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Nuovi metodi immunologici e di spettrometria di massa per l'analisi complessa di oligosaccaridi persistenti in foraggio di mais pretrattato con AFEX.La biomassa lignocellulosica è un'alternativa sostenibile ai combustibili fossili ed è ampiamente utilizzata per sviluppare biotecnologie per la produzione di prodotti come alimenti, mangimi, combustibili e prodotti chimici.La chiave di queste tecnologie è lo sviluppo di processi a costi competitivi per convertire i carboidrati complessi presenti nelle pareti delle cellule vegetali in zuccheri semplici come glucosio, xilosio e arabinosio.Poiché la biomassa lignocellulosica è molto tenace, deve essere sottoposta a trattamenti termochimici (ad esempio, esfoliazione di fibre di ammoniaca (AFEX), acidi diluiti (DA), liquidi ionici (IL)) e trattamenti biologici (ad esempio, idrolisi enzimatica e fermentazione microbica) in combinazione per ottenere il prodotto desiderato..Tuttavia, quando nel processo di idrolisi vengono utilizzati enzimi fungini commerciali, solo il 75-85% degli zuccheri solubili formati sono monosaccaridi e il restante 15-25% sono oligosaccaridi solubili e intrattabili, che non sono sempre disponibili per i microrganismi.In precedenza, abbiamo isolato e purificato con successo oligosaccaridi testardi solubili utilizzando una combinazione di separazione di carbonio e terra di diatomee e cromatografia di esclusione dimensionale, e abbiamo anche studiato le loro proprietà inibitorie degli enzimi.Abbiamo scoperto che gli oligosaccaridi contenenti sostituzioni di acido uronico metilato con grado più elevato di polimerizzazione (DP) sono più difficili da elaborare con miscele di enzimi commerciali rispetto agli oligosaccaridi a bassa DP e neutri.Qui riportiamo l'uso di diversi metodi aggiuntivi, tra cui la profilazione del glicano utilizzando anticorpi monoclonali (mAb) specifici per i glicani della biomassa vegetale per caratterizzare i legami glicani nelle pareti delle cellule vegetali e negli idrolizzati enzimatici, la ionizzazione del desorbimento laser assistita da matrice, la spettrometria di massa a tempo di volo..MALDI-TOF-MS) utilizza picchi diagnostici informativi sulla struttura ottenuti mediante spettroscopia dopo il decadimento secondario di ioni negativi, gascromatografia e spettrometria di massa (GC-MS) per caratterizzare i legami oligosaccaridici con e senza derivatizzazione.A causa delle piccole dimensioni degli oligosaccaridi (DP 4-20), queste molecole sono difficili da utilizzare per il legame e la caratterizzazione degli mAb.Per superare questo problema, abbiamo applicato un nuovo metodo di immobilizzazione dell'oligosaccaride basato sulla coniugazione della biotina che ha etichettato con successo la maggior parte degli oligosaccaridi solubili a bassa DP sulla superficie della micropiastra, che è stata quindi utilizzata in un sistema mAb ad alto rendimento per l'analisi di ligazione specifica.Questo nuovo metodo faciliterà in futuro lo sviluppo di analisi del glicome ad alto rendimento più avanzate che possono essere utilizzate per isolare e caratterizzare gli oligosaccaridi presenti nei biomarcatori a fini diagnostici.
La biomassa lignocellulosica, composta da materiali agricoli, forestali, erbacei e legnosi, è una potenziale materia prima per la produzione di prodotti a base biologica, inclusi alimenti, mangimi, carburanti e precursori chimici per produrre prodotti di valore superiore1.I carboidrati (come la cellulosa e l'emicellulosa) presenti nelle pareti delle cellule vegetali vengono depolimerizzati in monosaccaridi mediante trattamento chimico e biotrasformazione (come l'idrolisi enzimatica e la fermentazione microbica).I pretrattamenti comuni includono l'espansione della fibra di ammoniaca (AFEX), l'acido diluito (DA), il liquido ionico (IL) e l'esplosione di vapore (SE), che utilizzano una combinazione di sostanze chimiche e calore per ridurre la produzione di lignocellulosa aprendo le pareti cellulari delle piante3,4.testardaggine della materia, 5. L'idrolisi enzimatica viene eseguita con un elevato carico di solidi utilizzando enzimi commerciali contenenti carboidrati attivi (CAZymes) e la fermentazione microbica utilizzando lieviti o batteri transgenici per produrre combustibili e prodotti chimici a base biologica 6 .
I CAZymes negli enzimi commerciali sono composti da una complessa miscela di enzimi che scindono sinergicamente legami complessi di carboidrati-zuccheri per formare monosaccaridi2,7.Come riportato in precedenza, la complessa rete di polimeri aromatici di lignina con carboidrati li rende altamente intrattabili, il che porta a una conversione incompleta dello zucchero, accumulando il 15-25% di oligosaccaridi sessuali che non vengono prodotti durante l'idrolisi enzimatica della biomassa pretrattata.Questo è un problema comune con vari metodi di pretrattamento della biomassa.Alcune ragioni di questo collo di bottiglia includono l'inibizione enzimatica durante l'idrolisi o l'assenza o bassi livelli di enzimi essenziali essenziali che sono necessari per rompere i legami di zucchero nella biomassa vegetale.Comprendere la composizione e le caratteristiche strutturali degli zuccheri, come i legami zuccherini negli oligosaccaridi, ci aiuterà a migliorare la conversione degli zuccheri durante l'idrolisi, rendendo i processi biotecnologici competitivi in ​​termini di costi rispetto ai prodotti derivati ​​dal petrolio.
