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Nuovi metodi immunologici e spettrometrici di massa per l'analisi complessa di oligosaccaridi persistenti in stocchi di mais pretrattati con AFEX. La biomassa lignocellulosica rappresenta un'alternativa sostenibile ai combustibili fossili ed è ampiamente utilizzata per lo sviluppo di biotecnologie per la produzione di prodotti come alimenti, mangimi, combustibili e prodotti chimici. La chiave di queste tecnologie è lo sviluppo di processi competitivi in ​​termini di costi per la conversione dei carboidrati complessi presenti nelle pareti cellulari vegetali in zuccheri semplici come glucosio, xilosio e arabinosio. Poiché la biomassa lignocellulosica è molto ostinata, deve essere sottoposta a trattamenti termochimici (ad esempio, esfoliazione delle fibre con ammoniaca (AFEX), acidi diluiti (DA), liquidi ionici (IL)) e biologici (ad esempio, idrolisi enzimatica e fermentazione microbica) in combinazione per ottenere il prodotto desiderato. Tuttavia, quando nel processo di idrolisi si utilizzano enzimi fungini commerciali, solo il 75-85% degli zuccheri solubili formati sono monosaccaridi, mentre il restante 15-25% è costituito da oligosaccaridi solubili e intrattabili, non sempre disponibili per i microrganismi. In precedenza, abbiamo isolato e purificato con successo oligosaccaridi solubili ostinati utilizzando una combinazione di separazione di carbone e terra di diatomee e cromatografia ad esclusione dimensionale, e ne abbiamo anche studiato le proprietà inibitorie enzimatiche. Abbiamo scoperto che gli oligosaccaridi contenenti sostituzioni di acido uronico metilato con un grado di polimerizzazione (DP) più elevato sono più difficili da processare con miscele di enzimi commerciali rispetto agli oligosaccaridi a basso DP e neutri. In questo articolo descriviamo l'utilizzo di diversi metodi aggiuntivi, tra cui la profilazione dei glicani mediante anticorpi monoclonali (mAb) specifici per i glicani della biomassa vegetale per caratterizzare i legami glicanici nelle pareti cellulari vegetali e negli idrolizzati enzimatici, la ionizzazione a desorbimento laser assistito da matrice e la spettrometria di massa a tempo di volo. La spettroscopia MALDI-TOF-MS (MALDI-TOF-MS) utilizza picchi diagnostici informativi sulla struttura ottenuti mediante spettroscopia dopo decadimento secondario di ioni negativi, gascromatografia e spettrometria di massa (GC-MS) per caratterizzare i legami oligosaccaridici con e senza derivatizzazione. A causa delle piccole dimensioni degli oligosaccaridi (DP 4–20), queste molecole sono difficili da utilizzare per il legame e la caratterizzazione degli anticorpi monoclonali. Per superare questo problema, abbiamo applicato un nuovo metodo di immobilizzazione degli oligosaccaridi basato sulla coniugazione con biotina che ha marcato con successo la maggior parte degli oligosaccaridi solubili a basso DP sulla superficie della micropiastra, che è stata poi utilizzata in un sistema di anticorpi monoclonali ad alta produttività per l'analisi di ligazione specifica. Questo nuovo metodo faciliterà in futuro lo sviluppo di analisi del glicoma ad alto rendimento più avanzate, che potranno essere utilizzate per isolare e caratterizzare gli oligosaccaridi presenti nei biomarcatori a fini diagnostici.
La biomassa lignocellulosica, composta da materiali agricoli, forestali, erbacei e legnosi, è una potenziale materia prima per la produzione di prodotti biologici, tra cui alimenti, mangimi, combustibili e precursori chimici per la produzione di prodotti a valore aggiunto1. I carboidrati (come cellulosa ed emicellulosa) presenti nelle pareti cellulari vegetali vengono depolimerizzati in monosaccaridi mediante processi chimici e biotrasformazione (come l'idrolisi enzimatica e la fermentazione microbica). I pretrattamenti più comuni includono l'espansione delle fibre di ammoniaca (AFEX), l'acido diluito (DA), il liquido ionico (IL) e l'esplosione di vapore (SE), che utilizzano una combinazione di sostanze chimiche e calore per ridurre la produzione di lignocellulosa aprendo le pareti cellulari vegetali3,4. ostinazione della materia, 5. L'idrolisi enzimatica viene effettuata ad alto carico di solidi utilizzando enzimi commerciali contenenti carboidrati attivi (CAZymes) e la fermentazione microbica utilizzando lieviti o batteri transgenici per produrre combustibili e prodotti chimici a base biologica6.
I CAZymes negli enzimi commerciali sono composti da una miscela complessa di enzimi che scindono sinergicamente i legami complessi carboidrati-zuccheri per formare monosaccaridi2,7. Come riportato in precedenza, la complessa rete di polimeri aromatici di lignina con i carboidrati li rende altamente intrattabili, il che porta a una conversione incompleta degli zuccheri, con l'accumulo del 15-25% di oligosaccaridi sessuali che non vengono prodotti durante l'idrolisi enzimatica della biomassa pretrattata. Questo è un problema comune con vari metodi di pretrattamento della biomassa. Alcune cause di questo collo di bottiglia includono l'inibizione enzimatica durante l'idrolisi, oppure l'assenza o i bassi livelli di enzimi essenziali necessari per rompere i legami degli zuccheri nella biomassa vegetale. Comprendere la composizione e le caratteristiche strutturali degli zuccheri, come i legami degli zuccheri negli oligosaccaridi, ci aiuterà a migliorare la conversione degli zuccheri durante l'idrolisi, rendendo i processi biotecnologici competitivi in ​​termini di costi rispetto ai prodotti derivati ​​dal petrolio.
