Շնորհակալություն Nature.com կայք այցելելու համար: Ձեր օգտագործած դիտարկիչի տարբերակն ունի սահմանափակ CSS աջակցություն: Լավագույն փորձի համար խորհուրդ ենք տալիս օգտագործել թարմացված դիտարկիչ (կամ անջատել համատեղելիության ռեժիմը Internet Explorer-ում): Մինչդեռ, շարունակական աջակցությունն ապահովելու համար, մենք կայքը կցուցադրենք առանց ոճերի և JavaScript-ի:
AFEX-ով նախապես մշակված եգիպտացորենի ցանքերում կայուն օլիգոսախարիդների բարդ վերլուծության նոր իմունոլոգիական և զանգվածային սպեկտրոմետրիկ մեթոդներ: Լիգնոցելյուլոզային կենսազանգվածը կայուն այլընտրանք է բրածո վառելիքին և լայնորեն օգտագործվում է այնպիսի արտադրանքի արտադրության համար կենսատեխնոլոգիաներ մշակելու համար, ինչպիսիք են սնունդը, կերերը, վառելիքները և քիմիական նյութերը: Այս տեխնոլոգիաների բանալին բույսերի բջջային պատերում առկա բարդ ածխաջրերը պարզ շաքարների, ինչպիսիք են գլյուկոզան, քսիլոզը և արաբինոզը, վերածելու համար գնային առումով մրցունակ գործընթացների մշակումն է: Քանի որ լիգնոցելյուլոզային կենսազանգվածը շատ համառ է, այն պետք է ենթարկվի ջերմաքիմիական մշակումների (օրինակ՝ ամոնիակային մանրաթելերի շերտազատում (AFEX), նոսր թթուներ (DA), իոնային հեղուկներ (IL)) և կենսաբանական մշակումների (օրինակ՝ ֆերմենտատիվ հիդրոլիզ և մանրէային խմորում) համատեղ՝ ցանկալի արտադրանքը ստանալու համար: Այնուամենայնիվ, երբ հիդրոլիզի գործընթացում օգտագործվում են առևտրային սնկային ֆերմենտներ, առաջացած լուծելի շաքարների միայն 75-85%-ն են մոնոսախարիդներ, իսկ մնացած 15-25%-ը՝ լուծելի, դժվարությամբ կառավարվող օլիգոսախարիդներ, որոնք միշտ չէ, որ հասանելի են միկրոօրգանիզմների համար: Նախկինում մենք հաջողությամբ մեկուսացրել և մաքրել ենք լուծելի համառ օլիգոսախարիդներ՝ օգտագործելով ածխածնի և դիատոմային հողի բաժանման և չափերի բացառման քրոմատոգրաֆիայի համադրություն, ինչպես նաև ուսումնասիրել ենք դրանց ֆերմենտների արգելակող հատկությունները: Մենք պարզել ենք, որ մեթիլացված ուրոնաթթվի ավելի բարձր աստիճանի պոլիմերացման (DP) պարունակող օլիգոսախարիդները ավելի դժվար են մշակվում առևտրային ֆերմենտային խառնուրդներով, քան ցածր DP-ն և չեզոք օլիգոսախարիդները: Այստեղ մենք ներկայացնում ենք մի քանի լրացուցիչ մեթոդների կիրառումը, ներառյալ բույսերի կենսազանգվածի գլիկաններին բնորոշ մոնոկլոնալ հակամարմինների (mAbs) միջոցով գլիկանների պրոֆիլավորումը՝ բույսերի բջջային պատերում և ֆերմենտատիվ հիդրոլիզատներում գլիկանային կապերը բնութագրելու համար, մատրիցային օժանդակությամբ լազերային դեսորբցիայի իոնացումը, թռիչքի ժամանակի զանգվածային սպեկտրոմետրիան: MALDI-TOF-MS) մեթոդը օգտագործում է կառուցվածքային տեղեկատվական ախտորոշիչ գագաթներ, որոնք ստացվել են սպեկտրոսկոպիայի միջոցով՝ բացասական իոնների երկրորդային քայքայումից հետո, գազային քրոմատոգրաֆիայի և զանգվածային սպեկտրոմետրիայի (GC-MS) միջոցով՝ օլիգոսախարիդային կապերը բնութագրելու համար՝ դերիվատիզացիայով և առանց դրա: Օլիգոսախարիդների փոքր չափերի (DP 4–20) պատճառով այս մոլեկուլները դժվար է օգտագործել mAb-ի կապման և բնութագրման համար: Այս խնդիրը հաղթահարելու համար մենք կիրառեցինք բիոտինի կոնյուգացիայի վրա հիմնված օլիգոսախարիդների անշարժացման նոր մեթոդ, որը հաջողությամբ պիտակավորեց միկրոթիթեղի մակերեսին գտնվող ցածր DP լուծվող օլիգոսախարիդների մեծ մասը, որն այնուհետև օգտագործվեց բարձր թողունակությամբ mAb համակարգում՝ հատուկ լիգացիոն վերլուծության համար: Այս նոր մեթոդը ապագայում կնպաստի ավելի առաջադեմ բարձր թողունակությամբ գլիկոմային անալիզների մշակմանը, որոնք կարող են օգտագործվել բիոմարկերներում առկա օլիգոսախարիդները ախտորոշիչ նպատակներով մեկուսացնելու և բնութագրելու համար:
Լիգնոցելյուլոզային կենսազանգվածը, որը կազմված է գյուղատնտեսական, անտառային, խոտածածկ և փայտային նյութերից, պոտենցիալ հումք է կենսահիմքով արտադրանքի արտադրության համար, ներառյալ սնունդ, կեր, վառելիք և քիմիական նախորդներ՝ ավելի բարձր արժեք ունեցող արտադրանք ստանալու համար1: Բույսերի բջջային պատերում առկա ածխաջրերը (օրինակ՝ ցելյուլոզը և կիսացելյուլոզը) դեպոլիմերացվում են մոնոսախարիդների՝ քիմիական մշակման և կենսափոխակերպման միջոցով (օրինակ՝ ֆերմենտատիվ հիդրոլիզ և մանրէային խմորում): Տարածված նախնական մշակումները ներառում են ամոնիակային մանրաթելերի ընդլայնում (AFEX), նոսր թթու (DA), իոնային հեղուկ (IL) և գոլորշու պայթյուն (SE), որոնք օգտագործում են քիմիական նյութերի և ջերմության համադրություն՝ լիգնոցելյուլոզի արտադրությունը նվազեցնելու համար՝ բացելով բույսերի բջջային պատերը3,4: նյութի համառություն, 5: Ֆերմենտային հիդրոլիզն իրականացվում է բարձր պինդ նյութերի բեռի դեպքում՝ օգտագործելով առևտրային ակտիվ ածխաջրեր պարունակող ֆերմենտներ (CAZymes) և մանրէային խմորում՝ օգտագործելով տրանսգենային խմորիչներ կամ մանրէներ՝ կենսահիմքով վառելիք և քիմիական նյութեր ստանալու համար6:
Առևտրային ֆերմենտներում CAZիմները կազմված են ֆերմենտների բարդ խառնուրդից, որոնք սիներգիստորեն խզում են բարդ ածխաջրածին-շաքար կապերը՝ առաջացնելով մոնոսախարիդներ2,7: Ինչպես ավելի վաղ նշել էինք, լիգնինի և ածխաջրերի արոմատիկ պոլիմերների բարդ ցանցը դրանք դարձնում է խիստ դժվարամատչելի, ինչը հանգեցնում է շաքարի ոչ լիարժեք փոխակերպման, կուտակելով սեռական օլիգոսախարիդների 15-25%, որոնք չեն արտադրվում նախապես մշակված կենսազանգվածի ֆերմենտատիվ հիդրոլիզի ընթացքում: Սա կենսազանգվածի նախնական մշակման տարբեր մեթոդների տարածված խնդիր է: Այս խոչընդոտի որոշ պատճառներից են հիդրոլիզի ընթացքում ֆերմենտների արգելակումը կամ բույսերի կենսազանգվածում շաքարային կապերը խզելու համար անհրաժեշտ էական էական ֆերմենտների բացակայությունը կամ ցածր մակարդակը: Շաքարների կազմի և կառուցվածքային բնութագրերի, ինչպիսիք են օլիգոսախարիդներում շաքարային կապերը, հասկացողությունը կօգնի մեզ բարելավել շաքարի փոխակերպումը հիդրոլիզի ընթացքում՝ կենսատեխնոլոգիական գործընթացները դարձնելով նավթից ստացված արտադրանքի հետ մրցունակ արժեքի առումով:
Ածխաջրերի կառուցվածքի որոշումը մարտահրավեր է և պահանջում է այնպիսի մեթոդների համադրություն, ինչպիսիք են հեղուկ քրոմատոգրաֆիան (LC)11,12, միջուկային մագնիսական ռեզոնանսային սպեկտրոսկոպիան (NMR)13, մազանոթային էլեկտրոֆորեզը (CE)14,15,16 և զանգվածային սպեկտրոմետրիան (MS)17,18: MS մեթոդները, ինչպիսիք են ժամանակի թռիչքի զանգվածային սպեկտրոմետրիան լազերային դեսորբցիայով և իոնացմամբ՝ մատրիցայի միջոցով (MALDI-TOF-MS), բազմակողմանի մեթոդ են ածխաջրերի կառուցվածքները նույնականացնելու համար: Վերջերս նատրիումի իոնային ադդուկտների բախման-ինդուկցված դիսոցիացիայի (CID) տանդեմ MS-ն առավել լայնորեն օգտագործվել է օլիգոսախարիդների կցման դիրքերին, անոմերային կոնֆիգուրացիաներին, հաջորդականություններին և ճյուղավորման դիրքերին համապատասխանող մատնահետքերը նույնականացնելու համար 20, 21:
Գլիկանային վերլուծությունը հիանալի գործիք է ածխաջրային կապերի խորը նույնականացման համար22: Այս մեթոդը որպես զոնդեր օգտագործում է բույսերի բջջային պատի գլիկանին ուղղված մոնոկլոնալ հակամարմիններ (mAbs)՝ բարդ ածխաջրային կապերը հասկանալու համար: Աշխարհում առկա է ավելի քան 250 mAbs, որոնք նախագծված են տարբեր գծային և ճյուղավորված օլիգոսախարիդների դեմ՝ օգտագործելով տարբեր սախարիդներ24: Բույսերի բջջային պատի կառուցվածքը, կազմը և փոփոխությունները բնութագրելու համար լայնորեն օգտագործվել են մի քանի mAbs, քանի որ կան էական տարբերություններ՝ կախված բուսական բջջի տեսակից, օրգանից, տարիքից, զարգացման փուլից և աճի միջավայրից25,26: Վերջերս այս մեթոդն օգտագործվել է բույսերի և կենդանիների համակարգերում վեզիկուլների պոպուլյացիաները և դրանց համապատասխան դերը գլիկանի տեղափոխման մեջ, որոնք որոշվում են ենթաբջջային մարկերներով, զարգացման փուլերով կամ շրջակա միջավայրի խթաններով, հասկանալու և ֆերմենտատիվ ակտիվությունը որոշելու համար: Գլիկանների և քսիլանների որոշ տարբեր կառուցվածքներ, որոնք բացահայտվել են, ներառում են պեկտին (P), քսիլան (X), մանան (M), քսիլոգլուկաններ (XylG), խառը կապերի գլյուկաններ (MLG), արաբինօքսիլան (ArbX), գալակտոմաննան (GalG), գլյուկուրոնաթթու-արաբինօքսիլան (GArbX) և արաբինոգալակտան (ArbG)29:
Սակայն, չնայած այս բոլոր հետազոտական ​​ջանքերին, միայն մի քանի ուսումնասիրություններ են կենտրոնացել օլիգոսախարիդների կուտակման բնույթի վրա բարձր պինդ նյութերի բեռնվածության (HSL) հիդրոլիզի ժամանակ, ներառյալ օլիգոսախարիդների արտազատումը, օլիգոմերային շղթայի երկարության փոփոխությունները հիդրոլիզի ընթացքում, տարբեր ցածր DP պոլիմերներ և դրանց կորերի բաշխումները 30,31,32: Միևնույն ժամանակ, չնայած գլիկանի վերլուծությունը ապացուցել է իր օգտակարությունը գլիկանի կառուցվածքի համապարփակ վերլուծության համար, դժվար է գնահատել ջրում լուծվող ցածր DP օլիգոսախարիդները հակամարմինների մեթոդների միջոցով: 5-10 կԴա-ից պակաս մոլեկուլային քաշ ունեցող ավելի փոքր DP օլիգոսախարիդները չեն կապվում ELISA թիթեղների 33, 34 հետ և լվացվում են հակամարմինների ավելացումից առաջ:
Այստեղ, առաջին անգամ, մենք ցուցադրում ենք ELISA անալիզ ավիդինով պատված թիթեղների վրա՝ օգտագործելով մոնոկլոնալ հակամարմիններ, համատեղելով լուծելի հրակայուն օլիգոսախարիդների միաստիճան բիոտինիլացման ընթացակարգը գլիկոմային վերլուծության հետ: Գլիկոմային վերլուծության մեր մոտեցումը հաստատվել է MALDI-TOF-MS և GC-MS-ի վրա հիմնված լրացուցիչ օլիգոսախարիդային կապերի վերլուծությամբ՝ օգտագործելով հիդրոլիզացված շաքարային կազմությունների տրիմեթիլսիլիլ (TMS) դերիվատացում: Այս նորարարական մոտեցումը կարող է մշակվել որպես բարձր արտադրողականության մեթոդ ապագայում և ավելի լայն կիրառություն գտնել կենսաբժշկական հետազոտություններում35:
Ֆերմենտների և հակամարմինների հետթրանսլյացիոն փոփոխությունները, ինչպիսին է գլիկոզիլացումը,36 ազդում են դրանց կենսաբանական ակտիվության վրա: Օրինակ, շիճուկային սպիտակուցների գլիկոզիլացման փոփոխությունները կարևոր դեր են խաղում բորբոքային արթրիտի դեպքում, և գլիկոզիլացման փոփոխությունները օգտագործվում են որպես ախտորոշիչ մարկերներ37: Գրականության մեջ տարբեր գլիկաններ հեշտությամբ ի հայտ են գալիս տարբեր հիվանդությունների դեպքում, այդ թվում՝ ստամոքս-աղիքային համակարգի և լյարդի քրոնիկ բորբոքային հիվանդությունների, վիրուսային վարակների, ձվարանների, կրծքագեղձի և շագանակագեղձի քաղցկեղի դեպքում38,39,40: Գլիկանների կառուցվածքի հասկացողությունը հակամարմինների վրա հիմնված գլիկան ELISA մեթոդների միջոցով կապահովի լրացուցիչ վստահություն հիվանդությունների ախտորոշման հարցում՝ առանց բարդ MS մեթոդների օգտագործման:
Մեր նախորդ ուսումնասիրությունը ցույց տվեց, որ համառ օլիգոսախարիդները մնում են չհիդրոլիզացված նախնական մշակումից և ֆերմենտատիվ հիդրոլիզից հետո (Նկար 1): Մեր նախկինում հրապարակված աշխատանքում մենք մշակել ենք ակտիվացված ածխի պինդ փուլով արդյունահանման մեթոդ՝ օլիգոսախարիդները AFEX-ով նախապես մշակված եգիպտացորենի ցանման հիդրոլիզատից (ACSH)8 մեկուսացնելու համար: Սկզբնական արդյունահանումից և բաժանումից հետո օլիգոսախարիդները հետագայում ֆրակցիացվել են չափի բացառման քրոմատոգրաֆիայի (SEC) միջոցով և հավաքվել են մոլեկուլային քաշի հերթականությամբ: Տարբեր նախնական մշակումներից ազատված շաքարի մոնոմերները և օլիգոմերները վերլուծվել են շաքարի կազմի վերլուծությամբ: Տարբեր նախնական մշակման մեթոդներով ստացված շաքարի օլիգոմերների պարունակությունը համեմատելիս, համառ օլիգոսախարիդների առկայությունը տարածված խնդիր է կենսազանգվածը մոնոսախարիդների վերածելու ժամանակ և կարող է հանգեցնել շաքարի բերքատվության առնվազն 10-15%-ով և նույնիսկ մինչև 18%-ով նվազման: Այս մեթոդը օգտագործվում է օլիգոսախարիդային ֆրակցիաների հետագա մեծածավալ արտադրության համար: Արդյունքում ստացված ACH-ը և դրա հետագա ֆրակցիաները՝ տարբեր մոլեկուլային քաշերով, օգտագործվել են որպես փորձարարական նյութ օլիգոսախարիդների բնութագրման համար այս աշխատանքում:
Նախնական մշակումից և ֆերմենտատիվ հիդրոլիզից հետո, կայուն օլիգոսախարիդները մնացել են չհիդրոլիզացված: Այստեղ (Ա) ներկայացված է օլիգոսախարիդների բաժանման մեթոդ, որի դեպքում օլիգոսախարիդները մեկուսացվում են AFEX-ով նախապես մշակված եգիպտացորենի ցանման հիդրոլիզատից (ACSH)՝ օգտագործելով ակտիվացված ածխածնի և դիատոմային հողի փաթեթավորված շերտ։ (Բ) Օլիգոսախարիդների բաժանման մեթոդ: Օլիգոսախարիդները հետագայում բաժանվել են չափի բացառման քրոմատոգրաֆիայի (SEC) միջոցով։ (Գ) Սախարիդային մոնոմերներ և օլիգոմերներ, որոնք անջատվել են տարբեր նախնական մշակումներից (նոսրացված թթու՝ DA, իոնային հեղուկ՝ IL և AFEX): Ֆերմենտային հիդրոլիզի պայմաններ՝ 25% (ք/ք) բարձր պինդ նյութերի բեռնվածություն (մոտավորապես 8% գլյուկանային բեռնվածություն), 96 ժամ հիդրոլիզ, 20 մգ/գ առևտրային ֆերմենտային բեռնվածություն (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 հարաբերակցություն) և (Դ) AFEX-ով նախապես մշակված եգիպտացորենի ցանման (ACS) ցանման շաքարի մոնոմերներ և օլիգոմերներ:
Գլիկանային վերլուծությունը ապացուցել է իր օգտակարությունը պինդ կենսազանգվածի մնացորդներից մեկուսացված քաղվածքներում գլիկանների համապարփակ կառուցվածքային վերլուծության համար: Այնուամենայնիվ, ջրում լուծվող սախարիդները թերներկայացված են այս ավանդական մեթոդի դեպքում41, քանի որ ցածր մոլեկուլային քաշով օլիգոսախարիդները դժվար է անշարժացնել ELISA թիթեղների վրա և լվացվում են հակամարմինների ավելացումից առաջ: Հետևաբար, հակամարմինների կապման և բնութագրման համար օգտագործվել է մեկ քայլով բիոտինիլացման մեթոդ՝ ավիդինով պատված ELISA թիթեղների վրա լուծելի, ոչ համապատասխան օլիգոսախարիդները պատելու համար: Այս մեթոդը փորձարկվել է մեր նախկինում արտադրված ACSH-ի և դրա մոլեկուլային քաշի (կամ պոլիմերացման աստիճանի, DP) վրա հիմնված ֆրակցիայի միջոցով: Մեկ քայլով բիոտինիլացումը օգտագործվել է օլիգոսախարիդային կապման կապակցվածությունը մեծացնելու համար՝ ածխաջրածնի վերականգնող ծայրին բիոտին-LC-հիդրազիդ ավելացնելով (Նկար 2): Լուծույթում վերականգնող ծայրում գտնվող կիսացետալային խումբը ռեակցիայի մեջ է մտնում բիոտին-LC-հիդրազիդի հիդրազիդային խմբի հետ՝ հիդրազոնային կապ առաջացնելու համար: NaCNBH3 վերականգնող նյութի առկայության դեպքում հիդրազոնային կապը վերականգնվում է կայուն բիոտինիլացված վերջնական արտադրանքի: Շաքարի վերականգնող ծայրի փոփոխության շնորհիվ հնարավոր դարձավ ցածր DP օլիգոսախարիդների կապումը ELISA թիթեղների հետ, և մեր ուսումնասիրության մեջ դա արվեց ավիդինով պատված թիթեղների վրա՝ օգտագործելով գլիկան-նպատակային mAbs:
Մոնոկլոնալ հակամարմինների սկրինինգ՝ հիմնված ELISA-ի վրա՝ բիոտինիլացված օլիգոսախարիդների համար: Այստեղ (A) համակցված է օլիգոսախարիդների բիոտինիլացումը և հետագա ELISA սկրինինգը՝ NeutrAvidin-ով պատված թիթեղների վրա գլիկան-նպատակային mAbs-ներով, և (B)-ն ցույց է տալիս ռեակցիայի արգասիքների բիոտինիլացման մեկ քայլանոց ընթացակարգը:
Այնուհետև առաջնային և երկրորդային հակամարմիններին ավելացվեցին օլիգոսախարիդ-կոնյուգացված հակամարմիններով ավիդինով պատված թիթեղներ և լվացվեցին լույսի և ժամանակի նկատմամբ զգայուն միջավայրում: Հակամարմինների կապումն ավարտվելուց հետո ավելացրեք TMB սուբստրատ՝ թիթեղը ինկուբացելու համար: Ռեակցիան վերջապես դադարեցվեց ծծմբական թթվով: Ինկուբացված թիթեղները վերլուծվեցին ELISA ընթերցիչով՝ յուրաքանչյուր հակամարմնի կապման ուժը որոշելու համար՝ հակամարմին-սպեցիֆիկ խաչաձև կապը հայտնաբերելու համար: Փորձի մանրամասների և պարամետրերի համար տե՛ս համապատասխան «Նյութեր և մեթոդներ» բաժինը:
Մենք ցույց ենք տալիս այս նոր մշակված մեթոդի օգտակարությունը որոշակի կիրառությունների համար՝ բնութագրելով ACSH-ում առկա լուծելի օլիգոսախարիդները, ինչպես նաև լիգնոցելյուլոզային հիդրոլիզատներից անջատված հում և մաքրված օլիգոսախարիդային ֆրակցիաներում: Ինչպես ցույց է տրված նկար 3-ում, ACSH-ում կենսաացիլացված գլիկոմային փորձարկման մեթոդներով հայտնաբերված ամենատարածված էպիտոպ-փոխարինված քսիլանները սովորաբար ուրոնային (U) կամ մեթիլուրոնային (MeU) և պեկտինային արաբինոգալակտաններն են: Դրանց մեծ մասը հայտնաբերվել է նաև ոչ հիդրոլիզացված պինդ նյութերի (UHS) գլիկանների վերլուծության վերաբերյալ մեր նախորդ ուսումնասիրության մեջ43:
Հակազդող օլիգոսախարիդային էպիտոպների հայտնաբերում՝ բջջային պատի գլիկանին ուղղված մոնոկլոնալ հակամարմնի միջոցով: «Չեզոք» ֆրակցիան ACN ֆրակցիան է, իսկ «թթվային» ֆրակցիան՝ FA ֆրակցիան: Ջերմային քարտեզի վրա ավելի վառ կարմիրները ցույց են տալիս էպիտոպների ավելի բարձր պարունակություն, իսկ ավելի վառ կապույտները՝ դատարկ ֆոն: Սանդղակի վրա գունային արժեքները հիմնված են N=2 բանաձևերի հում OD արժեքների վրա: Հակամարմինների կողմից ճանաչված հիմնական էպիտոպները ներկայացված են աջ կողմում:
Այս ոչ ցելյուլոզային կառուցվածքները չէին կարող կտրվել ամենատարածված ցելյուլոզների և կիսելյուլոզների կողմից փորձարկված առևտրային ֆերմենտային խառնուրդում, որը ներառում է ամենատարածված առևտրային ֆերմենտները: Հետևաբար, դրանց հիդրոլիզի համար անհրաժեշտ են նոր օժանդակ ֆերմենտներ: Անհրաժեշտ ոչ ցելյուլոզային օժանդակ ֆերմենտների բացակայության դեպքում այս ոչ ցելյուլոզային կապերը կանխում են մոնոսախարիդների լիակատար փոխակերպումը, նույնիսկ եթե դրանց հիմնական շաքարային պոլիմերները լայնորեն հիդրոլիզվում են ավելի կարճ բեկորների և լուծվում առևտրային ֆերմենտային խառնուրդների միջոցով:
Սիգնալի բաշխման և դրա կապման ուժի հետագա ուսումնասիրությունը ցույց տվեց, որ կապող էպիտոպները ցածր էին բարձր DP շաքարային ֆրակցիաներում (A, B, C, DP մինչև 20+), քան ցածր DP ֆրակցիաներում (D, E, F, DP) դիմերներում (Նկ. 1): Թթվային բեկորները ավելի տարածված են ոչ ցելյուլոզային էպիտոպներում, քան չեզոք բեկորներում: Այս երևույթները համապատասխանում են մեր նախորդ ուսումնասիրության մեջ դիտարկված օրինաչափությանը, որտեղ բարձր DP-ն և թթվային մասնիկները ավելի դիմացկուն էին ֆերմենտատիվ հիդրոլիզի նկատմամբ: Հետևաբար, ոչ ցելյուլոզային գլիկանային էպիտոպների և U և MeU փոխարինումների առկայությունը կարող է մեծապես նպաստել օլիգոսախարիդների կայունությանը: Պետք է նշել, որ կապման և հայտնաբերման արդյունավետությունը կարող է խնդրահարույց լինել ցածր DP օլիգոսախարիդների համար, հատկապես, եթե էպիտոպը դիմերային կամ եռամերային օլիգոսախարիդ է: Սա կարելի է ստուգել տարբեր երկարությունների առևտրային օլիգոսախարիդների միջոցով, որոնցից յուրաքանչյուրը պարունակում է միայն մեկ էպիտոպ, որը կապվում է որոշակի mAb-ի հետ:
Այսպիսով, կառուցվածքին հատուկ հակամարմինների օգտագործումը բացահայտեց որոշակի տեսակի անզիջող կապեր: Կախված օգտագործվող հակամարմնի տեսակից, համապատասխան լիգացիայի օրինաչափությունից և դրա կողմից առաջացած ազդանշանի ուժգնությունից (ամենաշատ և ամենաքիչ առատ), կարող են նույնականացվել նոր ֆերմենտներ և կիսաքանակորեն ավելացվել ֆերմենտային խառնուրդին՝ ավելի ամբողջական գլիկոկոնվերսիայի համար: ACSH օլիգոսախարիդների վերլուծությունը որպես օրինակ վերցնելով՝ մենք կարող ենք ստեղծել գլիկանային կապերի տվյալների բազա յուրաքանչյուր կենսազանգվածի նյութի համար: Այստեղ պետք է նշել, որ պետք է հաշվի առնել հակամարմինների տարբեր կապակցությունը, և եթե դրանց կապակցությունը անհայտ է, դա որոշակի դժվարություններ կստեղծի տարբեր հակամարմինների ազդանշանները համեմատելիս: Բացի այդ, գլիկանային կապերի համեմատությունը կարող է լավագույնս աշխատել նույն հակամարմնի նմուշների միջև: Այս համառ կապերը կարող են հետագայում կապվել CAZyme տվյալների բազայի հետ, որից մենք կարող ենք նույնականացնել ֆերմենտներ, ընտրել թեկնածու ֆերմենտներ և փորձարկել կապերը խզող ֆերմենտներ կամ մշակել մանրէային համակարգեր՝ այդ ֆերմենտները արտահայտելու համար՝ կենսազտարաններում օգտագործելու համար44:
