Nature.com сайтына кергәнегез өчен рәхмәт. Сез куллана торган браузер версиясендә CSS ярдәме чикләнгән. Иң яхшы тәҗрибә өчен, без сезгә яңартылган браузер кулланырга киңәш итәбез (яки Internet Explorer'да туры килүчәнлек режимын сүндерегез). Шуңа кадәр, ярдәмне дәвам итү өчен, без сайтны стильләрсез һәм JavaScriptсыз күрсәтәчәкбез.
AFEX белән алдан эшкәртелгән кукуруз пирогындагы персистент олигосахаридларны комплекслы анализлау өчен яңа иммунологик һәм масса-спектрометрик ысуллар. Лигноцеллюлоза биомассасы казылма ягулыкларга тотрыклы альтернатива булып тора һәм азык-төлек, терлек азыгы, ягулык һәм химик матдәләр кебек продуктлар җитештерү өчен биотехнологияләрне эшләү өчен киң кулланыла. Бу технологияләрнең төп ачкычы - үсемлек күзәнәк тышчаларында булган катлаулы углеводларны глюкоза, ксилоза һәм арабиноза кебек гади шикәрләргә әйләндерү өчен бәягә конкурентлы процессларны эшләү. Лигноцеллюлоза биомассасы бик нык булганлыктан, теләгән продуктны алу өчен аны термохимик эшкәртүләргә (мәсәлән, аммиак җепселләрен эксфолиацияләү (AFEX), сыек кислоталар (DA), ион сыеклыклары (IL)) һәм биологик эшкәртүләргә (мәсәлән, ферментатив гидролиз һәм микроб ферментациясе) берләштереп үткәрергә кирәк. Ләкин, гидролиз процессында коммерция гөмбә ферментлары кулланылганда, барлыкка килгән эри торган шикәрләрнең нибары 75-85% ы моносахаридлар, ә калган 15-25% ы эри торган, чишелми торган олигосахаридлар, алар микроорганизмнар өчен һәрвакыт та мөмкин түгел. Элегрәк без углерод һәм диатомлы җир аеру һәм зурлыкны чыгару хроматографиясен кулланып, эри торган каты олигосахаридларны уңышлы аерып алдык һәм чистарттык, шулай ук ​​аларның фермент ингибитор үзлекләрен тикшердек. Без югарырак дәрәҗәдәге полимерлашу (DP) метилланган урон кислотасы алмаштыруларын үз эченә алган олигосахаридларны түбән DP һәм нейтраль олигосахаридларга караганда коммерция ферментлары катнашмалары белән эшкәртү авыррак икәнен ачыкладык. Монда без берничә өстәмә ысул куллану турында хәбәр итәбез, шул исәптән үсемлек күзәнәк стеналарында гликан бәйләнешләрен характерлау өчен үсемлек биомассасы гликаннарына хас моноклональ антитәнчекләр (mAbs) кулланып гликан профильләү һәм ферментатив гидролизатлар, матрица ярдәмендә лазер десорбциясе ионизациясе, очыш вакыты масса-спектрометриясе. . MALDI-TOF-MS) тискәре ионнарның икенчел таркалуыннан соң спектроскопия, газ хроматографиясе һәм масса-спектрометрия (GC-MS) ярдәмендә алынган структура-информатик диагностик пикларны олигосахарид бәйләнешләрен дериватизация белән һәм дериватизациясез характерлау өчен куллана. Олигосахаридларның кечкенә зурлыгы аркасында (DP 4–20), бу молекулаларны mAb бәйләнеше һәм характеристикасы өчен куллану авыр. Бу проблеманы хәл итү өчен, без микропластина өслегендә түбән DP эри торган олигосахаридларның күпчелеген уңышлы билгеләгән яңа биотин конъюгациясенә нигезләнгән олигосахарид иммобилизацияләү ысулын кулландык, ул аннары махсус лигация анализы өчен югары үткәрүчәнлекле mAb системасында кулланылды. Бу яңа ысул киләчәктә биомаркерларда булган олигосахаридларны диагностик максатларда аеру һәм характерлау өчен кулланылырга мөмкин булган алга киткән югары үткәрүчәнлекле гликом анализларын эшләүгә ярдәм итәчәк.
Лигноцеллюлоза биомассасы, авыл хуҗалыгы, урман хуҗалыгы, үлән һәм агач материалларыннан тора, югарырак кыйммәтле продуктлар җитештерү өчен азык-төлек, терлек азыгы, ягулык һәм химик прекурсорлар кебек биологик нигезле продуктлар җитештерү өчен потенциаль чимал булып тора1. Үсемлек күзәнәк тышчаларында булган углеводлар (мәсәлән, целлюлоза һәм гемицеллюлоза) химик эшкәртү һәм биотрансформация (мәсәлән, ферментатив гидролиз һәм микроб ферментациясе) юлы белән моносахаридларга деполимерлаша. Гадәти алдан эшкәртүләргә аммиак җепселләрен киңәйтү (AFEX), сыек кислота (DA), ион сыеклыгы (IL) һәм пар шартлавы (SE) керә, алар үсемлек күзәнәк тышчаларын ачу юлы белән лигноцеллюлоза җитештерүне киметү өчен химик матдәләр һәм җылылык комбинациясен кулланалар3,4. матдәнең ныклыгы, 5. Ферментатив гидролиз югары каты матдәләр йөкләнешендә коммерция актив углеводлы ферментлар (CAZymes) кулланып һәм трансген чүпрәләре яки бактерияләр кулланып биологик нигезле ягулыклар һәм химик матдәләр җитештерү өчен микроб ферментациясе ярдәмендә башкарыла6.