Determinare la struttura dei carboidrati è impegnativo e richiede una combinazione di metodi come la cromatografia liquida (LC)11,12, la spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR)13, l'elettroforesi capillare (CE)14,15,16 e la spettrometria di massa (MS)17,18. Metodi di MS come la spettrometria di massa a tempo di volo con desorbimento laser e ionizzazione su matrice (MALDI-TOF-MS) rappresentano un metodo versatile per l'identificazione delle strutture dei carboidrati. Recentemente, la MS tandem con dissociazione indotta da collisione (CID) di addotti di ioni sodio è stata ampiamente utilizzata per identificare impronte digitali corrispondenti alle posizioni di attacco degli oligosaccaridi, alle configurazioni anomeriche, alle sequenze e alle posizioni di ramificazione 20, 21.
L'analisi dei glicani è un ottimo strumento per l'identificazione approfondita dei legami dei carboidrati22. Questo metodo utilizza anticorpi monoclonali (mAb) diretti contro il glicano della parete cellulare vegetale come sonde per comprendere i legami complessi dei carboidrati. Sono disponibili in tutto il mondo oltre 250 mAb, progettati contro vari oligosaccaridi lineari e ramificati utilizzando vari saccaridi24. Diversi mAb sono stati ampiamente utilizzati per caratterizzare la struttura, la composizione e le modificazioni della parete cellulare vegetale, poiché vi sono differenze significative a seconda del tipo di cellula vegetale, dell'organo, dell'età, dello stadio di sviluppo e dell'ambiente di crescita25,26. Più recentemente, questo metodo è stato utilizzato per comprendere le popolazioni di vescicole nei sistemi vegetali e animali e il loro rispettivo ruolo nel trasporto dei glicani, determinato da marcatori subcellulari, stadi di sviluppo o stimoli ambientali, e per determinare l'attività enzimatica. Alcune delle diverse strutture di glicani e xilani che sono state identificate includono la pectina (P), lo xilano (X), il mannano (M), gli xiloglucani (XylG), i glucani a legame misto (MLG), l'arabinoxilano (ArbX), il galattomannano (GalG), l'acido glucuronico-arabinoxilano (GArbX) e l'arabino-galattano (ArbG)29.
Tuttavia, nonostante tutti questi sforzi di ricerca, solo pochi studi si sono concentrati sulla natura dell'accumulo di oligosaccaridi durante l'idrolisi ad alto carico di solidi (HSL), incluso il rilascio di oligosaccaridi, le variazioni di lunghezza della catena oligomerica durante l'idrolisi, vari polimeri a basso DP e le loro curve di distribuzione 30,31,32. Nel frattempo, sebbene l'analisi dei glicani si sia dimostrata uno strumento utile per un'analisi completa della struttura dei glicani, è difficile valutare gli oligosaccaridi a basso DP idrosolubili utilizzando metodi anticorpali. Gli oligosaccaridi a DP più piccoli con un peso molecolare inferiore a 5-10 kDa non si legano alle piastre ELISA 33, 34 e vengono lavati via prima dell'aggiunta di anticorpi.
In questo articolo, per la prima volta, dimostriamo un saggio ELISA su piastre rivestite di avidina utilizzando anticorpi monoclonali, combinando una procedura di biotinilazione in un unico passaggio per oligosaccaridi refrattari solubili con l'analisi del glicoma. Il nostro approccio all'analisi del glicoma è stato convalidato mediante analisi basata su MALDI-TOF-MS e GC-MS dei legami oligosaccaridici complementari mediante derivatizzazione con trimetilsilile (TMS) di composizioni zuccherine idrolizzate. Questo approccio innovativo può essere sviluppato in futuro come metodo ad alta produttività e trovare una più ampia applicazione nella ricerca biomedica35.
Le modificazioni post-traduzionali di enzimi e anticorpi, come la glicosilazione,36 ne influenzano l'attività biologica. Ad esempio, i cambiamenti nella glicosilazione delle proteine ​​sieriche svolgono un ruolo importante nell'artrite infiammatoria e vengono utilizzati come marcatori diagnostici37. In letteratura è stato riportato che vari glicani compaiono facilmente in una varietà di patologie, tra cui malattie infiammatorie croniche del tratto gastrointestinale e del fegato, infezioni virali, tumori ovarici, mammari e prostatici38,39,40. La comprensione della struttura dei glicani mediante metodi ELISA basati su anticorpi fornirà ulteriore sicurezza nella diagnosi delle malattie senza l'uso di complessi metodi di spettroscopia a spettroscopia multipla.