Գնահատելու համար, թե ինչպես են իմունոլոգիական մեթոդները լրացնում լիգնոցելյուլոզային հիդրոլիզատներում առկա ցածր մոլեկուլային քաշով օլիգոսախարիդները բնութագրելու այլընտրանքային մեթոդները, մենք իրականացրինք MALDI (Նկար 4, S1-S8) և TMS-ից ստացված սախարիդների վերլուծություն՝ հիմնվելով GC-MS-ի վրա նույն վահանակի (Նկար 5) օլիգոսախարիդային մասում: MALDI-ն օգտագործվում է օլիգոսախարիդների մոլեկուլների զանգվածային բաշխումը համապատասխանելու համար նախատեսված կառուցվածքին: Նկար 4-ում ցույց են տրված ACN-A և ACN-B չեզոք բաղադրիչների MS-ը: ACN-A վերլուծությունը հաստատել է պենտոզային շաքարների մի շարք՝ DP 4-8-ից (Նկար 4) մինչև DP 22 (Նկար S1), որոնց կշիռները համապատասխանում են MeU-քսիլան օլիգոսախարիդներին: ACN-B վերլուծությունը հաստատել է պենտոզային և գլյուկօքսիլանային շարքերը DP 8-15-ով: Լրացուցիչ նյութերում, ինչպիսին է նկար S3-ը, FA-C թթվային մասնիկի զանգվածային բաշխման քարտեզները ցույց են տալիս (Me)U տեղակալված պենտոզային շաքարների մի շարք՝ 8-15 DP-ով, որը համապատասխանում է ELISA-ի վրա հիմնված mAb սկրինինգում հայտնաբերված տեղակալված քսիլաններին: Էպիտոպները համապատասխանում են:
ACS-ում առկա լուծելի, ոչ կոմպակտ օլիգոսախարիդների MALDI-MS սպեկտրը։ Այստեղ՝ (A) ACN-A ցածր քաշային միջակայքի ֆրակցիաներ, որոնք պարունակում են մեթիլացված ուրոնաթթվի (DP 4-8) տեղակալված գլյուկուրոօքսիլան օլիգոսախարիդներ և (B) ACN-B քսիլան և մեթիլացված ուրոնաթթվի օլիգոսախարիդներ, որոնք տեղակալված են գլյուկուրոօքսիլանով (DP 8-15):
Հրակայուն օլիգոսախարիդների գլիկանային մնացորդի կազմի վերլուծություն: Այստեղ (A) GC-MS վերլուծության միջոցով ստացված տարբեր օլիգոսախարիդային ֆրակցիաների TMS սախարիդային կազմը: (B) Օլիգոսախարիդներում առկա տարբեր TMS-ից ստացված շաքարների կառուցվածքները: ACN – չեզոք օլիգոսախարիդներ պարունակող ացետոնիտրիլային ֆրակցիա և FA – թթվային օլիգոսախարիդներ պարունակող ֆերուլաթթվի ֆրակցիա:
Մեկ այլ հետաքրքիր եզրակացություն արվեց օլիգոսախարիդային ֆրակցիայի LC-MS վերլուծությունից, ինչպես ցույց է տրված նկար S9-ում (մեթոդները կարելի է տեսնել էլեկտրոնային լրացուցիչ նյութում): Հեքսոզային և -OAc խմբերի բեկորներ բազմիցս դիտարկվել են ACN-B ֆրակցիայի լիգացիայի ընթացքում: Այս հայտնագործությունը ոչ միայն հաստատում է գլիկոմի և MALDI-TOF վերլուծության մեջ դիտարկված բեկորացումը, այլև նոր տեղեկություններ է տրամադրում նախապես մշակված լիգնոցելյուլոզային կենսազանգվածում ածխաջրերի պոտենցիալ ածանցյալների մասին:
Մենք նաև կատարեցինք օլիգոսախարիդների ֆրակցիաների գլիկանային կազմի վերլուծություն՝ օգտագործելով TMS գլիկանային դերիվատացումը: GC-MS-ի միջոցով մենք որոշեցինք նեյրոնային (ոչ ածանցյալ) և թթվային շաքարների (GluA և GalA) կազմը օլիգոսախարիդային ֆրակցիայում (Նկար 5): Գլյուկուրոնաթթուն հանդիպում է C և D թթվային բաղադրիչներում, մինչդեռ գալակտուրոնաթթուն հանդիպում է A և B թթվային բաղադրիչներում, որոնք երկուսն էլ թթվային շաքարների բարձր DP բաղադրիչներ են: Այս արդյունքները ոչ միայն հաստատում են մեր ELISA և MALDI տվյալները, այլև համապատասխանում են օլիգոսախարիդների կուտակման վերաբերյալ մեր նախորդ ուսումնասիրություններին: Հետևաբար, մենք կարծում ենք, որ օլիգոսախարիդների բիոտինիլացումը և հետագա ELISA սկրինինգը օգտագործող ժամանակակից իմունոլոգիական մեթոդները բավարար են տարբեր կենսաբանական նմուշներում լուծելի դիմացկուն օլիգոսախարիդները հայտնաբերելու համար:
Քանի որ ELISA-ի վրա հիմնված mAb սկրինինգի մեթոդները վավերացվել են մի քանի տարբեր մեթոդներով, մենք ցանկացանք ավելի մանրամասն ուսումնասիրել այս նոր քանակական մեթոդի ներուժը: Երկու առևտրային օլիգոսախարիդներ՝ քսիլոհեքսասախարիդ օլիգոսախարիդը (XHE) և 23-α-L-արաբինոֆուրանոզիլ-քսիլոտրիոզը (A2XX), ձեռք են բերվել և փորձարկվել բջջային պատի գլիկանին ուղղված նոր mAb մոտեցմամբ: Նկար 6-ը ցույց է տալիս բիոտինիլացված կապման ազդանշանի և օլիգոսախարիդների կոնցենտրացիայի լոգարիթմական կոնցենտրացիայի միջև գծային կապը, ինչը ենթադրում է Լանգմյուիրի ադսորբցիայի հնարավոր մոդել: mAb-ների շարքում CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 և CCRC-M151-ը համընկնում էին XHE-ի հետ, իսկ CCRC-M108, CCRC-M109 և LM11-ը համընկնում էին A2XX-ի հետ 1 նմ-ից մինչև 100 նանո միջակայքում: Փորձի ընթացքում հակամարմինների սահմանափակ մատչելիության պատճառով, օլիգոսախարիդների յուրաքանչյուր կոնցենտրացիայի հետ սահմանափակ փորձեր են իրականացվել: Այստեղ պետք է նշել, որ որոշ հակամարմիններ շատ տարբեր կերպ են արձագանքում նույն օլիգոսախարիդին որպես սուբստրատ, հավանաբար այն պատճառով, որ դրանք կապվում են մի փոքր տարբեր էպիտոպների հետ և կարող են ունենալ շատ տարբեր կապման կապունակություն: Էպիտոպների ճշգրիտ նույնականացման մեխանիզմներն ու հետևանքները շատ ավելի բարդ կլինեն, երբ նոր mAb մոտեցումը կիրառվի իրական նմուշների վրա:
Տարբեր գլիկան-ուղղորդող mAb-ների հայտնաբերման միջակայքը որոշելու համար օգտագործվել են երկու առևտրային օլիգոսախարիդներ: Այստեղ օլիգոսախարիդների կոնցենտրացիայի լոգարիթմական կոնցենտրացիայի հետ գծային կորելյացիաները ցույց են տալիս (A) XHE-ի mAb-ի և (B) A2XX-ի mAb-ի հետ Լանգմյուրի ադսորբցիայի օրինաչափությունները: Համապատասխան էպիտոպները ցույց են տալիս փորձարկման մեջ որպես սուբստրատներ օգտագործվող առևտրային օլիգոսախարիդների կառուցվածքները:
Գլիկան-նպատակային մոնոկլոնալ հակամարմինների օգտագործումը (գլիկոկոմիկ վերլուծություն կամ ELISA-ի վրա հիմնված mAb սկրինինգ) հզոր գործիք է բույսերի կենսազանգվածը կազմող հիմնական բջջային պատի գլիկանների մեծ մասի խորը բնութագրման համար: Այնուամենայնիվ, դասական գլիկանային վերլուծությունը բնութագրում է միայն ավելի մեծ բջջային պատի գլիկանները, քանի որ օլիգոսախարիդների մեծ մասը արդյունավետորեն չի անշարժացվում ELISA թիթեղների վրա: Այս ուսումնասիրության մեջ AFEX-ով նախապես մշակված եգիպտացորենի ցանքսը ֆերմենտատիվ հիդրոլիզացվել է բարձր պինդ նյութերի պարունակությամբ: Շաքարի վերլուծությունն օգտագործվել է հիդրոլիզատում դիմացկուն բջջային պատի ածխաջրերի կազմը որոշելու համար: Այնուամենայնիվ, հիդրոլիզատներում ավելի փոքր օլիգոսախարիդների mAb վերլուծությունը թերագնահատված է, և օլիգոսախարիդները ELISA թիթեղների վրա արդյունավետորեն անշարժացնելու համար անհրաժեշտ են լրացուցիչ գործիքներ:
Այստեղ մենք ներկայացնում ենք mAb-ի սկրինինգի համար օլիգոսախարիդների անշարժացման նորարարական և արդյունավետ մեթոդ՝ համատեղելով օլիգոսախարիդների բիոտինիլացումը, որին հաջորդում է ELISA սկրինինգը NeutrAvidin™ պատված թիթեղների վրա: Անշարժացված բիոտինիլացված օլիգոսախարիդները ցույց տվեցին բավարար կապակցություն հակամարմնի հետ՝ հնարավորություն տալով արագ և արդյունավետորեն հայտնաբերել անդրդվելի օլիգոսախարիդները: Այս համառ օլիգոսախարիդների կազմի վերլուծությունը՝ հիմնված զանգվածային սպեկտրոմետրիայի վրա, հաստատեց իմունոսկրինինգի այս նոր մոտեցման արդյունքները: Այսպիսով, այս ուսումնասիրությունները ցույց են տալիս, որ օլիգոսախարիդների բիոտինիլացման և ELISA սկրինինգի համադրությունը գլիկան-ուղղված մոնոկլոնալ հակամարմինների հետ կարող է օգտագործվել օլիգոսախարիդներում խաչաձև կապերը հայտնաբերելու համար և կարող է լայնորեն կիրառվել օլիգոսախարիդների կառուցվածքը բնութագրող այլ կենսաքիմիական ուսումնասիրություններում:
Այս բիոտինի վրա հիմնված գլիկանի պրոֆիլավորման մեթոդը առաջին զեկույցն է, որը կարող է ուսումնասիրել բույսերի կենսազանգվածում լուծվող օլիգոսախարիդների անկայուն ածխաջրային կապերը: Սա օգնում է հասկանալ, թե ինչու են կենսազանգվածի որոշ մասեր այդքան համառ կենսավառելիքի արտադրության հարցում: Այս մեթոդը լրացնում է գլիկոմային վերլուծության մեթոդների կարևոր բացը և ընդլայնում է դրա կիրառումը բույսերի օլիգոսախարիդներից դուրս գտնվող ավելի լայն սուբստրատների վրա: Ապագայում մենք կարող ենք օգտագործել ռոբոտաշինությունը բիոտինիլացման համար և օգտագործել մեր մշակած մեթոդը ELISA-ի միջոցով նմուշների բարձր արդյունավետության վերլուծության համար:
Pioneer 33A14 հիբրիդային սերմերից աճեցված եգիպտացորենի ծղոտը (CS) հավաքվել է 2010 թվականին Կոլորադո նահանգի Ռեյի Կրամեր Ֆարմս քաղաքում: Հողատիրոջ թույլտվությամբ այս կենսազանգվածը կարող է օգտագործվել հետազոտությունների համար: Նմուշները պահվել են չոր, < 6% խոնավության պայմաններում, փակվող տոպրակների մեջ, սենյակային ջերմաստիճանում։ Նմուշները պահվել են չոր, < 6% խոնավության պայմաններում, փակվող տոպրակների մեջ, սենյակային ջերմաստիճանում։ Образцы храниль сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температура. Նմուշները պահվել են չոր վիճակում՝ <6% խոնավության պայմաններում, կայծակաճարմանդով փակվող տոպրակների մեջ, սենյակային ջերմաստիճանում։样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температура с влажностью < 6%. Նմուշները պահվում են կայծակաճարմանդ տոպրակների մեջ սենյակային ջերմաստիճանում և < 6% խոնավության պայմաններում։Ուսումնասիրությունը համապատասխանել է տեղական և ազգային ուղեցույցներին: Բաղադրիչ վերլուծությունը կատարվել է NREL արձանագրության միջոցով: Պարզվել է, որ կազմը պարունակում է 31.4% գլյուկան, 18.7% քսիլան, 3.3% արաբինան, 1.2% գալակտան, 2.2% ացետիլ, 14.3% լիգնին, 1.7% սպիտակուց և 13.4% մոխիր:
Cellic® CTec2-ը (138 մգ սպիտակուց/մլ, խմբաքանակ VCNI 0001) Novozymes-ից (Ֆրանկլինտոն, Հյուսիսային Կարոլինա, ԱՄՆ) ցելյուլազի, β-գլյուկոզիդազի և Cellic® HTec2-ի (157 մգ սպիտակուց/մլ, խմբաքանակ VHN00001) բարդ խառնուրդ է: Multifect Pectinase®-ը (72 մգ սպիտակուց/մլ), պեկտինը քայքայող ֆերմենտների բարդ խառնուրդ, նվիրաբերվել է DuPont Industrial Biosciences-ի (Պալո Ալտո, Կալիֆոռնիա, ԱՄՆ) կողմից: Ֆերմենտային սպիտակուցի կոնցենտրացիաները որոշվել են սպիտակուցի պարունակությունը գնահատելով (և ոչ սպիտակուցային ազոտի ներդրումը հանելով)՝ օգտագործելով Կյելդալի ազոտի վերլուծությունը (AOAC մեթոդ 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Իթակա, Նյու Յորք, ԱՄՆ): Դիատոմային հող 545-ը գնվել է EMD Millipore-ից (Բիլլերիկա, Մասաչուսեթս): Ակտիվացված ածուխը (DARCO, 100 mesh գրանուլներ), Ավիցելը (PH-101), հաճարենու քսիլանը և մնացած բոլոր քիմիական նյութերը գնվել են Sigma-Aldrich-ից (Սենթ Լուիս, Միսսուրի):
