Tack för att du besöker Nature.com. Webbläsarversionen du använder har begränsat CSS-stöd. För bästa möjliga upplevelse rekommenderar vi att du använder en uppdaterad webbläsare (eller inaktiverar kompatibilitetsläge i Internet Explorer). Under tiden, för att säkerställa fortsatt stöd, kommer vi att rendera webbplatsen utan stilar och JavaScript.
Nya immunologiska och masspektrometriska metoder för komplex analys av persistenta oligosackarider i majsstjärt förbehandlad med AFEX. Lignocellulosisk biomassa är ett hållbart alternativ till fossila bränslen och används i stor utsträckning för att utveckla bioteknik för produktion av produkter som livsmedel, foder, bränslen och kemikalier. Nyckeln till dessa tekniker är utvecklingen av kostnadseffektiva processer för att omvandla komplexa kolhydrater som finns i växtcellväggar till enkla sockerarter som glukos, xylos och arabinos. Eftersom lignocellulosisk biomassa är mycket envis måste den utsättas för termokemiska behandlingar (t.ex. ammoniakfiberexfoliering (AFEX), utspädda syror (DA), joniska vätskor (IL)) och biologiska behandlingar (t.ex. enzymatisk hydrolys och mikrobiell fermentering) i kombination för att erhålla den önskade produkten. Men när kommersiella svampenzymer används i hydrolysprocessen är endast 75–85 % av de lösliga sockerarterna som bildas monosackarider, och de återstående 15–25 % är lösliga, svårhanterliga oligosackarider, som inte alltid är tillgängliga för mikroorganismer. Tidigare har vi framgångsrikt isolerat och renat lösliga envisa oligosackarider med hjälp av en kombination av kol- och kiselgurseparation och storleksuteslutningskromatografi, och även undersökt deras enzymhämmande egenskaper. Vi har funnit att oligosackarider som innehåller metylerade uronsyrasubstitutioner med högre polymerisationsgrad (DP) är svårare att bearbeta med kommersiella enzymblandningar än oligosackarider med låg DP och neutrala oligosackarider. Här rapporterar vi användningen av flera ytterligare metoder, inklusive glykanprofilering med monoklonala antikroppar (mAb) specifika för växtbiomassaglykaner för att karakterisera glykanbindningar i växtcellväggar och enzymatiska hydrolysat, matrisassisterad laserdesorptionjonisering, time-of-flight-masspektrometri. MALDI-TOF-MS) använder strukturinformativa diagnostiska toppar erhållna genom spektroskopi efter sekundär sönderfall av negativa joner, gaskromatografi och masspektrometri (GC-MS) för att karakterisera oligosackaridbindningar med och utan derivatisering. På grund av oligosackaridernas lilla storlek (DP 4–20) är dessa molekyler svåra att använda för mAb-bindning och karakterisering. För att övervinna detta problem tillämpade vi en ny biotinkonjugeringsbaserad oligosackaridimmobiliseringsmetod som framgångsrikt märkte majoriteten av låg-DP-lösliga oligosackarider på mikrotiterplattans yta, vilka sedan användes i ett högkapacitetssystem med mAb för specifik ligeringsanalys. Denna nya metod kommer att underlätta utvecklingen av mer avancerade högkapacitets glykomanalyser i framtiden som kan användas för att isolera och karakterisera oligosackarider som finns i biomarkörer för diagnostiska ändamål.
Lignocellulosabiomassa, bestående av jordbruks-, skogsbruks-, gräs- och trämaterial, är en potentiell råvara för produktion av biobaserade produkter, inklusive livsmedel, foder, bränsle och kemiska prekursorer för att producera produkter med högre värde1. Kolhydrater (såsom cellulosa och hemicellulosa) som finns i växtcellväggar depolymeriseras till monosackarider genom kemisk bearbetning och biotransformation (såsom enzymatisk hydrolys och mikrobiell fermentering). Vanliga förbehandlingar inkluderar ammoniakfiberexpansion (AFEX), utspädd syra (DA), jonisk vätska (IL) och ångexplosion (SE), som använder en kombination av kemikalier och värme för att minska lignocellulosaproduktionen genom att öppna växtcellväggar3,4. 5. Enzymatisk hydrolys utförs vid en hög halt fasta ämnen med hjälp av kommersiella aktiva kolhydratinnehållande enzymer (CAZymer) och mikrobiell fermentering med hjälp av transgena jästsvampar eller bakterier för att producera biobaserade bränslen och kemikalier6.