Determinare la struttura dei carboidrati è impegnativo e richiede una combinazione di metodi come la cromatografia liquida (LC)11,12, la spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR)13, l'elettroforesi capillare (CE)14,15,16 e la spettrometria di massa (MS)17.,diciotto.I metodi MS come la spettrometria di massa a tempo di volo con desorbimento laser e ionizzazione utilizzando una matrice (MALDI-TOF-MS) sono un metodo versatile per identificare le strutture dei carboidrati.Recentemente, la MS tandem di dissociazione indotta da collisione (CID) di addotti di ioni sodio è stata ampiamente utilizzata per identificare le impronte digitali corrispondenti alle posizioni di attaccamento degli oligosaccaridi, alle configurazioni anomeriche, alle sequenze e alle posizioni di ramificazione 20, 21 .
L'analisi dei glicani è uno strumento eccellente per l'identificazione approfondita dei legami di carboidrati22.Questo metodo utilizza anticorpi monoclonali (mAb) diretti al glicano della parete cellulare vegetale come sonde per comprendere i legami complessi dei carboidrati.In tutto il mondo sono disponibili più di 250 mAbs, progettati contro vari oligosaccaridi lineari e ramificati utilizzando vari saccaridi24.Diversi mAb sono stati ampiamente utilizzati per caratterizzare la struttura, la composizione e le modifiche della parete cellulare delle piante, poiché vi sono differenze significative a seconda del tipo di cellula vegetale, dell'organo, dell'età, dello stadio di sviluppo e dell'ambiente di crescita25,26.Più recentemente, questo metodo è stato utilizzato per comprendere le popolazioni di vescicole nei sistemi vegetali e animali e i loro rispettivi ruoli nel trasporto di glicani come determinato da marcatori subcellulari, fasi di sviluppo o stimoli ambientali e per determinare l'attività enzimatica.Alcune delle diverse strutture di glicani e xilani che sono state identificate includono pectina (P), xilano (X), mannano (M), xiloglucani (XylG), glucani a legame misto (MLG), arabinoxilano (ArbX), galattomannano (GalG), acido glucuronico-arabinoxilano (GArbX) e arabino-galattano (ArbG)29.
Tuttavia, nonostante tutti questi sforzi di ricerca, solo pochi studi si sono concentrati sulla natura dell'accumulo di oligosaccaridi durante l'idrolisi ad alto carico di solidi (HSL), compreso il rilascio di oligosaccaridi, i cambiamenti della lunghezza della catena oligomerica durante l'idrolisi, vari polimeri a basso DP e le loro curve.distribuzioni 30,31,32.Nel frattempo, sebbene l'analisi dei glicani si sia dimostrata uno strumento utile per un'analisi completa della struttura dei glicani, è difficile valutare gli oligosaccaridi a basso DP solubili in acqua utilizzando metodi anticorpali.Gli oligosaccaridi DP più piccoli con un peso molecolare inferiore a 5-10 kDa non si legano alle piastre ELISA 33, 34 e vengono lavati via prima dell'aggiunta dell'anticorpo.
Qui, per la prima volta, dimostriamo un test ELISA su piastre rivestite di avidina utilizzando anticorpi monoclonali, combinando una procedura di biotinilazione in un'unica fase per oligosaccaridi refrattari solubili con l'analisi del glicome.Il nostro approccio all'analisi del glicome è stato convalidato dall'analisi basata su MALDI-TOF-MS e GC-MS dei collegamenti oligosaccaridici complementari utilizzando la derivatizzazione trimetilsililica (TMS) delle composizioni di zucchero idrolizzato.Questo approccio innovativo può essere sviluppato come metodo ad alto rendimento in futuro e trovare un'applicazione più ampia nella ricerca biomedica35.
Le modificazioni post-traduzionali di enzimi e anticorpi, come la glicosilazione,36 influenzano la loro attività biologica.Ad esempio, i cambiamenti nella glicosilazione delle proteine ​​sieriche svolgono un ruolo importante nell'artrite infiammatoria e i cambiamenti nella glicosilazione sono usati come marcatori diagnostici37.In letteratura è stato riportato che vari glicani compaiono prontamente in una varietà di malattie, comprese le malattie infiammatorie croniche del tratto gastrointestinale e del fegato, le infezioni virali, i tumori ovarici, mammari e prostatici38,39,40.Comprendere la struttura dei glicani utilizzando metodi ELISA basati su anticorpi fornirà ulteriore fiducia nella diagnosi della malattia senza l'uso di metodi MS complessi.
