Nature.com сайтаар зочилсонд баярлалаа.Таны ашиглаж буй хөтчийн хувилбар нь хязгаарлагдмал CSS дэмжлэгтэй.Хамгийн сайн ашиглахын тулд бид танд шинэчилсэн хөтөч ашиглахыг зөвлөж байна (эсвэл Internet Explorer-д нийцтэй байдлын горимыг идэвхгүй болгох).Энэ хооронд байнгын дэмжлэгийг хангахын тулд бид сайтыг ямар ч загвар, JavaScript-гүйгээр үзүүлэх болно.
AFEX-тэй урьдчилан боловсруулсан эрдэнэ шишийн зууханд агуулагдах үлдэгдэл олигосахаридын цогц шинжилгээ хийх дархлаа судлалын болон масс спектрометрийн шинэ аргууд.Лигноцеллюлозын биомасс нь чулуужсан түлшний тогтвортой хувилбар бөгөөд хүнс, тэжээл, түлш, химийн бодис зэрэг бүтээгдэхүүн үйлдвэрлэх биотехнологийг хөгжүүлэхэд өргөн хэрэглэгддэг.Эдгээр технологийн гол түлхүүр нь ургамлын эсийн хананд агуулагдах нийлмэл нүүрс усыг глюкоз, ксилоз, арабиноз зэрэг энгийн сахар болгон хувиргах өртөг зардалтай өрсөлдөхүйц үйл явцыг хөгжүүлэх явдал юм.Лигноцеллюлозын биомасс нь маш их зөрүүд байдаг тул хүссэн бүтээгдэхүүнээ авахын тулд термохимийн эмчилгээ (жишээлбэл, аммиакийн эслэг гуужуулагч (AFEX), шингэрүүлсэн хүчил (DA), ионы шингэн (IL)), биологийн эмчилгээ (жишээ нь: ферментийн гидролиз ба бичил биетний исгэх) зэргийг хослуулан хийх ёстой..Гэвч гидролизийн процесст арилжааны мөөгөнцрийн ферментийг ашиглах үед үүссэн уусдаг сахарын ердөө 75-85% нь моносахаридууд, үлдсэн 15-25% нь бичил биетэнд үргэлж байдаггүй уусдаг, уусдаг олигосахаридууд байдаг.Өмнө нь бид нүүрстөрөгчийн болон диатомийн шороог ялгах, хэмжээ хасах хроматографийн хосолсон уусдаг зөрүүд олигосахаридуудыг амжилттай тусгаарлаж, цэвэршүүлж, тэдгээрийн ферментийг дарангуйлах шинж чанарыг судалж үзсэн.Метилжүүлсэн уроны хүчлийн орлуулалтын өндөр зэрэгтэй полимержилт (DP) агуулсан олигосахаридууд нь бага DP, төвийг сахисан олигосахаридуудаас илүү арилжааны ферментийн хольцоор боловсруулахад илүү хэцүү болохыг олж мэдсэн.Энд бид ургамлын эсийн хана, ферментийн гидролизат дахь гликаны холбоог тодорхойлохын тулд ургамлын биомассын гликануудад тусгайлан зориулсан моноклональ эсрэгбие (mAbs) ашиглан гликаны профайлыг тодорхойлох, матрицын тусламжтай лазерын десорбцийн ионжуулалт, нислэгийн цагийн масс-спектрометр зэрэг хэд хэдэн нэмэлт аргуудыг ашигласан тухай мэдээлэв..MALDI-TOF-MS) нь сөрөг ионуудын хоёрдогч задралын дараа спектроскопи, хийн хроматографи, масс спектрометрийн (GC-MS) аргаар олж авсан бүтэц-мэдээллийн оношлогооны оргилуудыг ашиглан олигосахаридын холбоог деривативтай ба үүсээгүй шинж чанарыг тодорхойлдог.Олигосахаридын (DP 4-20) жижиг хэмжээтэй тул эдгээр молекулууд нь мАб-ийг холбох, шинж чанарыг тодорхойлоход ашиглахад хэцүү байдаг.Энэ асуудлыг даван туулахын тулд бид биотин коньюгацид суурилсан олигосахаридыг хөдөлгөөнгүй болгох шинэ аргыг хэрэглэсэн бөгөөд энэ нь бичил хавтангийн гадаргуу дээр бага уусдаг олигосахаридын дийлэнх хэсгийг амжилттай тэмдэглэж, дараа нь тусгай холболтын шинжилгээнд өндөр нэвтрүүлэх чадвартай mAb системд ашигласан.Энэхүү шинэ арга нь оношилгооны зорилгоор биомаркерт агуулагдах олигосахаридыг ялгаж, шинжлэхэд ашиглаж болох илүү дэвшилтэт өндөр нэвтрүүлэх чадвартай гликомын шинжилгээг боловсруулахад туслах болно.