CAZymer i kommersiella enzymer består av en komplex blandning av enzymer som synergistiskt klyver komplexa kolhydrat-sockerbindningar för att bilda monosackarider2,7. Som vi rapporterade tidigare gör det komplexa nätverket av aromatiska polymerer av lignin med kolhydrater dem mycket svårhanterliga, vilket leder till ofullständig sockeromvandling, vilket ackumulerar 15-25% könsoligosackarider som inte produceras under enzymatisk hydrolys av den förbehandlade biomassan. Detta är ett vanligt problem med olika förbehandlingsmetoder för biomassa. Några orsaker till denna flaskhals inkluderar enzymhämning under hydrolys, eller frånvaron av eller låga nivåer av essentiella enzymer som krävs för att bryta sockerbindningar i växtbiomassa. Att förstå sammansättningen och de strukturella egenskaperna hos sockerarter, såsom sockerbindningarna i oligosackarider, kommer att hjälpa oss att förbättra sockeromvandlingen under hydrolys, vilket gör biotekniska processer kostnadseffektiva med petroleumderiverade produkter.
Att bestämma kolhydraters struktur är utmanande och kräver en kombination av metoder som vätskekromatografi (LC)11,12, kärnmagnetisk resonansspektroskopi (NMR)13, kapillärelektrofores (CE)14,15,16 och masspektrometri (MS)17. ,arton. MS-metoder som time-of-flight-masspektrometri med laserdesorption och jonisering med hjälp av en matris (MALDI-TOF-MS) är en mångsidig metod för att identifiera kolhydratstrukturer. Nyligen har kollisionsinducerad dissociation (CID) tandem-MS av natriumjonaddukter använts mest för att identifiera fingeravtryck motsvarande oligosackaridfästningspositioner, anomera konfigurationer, sekvenser och förgreningspositioner 20, 21.
Glykananalys är ett utmärkt verktyg för djupgående identifiering av kolhydratbindningar22. Denna metod använder monoklonala antikroppar (mAb) riktade mot glykan i växtcellväggen som sonder för att förstå komplexa kolhydratbindningar. Mer än 250 mAb finns tillgängliga över hela världen, designade mot olika linjära och grenade oligosackarider med hjälp av olika sackarider24. Flera mAb har använts i stor utsträckning för att karakterisera strukturen, sammansättningen och modifieringarna av växtcellväggen, eftersom det finns betydande skillnader beroende på växtcellstyp, organ, ålder, utvecklingsstadium och tillväxtmiljö25,26. På senare tid har denna metod använts för att förstå vesikelpopulationer i växt- och djursystem och deras respektive roller i glykantransport bestämd av subcellulära markörer, utvecklingsstadier eller miljöstimuli, och för att bestämma enzymatisk aktivitet. Några av de olika strukturer av glykaner och xylaner som har identifierats inkluderar pektin (P), xylan (X), mannan (M), xyloglukaner (XylG), blandade glukaner (MLG), arabinoxylan (ArbX), galaktomannan (GalG), glukuronsyra-arabinoxylan (GArbX) och arabino-galaktan (ArbG)29.
Trots alla dessa forskningsinsatser har dock endast ett fåtal studier fokuserat på naturen av oligosackaridackumulering under hydrolys med hög fast substanshalt (HSL), inklusive frisättning av oligosackarid, förändringar i oligomera kedjelängder under hydrolys, olika polymerer med låg DP och deras kurvfördelningar 30,31,32. Samtidigt, även om glykananalys har visat sig vara ett användbart verktyg för en omfattande analys av glykanstrukturen, är det svårt att utvärdera vattenlösliga oligosackarider med låg DP med hjälp av antikroppsmetoder. Mindre DP-oligosackarider med en molekylvikt på mindre än 5–10 kDa binder inte till ELISA-plattor 33, 34 och tvättas bort före tillsats av antikroppar.
Här demonstrerar vi för första gången en ELISA-analys på avidinbelagda plattor med monoklonala antikroppar, som kombinerar en enstegsbiotinyleringsprocedur för lösliga refraktära oligosackarider med glykomanalys. Vår metod för glykomanalys validerades genom MALDI-TOF-MS och GC-MS-baserad analys av komplementära oligosackaridbindningar med trimetylsilyl (TMS)-derivatisering av hydrolyserade sockerkompositioner. Denna innovativa metod kan utvecklas som en högkapacitetsmetod i framtiden och få bredare tillämpning inom biomedicinsk forskning35.
Posttranslationella modifieringar av enzymer och antikroppar, såsom glykosylering,36 påverkar deras biologiska aktivitet. Till exempel spelar förändringar i glykosyleringen av serumproteiner en viktig roll vid inflammatorisk artrit, och förändringar i glykosylering används som diagnostiska markörer37. Olika glykaner har rapporterats i litteraturen som lätt uppträdande vid en mängd olika sjukdomar, inklusive kroniska inflammatoriska sjukdomar i mag-tarmkanalen och levern, virusinfektioner, äggstocks-, bröst- och prostatacancer38,39,40. Att förstå glykanernas struktur med hjälp av antikroppsbaserade glykan-ELISA-metoder kommer att ge ytterligare säkerhet vid sjukdomsdiagnos utan användning av komplexa MS-metoder.