Il nostro studio precedente ha mostrato che gli oligosaccaridi testardi rimanevano non idrolizzati dopo il pretrattamento e l'idrolisi enzimatica (Figura 1).Nel nostro lavoro precedentemente pubblicato, abbiamo sviluppato un metodo di estrazione in fase solida con carbone attivo per isolare gli oligosaccaridi dall'idrolizzato di stufato di mais pretrattato con AFEX (ACSH)8.Dopo l'estrazione e la separazione iniziale, gli oligosaccaridi sono stati ulteriormente frazionati mediante cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC) e raccolti in ordine di peso molecolare.I monomeri e gli oligomeri dello zucchero rilasciati da vari pretrattamenti sono stati analizzati mediante analisi della composizione dello zucchero.Quando si confronta il contenuto di oligomeri di zucchero ottenuti con vari metodi di pretrattamento, la presenza di oligosaccaridi testardi è un problema comune nella conversione della biomassa in monosaccaridi e può portare a una riduzione della resa in zucchero di almeno il 10-15% e anche fino al 18%.NOI.Questo metodo viene utilizzato per l'ulteriore produzione su larga scala di frazioni di oligosaccaridi.L'ACH risultante e le sue successive frazioni con diversi pesi molecolari sono state utilizzate come materiale sperimentale per la caratterizzazione degli oligosaccaridi in questo lavoro.
Dopo il pretrattamento e l'idrolisi enzimatica, gli oligosaccaridi persistenti sono rimasti non idrolizzati.Qui (A) è un metodo di separazione degli oligosaccaridi in cui gli oligosaccaridi sono isolati dall'idrolizzato di stufato di mais pretrattato con AFEX (ACSH) utilizzando un letto impaccato di carbone attivo e farina fossile;(B) Metodo per la separazione degli oligosaccaridi.Gli oligosaccaridi sono stati ulteriormente separati mediante cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC);(C) Monomeri e oligomeri saccaridi rilasciati da vari pretrattamenti (acido diluito: DA, liquido ionico: IL e AFEX).Condizioni di idrolisi enzimatica: elevato carico di solidi del 25% (p/p) (circa 8% di carico di glucano), 96 ore di idrolisi, carico di enzima commerciale di 20 mg/g (rapporto Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) e (D) monomeri di zucchero e oligomeri di glucosio, xilosio e arabinosio rilasciati da AFEX pretrattato stufato di mais (ACS).
L'analisi dei glicani si è dimostrata uno strumento utile per un'analisi strutturale completa dei glicani in estratti isolati da residui di biomassa solida.Tuttavia, i saccaridi idrosolubili sono sottorappresentati utilizzando questo metodo tradizionale41 perché gli oligosaccaridi a basso peso molecolare sono difficili da immobilizzare su piastre ELISA e vengono lavati via prima dell'aggiunta di anticorpi.Pertanto, per il legame e la caratterizzazione degli anticorpi, è stato utilizzato un metodo di biotinilazione in un'unica fase per rivestire oligosaccaridi solubili e non conformi su piastre ELISA rivestite con avidina.Questo metodo è stato testato utilizzando il nostro ACSH precedentemente prodotto e una frazione basata sul suo peso molecolare (o grado di polimerizzazione, DP).La biotinilazione in una fase è stata utilizzata per aumentare l'affinità di legame degli oligosaccaridi aggiungendo biotina-LC-idrazide all'estremità riducente del carboidrato (Fig. 2).In soluzione, il gruppo emiacetalico all'estremità riducente reagisce con il gruppo idrazidico di biotina-LC-idrazide per formare un legame idrazonico.In presenza dell'agente riducente NaCNBH3, il legame idrazonico si riduce a un prodotto finale biotinilato stabile.Con la modifica dell'estremità di riduzione dello zucchero, è diventato possibile il legame di oligosaccaridi DP bassi alle piastre ELISA e nel nostro studio ciò è stato fatto su piastre rivestite di avidina utilizzando mAb mirati al glicano.
Screening di anticorpi monoclonali basato su ELISA per oligosaccaridi biotinilati.Qui (A) ha combinato la biotinilazione degli oligosaccaridi e il successivo screening ELISA con mAb mirati al glicano su piastre rivestite di NeutrAvidin e (B) mostra una procedura in un'unica fase per la biotinilazione dei prodotti di reazione.
Le piastre rivestite di avidina con anticorpi coniugati con oligosaccaridi sono state quindi aggiunte agli anticorpi primari e secondari e lavate in un mezzo sensibile alla luce e al tempo.Dopo che il legame dell'anticorpo è completo, aggiungere il substrato TMB per incubare la piastra.La reazione è stata infine arrestata con acido solforico.Le piastre incubate sono state analizzate utilizzando un lettore ELISA per determinare la forza di legame di ciascun anticorpo per rilevare la reticolazione specifica dell'anticorpo.Per dettagli e parametri dell'esperimento, vedere la sezione corrispondente "Materiali e metodi".