Il nostro studio precedente ha dimostrato che gli oligosaccaridi ostinati rimanevano non idrolizzati dopo il pretrattamento e l'idrolisi enzimatica (Figura 1). Nel nostro lavoro precedentemente pubblicato, abbiamo sviluppato un metodo di estrazione in fase solida con carbone attivo per isolare gli oligosaccaridi dall'idrolizzato di stocchi di mais (ACSH) pretrattato con AFEX8. Dopo l'estrazione e la separazione iniziali, gli oligosaccaridi sono stati ulteriormente frazionati mediante cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC) e raccolti in ordine di peso molecolare. I monomeri e gli oligomeri di zucchero rilasciati da vari pretrattamenti sono stati analizzati mediante analisi della composizione degli zuccheri. Confrontando il contenuto di oligomeri di zucchero ottenuti con vari metodi di pretrattamento, la presenza di oligosaccaridi ostinati è un problema comune nella conversione della biomassa in monosaccaridi e può portare a una riduzione della resa zuccherina di almeno il 10-15% e persino fino al 18%. Questo metodo viene utilizzato per l'ulteriore produzione su larga scala di frazioni di oligosaccaridi. L'ACH risultante e le sue frazioni successive con diversi pesi molecolari sono state utilizzate come materiale sperimentale per la caratterizzazione degli oligosaccaridi in questo lavoro.
Dopo il pretrattamento e l'idrolisi enzimatica, gli oligosaccaridi persistenti sono rimasti non idrolizzati. Qui (A) è riportato un metodo di separazione degli oligosaccaridi in cui gli oligosaccaridi vengono isolati dall'idrolizzato di stocchi di mais (ACSH) pretrattato con AFEX utilizzando un letto compatto di carbone attivo e terra di diatomee; (B) Metodo per la separazione degli oligosaccaridi. Gli oligosaccaridi sono stati ulteriormente separati mediante cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC); (C) Monomeri e oligomeri di saccaridi rilasciati da vari pretrattamenti (acido diluito: DA, liquido ionico: IL e AFEX). Condizioni di idrolisi enzimatica: elevato carico di solidi del 25% (p/p) (circa l'8% di carico di glucano), idrolisi di 96 ore, carico di enzima commerciale di 20 mg/g (rapporto Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) e (D) Monomeri di zucchero e oligomeri di glucosio, xilosio e arabinosio rilasciati dallo stover di mais pretrattato con AFEX (ACS).
L'analisi dei glicani si è dimostrata uno strumento utile per un'analisi strutturale completa dei glicani in estratti isolati da residui di biomassa solida. Tuttavia, i saccaridi idrosolubili sono sottorappresentati utilizzando questo metodo tradizionale41 poiché gli oligosaccaridi a basso peso molecolare sono difficili da immobilizzare sulle piastre ELISA e vengono eliminati con il lavaggio prima dell'aggiunta dell'anticorpo. Pertanto, per il legame e la caratterizzazione degli anticorpi, è stato utilizzato un metodo di biotinilazione in un unico passaggio per rivestire gli oligosaccaridi solubili e non conformabili su piastre ELISA rivestite con avidina. Questo metodo è stato testato utilizzando il nostro ACSH precedentemente prodotto e una frazione basata sul suo peso molecolare (o grado di polimerizzazione, DP). La biotinilazione in un unico passaggio è stata utilizzata per aumentare l'affinità di legame degli oligosaccaridi aggiungendo biotina-LC-idrazide all'estremità riducente del carboidrato (Fig. 2). In soluzione, il gruppo emiacetalico all'estremità riducente reagisce con il gruppo idrazidico di biotina-LC-idrazide per formare un legame idrazone. In presenza dell'agente riducente NaCNBH3, il legame idrazone viene ridotto a un prodotto finale biotinilato stabile. Modificando l'estremità riducente dello zucchero, è diventato possibile il legame di oligosaccaridi a basso DP alle piastre ELISA, e nel nostro studio questo è stato effettuato su piastre rivestite con avidina utilizzando anticorpi monoclonali mirati ai glicani.
Screening di anticorpi monoclonali basato su ELISA per oligosaccaridi biotinilati. Qui (A) biotinilazione combinata di oligosaccaridi e successivo screening ELISA con anticorpi monoclonali mirati ai glicani su piastre rivestite con NeutrAvidin e (B) mostra una procedura monofase per la biotinilazione dei prodotti di reazione.
Piastre rivestite di avidina con anticorpi coniugati a oligosaccaridi sono state quindi aggiunte agli anticorpi primari e secondari e lavate in un terreno fotosensibile e temporizzato. Una volta completato il legame dell'anticorpo, è stato aggiunto il substrato TMB per incubare la piastra. La reazione è stata infine bloccata con acido solforico. Le piastre incubate sono state analizzate utilizzando un lettore ELISA per determinare la forza di legame di ciascun anticorpo e rilevare eventuali legami crociati anticorpo-specifici. Per dettagli e parametri dell'esperimento, vedere la sezione corrispondente "Materiali e Metodi".