Vår tidigare studie visade att envisa oligosackarider förblev ohydrolyserade efter förbehandling och enzymatisk hydrolys (Figur 1). I vårt tidigare publicerade arbete utvecklade vi en fastfasextraktionsmetod med aktivt kol för att isolera oligosackarider från AFEX-förbehandlat majsstoverhydrolysat (ACSH)8. Efter initial extraktion och separation fraktionerades oligosackariderna ytterligare genom storleksuteslutningskromatografi (SEC) och samlades in i molekylviktsordning. Sockermonomerer och oligomerer som frigjorts från olika förbehandlingar analyserades genom sockerkompositionsanalys. Vid jämförelse av innehållet av sockeroligomerer som erhållits genom olika förbehandlingsmetoder är närvaron av envisa oligosackarider ett vanligt problem vid omvandling av biomassa till monosackarider och kan leda till en minskning av sockerutbytet på minst 10–15 % och till och med upp till 18 %. Denna metod används för vidare storskalig produktion av oligosackaridfraktioner. Den resulterande ACH och dess efterföljande fraktioner med olika molekylvikter användes som experimentellt material för karakterisering av oligosackarider i detta arbete.
Efter förbehandling och enzymatisk hydrolys förblev persistenta oligosackarider ohydrolyserade. Här (A) är en oligosackaridseparationsmetod där oligosackarider isoleras från AFEX-förbehandlat majsstrovhydrolysat (ACSH) med hjälp av en packad bädd av aktivt kol och kiselgur; (B) Metod för separation av oligosackarider. Oligosackariderna separerades ytterligare genom storleksexklusionskromatografi (SEC); (C) Sackaridmonomerer och oligomerer frisatta från olika förbehandlingar (utspädd syra: DA, jonisk vätska: IL och AFEX). Enzymatiska hydrolysförhållanden: hög halt fasta ämnen på 25 % (vikt/vikt) (ungefär 8 % glukanmängd), 96 timmars hydrolys, 20 mg/g kommersiell enzymmängd (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1-förhållande) och (D) Sockermonomerer och oligomerer av glukos, xylos och arabinos frisatta från AFEX-förbehandlat majsstrov (ACS).
Glykanalys har visat sig vara ett användbart verktyg för en omfattande strukturanalys av glykaner i extrakt isolerade från fasta biomassarester. Vattenlösliga sackarider är dock underrepresenterade med denna traditionella metod41 eftersom oligosackarider med låg molekylvikt är svåra att immobilisera på ELISA-plattor och tvättas ut före tillsats av antikroppar. Därför användes en enstegsbiotinyleringsmetod för antikroppsbindning och karakterisering för att belägga lösliga, icke-följsamma oligosackarider på avidinbelagda ELISA-plattor. Denna metod testades med vår tidigare producerade ACSH och en fraktion baserad på dess molekylvikt (eller polymerisationsgrad, DP). Enstegsbiotinylering användes för att öka oligosackaridbindningsaffiniteten genom att tillsätta biotin-LC-hydrazid till den reducerande änden av kolhydratet (Fig. 2). I lösning reagerar hemiacetalgruppen vid den reducerande änden med hydrazidgruppen i biotin-LC-hydrazid för att bilda en hydrazonbindning. I närvaro av reduktionsmedlet NaCNBH3 reduceras hydrazonbindningen till en stabil biotinylerad slutprodukt. Med modifieringen av den sockerreducerande änden blev bindning av oligosackarider med låg DP till ELISA-plattor möjlig, och i vår studie gjordes detta på avidinbelagda plattor med användning av glykan-riktade mAbs.
Screening av monoklonala antikroppar baserade på ELISA för biotinylerade oligosackarider. Här (A) kombineras biotinylering av oligosackarider och efterföljande ELISA-screening med glykan-riktade mAbs på NeutrAvidin-belagda plattor och (B) visas en enstegsprocedur för biotinylering av reaktionsprodukter.
Avidinbelagda plattor med oligosackaridkonjugerade antikroppar tillsattes sedan till primära och sekundära antikroppar och tvättades i ett ljus- och tidskänsligt medium. Efter att antikroppsbindningen var fullständig tillsattes TMB-substrat för att inkubera plattan. Reaktionen stoppades slutligen med svavelsyra. De inkuberade plattorna analyserades med hjälp av en ELISA-läsare för att bestämma bindningsstyrkan för varje antikropp för att detektera antikroppsspecifik tvärbindning. För detaljer och parametrar för experimentet, se motsvarande avsnitt "Material och metoder".