AFEX նախնական մշակումը կատարվել է GLBRC-ում (Կենսազանգվածի փոխակերպման հետազոտական ​​լաբորատորիա, MSU, Լանսինգ, Միչիգան, ԱՄՆ): Նախնական մշակումը կատարվել է 140°C ջերմաստիճանում 15 րոպե տևողությամբ: 46 րոպե տևողությամբ նստեցման ժամանակ՝ անջուր ամոնիակի և կենսազանգվածի 1:1 հարաբերակցությամբ՝ 60% (ք/ք) բեռնվածությամբ, չժանգոտվող պողպատե սեղանային խմբաքանակային ռեակտորում (Parr Instruments Company): Այն տևել է 30 րոպե: Ռեակտորը տաքացվել է մինչև 140°C, և ամոնիակը արագորեն անջատվել է, ինչը թույլ է տվել կենսազանգվածին արագ վերադառնալ սենյակային ջերմաստիճանի: AFEX նախնական մշակված եգիպտացորենի ցանողի (ACS) կազմը նման էր չմշակված եգիպտացորենի ցանողի (UT-CS) կազմին:
Որպես օլիգոսախարիդների մեծածավալ արտադրության համար ելանյութ պատրաստվել է բարձր պինդ պարունակությամբ ACSH 25% (w/w) (մոտավորապես 8% դեքստրանային բեռնվածություն): ACS-ի ֆերմենտային հիդրոլիզը իրականացվել է առևտրային ֆերմենտային խառնուրդի միջոցով, որը ներառում է Cellic® Ctec2 10 մգ սպիտակուց/գ գլյուկան (նախապես մշակված կենսազանգվածում), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 մգ սպիտակուց/գ գլյուկան և Multifect Pectinase (Genencor Inc, ԱՄՆ): ), 5 մգ սպիտակուց/գ դեքստրան: Ֆերմենտային հիդրոլիզը իրականացվել է 5 լիտրանոց կենսառեակտորում՝ 3 լիտր աշխատանքային ծավալով, pH 4.8, 50°C ջերմաստիճանով և 250 պտ/րոպե արագությամբ: 96 ժամ հիդրոլիզացումից հետո հիդրոլիզատը հավաքվել է ցենտրիֆուգացման միջոցով 6000 պտ/րոպե արագությամբ 30 րոպե, ապա 14000 պտ/րոպե արագությամբ 30 րոպե՝ չհիդրոլիզացված պինդ նյութերը հեռացնելու համար: Այնուհետև հիդրոլիզատը ենթարկվել է ստերիլ ֆիլտրացիայի 0.22 մմ ֆիլտրի բաժակի միջոցով: Ֆիլտրված հիդրոլիզատը պահվել է ստերիլ շշերի մեջ 4°C ջերմաստիճանում, ապա ֆրակցիացվել է ածխածնի վրա:
Քաղվածքի վրա հիմնված կենսազանգվածի նմուշների կազմի վերլուծություն՝ համաձայն NREL լաբորատոր վերլուծության ընթացակարգերի. նմուշների պատրաստում կազմի վերլուծության համար (NREL/TP-510-42620) և կառուցվածքային ածխաջրերի և լիգնինի որոշում կենսազանգվածում (NREL/TP-510 – 42618)47:
Հիդրոլիզատային հոսքի օլիգոսախարիդային վերլուծությունը կատարվել է 2 մլ մասշտաբով՝ ավտոկլավի վրա հիմնված թթվային հիդրոլիզի մեթոդով: Հիդրոլիզատի նմուշը խառնել 69.7 մկլ 72% ծծմբական թթվի հետ 10 մլ պտուտակավոր կափարիչով կուլտուրայի խողովակի մեջ և ինկուբացել 1 ժամ սեղանի վրա 121°C ջերմաստիճանում, սառեցնել սառույցի վրա և զտել բարձր արդյունավետությամբ հեղուկ քրոմատոգրաֆիայի (HPLC) սրվակի մեջ: Օլիգոսախարիդների կոնցենտրացիան որոշվել է՝ թթվային հիդրոլիզացված նմուշում շաքարի ընդհանուր կոնցենտրացիայից հանելով չհիդրոլիզացված նմուշում մոնոսախարիդների կոնցենտրացիան:
Թթվային հիդրոլիզացված կենսազանգվածում գլյուկոզի, քսիլոզի և արաբինոզի կոնցենտրացիաները վերլուծվել են Shimadzu HPLC համակարգի միջոցով, որը հագեցած է ավտոնմուշառիչով, սյունակի տաքացուցիչով, իզոկրատիկ պոմպով և Bio-Rad Aminex HPX-87H սյան վրա գտնվող ռեֆրակցիայի ցուցիչի դետեկտորով: Սյունակը պահպանվել է 50°C ջերմաստիճանում և էլուացվել է 0.6 մլ/րոպե 5 մՄ H2SO4 ջրային հոսքով:
Հիդրոլիզատի վերին շերտը նոսրացվել և վերլուծվել է մոնոմերի և օլիգոսախարիդների պարունակության համար: Ֆերմենտատիվ հիդրոլիզից հետո ստացված մոնոմերային շաքարները վերլուծվել են HPLC-ի միջոցով, որը հագեցած է Bio-Rad (Հերկուլես, Կալիֆոռնիա) Aminex HPX-87P սյունակով և մոխրի պաշտպանիչ սյունակով: Սյունակի ջերմաստիճանը պահպանվել է 80°C-ի վրա, ջուրն օգտագործվել է որպես շարժական փուլ՝ 0.6 մլ/րոպե հոսքի արագությամբ: Օլիգոսախարիդները որոշվել են նոսր թթվում 121°C-ում հիդրոլիզի միջոցով՝ համաձայն 41, 48, 49 հղումներում նկարագրված մեթոդների:
Սախարիդային վերլուծությունը կատարվել է հում, AFEX-ով նախապես մշակված և բոլոր չհիդրոլիզացված կենսազանգվածի մնացորդների վրա (ներառյալ բջջային պատի սերիական քաղվածքների արտադրությունը և դրանց mAb-ի ստուգումը)՝ օգտագործելով նախկինում նկարագրված ընթացակարգերը 27, 43, 50, 51: Գլիկոմային վերլուծության համար բույսերի բջջային պատի նյութի ալկոհոլում չլուծվող մնացորդները պատրաստվում են կենսազանգվածի մնացորդներից և ենթարկվում են սերիական արդյունահանման՝ օգտագործելով ավելի ու ավելի ագրեսիվ ռեակտիվներ, ինչպիսիք են ամոնիումի օքսալատը (50 մՄ), նատրիումի կարբոնատը (50 մՄ և 0.5% w/v), CON.-ը (1Մ և 4Մ, երկուսն էլ՝ 1% w/v նատրիումի բորոհիդրիդով) և թթվային քլորիտը, ինչպես նախկինում նկարագրվել է 52,53: Այնուհետև արդյունահանումները ենթարկվել են ELISA-ի՝ բջջային պատի գլիկանին ուղղված mAb50-ների բարդ վահանակի նկատմամբ, և mAb-ի կապման ռեակցիաները ներկայացվել են որպես ջերմային քարտեզ: Բույսերի բջջային պատի գլիկանին ուղղված mAb-ները գնվել են լաբորատոր պաշարներից (CCRC, JIM և MAC շարքեր):
Օլիգոսախարիդների միափուլ բիոտինիլացում։ Ածխաջրերի կոնյուգացիան բիոտին-LC-հիդրազիդի հետ իրականացվել է հետևյալ ընթացակարգով։ Բիոտին-LC-հիդրազիդը (4.6 մգ/12 մկմոլ) լուծվել է դիմեթիլսուլֆօքսիդում (DMSO, 70 մկլ)՝ եռանդուն խառնելով և տաքացնելով 65°C ջերմաստիճանում 1 րոպե։ Ավելացվել է սառցադաշտային քացախաթթու (30 մկլ) և խառնուրդը լցվել է նատրիումի ցիանոբորոհիդրիդի (6.4 մգ/100 մկմոլ) վրա և ամբողջությամբ լուծվել է 65°C ջերմաստիճանում մոտ 1 րոպե տաքացնելուց հետո։ Այնուհետև, ռեակցիոն խառնուրդի 5-ից 8 մկլ ավելացվել է չորացրած օլիգոսախարիդին (1-100 նմոլ)՝ վերականգնող ծայրի վրա պիտակի 10-ապատիկ կամ ավելի մոլային ավելցուկ ստանալու համար։ Ռեակցիան իրականացվել է 65°C ջերմաստիճանում 2 ժամ, որից հետո նմուշները անմիջապես մաքրվել են։ Առանց վերականգնման պիտակավորման փորձերում նատրիումի ցիանոբորոհիդրիդ չի օգտագործվել, և նմուշները ռեակցիայի մեջ են մտել 65°C ջերմաստիճանում 2.5 ժամ։