Dimostriamo l'utilità di questo metodo di recente sviluppo per applicazioni specifiche caratterizzando gli oligosaccaridi solubili presenti nell'ACSH e nelle frazioni di oligosaccaridi grezzi e purificati isolati da idrolizzati lignocellulosici. Come mostrato in Figura 3, gli xilani con epitopo sostituito più comuni identificati nell'ACSH utilizzando metodi di analisi del glicoma bioacilato sono solitamente arabinogalattani uronici (U) o metiluronici (MeU) e pectici. La maggior parte di essi è stata riscontrata anche nel nostro precedente studio sull'analisi dei glicani di solidi non idrolizzati (UHS)43.
Rilevamento di epitopi oligosaccaridici recalcitranti mediante un anticorpo monoclonale diretto contro il glicano della parete cellulare. La frazione "neutra" è la frazione ACN e la frazione "acida" è la frazione FA. I rossi più brillanti sulla mappa di calore indicano un contenuto di epitopi più elevato, mentre i blu più brillanti indicano uno sfondo vuoto. I valori di colore sulla scala si basano sui valori grezzi di OD per le formulazioni N=2. I principali epitopi riconosciuti dagli anticorpi sono mostrati a destra.
Queste strutture non cellulosiche non potevano essere scisse dalle cellulasi ed emicellulasi più comuni nella miscela enzimatica commerciale testata, che include gli enzimi commerciali più comunemente utilizzati. Pertanto, sono necessari nuovi enzimi ausiliari per la loro idrolisi. Senza i necessari enzimi accessori non cellulosici, questi legami non cellulosici impediscono la completa conversione in monosaccaridi, anche se i loro polimeri di zucchero originali vengono ampiamente idrolizzati in frammenti più corti e disciolti utilizzando miscele enzimatiche commerciali.
Ulteriori studi sulla distribuzione del segnale e sulla sua forza di legame hanno mostrato che gli epitopi di legame erano inferiori nelle frazioni zuccherine ad alto DP (A, B, C, DP fino a 20+) rispetto alle frazioni a basso DP (D, E, F, DP) nei dimeri (Fig. 1). I frammenti acidi sono più comuni negli epitopi non cellulosici rispetto ai frammenti neutri. Questi fenomeni sono coerenti con il modello osservato nel nostro studio precedente, dove le frazioni acide e ad alto DP erano più resistenti all'idrolisi enzimatica. Pertanto, la presenza di epitopi glicanici non cellulosici e di sostituzioni U e MeU può contribuire notevolmente alla stabilità degli oligosaccaridi. Va notato che l'efficienza di legame e di rilevamento può essere problematica per gli oligosaccaridi a basso DP, soprattutto se l'epitopo è un oligosaccaride dimerico o trimerico. Questo può essere testato utilizzando oligosaccaridi commerciali di diverse lunghezze, ciascuno contenente un solo epitopo che si lega a uno specifico mAb.
Pertanto, l'uso di anticorpi strutturalmente specifici ha rivelato alcuni tipi di legami recalcitranti. A seconda del tipo di anticorpo utilizzato, del pattern di legame appropriato e dell'intensità del segnale prodotto (più o meno abbondante), è possibile identificare nuovi enzimi e aggiungerli semiquantitativamente alla miscela enzimatica per una glicoconversione più completa. Prendendo come esempio l'analisi degli oligosaccaridi ACSH, è possibile creare un database di legami glicanici per ciascun materiale di biomassa. È importante notare che è necessario tenere conto della diversa affinità degli anticorpi e, se la loro affinità è sconosciuta, ciò creerà alcune difficoltà nel confrontare i segnali di diversi anticorpi. Inoltre, il confronto dei legami glicanici può funzionare meglio tra campioni per lo stesso anticorpo. Questi legami recalcitranti possono quindi essere collegati al database CAZyme, da cui è possibile identificare gli enzimi, selezionare enzimi candidati e testare gli enzimi che rompono i legami, oppure sviluppare sistemi microbici per esprimere questi enzimi per l'uso nelle bioraffinerie44.
Per valutare come i metodi immunologici integrino metodi alternativi per la caratterizzazione degli oligosaccaridi a basso peso molecolare presenti negli idrolizzati lignocellulosici, abbiamo eseguito l'analisi MALDI (Fig. 4, S1-S8) e l'analisi dei saccaridi derivati ​​da TMS basata su GC-MS sullo stesso pannello (Fig. 5) di oligosaccaridi. L'analisi MALDI viene utilizzata per confrontare se la distribuzione in massa delle molecole di oligosaccaridi corrisponde alla struttura desiderata. La Fig. 4 mostra la spettroscopia a spettroscopia (MS) dei componenti neutri ACN-A e ACN-B. L'analisi di ACN-A ha confermato un intervallo di zuccheri pentosi che va da DP 4–8 (Fig. 4) a DP 22 (Fig. S1), i cui pesi corrispondono agli oligosaccaridi MeU-xilano. L'analisi di ACN-B ha confermato la serie di pentosi e glucoxilano con DP 8-15. In materiale supplementare come la Figura S3, le mappe di distribuzione di massa della frazione acida FA-C mostrano un intervallo di zuccheri pentosi sostituiti con (Me)U con una DP di 8-15, coerente con gli xilani sostituiti riscontrati nello screening con anticorpi monoclonali (mAb) basato su ELISA. Gli epitopi sono coerenti.