Vi demonstrerar användbarheten av denna nyutvecklade metod för specifika tillämpningar genom att karakterisera de lösliga oligosackariderna som finns i ACSH såväl som i råa och renade oligosackaridfraktioner isolerade från lignocellulosahydrolysat. Som visas i figur 3 är de vanligaste epitopsubstituerade xylanerna som identifierats i ACSH med hjälp av bioacylerade glykomanalysmetoder vanligtvis uronsyra (U) eller metyluronsyra (MeU) och pektinsyraarabinogalaktaner. De flesta av dem hittades också i vår tidigare studie om analys av glykaner från icke-hydrolyserade fasta ämnen (UHS)43.
Detektion av motsträviga oligosackarid-epitoper med hjälp av en monoklonal antikropp riktad mot cellväggens glykan. Den "neutrala" fraktionen är ACN-fraktionen och den "sura" fraktionen är FA-fraktionen. Ljusare röda färger på värmekartan indikerar högre epitopinnehåll, och ljusare blå färger indikerar en blank bakgrund. Färgvärdena på skalan är baserade på råa OD-värden för formuleringar N=2. De huvudsakliga epitoperna som känns igen av antikropparna visas till höger.
Dessa icke-cellulosastrukturer kunde inte klyvas av de vanligaste cellulaserna och hemicellulaserna i den testade kommersiella enzymblandningen, vilken inkluderar de vanligast använda kommersiella enzymerna. Därför krävs nya hjälpenzymer för deras hydrolys. Utan de nödvändiga icke-cellulosabaserade hjälpenzymerna förhindrar dessa icke-cellulosabindningar fullständig omvandling till monosackarider, även om deras modersockerpolymerer hydrolyseras i stor utsträckning till kortare fragment och löses upp med kommersiella enzymblandningar.
Vidare studier av signalfördelning och dess bindningsstyrka visade att bindningsepitoper var lägre i sockerfraktioner med hög DP (A, B, C, DP upp till 20+) än i fraktioner med låg DP (D, E, F, DP) i dimerer (Fig. 1). Syrafragment är vanligare i epitoper utan cellulosa än i neutrala fragment. Dessa fenomen överensstämmer med mönstret som observerades i vår tidigare studie, där epitoper med hög DP och syraenheter var mer resistenta mot enzymatisk hydrolys. Därför kan närvaron av glykanepitoper utan cellulosa och U- och MeU-substitutioner i hög grad bidra till oligosackaridernas stabilitet. Det bör noteras att bindnings- och detektionseffektivitet kan vara problematisk för oligosackarider med låg DP, särskilt om epitopen är en dimer eller trimer oligosackarid. Detta kan testas med kommersiella oligosackarider av olika längder, där var och en endast innehåller en epitop som binder till en specifik mAb.
Användningen av strukturspecifika antikroppar avslöjade således vissa typer av motsträviga bindningar. Beroende på vilken typ av antikropp som används, lämpligt ligeringsmönster och styrkan hos den signal den producerar (mest och minst förekommande), kan nya enzymer identifieras och tillsättas semi-kvantitativt till enzymblandningen för mer fullständig glykokonvertering. Med analysen av ACSH-oligosackarider som exempel kan vi skapa en databas med glykanbindningar för varje biomassamaterial. Det bör noteras här att antikropparnas olika affinitet bör beaktas, och om deras affinitet är okänd kommer detta att skapa vissa svårigheter vid jämförelse av signaler från olika antikroppar. Dessutom kan jämförelse av glykanbindningar fungera bäst mellan prover för samma antikropp. Dessa envisa bindningar kan sedan länkas till CAZyme-databasen, från vilken vi kan identifiera enzymer, välja kandidatenzymer och testa bindningsbrytande enzymer, eller utveckla mikrobiella system för att uttrycka dessa enzymer för användning i bioraffinaderier44.
För att utvärdera hur immunologiska metoder kompletterar alternativa metoder för att karakterisera oligosackarider med låg molekylvikt som finns i lignocellulosiska hydrolysat, utförde vi MALDI (Fig. 4, S1-S8) och analys av TMS-deriverade sackarider baserade på GC-MS på samma panel (Fig. 5) oligosackariddel. MALDI används för att jämföra om massfördelningen av oligosackaridmolekyler matchar den avsedda strukturen. Fig. 4 visar MS för de neutrala komponenterna ACN-A och ACN-B. ACN-A-analys bekräftade ett intervall av pentossockerarter från DP 4–8 (Fig. 4) till DP 22 (Fig. S1), vars vikter motsvarar MeU-xylan-oligosackarider. ACN-B-analys bekräftade pentos- och glukoxylanserien med DP 8-15. I kompletterande material, såsom figur S3, visar kartor över massfördelningen av FA-C-sura grupper ett intervall av (Me)U-substituerade pentossockerarter med en DP på ​​8–15, vilka överensstämmer med de substituerade xylanerna som finns i ELISA-baserad mAb-screening. Epitoperna är överensstämmande.