Хөдөө аж ахуй, ойн аж ахуй, өвс, модлог материалаас бүрдэх лигноцеллюлозын биомасс нь био-д суурилсан бүтээгдэхүүн, тэр дундаа хүнс, тэжээл, түлш, химийн прекурсоруудыг үйлдвэрлэх боломжит түүхий эд юм1.Ургамлын эсийн хананд агуулагдах нүүрс ус (целлюлоз, гемицеллюлоз гэх мэт) нь химийн боловсруулалт, биотрансформаци (ферментийн гидролиз, бичил биетний исгэх гэх мэт) замаар моносахаридууд болж деполимерждэг.Нийтлэг урьдчилсан боловсруулалтанд аммиакийн шилэн тэлэлт (AFEX), шингэрүүлсэн хүчил (DA), ионы шингэн (IL), уурын тэсрэлт (SE) ордог бөгөөд эдгээр нь ургамлын эсийн ханыг нээх замаар лигноцеллюлозын үйлдвэрлэлийг багасгахын тулд химийн бодис, дулааныг хослуулан хэрэглэдэг3,4.бодисын зөрүүд байдал, 5. Ферментийн гидролизийг хатуу бодисын өндөр ачаалалд арилжааны идэвхтэй нүүрс ус агуулсан фермент (CAZymes) ашиглан хийж, трансген мөөгөнцөр эсвэл бактери ашиглан бичил биетний исгэх үйл ажиллагааг био суурьтай түлш, химийн бодис үйлдвэрлэх 6 .
Арилжааны ферментийн CAZymes нь нийлмэл нүүрс ус-сахарын холбоог синергетик байдлаар задалж моносахарид үүсгэдэг ферментүүдийн нийлмэл хольцоос бүрддэг2,7.Өмнө дурьдсанчлан, нүүрс устай лигниний анхилуун үнэрт полимерүүдийн нарийн төвөгтэй сүлжээ нь тэдгээрийг тэсвэрлэх чадваргүй болгодог бөгөөд энэ нь элсэн чихэр бүрэн бус хувиргахад хүргэдэг бөгөөд урьдчилан боловсруулсан биомассын ферментийн гидролизийн явцад үүсдэггүй секс олигосахаридын 15-25% -ийг хуримтлуулдаг.Энэ нь биомассыг урьдчилан боловсруулах янз бүрийн аргуудын нийтлэг асуудал юм.Энэ гацаа үүсэх зарим шалтгаан нь гидролизийн үед ферментийг дарангуйлах, эсвэл ургамлын биомасс дахь сахарын холбоог таслахад шаардлагатай амин чухал ферментүүд байхгүй эсвэл бага түвшинд байдаг.Олигосахарид дахь сахарын холбоо зэрэг элсэн чихрийн найрлага, бүтцийн шинж чанарыг ойлгох нь гидролизийн үед чихрийн хувиргалтыг сайжруулж, биотехнологийн процессыг нефтийн гаралтай бүтээгдэхүүнтэй өрсөлдөхүйц үнэтэй болгоход тусална.
Нүүрс усны бүтцийг тодорхойлоход хэцүү бөгөөд шингэний хроматографи (LC)11,12, цөмийн соронзон резонансын спектроскопи (NMR)13, хялгасан судасны электрофорез (CE)14,15,16, масс спектрометр (MS)17 зэрэг аргуудыг хослуулах шаардлагатай., арван найман.Матриц (MALDI-TOF-MS) ашиглан лазерын десорбци ба ионжуулалт бүхий нислэгийн цагийн масс спектрометр зэрэг MS аргууд нь нүүрс усны бүтцийг тодорхойлох олон талт арга юм.Сүүлийн үед натрийн ионы нэмэлтүүдийн мөргөлдөөнөөс үүдэлтэй диссоциаци (CID) тандем MS нь олигосахаридын хавсралтын байрлал, аномерийн тохиргоо, дараалал, салаалсан байрлалд тохирох хурууны хээг тодорхойлоход хамгийн өргөн хэрэглэгддэг болсон 20, 21.
Гликаны шинжилгээ нь нүүрс усны холбоог нарийн тодорхойлох маш сайн хэрэгсэл юм22.Энэ арга нь нүүрс усны нийлмэл холбоосыг ойлгохын тулд ургамлын эсийн ханын гликан руу чиглэсэн моноклональ эсрэгбиемүүдийг (mAbs) ашигладаг.Төрөл бүрийн сахаридыг ашиглан төрөл бүрийн шугаман болон салаалсан олигосахаридын эсрэг зохион бүтээсэн 250 гаруй мАб нь дэлхий даяар байдаг.Ургамлын эсийн төрөл, эрхтэн, нас, хөгжлийн үе шат, өсөлтийн орчноос хамааран ихээхэн ялгаатай байдаг тул ургамлын эсийн хананы бүтэц, найрлага, өөрчлөлтийг тодорхойлоход хэд хэдэн мАб өргөн хэрэглэгддэг.Сүүлийн үед энэ аргыг ургамал, амьтны систем дэх цэврүүт цэврүүт популяци, тэдгээрийн гликаны тээвэрлэлт дэх гүйцэтгэх үүргийг ойлгох, эсийн доорхи маркерууд, хөгжлийн үе шатууд эсвэл хүрээлэн буй орчны өдөөлтөөр тодорхойлогддог, ферментийн идэвхийг тодорхойлоход ашиглаж байна.Тодорхойлогдсон гликан ба ксилануудын өөр өөр бүтцэд пектин (P), ксилан (X), маннан (M), ксилоглюкан (XylG), холимог холбоо глюкан (MLG), арабиноксилан (ArbX), галактоманнан (ГалГ), глюкуроны хүчил-арабиноксилан (GalG), глюкуроны хүчил-арабиноксилан (GAbino-G) ​​зэрэг орно.