Dimostriamo l'utilità di questo metodo di nuova concezione per applicazioni specifiche caratterizzando gli oligosaccaridi solubili presenti in ACSH così come nelle frazioni di oligosaccaridi grezzi e purificati isolati da idrolizzati lignocellulosici.Come mostrato nella Figura 3, gli xilani sostituiti dall'epitopo più comuni identificati in ACSH utilizzando metodi di analisi del glicome bioacilato sono solitamente uronici (U) o metiluronici (MeU) e arabinogalattani pectici.La maggior parte di essi è stata trovata anche nel nostro precedente studio sull'analisi dei glicani di solidi non idrolizzati (UHS)43.
Rilevazione di epitopi oligosaccaridici recalcitranti utilizzando un anticorpo monoclonale diretto al glicano della parete cellulare.La frazione "neutra" è la frazione ACN e la frazione "acida" è la frazione FA.I rossi più luminosi sulla mappa termica indicano un contenuto di epitopi più elevato e i blu più luminosi indicano uno sfondo vuoto.I valori di colore sulla scala si basano sui valori OD grezzi per le formulazioni N=2.I principali epitopi riconosciuti dagli anticorpi sono mostrati a destra.
Queste strutture non cellulosiche non potevano essere scisse dalle cellulasi ed emicellulasi più comuni nella miscela di enzimi commerciali testata, che include gli enzimi commerciali più comunemente usati.Pertanto, sono necessari nuovi enzimi ausiliari per la loro idrolisi.Senza i necessari enzimi accessori non cellulosici, questi legami non cellulosici impediscono la conversione completa in monosaccaridi, anche se i loro polimeri di zucchero genitore vengono ampiamente idrolizzati in frammenti più corti e sciolti utilizzando miscele di enzimi commerciali.
Ulteriori studi sulla distribuzione del segnale e sulla sua forza di legame hanno mostrato che gli epitopi di legame erano inferiori nelle frazioni di zucchero DP elevate (A, B, C, DP fino a 20+) rispetto alle frazioni DP basse (D, E, F, DP) nei dimeri) (Fig. 1).I frammenti acidi sono più comuni negli epitopi non cellulosici rispetto ai frammenti neutri.Questi fenomeni sono coerenti con il modello osservato nel nostro studio precedente, in cui le frazioni DP e acide elevate erano più resistenti all'idrolisi enzimatica.Pertanto, la presenza di epitopi di glicani non cellulosici e sostituzioni di U e MeU può contribuire notevolmente alla stabilità degli oligosaccaridi.Va notato che l'efficienza di legame e rilevamento può essere problematica per oligosaccaridi DP bassi, specialmente se l'epitopo è un oligosaccaride dimerico o trimerico.Questo può essere testato utilizzando oligosaccaridi commerciali di diverse lunghezze, ciascuno contenente un solo epitopo che si lega a uno specifico mAb.
Pertanto, l'uso di anticorpi specifici per la struttura ha rivelato alcuni tipi di legami recalcitranti.A seconda del tipo di anticorpo utilizzato, del modello di ligazione appropriato e della forza del segnale che produce (più e meno abbondante), è possibile identificare nuovi enzimi e aggiungerli semiquantitativamente alla miscela enzimatica per una glicoconversione più completa.Prendendo come esempio l'analisi degli oligosaccaridi ACSH, possiamo creare un database di legami glicanici per ogni materiale di biomassa.Va notato qui che la diversa affinità degli anticorpi dovrebbe essere presa in considerazione, e se la loro affinità è sconosciuta, ciò creerà alcune difficoltà quando si confrontano i segnali di diversi anticorpi.Inoltre, il confronto dei legami glicani può funzionare meglio tra campioni per lo stesso anticorpo.Questi legami ostinati possono quindi essere collegati al database CAZyme, da cui possiamo identificare gli enzimi, selezionare gli enzimi candidati e testare gli enzimi che rompono i legami o sviluppare sistemi microbici per esprimere questi enzimi per l'uso nelle bioraffinerie44.
Per valutare come i metodi immunologici integrino i metodi alternativi per la caratterizzazione degli oligosaccaridi a basso peso molecolare presenti negli idrolizzati lignocellulosici, abbiamo eseguito MALDI (Fig. 4, S1-S8) e analisi dei saccaridi derivati ​​da TMS basati su GC-MS sullo stesso pannello (Fig. 5) parte oligosaccaridica.MALDI viene utilizzato per confrontare se la distribuzione di massa delle molecole di oligosaccaridi corrisponde alla struttura prevista.Sulla fig.4 mostra MS dei componenti neutri ACN-A e ACN-B.L'analisi ACN-A ha confermato una gamma di zuccheri pentosi che vanno da DP 4–8 (Fig. 4) a DP 22 (Fig. S1), i cui pesi corrispondono agli oligosaccaridi MeU-xylan.L'analisi ACN-B ha confermato le serie pentoso e glucoxilano con DP 8-15.In materiale supplementare come la Figura S3, le mappe di distribuzione di massa della frazione acida FA-C mostrano una gamma di zuccheri pentosi sostituiti (Me) U con un DP di 8-15 che sono coerenti con gli xilani sostituiti trovati nello screening mAb basato su ELISA.Gli epitopi sono coerenti.