MALDI-MS-spektrum av lösliga icke-kompatibla oligosackarider närvarande i ACS. Här (A) ACN-A-fraktioner med låg vikt innehållande metylerad uronsyra (DP 4-8) substituerade med glukuroxylan-oligosackarider och (B) ACN-B-xylan och metylerade uronsyra-oligosackarider substituerade med glukuroxylan (DP 8-15).
Analys av sammansättningen av glykanresten i refraktära oligosackarider. Här (A) TMS-sackaridsammansättning av olika oligosackaridfraktioner erhållna med GC-MS-analys. (B) Strukturer av olika TMS-deriverade sockerarter som finns i oligosackarider. ACN – acetonitrilfraktion innehållande neutrala oligosackarider och FA – ferulsyrafraktion innehållande syra-oligosackarider.
En annan intressant slutsats drogs från LC-MS-analysen av oligosackaridfraktionen, såsom visas i figur S9 (metoder kan ses i det elektroniska kompletterande materialet). Fragment av hexos- och -OAc-grupper observerades upprepade gånger under ligering av ACN-B-fraktionen. Detta fynd bekräftar inte bara den fragmentering som observerats i glykom- och MALDI-TOF-analys, utan ger också ny information om potentiella kolhydratderivat i förbehandlad lignocellulosabiomassa.
Vi utförde även glykankompositionsanalys av oligosackaridfraktioner med hjälp av TMS-glykanderivatisering. Med hjälp av GC-MS bestämde vi sammansättningen av neurala (icke-derivativa) och sura sockerarter (GluA och GalA) i oligosackaridfraktionen (Fig. 5). Glukuronsyra finns i de sura komponenterna C och D, medan galakturonsyra finns i de sura komponenterna A och B, vilka båda är komponenter med hög DP i sura sockerarter. Dessa resultat bekräftar inte bara våra ELISA- och MALDI-data, utan överensstämmer också med våra tidigare studier av oligosackaridackumulering. Därför anser vi att moderna immunologiska metoder som använder biotinylering av oligosackarider och efterföljande ELISA-screening är tillräckliga för att detektera lösliga motsträviga oligosackarider i olika biologiska prover.
Eftersom ELISA-baserade mAb-screeningmetoder har validerats med flera olika metoder, ville vi ytterligare utforska potentialen hos denna nya kvantitativa metod. Två kommersiella oligosackarider, xylohexasackarid-oligosackarid (XHE) och 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotrios (A2XX), köptes in och testades med en ny mAb-metod riktad mot cellväggsglykanen. Figur 6 visar en linjär korrelation mellan den biotinylerade bindningssignalen och logaritmisk koncentration av oligosackaridkoncentrationen, vilket tyder på en möjlig Langmuir-adsorptionsmodell. Bland mAb:erna korrelerade CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 och CCRC-M151 med XHE, och CCRC-M108, CCRC-M109 och LM11 korrelerade med A2XX över ett intervall från 1 nm till 100 nano. På grund av den begränsade tillgången på antikroppar under experimentet utfördes begränsade experiment med varje oligosackaridkoncentration. Det bör noteras här att vissa antikroppar reagerar mycket olika på samma oligosackarid som substrat, förmodligen för att de binder till något olika epitoper och kan ha mycket olika bindningsaffiniteter. Mekanismerna och implikationerna för korrekt epitopidentifiering kommer att bli mycket mer komplexa när den nya mAb-metoden tillämpas på verkliga prover.
Två kommersiella oligosackarider användes för att bestämma detektionsområdet för olika glykan-riktade mAbs. Här indikerar linjära korrelationer med logaritmisk koncentration av oligosackaridkoncentrationen Langmuir-adsorptionsmönster för (A) XHE med mAb och (B) A2XX med mAb. Motsvarande epitoper indikerar strukturerna hos de kommersiella oligosackarider som användes som substrat i analysen.
Användningen av glykanriktade monoklonala antikroppar (glykokomisk analys eller ELISA-baserad mAb-screening) är ett kraftfullt verktyg för djupgående karakterisering av de flesta av de viktigaste cellväggsglykanerna som utgör växtbiomassa. Klassisk glykananalys karakteriserar dock endast större cellväggsglykaner, eftersom de flesta oligosackarider inte immobiliseras effektivt på ELISA-plattor. I denna studie hydrolyserades AFEX-förbehandlad majsstrov enzymatiskt vid en hög torrsubstanshalt. Sockeranalys användes för att bestämma sammansättningen av motsträviga cellväggskolhydrater i hydrolysatet. mAb-analys av mindre oligosackarider i hydrolysat är dock underskattad, och ytterligare verktyg behövs för att effektivt immobilisera oligosackarider på ELISA-plattor.