Гэсэн хэдий ч эдгээр бүх судалгааны хүчин чармайлтыг үл харгалзан, олигосахаридын ялгаралт, гидролизийн явцад олигомерын гинжин хэлхээний уртын өөрчлөлт, янз бүрийн DP бага полимерууд, тэдгээрийн муруй зэрэг хатуу бодисын ачаалал ихтэй (HSL) гидролизийн үед олигосахаридын хуримтлалын шинж чанарт анхаарлаа төвлөрүүлсэн цөөн тооны судалгаанууд байдаг.хуваарилалт 30,31,32.Гэсэн хэдий ч гликаны шинжилгээ нь гликаны бүтцийг цогцоор нь шинжлэхэд ашигтай хэрэгсэл болох нь батлагдсан ч эсрэгбиеийн аргыг ашиглан усанд уусдаг бага DP олигосахаридыг үнэлэхэд хэцүү байдаг.5-10 кДа-аас бага молекул жинтэй DP-ийн жижиг олигосахаридууд нь ELISA 33, 34 ялтсуудтай холбогддоггүй бөгөөд эсрэгбие нэмэхээс өмнө угааж арилдаг.
Энд бид анх удаа уусдаг галд тэсвэртэй олигосахаридын биотинилжилтийн нэг үе шаттай процедурыг гликомын шинжилгээтэй хослуулан авидинаар бүрсэн ялтсууд дээр моноклональ эсрэгбие ашиглан ELISA шинжилгээг үзүүлж байна.Гликомын шинжилгээ хийх бидний арга барилыг MALDI-TOF-MS болон GC-MS-д суурилсан нэмэлт олигосахаридын холбоосын триметилсилил (TMS) деривацийг гидролизжүүлсэн чихрийн найрлагыг ашиглан хийсэн шинжилгээгээр баталгаажуулсан.Энэхүү шинэлэг арга барилыг ирээдүйд өндөр бүтээмжтэй арга болгон хөгжүүлж, биоанагаахын судалгаанд өргөнөөр ашиглах боломжтой болно35.
Гликозиляци гэх мэт фермент ба эсрэгбиеийн трансляцийн дараах өөрчлөлтүүд нь биологийн идэвхжилд нөлөөлдөг.Тухайлбал, сийвэнгийн уургийн гликозиляцын өөрчлөлт нь үрэвсэлт үений үрэвсэлд чухал үүрэг гүйцэтгэдэг ба гликозиляцийн өөрчлөлтийг оношилгооны маркер болгон ашигладаг37.Төрөл бүрийн гликанууд нь ходоод гэдэсний зам, элэгний архаг үрэвсэлт өвчин, вируст халдвар, өндгөвч, хөхний булчирхай, түрүү булчирхайн хорт хавдар зэрэг олон төрлийн өвчинд амархан илэрдэг тухай ном зохиолд мэдээлсэн байдаг38,39,40.Эсрэгбие дээр суурилсан гликаны ELISA аргыг ашиглан гликаны бүтцийг ойлгох нь MS-ийн нарийн төвөгтэй аргуудыг ашиглахгүйгээр өвчний оношлогоонд нэмэлт итгэлийг өгөх болно.
Бидний өмнөх судалгаагаар зөрүүд олигосахаридууд урьдчилсан боловсруулалт болон ферментийн гидролизийн дараа гидролизгүй хэвээр байсныг харуулсан (Зураг 1).Бид өмнө нь хэвлэгдсэн ажилдаа AFEX-ээр урьдчилан боловсруулсан эрдэнэ шишийн зуухны гидролизатаас (ACSH)8 олигосахаридуудыг тусгаарлах идэвхжүүлсэн нүүрсийг хатуу фазын олборлох аргыг боловсруулсан.Анхлан олборлож, салгасны дараа олигосахаридуудыг хэмжээ хасуулах хроматографи (SEC) ашиглан цааш хувааж, молекул жингийн дарааллаар цуглуулсан.Төрөл бүрийн урьдчилсан боловсруулалтаас ялгарсан чихрийн мономер ба олигомеруудыг элсэн чихрийн найрлагын шинжилгээгээр шинжлэв.Урьдчилан боловсруулалтын янз бүрийн аргаар олж авсан чихрийн олигомеруудын агууламжийг харьцуулахдаа зөрүүд олигосахаридууд байгаа нь биомассыг моносахарид болгон хувиргах нийтлэг асуудал бөгөөд элсэн чихрийн гарцыг дор хаяж 10-15%, бүр 18% хүртэл бууруулахад хүргэдэг.АНУ.Энэ аргыг цаашид олигосахаридын фракцыг их хэмжээгээр үйлдвэрлэхэд ашигладаг.Үүссэн ACH болон өөр өөр молекул жинтэй түүний дараагийн фракцуудыг энэ ажилд олигосахаридын шинж чанарыг тодорхойлох туршилтын материал болгон ашигласан.