Spettro MALDI-MS degli oligosaccaridi solubili non conformi presenti nell'ACS.Qui, (A) ACN-A frazioni di peso ridotto contenenti acido uronico metilato (DP 4-8) sostituito glucurossilano oligosaccaridi e (B) ACN-B xilano e oligosaccaridi di acido uronico metilato sostituiti con glucurossilano (DP 8-15).
Analisi della composizione del residuo glicano di oligosaccaridi refrattari.Qui (A) composizione saccaridica TMS di varie frazioni oligosaccaridiche ottenute utilizzando l'analisi GC-MS.(B) Strutture di vari zuccheri derivati ​​da TMS presenti negli oligosaccaridi.ACN - frazione di acetonitrile contenente oligosaccaridi neutri e FA - frazione di acido ferulico contenente oligosaccaridi acidi.
Un'altra conclusione interessante è stata tratta dall'analisi LC-MS della frazione oligosaccaridica, come mostrato nella Figura S9 (i metodi possono essere visti nel materiale supplementare elettronico).Frammenti di gruppi esosi e -OAc sono stati ripetutamente osservati durante la legatura della frazione ACN-B.Questa scoperta non solo conferma la frammentazione osservata nell'analisi del glicome e MALDI-TOF, ma fornisce anche nuove informazioni sui potenziali derivati ​​dei carboidrati nella biomassa lignocellulosica pretrattata.
Abbiamo anche eseguito l'analisi della composizione del glicano delle frazioni di oligosaccaridi utilizzando la derivatizzazione del glicano TMS.Usando GC-MS, abbiamo determinato la composizione degli zuccheri neurali (non derivati) e acidi (GluA e GalA) nella frazione oligosaccaridica (Fig. 5).L'acido glucuronico si trova nei componenti acidi C e D, mentre l'acido galatturonico si trova nei componenti acidi A e B, entrambi componenti ad alto DP degli zuccheri acidi.Questi risultati non solo confermano i nostri dati ELISA e MALDI, ma sono anche coerenti con i nostri precedenti studi sull'accumulo di oligosaccaridi.Pertanto, riteniamo che i moderni metodi immunologici che utilizzano la biotinilazione degli oligosaccaridi e il successivo screening ELISA siano sufficienti per rilevare oligosaccaridi recalcitranti solubili in vari campioni biologici.
Poiché i metodi di screening degli mAb basati su ELISA sono stati convalidati da diversi metodi, abbiamo voluto esplorare ulteriormente il potenziale di questo nuovo metodo quantitativo.Due oligosaccaridi commerciali, xylohexasaccharide oligosaccharide (XHE) e 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX), sono stati acquistati e testati utilizzando un nuovo approccio mAb mirato al glicano della parete cellulare.La Figura 6 mostra una correlazione lineare tra il segnale di legame biotinilato e la concentrazione logaritmica della concentrazione di oligosaccaridi, suggerendo un possibile modello di adsorbimento di Langmuir.Tra gli mAb, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 e CCRC-M151 correlati con XHE e CCRC-M108, CCRC-M109 e LM11 correlati con A2XX in un intervallo da 1 nm a 100 nano.A causa della limitata disponibilità di anticorpi durante l'esperimento, sono stati eseguiti esperimenti limitati con ciascuna concentrazione di oligosaccaridi.Va notato qui che alcuni anticorpi reagiscono in modo molto diverso allo stesso oligosaccaride come substrato, presumibilmente perché si legano a epitopi leggermente diversi e possono avere affinità di legame molto diverse.I meccanismi e le implicazioni dell'identificazione accurata degli epitopi saranno molto più complessi quando il nuovo approccio mAb verrà applicato a campioni reali.
Sono stati utilizzati due oligosaccaridi commerciali per determinare l'intervallo di rilevamento di vari mAb mirati ai glicani.Qui, le correlazioni lineari con la concentrazione logaritmica della concentrazione di oligosaccaridi indicano i modelli di adsorbimento di Langmuir per (A) XHE con mAb e (B) A2XX con mAb.Gli epitopi corrispondenti indicano le strutture degli oligosaccaridi commerciali usati come substrati nel saggio.
L'uso di anticorpi monoclonali mirati ai glicani (analisi glicocomica o screening mAb basato su ELISA) è un potente strumento per la caratterizzazione approfondita della maggior parte dei principali glicani della parete cellulare che costituiscono la biomassa vegetale.Tuttavia, l'analisi classica dei glicani caratterizza solo i glicani della parete cellulare più grandi, poiché la maggior parte degli oligosaccaridi non è immobilizzata in modo efficiente sulle piastre ELISA.In questo studio, lo stufato di mais pretrattato con AFEX è stato idrolizzato enzimaticamente ad un alto contenuto di solidi.L'analisi dello zucchero è stata utilizzata per determinare la composizione dei carboidrati della parete cellulare recalcitrante nell'idrolizzato.Tuttavia, l'analisi mAb di oligosaccaridi più piccoli negli idrolizzati è sottostimata e sono necessari strumenti aggiuntivi per immobilizzare efficacemente gli oligosaccaridi sulle piastre ELISA.