Vi rapporterar här en ny och effektiv oligosackaridimmobiliseringsmetod för mAb-screening genom att kombinera oligosackaridbiotinylering följt av ELISA-screening på NeutrAvidin™-belagda plattor. De immobiliserade biotinylerade oligosackariderna uppvisade tillräcklig affinitet för antikroppen för att möjliggöra snabb och effektiv detektion av motsträviga oligosackarider. Analys av sammansättningen av dessa envisa oligosackarider baserad på masspektrometri bekräftade resultaten av denna nya metod för immunoscreening. Således visar dessa studier att kombinationen av oligosackaridbiotinylering och ELISA-screening med glykanriktade monoklonala antikroppar kan användas för att detektera tvärbindningar i oligosackarider och kan tillämpas i stor utsträckning i andra biokemiska studier som karakteriserar strukturen hos oligosackarider.
Denna biotinbaserade glykanprofileringsmetod är den första rapporten som kan undersöka de motsträviga kolhydratbindningarna hos lösliga oligosackarider i växtbiomassa. Detta hjälper till att förstå varför vissa delar av biomassa är så envisa när det gäller produktion av biobränsle. Denna metod fyller ett viktigt gap i glykomanalysmetoder och utvidgar dess tillämpning till ett bredare spektrum av substrat utöver växtoligosackarider. I framtiden kan vi komma att använda robotteknik för biotinylering och använda den metod vi har utvecklat för högkapacitetsanalys av prover med hjälp av ELISA.
Majsstrå (CS) odlat från hybridfrön av typen Pioneer 33A14 skördades år 2010 från Kramer Farms i Ray, Colorado. Med markägarens tillstånd kan denna biomassa användas för forskning. Proverna förvarades torrt < 6 % fuktighet i återförslutningsbara påsar i rumstemperatur. Proverna förvarades torrt < 6 % fuktighet i återförslutningsbara påsar i rumstemperatur. Optimera betalningar för anläggningar < 6 % i paket med byggnadsautomater. Proverna förvarades torrt vid <6 % luftfuktighet i dragkedjeförsedda påsar i rumstemperatur.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6 % Tjänster försörjs med anläggningar och anläggningar som har en strömförsörjning med < 6 %. Proverna förvaras i dragkedjeförsedda påsar i rumstemperatur med en luftfuktighet på < 6 %.Studien följde lokala och nationella riktlinjer. Sammansättningsanalys utfördes med hjälp av NREL-protokollet. Sammansättningen visade sig innehålla 31,4 % glukan, 18,7 % xylan, 3,3 % arabinan, 1,2 % galaktan, 2,2 % acetyl, 14,3 % lignin, 1,7 % protein och 13,4 % aska.
Cellic® CTec2 (138 mg protein/ml, lot VCNI 0001) är en komplex blandning av cellulas, β-glukosidas och Cellic® HTec2 (157 mg protein/ml, lot VHN00001) från Novozymes (Franklinton, NC, USA)). Multifect Pectinase® (72 mg protein/ml), en komplex blandning av pektinnebrytande enzymer, donerades av DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, USA). Enzymproteinkoncentrationerna bestämdes genom att uppskatta proteininnehållet (och subtrahera bidraget av icke-proteinkväve) med hjälp av Kjeldahl-kväveanalys (AOAC-metod 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA). Kiselgur 545 köptes från EMD Millipore (Billerica, MA). Aktivt kol (DARCO, 100 mesh granulat), Avicel (PH-101), xylan från bok och alla andra kemikalier köptes från Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
AFEX-förbehandling utfördes vid GLBRC (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, USA). Förbehandlingen utfördes vid 140 °C i 15 minuter. Uppehållstid 46 minuter vid förhållandet 1:1 vattenfri ammoniak till biomassa vid 60 % (vikt/vikt) laddning i en bänkreaktor av rostfritt stål (Parr Instruments Company). Det tog 30 minuter. Reaktorn värmdes upp till 140 °C och ammoniaken frigjordes snabbt, vilket gjorde att biomassan snabbt kunde återgå till rumstemperatur. Sammansättningen av AFEX-förbehandlad majsstrov (ACS) liknade den hos obehandlad majsstrov (UT-CS).