Բիոտինիլացված օլիգոսախարիդների նմուշների ELISA ծածկույթ և լվացում: Ավիդինով ծածկված ափսեի յուրաքանչյուր փոսիկին ավելացվել է 25 մկլ բիոտինիլացված նմուշ (յուրաքանչյուր կոնցենտրացված նմուշի 100 մկլ նոսրացված 0.1 Մ Tris բուֆերային լուծույթի (TBS) 5 մլ-ում): Վերահսկիչ փոսիկները ծածկվել են 50 մկլ բիոտինով՝ 10 մկգ/մլ կոնցենտրացիայով 0.1 Մ TBS-ում: Ապաիոնացված ջուրը օգտագործվել է որպես ծածկույթ դատարկ չափումների համար: Հաբը ինկուբացվել է 2 ժամ սենյակային ջերմաստիճանում մթության մեջ: Թիթեղը 3 անգամ լվանալ 0.1% յուղազրկված կաթով 0.1 Մ TBS-ում՝ օգտագործելով Grenier flat 3A-ի համար նախատեսված 11 ծրագիրը:
Առաջնային հակամարմինների ավելացում և լվացում։ Յուրաքանչյուր փոսիկի մեջ ավելացրեք 40 մկլ առաջնային հակամարմին։ Միկրոթիթեղը ինկուբացրեք 1 ժամ սենյակային ջերմաստիճանում, մթության մեջ։ Այնուհետև թիթեղները լվացվեցին 3 անգամ 0.1% կաթով 0.1M TBS լուծույթով՝ օգտագործելով Grenier Flat 3A-ի համար նախատեսված #11 լվացման ծրագիրը։
Ավելացրեք երկրորդային հակամարմին և լվացեք։ Յուրաքանչյուր փոսիկի մեջ ավելացրեք 50 մկլ մկան/առնետի երկրորդային հակամարմին (նոսրացված 1:5000 հարաբերակցությամբ 0.1% կաթի մեջ 0.1 Մ TBS լուծույթում): Միկրոթիթեղը ինկուբացրեք 1 ժամ սենյակային ջերմաստիճանում, մթության մեջ: Այնուհետև միկրոթիթեղները լվացվեցին 5 անգամ 0.1% կաթով 0.1 Մ TBS լուծույթում՝ օգտագործելով Grenier Flat 5A թիթեղների լվացման #12 ծրագիրը:
Սուբստրատի ավելացում։ Հիմքային սուբստրատին ավելացրեք 50 մկլ 3,3′,5,5′-տետրամեթիլբենզիդին (TMB) (ավելացնելով 2 կաթիլ բուֆեր, 3 կաթիլ TMB, 2 կաթիլ ջրածնի պերօքսիդ 15 ​​մլ ապաիոնացված ջրի մեջ)։ Պատրաստեք TMB սուբստրատը և օգտագործելուց առաջ խառնեք։ Միկրոթիթեղը ինկուբացրեք սենյակային ջերմաստիճանում 30 րոպե։ Մթության մեջ։
Ավարտեք քայլը և կարդացեք դեղահաբը։ Յուրաքանչյուր փոսիկի մեջ ավելացրեք 50 մկլ 1 Ն ծծմբական թթու և գրանցեք աբսորբցիան ​​450-ից մինչև 655 նմ՝ օգտագործելով ELISA ընթերցող։
Պատրաստեք այս անալիտների 1 մգ/մլ լուծույթներ ապաիոնացված ջրում՝ արաբինոզ, ռամնոզ, ֆուկոզ, քսիլոզ, գալակտուրոնաթթու (GalA), գլյուկուրոնաթթու (GlcA), մանոզ, գլյուկոզ, գալակտոզա, լակտոզա, N-ացետիլմանոզամին (manNAc), N-ացետիլգլյուկոզամին (glcNAc), N-ացետիլգալակտոզամին (galNAc), ինոզիտոլ (ներքին ստանդարտ): Երկու ստանդարտ պատրաստվել են՝ ավելացնելով աղյուսակ 1-ում ներկայացված 1 մգ/մլ շաքարի լուծույթները: Նմուշները սառեցվել և լիոֆիլացվել են -80°C ջերմաստիճանում, մինչև ջուրն ամբողջությամբ հեռացվի (սովորաբար մոտ 12-18 ժամ):
Անալիտիկ կշեռքի վրա պտուտակավոր կափարիչով խողովակների մեջ ավելացրեք 100-500 մկգ նմուշ։ Գրանցեք ավելացված քանակը։ Լավագույնն է նմուշը լուծել լուծիչի որոշակի կոնցենտրացիայի մեջ և ավելացնել այն խողովակի մեջ որպես հեղուկ ալիքվոտ։ Յուրաքանչյուր նմուշային խողովակի համար օգտագործեք 20 մկլ 1 մգ/մլ ինոզիտոլ որպես ներքին ստանդարտ։ Նմուշին ավելացված ներքին ստանդարտի քանակը պետք է նույնը լինի, ինչ ստանդարտ խողովակին ավելացված ներքին ստանդարտի քանակը։
Պտուտակավոր կափարիչով սրվակի մեջ ավելացրեք 8 մլ անջուր մեթանոլ: Այնուհետև ավելացրեք 4 մլ 3 Ն մեթանոլային HCl լուծույթ, փակեք կափարիչը և թափահարեք: Այս գործընթացում ջուր չի օգտագործվում:
Օլիգոսախարիդային նմուշներին և ստանդարտ TMS խողովակներին ավելացրեք 500 մկլ 1 Մ HCl մեթանոլի լուծույթ: Նմուշները ինկուբացվել են գիշերը (168 ժամ) 80°C ջերմաստիճանում ջերմային բլոկում: Մեթանոլիզի արգասիքները չորացրեք սենյակային ջերմաստիճանում՝ օգտագործելով չորացման բազմաձևացուցիչ: Ավելացրեք 200 մկլ MeOH և կրկին չորացրեք: Այս գործընթացը կրկնվում է երկու անգամ: Նմուշին ավելացրեք 200 մկլ մեթանոլ, 100 մկլ պիրիդին և 100 մկլ քացախային անհիդրիդ և լավ խառնեք: Նմուշները ինկուբացեք սենյակային ջերմաստիճանում 30 րոպե: Այնուհետև չորացրեք: Ավելացրեք 200 մկլ մեթանոլ և կրկին չորացրեք:
Ավելացրեք 200 մկլ Tri-Sil և տաքացրեք խողովակը կափարիչով 20 րոպե: 80°C ջերմաստիճանում, ապա սառեցրեք մինչև սենյակային ջերմաստիճան: Օգտագործեք չորացման բազմաբնույթ սարք՝ նմուշը մոտավորապես 50 մկլ ծավալով չորացնելու համար: Կարևոր է նշել, որ մենք թույլ չենք տվել, որ նմուշները լիովին չորանան:
Ավելացրեք 2 մլ հեքսան և լավ խառնեք պտույտով։ Պաստերի պիպետների ծայրերը (5-8 մմ) լցրեք ապակե բամբակի մի կտորով՝ այն տեղադրելով 5-3/4 դյույմ տրամագծով պիպետի վրա։ Նմուշները ցենտրիֆուգացվել են 3000 գ-ի տակ 2 րոպե։ Անլուծելի մնացորդները նստվածք են ստացել։ Չորացրեք նմուշը մինչև 100-150 մկլ։ Մոտավորապես 1 մկլ ծավալ ներարկվել է GC-MS-ի մեջ՝ 80 °C սկզբնական ջերմաստիճանում և 2.0 րոպե սկզբնական ժամանակում (աղյուսակ 2):