Riportiamo qui un nuovo ed efficiente metodo di immobilizzazione dell'oligosaccaride per lo screening di mAb combinando la biotinilazione dell'oligosaccaride seguita dallo screening ELISA su piastre rivestite NeutrAvidin™.Gli oligosaccaridi biotinilati immobilizzati hanno mostrato un'affinità sufficiente per l'anticorpo per consentire il rilevamento rapido ed efficiente degli oligosaccaridi recalcitranti.L'analisi della composizione di questi ostinati oligosaccaridi basata sulla spettrometria di massa ha confermato i risultati di questo nuovo approccio all'immunoscreening.Pertanto, questi studi dimostrano che la combinazione di biotinilazione di oligosaccaridi e screening ELISA con anticorpi monoclonali mirati al glicano può essere utilizzata per rilevare i legami incrociati negli oligosaccaridi e può essere ampiamente applicata in altri studi biochimici che caratterizzano la struttura degli oligosaccaridi.
Questo metodo di profilazione dei glicani basato sulla biotina è il primo rapporto in grado di indagare i legami carboidrati recalcitranti degli oligosaccaridi solubili nella biomassa vegetale.Questo aiuta a capire perché alcune parti della biomassa sono così ostinate quando si tratta di produzione di biocarburanti.Questo metodo colma un'importante lacuna nei metodi di analisi del glicome ed estende la sua applicazione a una gamma più ampia di substrati oltre agli oligosaccaridi vegetali.In futuro, potremmo utilizzare la robotica per la biotinilazione e utilizzare il metodo che abbiamo sviluppato per l'analisi ad alto rendimento dei campioni utilizzando ELISA.
La paglia di mais (CS) coltivata da semi ibridi Pioneer 33A14 è stata raccolta nel 2010 da Kramer Farms a Ray, in Colorado.Con il permesso del proprietario terriero, questa biomassa può essere utilizzata per la ricerca. I campioni sono stati conservati asciutti <6% di umidità in sacchetti con chiusura lampo a temperatura ambiente. I campioni sono stati conservati asciutti <6% di umidità in sacchetti con chiusura lampo a temperatura ambiente. Le quantità vengono ridotte al minimo a una temperatura inferiore al 6% in confezione con una temperatura ambiente costante. I campioni sono stati conservati asciutti a <6% di umidità in sacchetti con cerniera a temperatura ambiente.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Le quantità sono contenute nelle confezioni con una temperatura ambiente costante < 6%. I campioni vengono conservati in sacchetti con cerniera a temperatura ambiente con umidità < 6%.Lo studio è conforme alle linee guida locali e nazionali.L'analisi composizionale è stata eseguita utilizzando il protocollo NREL.Si è trovato che la composizione conteneva il 31,4% di glucano, il 18,7% di xilano, il 3,3% di arabinano, l'1,2% di galattano, il 2,2% di acetile, il 14,3% di lignina, l'1,7% di proteine ​​e il 13,4% di ceneri.
Cellic® CTec2 (138 mg proteine/ml, lotto VCNI 0001) è una miscela complessa di cellulasi, β-glucosidasi e Cellic® HTec2 (157 mg proteine/ml, lotto VHN00001) di Novozymes (Franklinton, NC, USA)).Multifect Pectinase® (72 mg di proteine/mL), una miscela complessa di enzimi che degradano la pectina, è stato donato da DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, USA).Le concentrazioni di proteine ​​enzimatiche sono state determinate stimando il contenuto proteico (e sottraendo il contributo dell'azoto non proteico) utilizzando l'analisi dell'azoto Kjeldahl (metodo AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA).La farina fossile 545 è stata acquistata da EMD Millipore (Billerica, MA).Carbone attivo (DARCO, granuli da 100 mesh), Avicel (PH-101), xilano di faggio e tutti gli altri prodotti chimici sono stati acquistati da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
Il pretrattamento AFEX è stato eseguito presso GLBRC (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, USA).Il pretrattamento è stato effettuato a 140°C per 15 minuti.46 tempo di residenza con un rapporto 1:1 di ammoniaca anidra rispetto alla biomassa al 60% (p/p) di carico in un reattore discontinuo da banco in acciaio inossidabile (Parr Instruments Company).Ci sono voluti 30 minuti.Il reattore è stato portato a 140°C e l'ammoniaca è stata rapidamente rilasciata, consentendo alla biomassa di tornare rapidamente a temperatura ambiente.La composizione del fornello di mais pretrattato AFEX (ACS) era simile a quella del fornello di mais non trattato (UT-CS).
