuklandyryldy we monomer we oligosaharid mukdary boýunça seljerildi. Fermentatiw gidrolizden soň alnan monomer şekerler Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P sütün we kül gorag sütün bilen enjamlaşdyrylan HPLC arkaly seljerildi. Sütün temperaturasy 80°C-de saklandy, suw hereketli faza hökmünde 0,6 ml/min akym tizligi bilen ulanyldy. Oligosaharidler 41, 48, 49 salgylanmalarynda beýan edilen usullara laýyklykda 121°C-de suwuklandyrylan kislotada gidroliz arkaly kesgitlenildi.
Saharid analizi çig, AFEX öňünden işlenen we gidrolizlenmedik ähli biomassa galyndylarynda (seriýaly öýjük diwar ekstraktlarynyň önümçiligi we olaryň mAb skriningi bilen birlikde) öň beýan edilen usullar 27, 43, 50, 51 ulanylyp geçirildi. Glikom analizi üçin ösümlik öýjük diwar materialynyň spirtde eremeýän galyndylary biomassa galyndylaryndan taýýarlanylýar we öň beýan edilşi ýaly ammonium oksalat (50 mM), natriý karbonat (50 mM we 0,5% w/v), CON (1M we 4M, ikisi hem 1% w/v natriý borohidrid bilen) we kislota hlorit ýaly barha agressiw reagentler bilen seriýaly ekstraksiýa sezewar edilýär52,53. Soňra ekstraktlar öýjük diwar glikanyna gönükdirilen mAb50-leriň çylşyrymly paneline garşy ELISA-a sezewar edildi we mAb baglanyş reaksiýalary ýylylyk kartasy hökmünde görkezildi. Ösümlik öýjük diwar glikanyna gönükdirilen mAblar laboratoriýa ätiýaçlyklaryndan (CCRC, JIM we MAC seriýalary) satyn alyndy.
Oligosaharidleriň bir tapgyrly biotinilleşdirilmegi. Uglewodlaryň biotin-LC-gidrazid bilen birleşdirilmegi aşakdaky usul arkaly amala aşyryldy. Biotin-LC-gidrazid (4,6 mg/12 μmol) dimetil sulfoksidde (DMSO, 70 μl) güýçli garyşdyryp we 65°C-da 1 minutlap gyzdyryp eredildi. Buz sirkesi turşusy (30 µl) goşuldy we garyndy natriý sianoborohidridiniň (6,4 mg/100 µmol) üstüne guýuldy we 65°C-da takmynan 1 minutlap gyzdyrylandan soň doly eredildi. Soňra, reaksiýa garyndysynyň 5-den 8 μl-e çenli bölegi guradylan oligosaharidiň üstüne (1-100 nmol) goşulyp, ýazgynyň azaldyjy ujundan 10 esse ýa-da ondan köp molar artykmaçlygy alyndy. Reaksiýa 65°C-da 2 sagatlap geçirildi, şondan soň nusgalar derrew arassalanyldy. Etiketleme tejribelerinde reduksasiýa edilmezden natriý sianoborohidridi ulanylmady we nusgalar 65°C-de 2,5 sagatlap reaksiýa geçirildi.
Biotinleşdirilen oligosaharidleriň nusgalaryny ELISA bilen örtmek we ýuwmak. Awidin bilen örtülen plastinkanyň her bir guýusyna 25 μl biotinleşdirilen nusgalar (her bir konsentrirlenen nusganyň 100 μl-i 0,1 M Tris bufer ergininiň (TBS) 5 ml-inde eredildi) goşuldy. Gözegçilik guýulary 0,1 M TBS-de 10 μg/ml konsentrasiýasynda 50 μl biotin bilen örtildi. Boş ölçegler üçin örtük hökmünde deionlaşdyrylan suw ulanyldy. Tabletka otagyň temperaturasynda garaňky ýerde 2 sagatlap inkubasiýa edildi. Grenier flat 3A üçin 11-nji programmany ulanyp, plastinkany 0,1 M TBS-de 0,1% ýagsyz süýt bilen 3 gezek ýuwuň.
Esasy antitelalary goşmak we ýuwmak. Her bir guýuja 40 µl esasy antitela goşuň. Mikroplastinany otagyň temperaturasynda garaňky ýerde 1 sagatlap inkubasiýa ediň. Soňra plastinalar Grenier Flat 3A üçin 11-nji ýuwuş programmasyny ulanyp, 0,1% süýt bilen 0,1 M TBS-de 3 gezek ýuwuldy.