Spettro MALDI-MS degli oligosaccaridi solubili non conformabili presenti nelle ACS. Qui, (A) frazioni a basso peso molecolare di ACN-A contenenti oligosaccaridi glucurossilanici sostituiti con acido uronico metilato (DP 4-8) e (B) oligosaccaridi xilani e acido uronico metilato sostituiti con glucurossilanico (DP 8-15) di ACN-B.
Analisi della composizione del residuo glicano di oligosaccaridi refrattari. Qui (A) Composizione saccaridica TMS di varie frazioni di oligosaccaridi ottenuta mediante analisi GC-MS. (B) Strutture di vari zuccheri derivati ​​da TMS presenti negli oligosaccaridi. ACN – frazione di acetonitrile contenente oligosaccaridi neutri e FA – frazione di acido ferulico contenente oligosaccaridi acidi.
Un'altra conclusione interessante è stata tratta dall'analisi LC-MS della frazione oligosaccaridica, come mostrato in Figura S9 (i metodi sono disponibili nel materiale supplementare elettronico). Frammenti di gruppi esosi e -OAc sono stati ripetutamente osservati durante la legatura della frazione ACN-B. Questo risultato non solo conferma la frammentazione osservata nell'analisi del glicoma e MALDI-TOF, ma fornisce anche nuove informazioni sui potenziali derivati ​​dei carboidrati nella biomassa lignocellulosica pretrattata.
Abbiamo inoltre eseguito l'analisi della composizione glicanica delle frazioni oligosaccaridiche utilizzando la derivatizzazione glicanica mediante TMS. Utilizzando la GC-MS, abbiamo determinato la composizione degli zuccheri neurali (non derivati) e acidi (GluA e GalA) nella frazione oligosaccaridica (Fig. 5). L'acido glucuronico si trova nei componenti acidi C e D, mentre l'acido galatturonico si trova nei componenti acidi A e B, entrambi componenti ad alto DP degli zuccheri acidi. Questi risultati non solo confermano i nostri dati ELISA e MALDI, ma sono anche coerenti con i nostri precedenti studi sull'accumulo di oligosaccaridi. Pertanto, riteniamo che i moderni metodi immunologici che utilizzano la biotinilazione degli oligosaccaridi e il successivo screening ELISA siano sufficienti per rilevare oligosaccaridi solubili recalcitranti in vari campioni biologici.
Poiché i metodi di screening con anticorpi monoclonali (mAb) basati su ELISA sono stati convalidati da diversi metodi, abbiamo voluto esplorare ulteriormente il potenziale di questo nuovo metodo quantitativo. Due oligosaccaridi commerciali, lo xiloesasaccaride oligosaccaride (XHE) e il 23-α-L-arabinofuranosil-xilotriosio (A2XX), sono stati acquistati e testati utilizzando un nuovo approccio con anticorpi monoclonali che ha come bersaglio il glicano della parete cellulare. La Figura 6 mostra una correlazione lineare tra il segnale di legame biotinilato e la concentrazione logaritmica dell'oligosaccaride, suggerendo un possibile modello di adsorbimento di Langmuir. Tra gli anticorpi monoclonali, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 e CCRC-M151 sono risultati correlati con XHE, mentre CCRC-M108, CCRC-M109 e LM11 sono risultati correlati con A2XX in un intervallo di dimensioni compreso tra 1 nm e 100 nanometri. A causa della limitata disponibilità di anticorpi durante l'esperimento, sono stati eseguiti solo pochi esperimenti con ciascuna concentrazione di oligosaccaride. È importante notare che alcuni anticorpi reagiscono in modo molto diverso allo stesso oligosaccaride come substrato, presumibilmente perché si legano a epitopi leggermente diversi e possono avere affinità di legame molto diverse. I meccanismi e le implicazioni di un'identificazione accurata degli epitopi saranno molto più complessi quando il nuovo approccio basato sugli anticorpi monoclonali (mAb) verrà applicato a campioni reali.
Due oligosaccaridi commerciali sono stati utilizzati per determinare l'intervallo di rilevamento di vari anticorpi monoclonali diretti contro i glicani. In questo caso, le correlazioni lineari con la concentrazione logaritmica dell'oligosaccaride indicano i pattern di adsorbimento di Langmuir per (A) XHE con anticorpi monoclonali e (B) A2XX con anticorpi monoclonali. Gli epitopi corrispondenti indicano le strutture degli oligosaccaridi commerciali utilizzati come substrati nel test.
L'uso di anticorpi monoclonali mirati ai glicani (analisi glicocomica o screening con anticorpi monoclonali (mAb) basato su ELISA) è un potente strumento per la caratterizzazione approfondita della maggior parte dei principali glicani della parete cellulare che costituiscono la biomassa vegetale. Tuttavia, l'analisi classica dei glicani caratterizza solo i glicani della parete cellulare più grandi, poiché la maggior parte degli oligosaccaridi non viene immobilizzata efficacemente sulle piastre ELISA. In questo studio, lo stocco di mais pretrattato con AFEX è stato idrolizzato enzimaticamente ad alto contenuto di solidi. L'analisi degli zuccheri è stata utilizzata per determinare la composizione dei carboidrati recalcitranti della parete cellulare nell'idrolizzato. Tuttavia, l'analisi con anticorpi monoclonali (mAb) degli oligosaccaridi più piccoli negli idrolizzati è sottostimata e sono necessari strumenti aggiuntivi per immobilizzare efficacemente gli oligosaccaridi sulle piastre ELISA.