Коммерция ферментларындагы CAZymes ферментларның катлаулы катнашмасыннан тора, алар катлаулы углевод-шикәр бәйләнешләрен синергетик рәвештә өзеп, моносахаридлар барлыкка китерә2,7. Элегрәк хәбәр иткәнебезчә, лигнинның углеводлар белән ароматик полимерларының катлаулы челтәре аларны бик катлаулы итә, бу шикәрнең тулысынча үзгәрүенә китерә, алдан эшкәртелгән биомассаның ферментатив гидролизы вакытында җитештерелмәгән җенес олигосахаридларының 15-25% ын җыя. Бу төрле биомасса алдан эшкәртү ысуллары белән еш очрый торган проблема. Бу киртәнең кайбер сәбәпләре арасында гидролиз вакытында ферментларның ингибирлануы яки үсемлек биомассасында шикәр бәйләнешләрен өзү өчен кирәкле мөһим ферментларның булмавы яки түбән дәрәҗәсе бар. Олигосахаридлардагы шикәр бәйләнешләре кебек шикәрләрнең составын һәм структураль үзенчәлекләрен аңлау гидролиз вакытында шикәрнең әйләнүен яхшыртырга ярдәм итәчәк, биотехнологик процессларны нефть продуктлары белән көндәшлеккә сәләтле итәчәк.
Углеводларның структурасын билгеләү катлаулы һәм сыек хроматография (LC)11,12, ядрә магнит-резонанс спектроскопиясе (ЯМР)13, капилляр электрофорез (CE)14,15,16 һәм масса-спектрометрия (MS)17 кебек ысулларны берләштерергә кирәк. ,унсигез. Очыш вакыты масса-спектрометриясе, лазер десорбциясе һәм матрица ярдәмендә ионлаштыру (MALDI-TOF-MS) кебек MS ысуллары углевод структураларын ачыклау өчен күпкырлы ысул булып тора. Соңгы вакытта натрий ионнары аддуктларының бәрелештән килеп чыккан диссоциациясе (CID) тандем MS олигосахаридларның беркетү позицияләренә, аномер конфигурацияләренә, эзлеклелекләренә һәм тармаклану позицияләренә туры килә торган бармак эзләрен ачыклау өчен иң киң кулланыла 20, 21.
Гликан анализы углевод бәйләнешләрен тирәнтен ачыклау өчен бик яхшы корал булып тора22. Бу ысул катлаулы углевод бәйләнешләрен аңлау өчен зондлар буларак үсемлек күзәнәк тышчасы гликанына юнәлтелгән моноклональ антитәнчекләрне (mAbs) куллана. Дөнья күләмендә 250 дән артык мAbs бар, алар төрле сахаридлар кулланып төрле сызыклы һәм тармакланган олигосахаридларга каршы эшләнгән24. Үсемлек күзәнәк тышчасы структурасын, составын һәм модификацияләрен характерлау өчен берничә мAbs киң кулланыла, чөнки үсемлек күзәнәк төренә, органга, яшькә, үсеш стадиясенә һәм үсеш мохитенә карап зур аермалар бар25,26. Соңгы вакытта бу ысул үсемлек һәм хайван системаларындагы везикула популяцияләрен һәм аларның гликан транспортындагы ролен субклетка маркерлары, үсеш стадияләре яки мохит стимуллары белән билгеләнә торган рольләрен аңлау һәм ферментатив активлыкны билгеләү өчен кулланыла. Гликаннар һәм ксиланнарның төрле структуралары арасында пектин (P), ксилан (X), маннан (M), ксилоглюканнар (XylG), катнаш бәйләнеш глюканнары (MLG), арабиноксилан (ArbX), галактоманнан (GalG), глюкурон кислотасы-арабиноксилан (GArbX) һәм арабино-галактан (ArbG) бар.
Шулай да, бу тикшеренүләргә карамастан, югары каты матдәләр йөкләнеше (HSL) гидролизы вакытында олигосахарид туплану характерына, шул исәптән олигосахарид бүленеп чыгуына, гидролиз вакытында олигомер чылбыр озынлыгы үзгәрешләренә, төрле түбән ДП полимерларына һәм аларның кәкреләренә багышланган тикшеренүләр аз гына. бүленешләр 30,31,32. Шул ук вакытта, гликан анализы гликан структурасын комплекслы анализлау өчен файдалы корал булып чыкса да, суда эри торган түбән ДП олигосахаридларын антитәнчек ысуллары ярдәмендә бәяләү авыр. Молекуляр авырлыгы 5-10 кДадан кимрәк булган кечерәк ДП олигосахаридлары ELISA пластиналарына бәйләнми 33, 34 һәм антитәнчекләр өстәгәнче юылып китә.
Монда без беренче тапкыр авидин белән капланган пластиналарда моноклональ антитәнчекләр кулланып ELISA анализын күрсәтәбез, ул эри торган рефрактер олигосахаридлар өчен бер адымлы биотинилләштерү процедурасын гликом анализы белән берләштерә. Гликом анализына карашыбыз гидролизланган шикәр составларын триметилсилил (TMS) дериватизацияләү ярдәмендә комплементар олигосахарид бәйләнешләренең MALDI-TOF-MS һәм GC-MS нигезендәге анализы белән расланды. Бу инновацион ысул киләчәктә югары җитештерүчәнлекле ысул буларак эшләнергә һәм биомедицина тикшеренүләрендә киңрәк кулланылыш табарга мөмкин35.
Ферментларның һәм антитәнчекләрнең трансляциядән соңгы модификацияләре, мәсәлән, гликозиллашу,36 аларның биологик активлыгына тәэсир итә. Мәсәлән, сыворотка аксымнарының гликозиллашуындагы үзгәрешләр ялкынсыну артритында мөһим роль уйный, һәм гликозиллашудагы үзгәрешләр диагностик маркерлар буларак кулланыла37. Әдәбиятта төрле гликаннарның төрле авыруларда, шул исәптән ашказаны-эчәк тракты һәм бавырның хроник ялкынсыну авыруларында, вируслы инфекцияләрдә, аналык, күкрәк һәм простата яман шешләрендә җиңел күренүе турында хәбәр ителә38,39,40. Антитәнчекләргә нигезләнгән гликан ELISA ысулларын кулланып, гликаннарның структурасын аңлау катлаулы склероз ысулларын кулланмыйча авыру диагнозын куюда өстәмә ышаныч бирәчәк.