Урьдчилан боловсруулалт ба ферментийн гидролизийн дараа тогтвортой олигосахаридууд гидролизгүй хэвээр үлджээ.Энд (A) олигосахаридуудыг AFEX-ээр урьдчилан боловсруулсан эрдэнэ шишийн зуухны гидролизатаас (ACSH) идэвхижүүлсэн нүүрс болон диатомийн шороог ашиглан тусгаарлаж олигосахарид ялгах арга;(B) Олигосахаридуудыг ялгах арга.Олигосахаридуудыг хэмжээ хасах хроматографи (SEC) -ээр цааш нь тусгаарласан;(C) Төрөл бүрийн урьдчилсан боловсруулалтаас ялгарсан сахаридын мономер ба олигомерууд (шингэрүүлсэн хүчил: DA, ионы шингэн: IL ба AFEX).Ферментийн гидролизийн нөхцөл: хатуу бодисын өндөр ачаалал 25% (w/w) (ойролцоогоор 8% глюкан ачаалал), 96 цагийн гидролиз, 20 мг/г арилжааны ферментийн ачаалал (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 харьцаа) ба (D) Сахарын мономерууд ба олигомерууд (г/х)-аас ялгарсан AFF-ийн олигомерууд, сторекоз, сторилозын преференциалууд. ACS).
Гликаны шинжилгээ нь хатуу биомассын үлдэгдэлээс тусгаарлагдсан ханд дахь гликануудын бүтцийн цогц шинжилгээ хийхэд хэрэгтэй хэрэгсэл болох нь батлагдсан.Гэсэн хэдий ч усанд уусдаг сахаридууд энэ уламжлалт аргыг хэрэглэхэд хангалтгүй байдаг41, учир нь бага молекул жинтэй олигосахаридууд нь ELISA хавтан дээр хөдөлгөөнгүй болоход хэцүү байдаг бөгөөд эсрэгбие нэмэхээс өмнө угааж арилдаг.Тиймээс эсрэгбиеийг холбох, шинж чанарыг тодорхойлохын тулд уусдаг, үл нийцэх олигосахаридуудыг авидинаар бүрсэн ELISA хавтан дээр бүрэхийн тулд нэг үе шаттай биотинизацийн аргыг ашигласан.Энэ аргыг өмнө нь үйлдвэрлэсэн ACSH болон түүний молекул жин (эсвэл полимержих зэрэг, DP) дээр үндэслэсэн фракцыг ашиглан туршиж үзсэн.Нэг үе шаттай биотинилжилтийг нүүрсустөрөгчийн бууруулагч хэсэгт биотин-LC-гидразидыг нэмж олигосахаридтай холбох чадварыг нэмэгдүүлэхэд ашигласан (Зураг 2).Уусмал дахь гемиацетийн бүлэг нь багасгах төгсгөлд биотин-LC-гидразидын гидразидын бүлэгтэй урвалд орж гидразоны холбоо үүсгэдэг.Найруулагч NaCNBH3 байгаа тохиолдолд гидразоны холбоо нь тогтвортой биотинжүүлсэн эцсийн бүтээгдэхүүн болж буурдаг.Элсэн чихэр бууруулах төгсгөлийг өөрчилснөөр DP багатай олигосахаридуудыг ELISA ялтсуудтай холбох боломжтой болсон бөгөөд бидний судалгаагаар үүнийг гликан чиглэсэн мАб ашиглан авидинаар бүрсэн ялтсууд дээр хийсэн.
Биотинжүүлсэн олигосахаридын эсрэг ELISA-д суурилсан моноклональ эсрэгбиемүүдийг илрүүлэх.Энд (A) олигосахаридын биотинизаци ба дараа нь NeutrAvidin бүрсэн ялтсууд дээр гликан-зорилтот mAbs-тай ELISA скрининг хийх ба (B) урвалын бүтээгдэхүүнийг биотинжуулах нэг үе шаттай процедурыг харуулж байна.
Дараа нь олигосахаридтай хавсарсан эсрэгбие бүхий авидинаар бүрсэн ялтсуудыг анхдагч болон хоёрдогч эсрэгбиемүүдэд нэмж, гэрэл, цаг хугацааны мэдрэмжтэй орчинд угаана.Эсрэг биетийг холбож дууссаны дараа хавтанг өсгөвөрлөхийн тулд TMB субстрат нэмнэ.Эцэст нь хүхрийн хүчлээр урвалыг зогсоов.Өсгөвөрлөсөн ялтсуудыг ELISA уншигч ашиглан шинжилж, эсрэгбие тус бүрийн холбох хүчийг тодорхойлж, эсрэгбиеийн өвөрмөц хөндлөн холбоосыг илрүүлсэн.Туршилтын дэлгэрэнгүй мэдээлэл, параметрүүдийг "Материал ба арга" гэсэн хэсгээс харна уу.
Бид ACSH-д агуулагдах уусдаг олигосахаридууд болон лигноцеллюлозын гидролизатаас тусгаарлагдсан түүхий болон цэвэршүүлсэн олигосахаридын фракцуудад агуулагдах уусдаг олигосахаридуудыг тодорхойлох замаар тодорхой хэрэглээнд зориулж энэхүү шинээр боловсруулсан аргын ашиг тусыг харуулж байна.Зураг 3-т үзүүлснээр биоацилжуулсан гликомын шинжилгээний аргыг ашиглан ACSH-д тодорхойлсон хамгийн түгээмэл эпитопоор орлуулсан ксиланууд нь ихэвчлэн уроник (U) эсвэл метилуроны (MeU) ба пектик арабиногалактанууд юм.Тэдгээрийн ихэнхийг бидний өмнөх гидролизгүй хатуу бодисын гликануудын (UHS) шинжилгээнд хийсэн судалгаагаар олсон43.