ACSH ad alto contenuto di solidi 25% (p/p) (circa l'8% di carico di destrano) è stato preparato come materiale di partenza per la produzione su larga scala di oligosaccaridi.L'idrolisi enzimatica dell'ACS è stata eseguita utilizzando una miscela di enzimi commerciali comprendente Cellic® Ctec2 10 mg di proteine/g glucano (in biomassa pretrattata), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg di proteine/g glucano e Multifect Pectinase (Genencor Inc, USA).).), 5 mg di proteine/g di destrano.L'idrolisi enzimatica è stata effettuata in un bioreattore da 5 litri con un volume di lavoro di 3 litri, pH 4,8, 50°C e 250 rpm.Dopo l'idrolisi per 96 ore, l'idrolizzato è stato raccolto mediante centrifugazione a 6000 rpm per 30 minuti e quindi a 14000 rpm per 30 minuti per rimuovere i solidi non idrolizzati.L'idrolizzato è stato quindi sottoposto a filtrazione sterile attraverso un bicchiere filtrante da 0,22 mm.L'idrolizzato filtrato è stato conservato in bottiglie sterili a 4°C e poi frazionato su carbone.
Analisi della composizione dei campioni di biomassa a base di estratto secondo le procedure di analisi di laboratorio NREL: preparazione dei campioni per l'analisi della composizione (NREL/TP-510-42620) e determinazione dei carboidrati strutturali e della lignina nella biomassa (NREL/TP-510 – 42618)47.
L'analisi degli oligosaccaridi del flusso di idrolizzato è stata eseguita su una scala di 2 ml utilizzando un metodo di idrolisi acida basato su autoclave.Mescolare il campione di idrolizzato con 69,7 ml di acido solforico al 72% in una provetta di coltura con tappo a vite da 10 ml e incubare per 1 ora su un banco a 121 ° C, raffreddare su ghiaccio e filtrare in una fiala per cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC).La concentrazione di oligosaccaridi è stata determinata sottraendo la concentrazione di monosaccaridi nel campione non idrolizzato dalla concentrazione di zucchero totale nel campione idrolizzato con acido.
Le concentrazioni di glucosio, xilosio e arabinosio nella biomassa idrolizzata acida sono state analizzate utilizzando un sistema HPLC Shimadzu dotato di campionatore automatico, riscaldatore della colonna, pompa isocratica e rilevatore di indice di rifrazione su una colonna Bio-Rad Aminex HPX-87H.La colonna è stata mantenuta a 50°C ed eluita con 0,6 ml/min di H2SO4 5 mM in acqua.fluire.
Il surnatante idrolizzato è stato diluito e analizzato per il contenuto di monomeri e oligosaccaridi.Gli zuccheri monomerici ottenuti dopo l'idrolisi enzimatica sono stati analizzati mediante HPLC equipaggiato con una colonna Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P e una colonna di protezione della cenere.La temperatura della colonna è stata mantenuta a 80°C, è stata utilizzata acqua come fase mobile con un flusso di 0,6 ml/min.Gli oligosaccaridi sono stati determinati mediante idrolisi in acido diluito a 121°C secondo i metodi descritti nei rif.41, 48, 49.
L'analisi del saccaride è stata eseguita su residui di biomassa grezzi, pretrattati con AFEX e tutti i residui di biomassa non idrolizzati (compresa la produzione di estratti seriali di pareti cellulari e il loro screening con mAb) utilizzando le procedure descritte in precedenza 27, 43, 50, 51 .Per l'analisi del glicome, i residui insolubili in alcol del materiale della parete cellulare vegetale vengono preparati da residui di biomassa e sottoposti a estrazione seriale con reagenti sempre più aggressivi come ossalato di ammonio (50 mM), carbonato di sodio (50 mM e 0,5% p/v), CON.(1M e 4M, entrambi con boroidruro di sodio 1% p/v) e clorito acido come precedentemente descritto52,53.Gli estratti sono stati quindi sottoposti a ELISA contro un pannello complesso di mAb50 diretti al glicano della parete cellulare e le reazioni di legame mAb sono state presentate come una mappa termica.Gli mAb mirati al glicano della parete cellulare vegetale sono stati acquistati da scorte di laboratorio (serie CCRC, JIM e MAC).
Biotinilazione in un solo passaggio degli oligosaccaridi.La coniugazione dei carboidrati con biotina-LC-idrazide è stata eseguita utilizzando la seguente procedura.La biotina-LC-idrazide (4,6 mg/12 μmol) è stata sciolta in dimetilsolfossido (DMSO, 70 μl) mediante vigorosa agitazione e riscaldamento a 65°C per 1 min.È stato aggiunto acido acetico glaciale (30 µl) e la miscela è stata versata su sodio cianoboroidruro (6,4 mg/100 µmol) e completamente sciolta dopo riscaldamento a 65°C per circa 1 minuto.Quindi, da 5 a 8 μl della miscela di reazione sono stati aggiunti all'oligosaccaride essiccato (1-100 nmol) per ottenere un eccesso molare di 10 volte o più dell'etichetta sull'estremità riducente.La reazione è stata condotta a 65°C per 2 h, dopodiché i campioni sono stati immediatamente purificati.Nessun cianoboroidruro di sodio è stato utilizzato negli esperimenti di etichettatura senza riduzione, e i campioni sono stati fatti reagire a 65°C per 2,5 ore.