Безнең алдагы тикшеренүләр күрсәткәнчә, катгый олигосахаридлар алдан эшкәртүдән һәм ферментатив гидролиздан соң гидролизланмаган килеш кала (1 нче рәсем). Элегрәк бастырылган эшебездә без AFEX белән алдан эшкәртелгән кукуруз гидролизатыннан (ACSH)8 олигосахаридларны аерып алу өчен активлаштырылган күмер каты фазалы экстракция ысулын эшләдек. Башлангыч экстракциядән һәм аерудан соң, олигосахаридлар зурлыкны аеру хроматографиясе (SEC) ярдәмендә фракцияләнде һәм молекуляр авырлык тәртибендә җыелды. Төрле алдан эшкәртүдән аерылган шикәр мономерлары һәм олигомерлары шикәр составын анализлау ярдәмендә анализланды. Төрле алдан эшкәртү ысуллары белән алынган шикәр олигомерларының эчтәлеген чагыштырганда, катгый олигосахаридларның булуы биомассаны моносахаридларга әйләндерүдә еш очрый торган проблема булып тора һәм шикәр күләмен ким дигәндә 10-15% ка, хәтта 18% ка кадәр киметүгә китерергә мөмкин. АКШта бу ысул олигосахарид фракцияләрен алга таба зур күләмдә җитештерү өчен кулланыла. Нәтиҗәдә барлыкка килгән ACH һәм аннан соңгы төрле молекуляр авырлыктагы фракцияләр бу эштә олигосахаридларны характерлау өчен эксперименталь материал буларак кулланылды.
Алдан эшкәртү һәм ферментатив гидролиздан соң, даими олигосахаридлар гидролизланмаган килеш калган. Монда (A) олигосахаридларны аеру ысулы күрсәтелгән, анда олигосахаридлар AFEX белән алдан эшкәртелгән кукуруз гидролизатыннан (ACSH) активлаштырылган күмер һәм диатомлы җир катламы ярдәмендә аерыла; (B) Олигосахаридларны аеру ысулы. Олигосахаридлар зурлыкны аеру хроматографиясе (SEC) ярдәмендә аерылган; (C) Төрле алдан эшкәртүләрдән аерылган сахарид мономерлары һәм олигомерлары (сыекландырылган кислота: DA, ионлы сыеклык: IL һәм AFEX). Ферментатив гидролиз шартлары: каты матдәләрнең югары күләме 25% (w/w) (якынча 8% глюкан күләме), 96 сәгать гидролиз, 20 мг/г коммерция фермент күләме (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 нисбәте) һәм (D) AFEX алдан эшкәртелгән кукуруз пирогын (ACS) чыгарган глюкоза, ксилоза һәм арабинозаның шикәр мономерлары һәм олигомерлары.
Гликан анализы каты биомасса калдыкларыннан аерып алынган экстрактлардагы гликаннарның комплекслы структураль анализы өчен файдалы корал булып чыкты. Ләкин, бу традицион ысулны кулланып, суда эри торган сахаридлар аз күрсәтелә41, чөнки түбән молекуляр авырлыктагы олигосахаридларны ELISA пластиналарында иммобилизацияләү авыр һәм антитәнчекләр өстәгәнче юып ташлыйлар. Шуңа күрә, антитәнчекләр бәйләү һәм характеристика ясау өчен, авидин белән капланган ELISA пластиналарында эри торган, туры килмәгән олигосахаридларны каплау өчен бер этаплы биотинилләштерү ысулы кулланылды. Бу ысул безнең элек җитештерелгән ACSH һәм аның молекуляр авырлыгына (яки полимеризация дәрәҗәсе, DP) нигезләнгән фракция ярдәмендә сыналды. Бер этаплы биотинилләштерү углеводның киметү очына биотин-LC-гидразид өстәп, олигосахарид бәйләү аффинлыгын арттыру өчен кулланылды (2 нче рәсем). Эретмәдә киметү очындагы гемиацеталь төркем биотин-LC-гидразидның гидразид төркеме белән реакциягә кереп, гидразон бәйләнеше барлыкка китерә. NaCNBH3 редукторы булганда, гидразон бәйләнеше тотрыклы биотинилләштерелгән продуктка әйләнә. Шикәр редукторын үзгәртү белән, түбән ДП олигосахаридларын ELISA пластинкаларына бәйләү мөмкин булды, һәм безнең тикшеренүдә бу гликанга юнәлтелгән mAbs кулланып авидин белән капланган пластинкаларда эшләнде.
Биотинланган олигосахаридлар өчен ELISA нигезендә моноклональ антитәнчекләрне скрининглау. Монда (A) олигосахаридларны берләштерелгән биотинилләштерү һәм аннан соң NeutrAvidin белән капланган пластиналарда гликанга юнәлтелгән mAbs белән ELISA скринингы һәм (B) реакция продуктларын биотинилләштерү өчен бер адымлы процедура күрсәтелгән.
Олигосахарид белән конъюгацияләнгән антитәнчекләр белән авидин белән капланган пластиналар аннары беренчел һәм икенчел антитәнчекләргә өстәлде һәм яктылыкка һәм вакытка сизгер мохиттә юылды. Антитәнчекләр бәйләнеше тәмамланганнан соң, пластинаны инкубацияләү өчен TMB субстратын өстәгез. Реакция, ниһаять, күкерт кислотасы белән туктатылды. Инкубацияләнгән пластиналар ELISA уку җайланмасы ярдәмендә анализланды, һәр антитәнчекнең бәйләнеш көчен билгеләү өчен, антитәнчекләргә хас кисешмә бәйләнешне ачыклау максатыннан. Тәҗрибә турында тулырак мәгълүмат һәм параметрлар өчен тиешле "Материаллар һәм методлар" бүлеген карагыз.