Эсийн ханын гликан руу чиглэсэн моноклональ эсрэгбие ашиглан эсэргүүцэгч олигосахаридын эпитопуудыг илрүүлэх."Төвийг сахисан" хэсэг нь ACN фракц, "хүчиллэг" хэсэг нь FA фракц юм.Дулааны зураг дээрх илүү тод улаан нь эпитопын өндөр агууламжийг, харин илүү тод цэнхэр өнгө нь хоосон дэвсгэрийг илтгэнэ.Хуваарийн өнгөний утгыг N = 2 найрлага дахь түүхий OD утга дээр үндэслэнэ.Эсрэг биетээр танигдсан гол эпитопуудыг баруун талд харуулав.
Эдгээр целлюлоз бус бүтцийг туршиж үзсэн арилжааны ферментийн хольц дахь хамгийн түгээмэл целлюлаза ба гемицеллюлазууд задалж чадаагүй бөгөөд үүнд хамгийн түгээмэл хэрэглэгддэг арилжааны ферментүүд багтдаг.Тиймээс тэдгээрийн гидролизийн хувьд шинэ туслах ферментүүд шаардлагатай байдаг.Шаардлагатай целлюлозын бус нэмэлт ферментүүдгүйгээр эдгээр целлюлозын бус холбоо нь тэдний эх элсэн чихрийн полимерүүд нь богино хэсгүүдэд их хэмжээгээр гидролиз болж, арилжааны ферментийн хольцыг ашиглан уусдаг байсан ч моносахарид руу бүрэн шилжихээс сэргийлдэг.
Дохионы тархалт ба түүний холболтын хүчийг цаашид судлах нь холбогч эпитопууд нь димер дэх бага DP фракцтай (D, E, F, DP) харьцуулахад өндөр DP сахарын фракц (A, B, C, DP 20+ хүртэл) бага байгааг харуулсан) (Зураг 1).Хүчиллэг хэсгүүд нь целлюлозгүй эпитопуудад төвийг сахисан хэсгүүдээс илүү түгээмэл байдаг.Эдгээр үзэгдлүүд нь бидний өмнөх судалгаанд ажиглагдсан загвартай нийцэж байгаа бөгөөд өндөр DP ба хүчиллэг хэсгүүд нь ферментийн гидролизд илүү тэсвэртэй байсан.Тиймээс целлюлозын бус гликан эпитопууд болон U ба MeU орлуулалтууд нь олигосахаридын тогтвортой байдалд ихээхэн хувь нэмэр оруулдаг.Ялангуяа эпитоп нь димер эсвэл тример олигосахарид бол DP багатай олигосахаридын хувьд холбох, илрүүлэх үр ашиг нь асуудалтай байдаг гэдгийг тэмдэглэх нь зүйтэй.Үүнийг тус бүр нь зөвхөн нэг эпитоп агуулсан, тодорхой мАб-тай холбогддог өөр өөр урттай арилжааны олигосахаридуудыг ашиглан туршиж болно.
Тиймээс бүтцийн өвөрмөц эсрэгбиемүүдийг ашиглах нь тодорхой төрлийн эсэргүүцлийн холбоог илрүүлсэн.Ашигласан эсрэгбиеийн төрөл, тохирох холбоосын загвар, түүний гаргаж буй дохионы хүч (хамгийн их ба хамгийн бага) зэргээс хамааран шинэ ферментүүдийг тодорхойлж, илүү бүрэн глико хувиргахын тулд ферментийн холимогт хагас тоон хэмжээгээр нэмж болно.ACSH олигосахаридын шинжилгээг жишээ болгон авч үзвэл бид биомасс материал бүрийн гликан бондын мэдээллийн санг үүсгэж болно.Эсрэгбиемүүдийн өөр өөр ойр дотно байдлыг харгалзан үзэх шаардлагатай бөгөөд хэрэв тэдгээрийн хамаарал тодорхойгүй бол энэ нь өөр өөр эсрэгбиемүүдийн дохиог харьцуулах үед тодорхой хүндрэл учруулна гэдгийг энд тэмдэглэх нь зүйтэй.Нэмж дурдахад, гликан бондын харьцуулалт нь ижил эсрэгбиеийн дээжүүдийн хооронд хамгийн сайн үр дүнтэй байж болно.Дараа нь эдгээр зөрүүд бондуудыг CAZyme мэдээллийн сантай холбож, эндээс бид ферментийг тодорхойлох, нэр дэвшигч ферментийг сонгох, холбоо таслах ферментийг шалгах, эсвэл био боловсруулах үйлдвэрт ашиглах зорилгоор эдгээр ферментийг илэрхийлэх бичил биетний системийг хөгжүүлэх боломжтой44.