In questo articolo presentiamo un nuovo ed efficiente metodo di immobilizzazione degli oligosaccaridi per lo screening di anticorpi monoclonali (mAb) che combina la biotinilazione degli oligosaccaridi seguita dallo screening ELISA su piastre rivestite con NeutrAvidin™. Gli oligosaccaridi biotinilati immobilizzati hanno mostrato un'affinità sufficiente per l'anticorpo da consentire il rilevamento rapido ed efficiente degli oligosaccaridi recalcitranti. L'analisi della composizione di questi oligosaccaridi ostinati basata sulla spettrometria di massa ha confermato i risultati di questo nuovo approccio all'immunoscreening. Pertanto, questi studi dimostrano che la combinazione di biotinilazione degli oligosaccaridi e screening ELISA con anticorpi monoclonali mirati ai glicani può essere utilizzata per rilevare i crosslink negli oligosaccaridi e può essere ampiamente applicata in altri studi biochimici che caratterizzano la struttura degli oligosaccaridi.
Questo metodo di profilazione dei glicani a base di biotina è il primo studio in grado di studiare i legami carboidrato-recalcitranti degli oligosaccaridi solubili nella biomassa vegetale. Questo aiuta a comprendere perché alcune parti della biomassa siano così ostinate quando si tratta di produzione di biocarburanti. Questo metodo colma un'importante lacuna nei metodi di analisi dei glicomi ed estende la sua applicazione a una gamma più ampia di substrati, oltre agli oligosaccaridi vegetali. In futuro, potremmo utilizzare la robotica per la biotinilazione e utilizzare il metodo che abbiamo sviluppato per l'analisi ad alto rendimento dei campioni mediante ELISA.
La paglia di mais (CS) coltivata da semi ibridi Pioneer 33A14 è stata raccolta nel 2010 presso la Kramer Farms di Ray, Colorado. Con il permesso del proprietario del terreno, questa biomassa può essere utilizzata per la ricerca. I campioni sono stati conservati in sacchetti con chiusura a zip, asciutti, a temperatura ambiente e con umidità < 6%. I campioni sono stati conservati in sacchetti con chiusura a zip, asciutti, a temperatura ambiente e con umidità < 6%. La formazione di succhi di frutta si è congelata con una temperatura < 6% nelle confezioni a temperatura ambiente. I campioni sono stati conservati all'asciutto, a <6% di umidità, in sacchetti con cerniera a temperatura ambiente.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中.Migliori risultati < 6% La temperatura della confezione è elevata con temperatura ambiente < 6%. I campioni vengono conservati in sacchetti con cerniera a temperatura ambiente con umidità < 6%.Lo studio è stato condotto in conformità con le linee guida locali e nazionali. L'analisi composizionale è stata eseguita utilizzando il protocollo NREL. La composizione è risultata contenere il 31,4% di glucano, il 18,7% di xilano, il 3,3% di arabinano, l'1,2% di galattano, il 2,2% di acetile, il 14,3% di lignina, l'1,7% di proteine ​​e il 13,4% di ceneri.
Cellic® CTec2 (138 mg di proteine/ml, lotto VCNI 0001) è una miscela complessa di cellulasi, β-glucosidasi e Cellic® HTec2 (157 mg di proteine/ml, lotto VHN00001) di Novozymes (Franklinton, NC, USA). Multifect Pectinase® (72 mg di proteine/ml), una miscela complessa di enzimi che degradano le pectine, è stata donata da DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, USA). Le concentrazioni proteiche degli enzimi sono state determinate stimando il contenuto proteico (e sottraendo il contributo dell'azoto non proteico) utilizzando l'analisi dell'azoto Kjeldahl (metodo AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA). La terra di diatomee 545 è stata acquistata da EMD Millipore (Billerica, MA). Il carbone attivo (DARCO, granuli da 100 mesh), Avicel (PH-101), lo xilano di faggio e tutti gli altri prodotti chimici sono stati acquistati da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
Il pretrattamento AFEX è stato eseguito presso il GLBRC (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, USA). Il pretrattamento è stato effettuato a 140 °C per 15 minuti. Il tempo di residenza è stato di 46 minuti con un rapporto 1:1 tra ammoniaca anidra e biomassa al 60% (p/p) in un reattore batch da banco in acciaio inossidabile (Parr Instruments Company). Il processo è durato 30 minuti. Il reattore è stato portato a 140 °C e l'ammoniaca è stata rilasciata rapidamente, consentendo alla biomassa di tornare rapidamente a temperatura ambiente. La composizione dello stocco di mais pretrattato con AFEX (ACS) era simile a quella dello stocco di mais non trattato (UT-CS).