Без бу яңа эшләнгән ысулның конкрет кушымталар өчен файдалылыгын ACSHда, шулай ук ​​лигноцеллюлоза гидролизатларыннан аерылган чимал һәм чистартылган олигосахарид фракцияләрендә булган эри торган олигосахаридларны характерлау юлы белән күрсәтәбез. 3 нче рәсемдә күрсәтелгәнчә, биоацилләштерелгән гликом анализы ысулларын кулланып ACSHда ачыкланган иң еш очрый торган эпитоп белән алыштырылган ксиланнар гадәттә урон (U) яки метилурон (MeU) һәм пектик арабиногалактаннар. Аларның күбесе шулай ук ​​гидролизланмаган каты матдәләрнең (UHS) гликаннарын анализлау буенча безнең алдагы тикшеренүдә дә табылган иде43.
Күзәнәк тышчасы гликанына юнәлтелгән моноклональ антитәнчек ярдәмендә баш тартучы олигосахарид эпитопларын ачыклау. "Нейтраль" фракция - ACN фракциясе, ә "әче" фракция - FA фракциясе. Җылылык картасындагы яктырак кызыл төсләр эпитопның югарырак булуын, ә яктырак зәңгәр төсләр буш фонны күрсәтә. Шкаладагы төс кыйммәтләре N=2 формулалары өчен чимал OD кыйммәтләренә нигезләнгән. Антитәнчекләр тарафыннан танылган төп эпитоплар уң якта күрсәтелгән.
Бу целлюлоза булмаган структураларны сыналган коммерция ферментлары катнашмасындагы иң еш очрый торган целлюлозалар һәм гемицеллюлазалар кисә алмады, алар арасында иң еш кулланыла торган коммерция ферментлары да бар. Шуңа күрә аларның гидролизы өчен яңа ярдәмче ферментлар кирәк. Кирәкле целлюлоза булмаган өстәмә ферментлар булмаганда, бу целлюлоза булмаган бәйләнешләр моносахаридларга тулысынча әйләнергә комачаулый, хәтта аларның төп шикәр полимерлары кыскарак фрагментларга киң гидролизланса һәм коммерция ферментлары катнашмалары ярдәмендә эретелсә дә.
Сигнал таралуын һәм аның бәйләнеш көчен алга таба өйрәнү күрсәткәнчә, бәйләнеш эпитоплары югары DP шикәр фракцияләрендә (A, B, C, DP 20+ кадәр) түбән DP фракцияләренә (D, E, F, DP) караганда түбәнрәк булган (1 нче рәсем). Кислота фрагментлары целлюлоза булмаган эпитопларда нейтраль фрагментларга караганда ешрак очрый. Бу күренешләр безнең алдагы тикшеренүдә күзәтелгән үрнәк белән туры килә, анда югары DP һәм кислота өлешләре ферментатив гидролизга чыдамрак булган. Шуңа күрә целлюлоза булмаган гликан эпитоплары һәм U һәм MeU алмаштырулары булу олигосахаридларның тотрыклылыгына зур өлеш кертә ала. Шунысын да билгеләп үтәргә кирәк, бәйләнеш һәм ачыклау нәтиҗәлелеге түбән DP олигосахаридлары өчен проблемалы булырга мөмкин, бигрәк тә эпитоп димер яки тример олигосахарид булса. Моны төрле озынлыктагы коммерция олигосахаридлары ярдәмендә тикшерергә мөмкин, һәрберсендә билгеле бер mAb белән бәйләнешкә кергән бер генә эпитоп бар.
Шулай итеп, структурага хас антитәнчекләр куллану билгеле бер төрдәге каршылыклы бәйләнешләрне ачыклады. Кулланылган антитәнчек төренә, тиешле бәйләү үрнәгенә һәм ул чыгарган сигналның көченә (иң күп һәм иң аз) карап, яңа ферментларны ачыкларга һәм тулырак гликоконверсия өчен фермент катнашмасына ярымсанлы рәвештә өстәргә мөмкин. ACSH олигосахаридларын анализлау мисалын алып, без һәр биомасса материалы өчен гликан бәйләнешләре базасын булдыра алабыз. Монда антитәнчекләрнең төрле якынлыгын исәпкә алырга кирәклеген билгеләп үтәргә кирәк, һәм аларның якынлыгы билгесез булса, бу төрле антитәнчекләрнең сигналларын чагыштырганда билгеле бер кыенлыклар тудырачак. Моннан тыш, гликан бәйләнешләрен чагыштыру бер үк антитәнчек өчен үрнәкләр арасында иң яхшы эшләргә мөмкин. Аннары бу нык бәйләнешләрне CAZyme базасына тоташтырырга мөмкин, аннан без ферментларны ачыклый алабыз, кандидат ферментларны сайлый алабыз һәм бәйләнешләрне өзүче ферментларны тикшерә алабыз, яки биорезервация заводларында куллану өчен бу ферментларны экспрессияләү өчен микроб системаларын эшли алабыз44.
Лигноцеллюлоза гидролизатларында булган түбән молекуляр авырлыктагы олигосахаридларны характерлау өчен иммунологик ысулларның альтернатив ысулларны ничек тулыландыруын бәяләү өчен, без MALDI (4 нче рәсем, S1-S8) һәм GC-MS нигезендә TMS-тан алынган сахаридлар анализын бер үк панельдә (5 нче рәсем) олигосахарид өлешендә үткәрдек. MALDI олигосахарид молекулаларының масса бүленеше максатчан структурага туры киләме-юкмы икәнен чагыштыру өчен кулланыла. 4 нче рәсемдә ACN-A һәм ACN-B нейтраль компонентларының MS күрсәтелгән. ACN-A анализы DP 4–8 дән (4 нче рәсем) DP 22 гә кадәр (S1 нче рәсем) пентоза шикәрләре диапазонын раслады, аларның авырлыклары MeU-ксилан олигосахаридларына туры килә. ACN-B анализы DP 8-15 белән пентоза һәм глюкоксилан сериясен раслады. S3 рәсеме кебек өстәмә материалларда, FA-C кислоталы өлеш массасы таралышы карталарында ELISA нигезендәге mAb скринингында табылган алмаштырылган ксиланнар белән туры килә торган, DP 8-15 булган (Me)U алмаштырылган пентоза шикәрләре диапазоны күрсәтелгән. Эпитоплар туры килә.