Дархлаа судлалын аргууд нь лигноцеллюлозын гидролизатуудад агуулагдах бага молекул жинтэй олигосахаридыг тодорхойлох өөр аргуудыг хэрхэн нөхөж байгааг үнэлэхийн тулд бид MALDI (Зураг 4, S1-S8) болон GC-MS дээр суурилсан TMS-аас гаралтай сахаридын шинжилгээг ижил самбар дээр (Зураг 5) олигосахаридын хэсэгт хийсэн.MALDI нь олигосахаридын молекулуудын массын тархалт нь төлөвлөсөн бүтэцтэй тохирч байгаа эсэхийг харьцуулахад ашиглагддаг.Зураг дээр.4-т ACN-A ба ACN-B төвийг сахисан бүрэлдэхүүн хэсгүүдийн MS-ийг харуулав.ACN-A шинжилгээгээр жин нь MeU-ксилан олигосахаридтай тохирч байгаа DP 4-8 (Зураг 4)-аас DP 22 (Зураг S1) хүртэлх пентозын сахарын хүрээг баталсан.ACN-B шинжилгээгээр пентоз ба глюкоксилан цувралыг DP 8-15-тай баталсан.Зураг S3 гэх мэт нэмэлт материалд FA-C хүчиллэг хэсгийн массын тархалтын зураг нь ELISA-д суурилсан mAb-ийн скринингэд олдсон орлуулсан ксилануудтай нийцэж байгаа DP 8-15-тай (Me)U орлуулсан пентозын сахарын хүрээг харуулж байна.Эпитопууд нь тууштай байдаг.
ACS-д агуулагдах уусдаг үл нийцэх олигосахаридын MALDI-MS спектр.Энд (A) ACN-A бага жинтэй фракцуудыг метилжүүлсэн уроны хүчил (DP 4-8) агуулсан глюкуроксилан олигосахаридууд ба (B) глюкуроксилан (DP 8-15) -аар орлуулсан ACN-B ксилан ба метилжүүлсэн уроны хүчлийн олигосахаридуудыг орлуулсан.
Галд тэсвэртэй олигосахаридын гликаны үлдэгдлийн найрлагын шинжилгээ.Энд (A) GC-MS шинжилгээ ашиглан олж авсан төрөл бүрийн олигосахаридын фракцуудын TMS сахаридын найрлага.(B) Олигосахаридуудад агуулагдах янз бүрийн TMS-ээс гаралтай элсэн чихрийн бүтэц.ACN – саармаг олигосахарид агуулсан ацетонитрилийн фракц ба FA – хүчил олигосахарид агуулсан ферулийн хүчлийн фракц.
Зураг S9-д үзүүлсэн шиг олигосахаридын фракцын LC-MS шинжилгээнээс өөр нэг сонирхолтой дүгнэлт хийсэн (аргуудыг цахим нэмэлт материалаас харж болно).ACN-B фракцыг холбосон үед гексоз ба -OAc бүлгүүдийн фрагментууд олон удаа ажиглагдсан.Энэхүү олдвор нь гликом болон MALDI-TOF шинжилгээнд ажиглагдсан хуваагдлыг батлахаас гадна урьдчилан боловсруулсан лигноцеллюлозын биомасс дахь нүүрсустөрөгчийн боломжит деривативуудын талаар шинэ мэдээлэл өгдөг.
Мөн бид TMS гликаны деривацийг ашиглан олигосахаридын фракцын гликаны найрлагын шинжилгээ хийсэн.GC-MS-ийг ашиглан бид олигосахаридын фракц дахь мэдрэлийн (үүсмэл бус) ба хүчиллэг сахарын (GluA ба GalA) найрлагыг тодорхойлсон (Зураг 5).Глюкуроны хүчил нь C ба D хүчиллэг бүрэлдэхүүн хэсгүүдэд агуулагддаг бол галактуроны хүчил нь хүчиллэг сахарын өндөр DP бүрэлдэхүүн хэсэг болох хүчиллэг A ба B бүрэлдэхүүн хэсгүүдэд байдаг.Эдгээр үр дүн нь бидний ELISA болон MALDI-ийн өгөгдлийг батлахаас гадна олигосахаридын хуримтлалын талаарх бидний өмнөх судалгаатай нийцэж байна.Иймээс олигосахаридын биотинилжилтийг ашиглан орчин үеийн дархлаа судлалын аргууд, дараа нь ELISA скрининг хийх нь янз бүрийн биологийн дээжинд уусдаг эсэргүүцэгч олигосахаридуудыг илрүүлэхэд хангалттай гэж бид үзэж байна.
ELISA-д суурилсан mAb скринингийн аргуудыг хэд хэдэн өөр аргаар баталгаажуулсан тул бид энэхүү шинэ тоон аргын боломжийг судлахыг хүссэн.Арилжааны хоёр олигосахарид болох ксилохексасахарид олигосахарид (XHE) ба 23-α-L-арабинофуранозил-ксилотриоз (A2XX)-ийг эсийн ханын гликан руу чиглэсэн шинэ мАб аргыг ашиглан худалдан авч туршсан.Зураг 6-д биотинжуулсан холбох дохио ба олигосахаридын концентрацийн лог концентрацийн хоорондох шугаман хамаарлыг харуулсан нь Лангмюрын шингээлтийн загварыг харуулж байна.mAb-ийн дотроос CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148, CCRC-M151 нь XHE-тэй, CCRC-M108, CCRC-M109, LM11 нь A2XX-тэй na10nm-ээс на10м-н хооронд хамааралтай байна.Туршилтын явцад эсрэгбиеийн олдоц хязгаарлагдмал байсан тул олигосахаридын концентраци тус бүрээр хязгаарлагдмал туршилт хийсэн.Зарим эсрэгбие нь субстрат болох ижил олигосахаридтай харилцан адилгүй хариу үйлдэл үзүүлдэг гэдгийг энд тэмдэглэх нь зүйтэй, учир нь тэдгээр нь ялимгүй өөр эпитопуудтай холбогддог бөгөөд хоорондоо маш өөр төрлийн холбогдох чадвартай байдаг.Бодит дээжинд mAb-ийн шинэ аргыг хэрэглэх үед эпитопыг үнэн зөв тодорхойлох механизм, үр дагавар нь илүү төвөгтэй байх болно.