ACSH ad alto contenuto di solidi al 25% (p/p) (con un carico di destrano di circa l'8%) è stato preparato come materiale di partenza per la produzione su larga scala di oligosaccaridi. L'idrolisi enzimatica di ACS è stata eseguita utilizzando una miscela enzimatica commerciale contenente Cellic® Ctec2 10 mg di proteine/g di glucano (in biomassa pretrattata), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg di proteine/g di glucano e Multifect Pectinase (Genencor Inc, USA). ). ), 5 mg di proteine/g di destrano. L'idrolisi enzimatica è stata condotta in un bioreattore da 5 litri con un volume di lavoro di 3 litri, pH 4,8, 50 °C e 250 giri/min. Dopo l'idrolisi per 96 ore, l'idrolizzato è stato raccolto mediante centrifugazione a 6000 giri/min per 30 minuti e successivamente a 14000 giri/min per 30 minuti per rimuovere i solidi non idrolizzati. L'idrolizzato è stato quindi sottoposto a filtrazione sterile attraverso un becher filtrante da 0,22 mm. L'idrolizzato filtrato è stato conservato in bottiglie sterili a 4 °C e quindi frazionato su carbone.
Analisi della composizione di campioni di biomassa a base di estratti secondo le procedure di analisi di laboratorio NREL: preparazione di campioni per l'analisi della composizione (NREL/TP-510-42620) e determinazione di carboidrati strutturali e lignina nella biomassa (NREL/TP-510 – 42618)47.
L'analisi degli oligosaccaridi del flusso di idrolizzato è stata eseguita su una scala di 2 ml utilizzando un metodo di idrolisi acida basato su autoclave. Mescolare il campione di idrolizzato con 69,7 µl di acido solforico al 72% in una provetta per coltura con tappo a vite da 10 ml e incubare per 1 ora su un banco a 121 °C, raffreddare in ghiaccio e filtrare in una fiala per cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC). La concentrazione di oligosaccaridi è stata determinata sottraendo la concentrazione di monosaccaridi nel campione non idrolizzato dalla concentrazione totale di zuccheri nel campione idrolizzato con acido.
Le concentrazioni di glucosio, xilosio e arabinosio nella biomassa idrolizzata acida sono state analizzate utilizzando un sistema HPLC Shimadzu dotato di autocampionatore, riscaldatore per colonna, pompa isocratica e rivelatore a indice di rifrazione su una colonna Bio-Rad Aminex HPX-87H. La colonna è stata mantenuta a 50 °C ed eluita con 0,6 ml/min di H₂SO₂ 5 mM in acqua.
Il surnatante dell'idrolizzato è stato diluito e analizzato per il contenuto di monomeri e oligosaccaridi. Gli zuccheri monomerici ottenuti dopo idrolisi enzimatica sono stati analizzati mediante HPLC equipaggiata con una colonna Aminex HPX-87P Bio-Rad (Hercules, CA) e una colonna Ash Guard. La temperatura della colonna è stata mantenuta a 80 °C e l'acqua è stata utilizzata come fase mobile con una portata di 0,6 ml/min. Gli oligosaccaridi sono stati determinati mediante idrolisi in acido diluito a 121 °C secondo i metodi descritti nei riferimenti 41, 48, 49.
L'analisi dei saccaridi è stata eseguita su residui di biomassa grezzi, pretrattati con AFEX e su tutti i residui di biomassa non idrolizzati (inclusa la produzione di estratti seriali di parete cellulare e il relativo screening di mAb) utilizzando procedure precedentemente descritte 27, 43, 50, 51. Per l'analisi del glicoma, i residui insolubili in alcol del materiale della parete cellulare vegetale vengono preparati da residui di biomassa e sottoposti a estrazione seriale con reagenti via via più aggressivi come ossalato di ammonio (50 mM), carbonato di sodio (50 mM e 0,5% p/v), CON. (1M e 4M, entrambi con boroidruro di sodio all'1% p/v) e clorito acido come precedentemente descritto52,53. Gli estratti sono stati quindi sottoposti a ELISA contro un pannello complesso di mAb50 diretti al glicano della parete cellulare e le reazioni di legame di mAb sono state presentate come una mappa di calore. Gli mAb diretti al glicano della parete cellulare vegetale sono stati acquistati da stock di laboratorio (serie CCRC, JIM e MAC).
Biotinilazione in un unico passaggio di oligosaccaridi. La coniugazione dei carboidrati con biotina-LC-idrazide è stata eseguita utilizzando la seguente procedura. La biotina-LC-idrazide (4,6 mg/12 μmol) è stata sciolta in dimetilsolfossido (DMSO, 70 μl) sotto vigorosa agitazione e riscaldamento a 65 °C per 1 minuto. È stato aggiunto acido acetico glaciale (30 μl) e la miscela è stata versata su sodio cianoboroidruro (6,4 mg/100 μmol) e completamente sciolta dopo riscaldamento a 65 °C per circa 1 minuto. Quindi, da 5 a 8 μl della miscela di reazione sono stati aggiunti all'oligosaccaride essiccato (1-100 nmol) per ottenere un eccesso molare di 10 volte o più del marcatore rispetto all'estremità riducente. La reazione è stata condotta a 65 °C per 2 ore, dopodiché i campioni sono stati immediatamente purificati. Non è stato utilizzato cianoboroidruro di sodio negli esperimenti di marcatura senza riduzione e i campioni sono stati fatti reagire a 65 °C per 2,5 ore.