ACS'та булган эри торган, туры килмәгән олигосахаридларның MALDI-MS спектры. Монда, (A) метилланган урон кислотасын (DP 4-8) алыштырган глюкуроксилан олигосахаридларын үз эченә алган ACN-A түбән авырлык диапазонындагы фракцияләр һәм (B) глюкуроксилан белән алыштырылган ACN-B ксилан һәм метилланган урон кислотасы олигосахаридлары (DP 8-15).
Рефрактер олигосахаридларның гликан калдыгы составын анализлау. Монда (A) GC-MS анализы ярдәмендә алынган төрле олигосахарид фракцияләренең TMS сахариды составы. (B) Олигосахаридларда булган төрле TMS-тан алынган шикәрләрнең структуралары. ACN – нейтраль олигосахаридларны үз эченә алган ацетонитрил фракциясе һәм FA – кислота олигосахаридларын үз эченә алган ферул кислотасы фракциясе.
S9 рәсемендә күрсәтелгәнчә, олигосахарид фракциясенең LC-MS анализыннан тагын бер кызыклы нәтиҗә ясалды (методларны электрон өстәмә материалда күрергә мөмкин). ACN-B фракциясен бәйләү вакытында гексоза һәм -OAc төркемнәренең фрагментлары кабат-кабат күзәтелде. Бу ачыш гликом һәм MALDI-TOF анализында күзәтелгән фрагментацияне раслап кына калмый, ә алдан эшкәртелгән лигноцеллюлоза биомассасындагы углеводларның потенциаль туындылары турында яңа мәгълүмат та бирә.
Шулай ук ​​без TMS гликан деривациясен кулланып, олигосахарид фракцияләренең гликан составын анализладык. GC-MS кулланып, без олигосахарид фракциясендә нейрон (дериватив булмаган) һәм кислоталы шикәрләрнең (GluA һәм GalA) составын билгеләдек (5 нче рәсем). Глюкурон кислотасы C һәм D кислоталы компонентларында, ә галактурон кислотасы A һәм B кислоталы компонентларында очрый, алар икесе дә кислоталы шикәрләрнең югары DP компонентлары. Бу нәтиҗәләр безнең ELISA һәм MALDI мәгълүматларын раслап кына калмый, ә олигосахарид туплануын өйрәнү буенча элеккеге тикшеренүләребез белән дә туры килә. Шуңа күрә, без олигосахаридларның биотинилизациясен һәм аннан соңгы ELISA скринингын кулланып заманча иммунологик ысуллар төрле биологик үрнәкләрдә эри торган кире кальцитрант олигосахаридларны ачыклау өчен җитәрлек дип саныйбыз.
ELISA нигезендәге mAb скрининг ысуллары берничә төрле ысул белән расланганлыктан, без бу яңа санлы ысулның мөмкинлекләрен тагын да тирәнрәк өйрәнергә теләдек. Ике коммерция олигосахариды, ксилогексахарид олигосахариды (XHE) һәм 23-α-L-арабинофуранозил-ксилотриоза (A2XX), сатып алынды һәм күзәнәк тышчасы гликанына юнәлтелгән яңа mAb ысулы ярдәмендә тикшерелде. 6 нчы рәсемдә биотинилланган бәйләнеш сигналы һәм олигосахарид концентрациясе арасындагы сызыклы корреляция күрсәтелгән, бу Ленгмюр адсорбция моделенең мөмкин булуын күрсәтә. mAbs арасында CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 һәм CCRC-M151 XHE белән корреляцияләнгән, ә CCRC-M108, CCRC-M109 һәм LM11 1 нм-нан 100 нанога кадәр диапазонда A2XX белән корреляцияләнгән. Эксперимент вакытында антитәнчекләрнең чикләнгән булуы сәбәпле, һәр олигосахарид концентрациясе белән чикләнгән экспериментлар үткәрелде. Монда кайбер антитәнчекләрнең субстрат буларак бер үк олигосахаридка бик төрле реакция бирүен билгеләп үтәргә кирәк, мөгаен, алар бераз төрле эпитопларга бәйләнгәнгә һәм бик төрле бәйләнешләргә ия булырга мөмкин. Яңа mAb ысулы чын үрнәкләргә кулланылганда, эпитопларны төгәл билгеләү механизмнары һәм нәтиҗәләре күпкә катлаулырак булачак.
Төрле гликанга юнәлтелгән mAb'ларның ачыклау диапазонын билгеләү өчен ике коммерция олигосахариды кулланылды. Монда олигосахарид концентрациясенең логарифм концентрациясе белән сызыклы корреляцияләр (A) mAb белән XHE һәм (B) mAb белән A2XX өчен Ленгмюр адсорбция үрнәкләрен күрсәтә. Тиешле эпитоплар анализда субстрат буларак кулланылган коммерция олигосахаридларының структураларын күрсәтә.