Төрөл бүрийн гликан зорилтот мАб-ийн илрүүлэх хүрээг тодорхойлоход арилжааны хоёр олигосахарид ашигласан.Энд олигосахаридын концентрацийн лог концентрацитай шугаман хамаарал нь (A) XHE-ийн mAb ба (B) A2XX-ийн mAb-ийн шингээлтийн хэв маягийг харуулж байна.Харгалзах эпитопууд нь шинжилгээнд субстрат болгон ашигладаг арилжааны олигосахаридын бүтцийг заана.
Гликанд чиглэсэн моноклональ эсрэгбие (гликокомикийн шинжилгээ эсвэл ELISA-д суурилсан mAb скрининг) ашиглах нь ургамлын биомассыг бүрдүүлдэг ихэнх эсийн ханын гликануудын гүн гүнзгий шинж чанарыг тодорхойлох хүчирхэг хэрэгсэл юм.Гэсэн хэдий ч ихэнх олигосахаридууд нь ELISA ялтсууд дээр үр дүнтэй хөдөлгөөнгүй байдаг тул сонгодог гликаны шинжилгээ нь зөвхөн том эсийн ханын гликануудыг тодорхойлдог.Энэхүү судалгаагаар AFEX-ээр урьдчилан боловсруулсан эрдэнэ шишийн зуухыг хатуу бодисын агууламж өндөртэй ферментийн гидролизчилсэн.Гидролизат дахь эсэргүүцэгч эсийн хананы нүүрсустөрөгчийн найрлагыг тодорхойлохын тулд чихрийн шинжилгээг ашигласан.Гэсэн хэдий ч гидролизат дахь жижиг олигосахаридын мАб шинжилгээг дутуу үнэлдэг бөгөөд ELISA хавтан дээрх олигосахаридыг үр дүнтэй хөдөлгөөнгүй болгох нэмэлт хэрэгсэл шаардлагатай.
Бид энд олигосахаридын биотинизацийг хослуулан, дараа нь NeutrAvidin ™ бүрсэн хавтан дээр ELISA скрининг хийх замаар мАб скрининг хийх олигосахаридыг хөдөлгөөнгүй болгох шинэ, үр дүнтэй аргыг танилцуулж байна.Хөдөлгөөнгүйжүүлсэн биотинжүүлсэн олигосахаридууд нь эсрэгбиетэй харьцах харьцааг харуулсан бөгөөд эсэргүүцэгч олигосахаридуудыг хурдан бөгөөд үр дүнтэй илрүүлэх боломжийг олгодог.Масс спектрометрт суурилсан эдгээр зөрүүд олигосахаридын найрлагад хийсэн дүн шинжилгээ нь дархлаа судлалын энэхүү шинэ аргын үр дүнг баталжээ.Иймээс эдгээр судалгаанууд нь олигосахаридын биотинизаци ба ELISA скринингийг гликан чиглэсэн моноклональ эсрэгбиетэй хослуулан олигосахаридын хөндлөн холбоосыг илрүүлэхэд ашиглаж болох ба олигосахаридын бүтцийг тодорхойлдог биохимийн бусад судалгаанд өргөнөөр ашиглаж болохыг харуулж байна.
Энэхүү биотинд суурилсан гликаны профайл тодорхойлох арга нь ургамлын биомасс дахь уусдаг олигосахаридын нүүрсустөрөгчийн эсэргүүцлийг судлах чадвартай анхны тайлан юм.Энэ нь био түлш үйлдвэрлэхэд биомассын зарим хэсэг яагаад ийм зөрүүд байдгийг ойлгоход тусална.Энэ арга нь гликомын шинжилгээний аргуудын чухал цоорхойг нөхөж, ургамлын олигосахаридаас гадна илүү өргөн хүрээний субстратуудад хэрэглэх боломжийг олгодог.Ирээдүйд бид биотинжуулалтад робот техникийг ашиглаж, ELISA ашиглан дээжийг өндөр үр дүнтэй шинжлэхэд бидний боловсруулсан аргыг ашиглаж болно.