ACSH med hög halt av torrsubstans 25 % (vikt/vikt) (ungefär 8 % dextranmängd) framställdes som utgångsmaterial för storskalig produktion av oligosackarider. Enzymatisk hydrolys av ACS utfördes med en kommersiell enzymblandning inkluderande Cellic® Ctec2 10 mg protein/g glukan (i förbehandlad biomassa), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg protein/g glukan och Multifect Pectinase (Genencor Inc, USA). ), 5 mg protein/g dextran. Enzymatisk hydrolys utfördes i en 5-liters bioreaktor med en arbetsvolym på 3 liter, pH 4,8, 50 °C och 250 rpm. Efter hydrolys i 96 timmar uppsamlades hydrolysatet genom centrifugering vid 6000 rpm i 30 minuter och sedan vid 14000 rpm i 30 minuter för att avlägsna ohydrolyserat fast material. Hydrolysatet sterilfiltrerades sedan genom en 0,22 mm filterbägare. Det filtrerade hydrolysatet förvarades i sterila flaskor vid 4°C och fraktionerades sedan på kol.
Analys av sammansättningen av extraktbaserade biomassaprover enligt NREL:s laboratorieanalysprocedurer: beredning av prover för sammansättningsanalys (NREL/TP-510-42620) och bestämning av strukturella kolhydrater och lignin i biomassa (NREL/TP-510–42618)47.
Oligosackaridanalys av hydrolysatströmmen utfördes i 2 ml-skala med hjälp av en autoklavbaserad syrahydrolysmetod. Blanda hydrolysatprovet med 69,7 µl 72 % svavelsyra i ett 10 ml odlingsrör med skruvkork och inkubera i 1 timme på en bänkskiva vid 121 °C, kyl på is och filtrera över i en HPLC-ampull (high performance liquid chromatography). Koncentrationen av oligosackarider bestämdes genom att subtrahera koncentrationen av monosackarider i det icke-hydrolyserade provet från den totala sockerkoncentrationen i det syrahydrolyserade provet.
Glukos-, xylos- och arabinoskoncentrationerna i den syrahydrolyserade biomassan analyserades med hjälp av ett Shimadzu HPLC-system utrustat med en autosampler, kolonnvärmare, isokratisk pump och brytningsindexdetektor på en Bio-Rad Aminex HPX-87H-kolonn. Kolonnen hölls vid 50 °C och eluerades med 0,6 ml/min 5 mM H2SO4 i vattenflöde.
Hydrolysatsupernatanten späddes och analyserades med avseende på monomer- och oligosackaridinnehåll. Monomera sockerarter erhållna efter enzymatisk hydrolys analyserades med HPLC utrustad med en Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P-kolonn och en askskyddskolonn. Kolonnens temperatur hölls vid 80 °C, vatten användes som mobil fas med en flödeshastighet på 0,6 ml/min. Oligosackarider bestämdes genom hydrolys i utspädd syra vid 121 °C enligt de metoder som beskrivs i ref. 41, 48, 49.
Sackaridanalys utfördes på råa, AFEX-förbehandlade och alla icke-hydrolyserade biomassarester (inklusive produktion av seriella cellväggsextrakt och deras mAb-screening) med användning av tidigare beskrivna procedurer 27, 43, 50, 51. För glykomanalys framställs alkohololösliga rester av växtcellväggsmaterial från biomassarester och utsätts för seriell extraktion med alltmer aggressiva reagens såsom ammoniumoxalat (50 mM), natriumkarbonat (50 mM och 0,5 % w/v), CON. (1M och 4M, båda med 1 % w/v natriumborhydrid) och syraklorit enligt tidigare beskrivning 52,53. Extrakten utsattes sedan för ELISA mot en komplex panel av mAb50 riktade mot cellväggsglykanen, och mAb-bindningsreaktionerna presenterades som en värmekarta. mAb riktade mot växtcellväggsglykan köptes från laboratorielager (CCRC-, JIM- och MAC-serien).
Enstegsbiotinylering av oligosackarider. Konjugeringen av kolhydrater med biotin-LC-hydrazid utfördes med följande procedur. Biotin-LC-hydrazid (4,6 mg/12 μmol) löstes i dimetylsulfoxid (DMSO, 70 μl) genom kraftig omrörning och uppvärmning vid 65 °C i 1 minut. Isättika (30 μl) tillsattes och blandningen hälldes på natriumcyanoborhydrid (6,4 mg/100 μmol) och löstes fullständigt efter uppvärmning vid 65 °C i cirka 1 minut. Därefter tillsattes 5 till 8 μl av reaktionsblandningen till den torkade oligosackariden (1-100 nmol) för att erhålla ett 10-faldigt eller mer molärt överskott av märkningen jämfört med den reducerande änden. Reaktionen utfördes vid 65 °C i 2 timmar, varefter proverna omedelbart renades. Ingen natriumcyanoborhydrid användes i märkningsexperimenten utan reduktion, och proverna fick reagera vid 65 °C i 2,5 timmar.