Rivestimento ELISA e lavaggio di campioni di oligosaccaridi biotinilati. 25 μl di campioni biotinilati (100 μl di ciascun campione concentrato diluito in 5 ml di soluzione tampone Tris (TBS) 0,1 M) sono stati aggiunti a ciascun pozzetto della piastra rivestita con avidina. I pozzetti di controllo sono stati rivestiti con 50 μl di biotina a una concentrazione di 10 μg/ml in TBS 0,1 M. Acqua deionizzata è stata utilizzata come rivestimento per le misurazioni del bianco. La compressa è stata incubata per 2 ore a temperatura ambiente al buio. Lavare la piastra 3 volte con latte scremato allo 0,1% in TBS 0,1 M utilizzando il programma n. 11 per Grenier flat 3A.
Aggiunta e lavaggio degli anticorpi primari. Aggiungere 40 µl di anticorpo primario a ciascun pozzetto. Incubare la micropiastra per 1 ora a temperatura ambiente e al buio. Le piastre sono state quindi lavate 3 volte con latte allo 0,1% in TBS 0,1 M utilizzando il programma di lavaggio n. 11 per Grenier Flat 3A.
Aggiungere l'anticorpo secondario e lavare. Aggiungere 50 µl di anticorpo secondario di topo/ratto (diluito 1:5000 in latte allo 0,1% in TBS 0,1 M) a ciascun pozzetto. Incubare la micropiastra per 1 ora a temperatura ambiente e al buio. Le micropiastre sono state quindi lavate 5 volte con latte allo 0,1% in TBS 0,1 M utilizzando il programma di lavaggio per piastre Grenier Flat 5A n. 12.
Aggiunta di un substrato. Aggiungere 50 µl di 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) al substrato base (aggiungendo 2 gocce di tampone, 3 gocce di TMB, 2 gocce di perossido di idrogeno a 15 ml di acqua deionizzata). Preparare il substrato TMB e agitare con vortex prima dell'uso. Incubare la micropiastra a temperatura ambiente per 30 minuti. Al buio.
Completare la fase e leggere la compressa. Aggiungere 50 µl di acido solforico 1 N a ciascun pozzetto e registrare l'assorbanza da 450 a 655 nm utilizzando un lettore ELISA.
Preparare soluzioni a 1 mg/ml dei seguenti analiti in acqua deionizzata: arabinosio, ramnosio, fucosio, xilosio, acido galatturonico (GalA), acido glucuronico (GlcA), mannosio, glucosio, galattosio, lattosio, N-acetilmannosammina (manNAc), N-acetilglucosamina (glcNAc), N-acetilgalattosammina (galNAc), inositolo (standard interno). Sono stati preparati due standard aggiungendo le soluzioni zuccherine a 1 mg/ml mostrate nella Tabella 1. I campioni vengono congelati e liofilizzati a -80° C fino alla completa rimozione dell'acqua (solitamente circa 12-18 ore).
Aggiungere 100-500 µg di campione in provette con tappo a vite su una bilancia analitica. Registrare la quantità aggiunta. È consigliabile sciogliere il campione in una concentrazione specifica di solvente e aggiungerlo alla provetta come aliquota liquida. Utilizzare 20 µl di inositolo 1 mg/ml come standard interno per ogni provetta. La quantità di standard interno aggiunta al campione deve essere uguale alla quantità di standard interno aggiunta alla provetta standard.
Aggiungere 8 ml di metanolo anidro a una fiala con tappo a vite. Quindi aggiungere 4 ml di soluzione metanolica di HCl 3 N, tappare e agitare. Questo processo non richiede l'uso di acqua.
Aggiungere 500 µl di soluzione metanolo 1 M di HCl ai campioni di oligosaccaridi e alle provette standard per TMS. I campioni sono stati incubati per una notte (168 ore) a 80 °C in un blocco termico. Essiccare il prodotto di metanolisi a temperatura ambiente utilizzando un collettore di essiccazione. Aggiungere 200 µl di MeOH e asciugare nuovamente. Questo processo viene ripetuto due volte. Aggiungere 200 µl di metanolo, 100 µl di piridina e 100 µl di anidride acetica al campione e mescolare bene. Incubare i campioni a temperatura ambiente per 30 minuti e lasciarli essiccare. Aggiungere 200 µl di metanolo e asciugare nuovamente.
Aggiungere 200 µl di Tri-Sil e riscaldare la provetta con tappo per 20 minuti. Portare a 80 °C, quindi lasciar raffreddare a temperatura ambiente. Utilizzare un collettore di essiccazione per essiccare ulteriormente il campione fino a un volume di circa 50 µl. È importante notare che non abbiamo lasciato asciugare completamente i campioni.
Aggiungere 2 ml di esano e mescolare bene vortexando. Riempire le punte delle pipette Pasteur (5-8 mm) con un pezzo di lana di vetro inserendola sopra una pipetta di 5-3/4 pollici di diametro. I campioni sono stati centrifugati a 3000 g per 2 minuti. Eventuali residui insolubili sono precipitati. Essiccare il campione a 100-150 µl. Un volume di circa 1 µl è stato iniettato nel GC-MS a una temperatura iniziale di 80 °C e un tempo iniziale di 2,0 minuti (Tabella 2).