Гликанга юнәлтелгән моноклональ антитәнчекләр куллану (гликокомик анализ яки ELISA нигезендәге mAb скринингы) үсемлек биомассасын тәшкил итүче күпчелек төп күзәнәк тышчасы гликаннарын тирәнтен характерлау өчен көчле корал булып тора. Ләкин классик гликан анализы зуррак күзәнәк тышчасы гликаннарын гына характерлый, чөнки күпчелек олигосахаридлар ELISA пластиналарында нәтиҗәле иммобилизацияләнми. Бу тикшеренүдә AFEX белән алдан эшкәртелгән кукуруз стоверы югары каты матдәләр күләмендә ферментатив гидролизланган. Гидролизаттагы кире кайтарылган күзәнәк тышчасы углеводларының составын билгеләү өчен шикәр анализы кулланылган. Ләкин гидролизатлардагы кечерәк олигосахаридларның mAb анализы киметелгән, һәм ELISA пластиналарындагы олигосахаридларны нәтиҗәле иммобилизацияләү өчен өстәмә кораллар кирәк.
Без монда NeutrAvidin™ белән капланган пластиналарда олигосахарид биотинилизациясен һәм аннан соң ELISA скринингын берләштереп, mAb скринингы өчен яңа һәм нәтиҗәле олигосахарид иммобилизацияләү ысулын тәкъдим итәбез. Иммобилизацияләнгән биотинилизацияләнгән олигосахаридлар антитәнчек өчен җитәрлек аффинитет күрсәттеләр, бу исә кире кайтарылган олигосахаридларны тиз һәм нәтиҗәле ачыкларга мөмкинлек бирде. Бу нык олигосахаридларның составын масса-спектрометрия нигезендә анализлау иммунскринингка карата бу яңа ысулның нәтиҗәләрен раслады. Шулай итеп, бу тикшеренүләр олигосахарид биотинилизациясен һәм ELISA скринингын гликанга юнәлтелгән моноклональ антитәнчекләр белән берләштерү олигосахаридларда кросс-бәйләнешләрне ачыклау өчен кулланылырга мөмкин булуын һәм олигосахаридлар структурасын характерлый торган башка биохимик тикшеренүләрдә киң кулланылырга мөмкин булуын күрсәтә.
Бу биотин нигезендәге гликан профильләү ысулы үсемлек биомассасындагы эри торган олигосахаридларның тотрыксыз углевод бәйләнешләрен тикшерә алырлык беренче доклад. Бу биомассаның кайбер өлешләренең ни өчен биоотукатурлык җитештерүдә шулкадәр нык булуын аңларга ярдәм итә. Бу ысул гликом анализы ысулларындагы мөһим бушлыкны тутыра һәм аны үсемлек олигосахаридларыннан тыш, субстратларның киңрәк диапазонына да куллана. Киләчәктә без биотинилләштерү өчен робототехника кулланырга һәм ELISA кулланып үрнәкләрнең югары җитештерүчәнлекле анализы өчен без эшләгән ысулны кулланырга мөмкин.
Pioneer 33A14 гибрид орлыкларыннан үстерелгән кукуруз саламы (КС) 2010 елда Колорадо штатының Рей шәһәрендәге Kramer Farms фермасыннан җыелган. Җир хуҗасы рөхсәте белән, бу биомасса тикшеренүләр өчен кулланылырга мөмкин. Үрнәкләр бүлмә температурасында, сыдырма капчыкларда, 6% дан ким дымлылыкта коры килеш сакланды. Үрнәкләр бүлмә температурасында, сыдырма капчыкларда, 6% дан ким дымлылыкта коры килеш сакланды. Об чанцы хранились сухим при влажности <6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной шине. Үрнәкләр бүлмә температурасында, фермуарлы капчыкларда <6% дымлылыкта коры килеш сакланды.样品在室温下以干燥 <6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥 <6% Об чанцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной че с влажностью <6%. Үрнәкләр бүлмә температурасында, дымлылыгы < 6% булган сыдырма капчыкларда саклана.Тикшеренү җирле һәм милли күрсәтмәләргә туры килде. Состав анализы NREL протоколы ярдәмендә үткәрелде. Составта 31,4% глюкан, 18,7% ксилан, 3,3% арабинан, 1,2% галактан, 2,2% ацетил, 14,3% лигнин, 1,7% аксым һәм 13,4% көл барлыгы ачыкланды.
Cellic® CTec2 (138 мг аксым/мл, партия VCNI 0001) - Novozymes (Франклинтон, Төньяк Каролина, АКШ) компаниясеннән целлюлаза, β-глюкозидаза һәм Cellic® HTec2 (157 мг аксым/мл, партия VHN00001) катлаулы катнашмасы. Пектинны таркатучы ферментларның катлаулы катнашмасы булган Multifect Pectinase® (72 мг аксым/мл) DuPont Industrial Biosciences (Пало-Альто, Калифорния, АКШ) тарафыннан бүләк ителде. Фермент аксымының концентрациясе аксым күләмен бәяләү (һәм аксым булмаган азотның өлешен алып ташлау) юлы белән Kjeldahl азот анализы ярдәмендә билгеләнде (AOAC ысулы 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Итака, Нью-Йорк, АКШ). Диатомлы җир 545 EMD Millipore (Billerica, MA) компаниясеннән сатып алынды. Активлаштырылган күмер (DARCO, 100 меш гранула), Avicel (PH-101), бук агачы ксилан һәм башка барлык химик матдәләр Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури) компаниясеннән сатып алынган.
AFEX алдан эшкәртү GLBRC (Биомассаны үзгәртү тикшеренү лабораториясе, MSU, Лансинг, MI, АКШ) лабораториясендә башкарылды. Алдан эшкәртү 140°C температурада 15 минут дәвамында башкарылды. 46 минут эчендә сусыз аммиакның биомассага 1:1 нисбәтендә, дат басмас корычтан эшләнгән өстәл реакторында (Parr Instruments Company) 60% (w/w) йөкләнештә тотрыксыз корычтан эшләнгән өстәл реакторында үткәрелде. Бу 30 минут вакыт алды. Реактор 140°C температурага китерелде һәм аммиак тиз арада чыгарылды, бу биомассаның тиз арада бүлмә температурасына кайтуына мөмкинлек бирде. AFEX алдан эшкәртелгән кукуруз пешергеченең (ACS) составы эшкәртелгән кукуруз пешергеченә (UT-CS) охшаш иде.