Rivestimento ELISA e lavaggio di campioni di oligosaccaridi biotinilati.25 μl di campioni biotinilati (100 μl di ciascun campione concentrato diluito in 5 ml di soluzione tampone Tris 0,1 M (TBS)) sono stati aggiunti a ciascun pozzetto della piastra rivestita con avidina.I pozzetti di controllo sono stati rivestiti con 50 μl di biotina a una concentrazione di 10 μg/ml in 0,1 M TBS.L'acqua deionizzata è stata utilizzata come rivestimento per le misure in bianco.La compressa è stata incubata per 2 ore a temperatura ambiente al buio.Lavare la piastra 3 volte con 0,1% di latte scremato in 0,1 M TBS utilizzando il programma n.11 per Grenier piano 3A.
Aggiunta e lavaggio di anticorpi primari.Aggiungere 40 ml di anticorpo primario in ciascun pozzetto.Incubare la micropiastra per 1 ora a temperatura ambiente al buio.Le piastre sono state quindi lavate 3 volte con lo 0,1% di latte in 0,1 M TBS utilizzando il programma di lavaggio n. 11 per Grenier Flat 3A.
Aggiungere l'anticorpo secondario e lavare.Aggiungere 50 ml di anticorpo secondario topo/ratto (diluito 1:5000 in 0,1% di latte in 0,1 M TBS) in ciascun pozzetto.Incubare la micropiastra per 1 ora a temperatura ambiente al buio.Le micropiastre sono state quindi lavate 5 volte con lo 0,1% di latte in 0,1 M TBS utilizzando il programma di lavaggio per lastre Grenier Flat 5A #12.
Aggiunta di un substrato.Aggiungere 50 µl di 3,3′,5,5′-tetrametilbenzidina (TMB) al substrato di base (aggiungendo 2 gocce di tampone, 3 gocce di TMB, 2 gocce di perossido di idrogeno a 15 ml di acqua deionizzata).Preparare il substrato TMB.e vortice prima dell'uso).Incubare la micropiastra a temperatura ambiente per 30 minuti.Nell'oscurità.
Completa il passaggio e leggi la tavoletta.Aggiungere 50 ml di acido solforico 1 N in ciascun pozzetto e registrare l'assorbanza da 450 a 655 nm utilizzando un lettore ELISA.
Preparare soluzioni da 1 mg/ml di questi analiti in acqua deionizzata: arabinosio, ramnosio, fucosio, xilosio, acido galatturonico (GalA), acido glucuronico (GlcA), mannosio, glucosio, galattosio, lattosio, N-acetilmannosamina (manNAc), N-acetilglucosamina.(glcNAc), N-acetilgalattosamina (galNAc), inositolo (standard interno).Sono stati preparati due standard aggiungendo le soluzioni zuccherine da 1 mg/mL mostrate nella Tabella 1. I campioni vengono congelati e liofilizzati a -80°C fino a quando tutta l'acqua viene rimossa (in genere circa 12-18 ore).
Aggiungere 100–500 µg di campione alle provette con tappo a vite su una bilancia analitica.Registra l'importo aggiunto.È meglio sciogliere il campione in una specifica concentrazione di solvente e aggiungerlo alla provetta come aliquota liquida.Utilizzare 20 ml di 1 mg / ml di inositolo come standard interno per ogni provetta.La quantità di standard interno aggiunta al campione deve essere uguale alla quantità di standard interno aggiunta alla provetta standard.
Aggiungere 8 ml di metanolo anidro in una fiala con tappo a vite.Quindi 4 ml di 3 N. soluzione metanolica di HCl, tappati e agitati.Questo processo non utilizza acqua.
Aggiungere 500 ml di soluzione metanolo 1 M HCl ai campioni di oligosaccaridi e provette TMS standard.I campioni sono stati incubati durante la notte (168 ore) a 80°C in un blocco termico.Essiccare il prodotto di metanolisi a temperatura ambiente utilizzando un collettore di essiccazione.Aggiungere 200 microlitri MeOH e asciugare nuovamente.Questo processo viene ripetuto due volte.Aggiungere 200 ml di metanolo, 100 ml di piridina e 100 ml di anidride acetica al campione e mescolare bene.Incubare i campioni a temperatura ambiente per 30 minuti.ed essiccato.Aggiungere 200 ml di metanolo e asciugare nuovamente.
Aggiungere 200 ml di Tri-Sil e riscaldare la provetta con tappo per 20 minuti.80°C, quindi raffreddato a temperatura ambiente.Utilizzare un collettore di essiccazione per asciugare ulteriormente il campione fino a un volume di circa 50 ml.È importante notare che non abbiamo lasciato asciugare completamente i campioni.
Aggiungere 2 ml di esano e mescolare bene nel Vortex.Riempire le punte delle pipette Pasteur (5-8 mm) con un pezzo di lana di vetro inserendo la lana di vetro sopra una pipetta di diametro 5-3/4 pollici.I campioni sono stati centrifugati a 3000 g per 2 minuti.Eventuali residui insolubili vengono precipitati.Essiccare il campione a 100-150 ml.Un volume di circa 1 μl è stato iniettato nel GC-MS a una temperatura iniziale di 80 °C e un tempo iniziale di 2,0 minuti (Tabella 2).