ELISA-beläggning och tvättning av prover av biotinylerade oligosackarider. 25 μl biotinylerade prover (100 μl av varje koncentrerat prov utspätt i 5 ml 0,1 M Tris-buffertlösning (TBS)) tillsattes till varje brunn i den avidinbelagda plattan. Kontrollbrunnar belades med 50 μl biotin i en koncentration av 10 μg/ml i 0,1 M TBS. Avjoniserat vatten användes som beläggning för blankmätningarna. Tabletten inkuberades i 2 timmar vid rumstemperatur i mörker. Tvätta plattan 3 gånger med 0,1 % skummjölk i 0,1 M TBS med program nr 11 för Grenier flat 3A.
Tillsats och tvättning av primära antikroppar. Tillsätt 40 µl primär antikropp till varje brunn. Inkubera mikroplattan i 1 timme vid rumstemperatur i mörker. Plattorna tvättades sedan 3 gånger med 0,1 % mjölk i 0,1 M TBS med tvättprogram #11 för Grenier Flat 3A.
Tillsätt sekundär antikropp och tvätta. Tillsätt 50 µl sekundär antikropp från mus/råtta (utspädd 1:5000 i 0,1 % mjölk i 0,1 M TBS) till varje brunn. Inkubera mikroplattan i 1 timme vid rumstemperatur i mörker. Mikroplattorna tvättades sedan 5 gånger med 0,1 % mjölk i 0,1 M TBS med Grenier Flat 5A platttvättprogram #12.
Tillsats av substrat. Tillsätt 50 µl 3,3′,5,5′-tetrametylbensidin (TMB) till bassubstratet (genom att tillsätta 2 droppar buffert, 3 droppar TMB, 2 droppar väteperoxid till 15 ml avjoniserat vatten). Förbered TMB-substratet och vortexa före användning. Inkubera mikroplattan i rumstemperatur i 30 minuter. I mörker.
Slutför steget och avläs tabletten. Tillsätt 50 µl 1 N svavelsyra till varje brunn och registrera absorbansen från 450 till 655 nm med en ELISA-avläsare.
Bered 1 mg/ml lösningar av dessa analyter i avjoniserat vatten: arabinos, ramnos, fukos, xylos, galakturonsyra (GalA), glukuronsyra (GlcA), mannos, glukos, galaktos, laktos, N-acetylmannosamin (manNAc), N-acetylglukosamin (glcNAc), N-acetylgalaktosamin (galNAc), inositol (intern standard). Två standarder framställdes genom att tillsätta de 1 mg/ml sockerlösningar som visas i tabell 1. Proverna fryses och frystorkas vid -80° C tills allt vatten har avlägsnats (vanligtvis cirka 12–18 timmar).
Tillsätt 100–500 µg prov till skruvkorkrör på en analysvåg. Registrera den tillsatta mängden. Det är bäst att lösa upp provet i en specifik koncentration av lösningsmedel och tillsätta det till röret som en flytande alikvot. Använd 20 µl 1 mg/ml inositol som intern standard för varje provrör. Mängden intern standard som tillsätts till provet måste vara densamma som mängden intern standard som tillsätts till standardröret.
Tillsätt 8 ml vattenfri metanol till en skruvkork. Sedan tillsätt 4 ml 3 N metanolisk HCl-lösning, förslut och skaka om. Denna process använder inte vatten.
Tillsätt 500 µl 1 M HCl-metanollösning till oligosackaridproverna och standard TMS-rören. Proverna inkuberades över natten (168 timmar) vid 80 °C i ett termiskt block. Torka metanolysprodukten vid rumstemperatur med hjälp av ett torkrör. Tillsätt 200 µl MeOH och torka igen. Denna process upprepas två gånger. Tillsätt 200 µl metanol, 100 µl pyridin och 100 µl ättiksyraanhydrid till provet och blanda väl. Inkubera proverna vid rumstemperatur i 30 minuter och torka dem. Tillsätt 200 µl metanol och torka igen.
Tillsätt 200 µl Tri-Sil och värm på röret med lock i 20 minuter. Låt det värmas till 80 °C och kylas sedan till rumstemperatur. Använd ett torkrör för att torka provet ytterligare till en volym på cirka 50 µl. Det är viktigt att notera att vi inte lät proverna torka helt.
Tillsätt 2 ml hexan och blanda väl genom att virvla. Fyll spetsarna på pasteurpipetter (5–8 mm) med en bit glasull genom att placera glasullen ovanpå en pipett med en diameter på 5,3/4 tum. Proverna centrifugerades vid 3000 g i 2 minuter. Eventuella olösliga rester fälls ut. Torka provet till 100–150 µl. En volym på cirka 1 μl injicerades i GC-MS vid en initial temperatur på 80 °C och en initial tid på 2,0 minuter (tabell 2).