Олигосахаридларны зур күләмдә җитештерү өчен башлангыч материал буларак югары каты матдәләр ACSH 25% (w/w) (якынча 8% декстран йөкләнеше) әзерләнде. ACS ферментатив гидролизы Cellic® Ctec2 10 мг аксым/г глюкан (алдан эшкәртелгән биомассада), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 мг аксым/г глюкан һәм Multifect Pectinase (Genencor Inc, АКШ) кебек коммерция фермент катнашмасы ярдәмендә башкарылды. Ферментатив гидролиз 3 литр эш күләме, рН 4,8, 50°C һәм 250 әйләнеш/мин булган 5 литрлы биореакторда үткәрелде. 96 сәгать гидролизлаганнан соң, гидролизат 6000 әйләнеш/мин тизлегендә 30 минут дәвамында, аннары 14000 әйләнеш/мин тизлегендә 30 минут дәвамында гидролизланмаган каты матдәләрне чыгару өчен центрифугалау юлы белән җыелды. Аннары гидролизат 0,22 мм фильтр стаканы аша стериль фильтрлауга дучар ителде. Фильтрланган гидролизат стериль шешәләрдә 4°C температурада сакланды, аннары күмердә фракцияләнде.
NREL лаборатория анализы процедуралары буенча экстракт нигезендәге биомасса үрнәкләренең составын анализлау: состав анализы өчен үрнәкләр әзерләү (NREL/TP-510-42620) һәм биомассадагы структураль углеводларны һәм лигнинны билгеләү (NREL/TP-510 – 42618)47.
Гидролизат агымының олигосахарид анализы автоклав нигезендәге кислота гидролизы ысулы кулланып 2 мл масштабта үткәрелде. Гидролизат үрнәген 10 мл винтлы капкачлы культура пробиркасында 69,7 мкл 72% күкерт кислотасы белән кушыгыз һәм 121 °C температурада 1 сәгать дәвамында өстәл өслегендә инкубацияләгез, бозда суытыгыз һәм югары нәтиҗәле сыек хроматография (HPLC) флаконына фильтрлагыз. Олигосахаридларның концентрациясе кислота-гидролизланган үрнәктәге гомуми шикәр концентрациясеннән гидролизланмаган үрнәктәге моносахаридлар концентрациясен алып ташлау юлы белән билгеләнде.
Кислота гидролизланган биомассадагы глюкоза, ксилоза һәм арабиноза концентрацияләре Bio-Rad Aminex HPX-87H колонкасында автосамплер, колонка җылыткычы, изократик насос һәм сыну күрсәткече детекторы белән җиһазландырылган Shimadzu HPLC системасы ярдәмендә анализланды. Колонна 50°C температурада тотылды һәм 0,6 мл/мин 5 мМ H2SO4 су агымы белән элюцияләнде.
Гидролизат өслеге суюлтылды һәм мономер һәм олигосахарид күләменә анализланды. Ферментатив гидролиздан соң алынган мономер шикәрләр Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P колонкасы һәм көл саклау колонкасы белән җиһазландырылган HPLC ярдәмендә анализланды. Колонна температурасы 80°C температурада тотылды, хәрәкәтчән фаза буларак су 0,6 мл/мин агым тизлеге белән кулланылды. Олигосахаридлар 41, 48, 49 сылтамаларында тасвирланган ысулларга туры китереп, 121°C температурада суюлтылган кислотада гидролиз юлы белән билгеләнде.
Сахарид анализы чимал, AFEX алдан эшкәртелгән һәм барлык гидролизланмаган биомасса калдыкларында (серияле күзәнәк тышчасы экстрактларын җитештерү һәм аларның mAb скринингын кертеп) элек тасвирланган 27, 43, 50, 51 процедураларын кулланып үткәрелде. Гликом анализы өчен, үсемлек күзәнәк тышчасы материалының спиртта эреми торган калдыклары биомасса калдыкларыннан әзерләнә һәм элек тасвирланганча, аммоний оксалат (50 мМ), натрий карбонаты (50 мМ һәм 0,5% w/v), CON (1M һәм 4M, икесе дә 1% w/v натрий борогидриды белән) һәм кислота хлориты кебек агрессив реагентлар белән серияле экстракциягә дучар ителә52,53. Аннары экстрактлар күзәнәк тышчасы гликанына юнәлтелгән mAb50s комплекс панеленә каршы ELISAга дучар ителде, һәм mAb бәйләнеш реакцияләре җылылык картасы буларак күрсәтелде. Үсемлек күзәнәк тышчасы гликанына юнәлтелгән mAbлар лаборатория запасларыннан (CCRC, JIM һәм MAC серияләре) сатып алынды.
Олигосахаридларның бер этаплы биотинилизациясе. Углеводларны биотин-LC-гидразид белән конъюгацияләү түбәндәге процедура ярдәмендә башкарылды. Биотин-LC-гидразид (4,6 мг/12 мкмоль) диметил сульфоксидта (DMSO, 70 мкл) нык болгатып һәм 65°C температурада 1 минут җылытып эретелде. Боз сиркәсе кислотасы (30 мкл) өстәлде һәм катнашма натрий цианоборогидридына (6,4 мг/100 мкмоль) коелды һәм 65°C температурада якынча 1 минут җылытканнан соң тулысынча эретелде. Аннары, киптерелгән олигосахаридка (1-100 нмоль) реакция катнашмасының 5-8 мкл өлеше өстәлде, киптерелгән оч өстендә этикетканың 10 тапкыр яки аннан да күбрәк моляр артыклыгы алынды. Реакция 65°C температурада 2 сәгать дәвамында үткәрелде, аннан соң үрнәкләр шунда ук чистартылды. Маркировкалау тәҗрибәләрендә натрий цианоборогидриды редукциясез кулланылмады, һәм үрнәкләр 65°C температурада 2,5 сәгать дәвамында реакциягә кертелде.