Ikinji derejeli antitela goşuň we ýuwuň. Her bir guýuja 50 µl syçan/syçan ikinji derejeli antitela goşuň (0,1 M TBS-de 0,1% süýtde 1:5000 eredildi). Mikroplastinany otagyň temperaturasynda garaňky ýerde 1 sagatlap inkubasiýa ediň. Soňra mikroplastinalar Grenier Flat 5A plastinka ýuwujy programmasy #12 ulanylyp, 0,1% süýt bilen 0,1 M TBS-de 5 gezek ýuwuldy.
Substrat goşmak. Esasy substrata 50 µl 3,3',5,5'-tetrametilbenzidin (TMB) goşuň (15 ml deionlaşdyrylan suwa 2 damja bufer, 3 damja TMB, 2 damja wodorod peroksidi goşmak arkaly). TMB substratyny taýýarlaň. we ulanmazdan öň vorteks ediň). Mikroplastinany otag temperaturasynda 30 minutlap inkubasiýa ediň. Garaňky ýerde.
Bu ädimi tamamlaň we tabletkany okaň. Her guýuja 50 µl 1 N kükürt kislotasyny goşuň we ELISA okaýjysyny ulanyp, 450-den 655 nm-e çenli absorbsiýany ýazyň.
Bu analizatorlaryň 1 mg/ml erginlerini deionizirlenen suwda taýýarlaň: arabinoza, ramnoza, fukoza, ksiloza, galakturon turşusy (GalA), glýukuron turşusy (GlcA), mannoza, glýukoza, galaktoza, laktoza, N-asetilmannozamin (manNAc), N-asetilglýukozamin. (glcNAc), N-asetilgalaktozamin (galNAc), inozitol (içki standart). 1-nji tablisada görkezilen 1 mg/ml şeker erginlerini goşmak arkaly iki standart taýýarlanyldy. Nusgalar ähli suw aýrylýança (adatça takmynan 12-18 sagat) -80°C temperaturada doňdurylýar we liofilizlenýär.
Analitik terazide gapakly turbalary burab goýmak üçin 100–500 µg nusga goşuň. Goşulan mukdary ýazyň. Nusgany belli bir konsentrasiýadaky erijide eredip, ony turba suwuklyk hökmünde goşmak iň gowusydyr. Her nusga turbasy üçin içki standart hökmünde 20 µl 1 mg/ml inozitol ulanyň. Nusga goşulan içki standartyň mukdary standart turba goşulan içki standartyň mukdaryna deň bolmalydyr.
Gaply flakona 8 ml suwsuz metanol goşuň. Soňra 4 ml 3 N metanol HCl erginini goşuň, gapagyny ýapyň we çaýkaň. Bu prosesde suw ulanylmaýar.
Oligosaharid nusgalaryna we standart TMS turbalaryna 500 µl 1 M HCl metanol erginini goşuň. Nusgalar 80° C temperaturada bir gije (168 sagat) termal blokda inkubasiýa edildi. Metanoliz önümini guradyjy kollektor arkaly otag temperaturasynda guradyň. 200 µl MeOH goşuň we ýene-de guradyň. Bu proses iki gezek gaýtalanýar. Nusga 200 µl metanol, 100 µl piridin we 100 µl sirke anhidridi goşuň we gowy garyşdyryň. Nusgalary otag temperaturasynda 30 minut inkubasiýa ediň we guradyň. 200 µl metanol goşuň we ýene-de guradyň.
200 µl Tri-Sil goşuň we gapakly turbany 20 minutlap gyzdyryň. 80°C, soňra otag temperaturasyna çenli sowadyň. Nusgany takmynan 50 µl göwrümde guratmak üçin guradyjy kollektor ulanyň. Nusgalaryň doly guramagyna ýol bermedikdigimizi bellemek möhümdir.
2 ml geksan goşuň we woteksläp gowy garyşdyryň. Pasteur pipetkalarynyň (5-8 mm) ujuny 5-3/4 dýuým diametrli pipetkanyň üstüne aýna ýüňüni goýup, aýna ýüňünden bir bölek dolduryň. Nusgalar 3000 g-da 2 minutlap santrifuga edildi. Eremeýän galyndylaryň hemmesi çökýär. Nusgany 100-150 µl çenli guradyň. GC-MS-e başlangyç temperatura 80 °C we başlangyç 2,0 minutda takmynan 1 µl göwrümde guýuldy (2-nji tablisa).