Биотинланган олигосахаридлар үрнәкләрен ELISA белән каплау һәм юу. Авидин белән капланган пластинаның һәр чокырына 25 мкл биотинланган үрнәкләр (һәр концентрацияләнгән үрнәктән 100 мкл 5 мл 0,1 М Трис буфер эремәсендә (TBS) эретелгән) өстәлде. Контроль чокырлары 0,1 М TBSда 10 мкг/мл концентрациясендә 50 мкл биотин белән капланды. Буш үлчәүләр өчен каплау буларак деионизацияләнгән су кулланылды. Таблетка бүлмә температурасында караңгыда 2 сәгать инкубацияләнде. Grenier flat 3A өчен 11 нче программа кулланып, пластинаны 0,1 М TBSда 0,1% майсызландырылган сөт белән 3 тапкыр юыгыз.
Беренчел антитәнчекләрне өстәү һәм юу. Һәр чокырда 40 мкл беренчел антитәнчек өстәгез. Микропластинканы бүлмә температурасында караңгыда 1 сәгать инкубацияләгез. Аннары пластиналар Grenier Flat 3A өчен 11 нче юу программасы ярдәмендә 0,1% сөт белән 0,1 М TBS эремәсендә 3 тапкыр юылды.
Икенчел антитәнчек өстәгез һәм юыгыз. Һәр чокырда 50 мкл тычкан/күсе икенчел антитәнчек өстәгез (0,1% сөттә 0,1 M TBS'та 1:5000 сыекландырылган). Микропластинканы бүлмә температурасында караңгыда 1 сәгать инкубацияләгез. Аннары микропластинкалар Grenier Flat 5A пластина юу программасы #12 кулланып, 0,1% сөт белән 0,1 M TBS'та 5 тапкыр юылды.
Субстрат өстәү. Нигез субстратка 50 мкл 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (TMB) өстәгез (15 мл деионизацияләнгән суга 2 тамчы буфер, 3 тамчы TMB, 2 тамчы водород перекисе өстәп). TMB субстратын әзерләгез. Кулланыр алдыннан вортекслагыз). Микропластинканы бүлмә температурасында 30 минут инкубацияләгез. Караңгыда.
Адымны тәмамлагыз һәм таблетканы укыгыз. Һәр чокырда 50 мкл 1 Н сульфат кислотасы өстәгез һәм ELISA уку җайланмасы ярдәмендә 450 дән 655 нм га кадәр абсорбцияне язып алыгыз.
Бу аналитларның 1 мг/мл эремәләрен деионизацияләнгән суда әзерләгез: арабиноза, рамноза, фукоза, ксилоза, галактурон кислотасы (GalA), глюкурон кислотасы (GlcA), манноза, глюкоза, галактоза, лактоза, N-ацетилманнозамин (manNAc), N-ацетилглюкозамин. (glcNAc), N-ацетилгалактозамин (galNAc), инозитол (эчке стандарт). 1 нче таблицада күрсәтелгән 1 мг/мл шикәр эремәләрен өстәп, ике стандарт әзерләнде. Үрнәкләр -80°C температурада туңдырыла һәм лиофилизацияләнә, барлык су алынганчы (гадәттә якынча 12-18 сәгать).
Аналитик баланстагы капкачлы пробиркаларга 100–500 мкг үрнәк өстәгез. Өстәлгән күләмне язып куегыз. Үрнәкне билгеле бер концентрациядәге эреткечтә эретеп, пробиркага сыеклык аликвоты буларак өстәү иң яхшысы. Һәр үрнәк пробиркасы өчен эчке эталон буларак 20 мкл 1 мг/мл инозитол кулланыгыз. Үрнәккә өстәлгән эчке эталон күләме стандарт пробиркага өстәлгән эчке эталон күләменә тигез булырга тиеш.
Бормалы капкачлы флаконга 8 мл сусыз метанол өстәгез. Аннары 4 мл 3 Н метаноллы HCl эремәсен өстәгез, капкач белән ябыгыз һәм селкетегез. Бу процесс су кулланылмый.
Олигосахарид үрнәкләренә һәм стандарт TMS пробиркаларына 500 мкл 1 М HCl метанол эремәсен өстәгез. Үрнәкләр төнлә (168 сәгать) 80°C температурада термоблокта инкубацияләнде. Метанолиз продуктын бүлмә температурасында киптерү коллекторы ярдәмендә киптерегез. 200 мкл MeOH өстәгез һәм тагын киптерегез. Бу процесс ике тапкыр кабатлана. Үрнәккә 200 мкл метанол, 100 мкл пиридин һәм 100 мкл сиркә ангидриды өстәгез һәм яхшылап болгатыгыз. Үрнәкләрне бүлмә температурасында 30 минут инкубацияләгез һәм киптерегез. 200 мкл метанол өстәгез һәм тагын киптерегез.
200 мкл Tri-Sil өстәгез һәм капкач белән ябылган пробирканы 20 минут җылытыгыз. 80°C температурада, аннары бүлмә температурасына кадәр суытыгыз. Үрнәкне якынча 50 мкл күләмгә кадәр киптерү өчен киптергеч кулланыгыз. Шунысын да билгеләп үтәргә кирәк, без үрнәкләрнең тулысынча кипүенә юл куймадык.
2 мл гексан өстәгез һәм яхшылап болгатыгыз. Пастер пипеткаларының очларын (5-8 мм) пыяла мамык кисәге белән тутырыгыз, пыяла мамыкны 5-3/4 дюйм диаметрлы пипетка өстенә куегыз. Үрнәкләр 3000 г авырлыкта 2 минут дәвамында центрифугаланды. Эремәгән калдыклар чөкмәгә әйләнә. Үрнәкне 100-150 мкл кадәр киптерегез. Якынча 1 мкл күләм GC-MS эченә 80 °C башлангыч температурада һәм 2,0 минут башлангыч вакытта кертелде (2 нче таблица).