Pioneer 33A14 эрлийз үрээр ургуулсан эрдэнэ шишийн сүрлийг (CS) 2010 онд Колорадо мужийн Рэй хотын Крамер фермээс хураан авсан.Газар эзэмшигчийн зөвшөөрлөөр энэхүү биомассыг судалгаанд ашиглаж болно. Дээжийг хуурай <6%-ийн чийгтэй, цахилгаантай уутанд тасалгааны температурт хадгалсан. Дээжийг хуурай <6%-ийн чийгтэй, цахилгаантай уутанд тасалгааны температурт хадгалсан. Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре. Дээжийг тасалгааны температурт цахилгаан товчтой уутанд 6%-иас бага чийгшилтэй хуурай нөхцөлд хадгалсан.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < 6%. Дээжийг цахилгаан товч уутанд хийж, өрөөний температурт, чийгшил 6% -иас багагүй нөхцөлд хадгална.Судалгаа нь орон нутгийн болон үндэсний удирдамжид нийцсэн.Найрлагын шинжилгээг NREL протокол ашиглан хийсэн.Найрлагад 31.4% глюкан, 18.7% ксилан, 3.3% арабинан, 1.2% галактан, 2.2% ацетил, 14.3% лигнин, 1.7% уураг, 13.4% үнс агуулагддаг нь тогтоогдсон.
Cellic® CTec2 (138 мг уураг/мл, VCNI 0001 багц) нь Novozymes (Franklinton, NC, АНУ) компанийн целлюлаза, β-глюкозидаза болон Cellic® HTec2 (157 мг уураг/мл, VHN00001 багц)-ийн цогц холимог юм.Multifect Pectinase® (72 мг уураг/мл) нь пектин задалдаг ферментийн цогц хольцыг DuPont Industrial Biosciences (Пало Алто, Калифорниа, АНУ) хандивласан.Ферментийн уургийн концентрацийг Kjeldahl азотын шинжилгээ (AOAC арга 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA) ашиглан уургийн агууламжийг (мөн уураг бус азотын хувь нэмрийг хасч) тооцоолсноор тодорхойлсон.Diatomaceous earth 545-ийг EMD Millipore (Billerica, MA) компаниас худалдаж авсан.Идэвхжүүлсэн нүүрс (DARCO, 100 торон мөхлөг), Avicel (PH-101), beech xylan болон бусад бүх химийн бодисыг Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) компаниас худалдаж авсан.
AFEX-ийн урьдчилсан эмчилгээг GLBRC (Биомасс хувиргах судалгааны лаборатори, MSU, Lansing, MI, АНУ) дээр хийсэн.Урьдчилан боловсруулалтыг 140 хэмд 15 минутын турш явуулна.46 зэвэрдэггүй ган вандан реакторт (Parr Instruments Company) 1:1 усгүй аммиак ба биомасс 60% (б/х) ачаалалтай байх үед оршин суух хугацаа.30 минут болсон.Реакторыг 140 хэмд хүргэж аммиакийг хурдан гаргаж, биомассыг тасалгааны температурт хурдан буцаах боломжийг олгосон.AFEX-ийн урьдчилан боловсруулсан эрдэнэ шишийн зуухны (ACS) найрлага нь боловсруулаагүй эрдэнэ шишийн зуухны (UT-CS) найрлагатай төстэй байв.
Өндөр хатуу ACSH 25% (w/w) (ойролцоогоор 8% декстраны ачаалал) олигосахаридыг их хэмжээгээр үйлдвэрлэх эхлэлийн материал болгон бэлтгэсэн.ACS-ийн ферментийн гидролизийг Cellic® Ctec2 10 мг уураг/г глюкан (урьдчилан боловсруулсан биомассанд), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 мг уураг/г глюкан, Multifect Pectinase (Genencor Inc, АНУ) зэрэг арилжааны ферментийн хольцыг ашиглан гүйцэтгэсэн.).), 5 мг уураг/г декстран.Ферментийн гидролизийг 5 литрийн багтаамжтай биореакторт 3 литр, рН 4.8, 50°С, 250 эрг / мин ажиллах хүчин чадалтай хийсэн.96 цагийн турш гидролиз хийсний дараа гидролизатыг 6000 эрг / мин-д 30 минут, дараа нь 14 000 эрг / мин-т 30 минутын турш центрифугээр цуглуулж, гидролизгүй хатуу бодисыг зайлуулна.Дараа нь гидролизатыг 0.22 мм-ийн шүүлтүүрийн шилэн саванд ариутгасан шүүнэ.Шүүсэн гидролизатыг ариутгасан саванд 4°С-т хадгалж, дараа нь нүүрстөрөгч дээр хуваасан.
NREL лабораторийн шинжилгээний журмын дагуу ханд дээр суурилсан биомассын дээжийн найрлагын шинжилгээ: дээжийг найрлагын шинжилгээнд бэлтгэх (NREL/TP-510-42620) болон биомасс дахь бүтцийн нүүрс ус, лигнинийг тодорхойлох (NREL/TP-510 – 42618)47.
Гидролизатын урсгалын олигосахаридын шинжилгээг автоклавт суурилсан хүчиллэг гидролизийн аргыг ашиглан 2 мл масштабаар хийсэн.Гидролизатын дээжийг 69.7 мкл 72%-ийн хүхрийн хүчилтэй 10 мл-ийн шураг малгайтай өсгөврийн хоолойд хольж, ширээний тавцан дээр 121 ° C-т 1 цаг өсгөвөрлөж, мөсөн дээр хөргөж, өндөр хүчин чадалтай шингэн хроматографийн (HPLC) шилэн саванд шүүнэ.Олигосахаридын концентрацийг хүчиллэг гидролизжүүлсэн дээж дэх нийт сахарын агууламжаас гидролизгүй дээж дэх моносахаридын концентрацийг хасаж тодорхойлно.
Био-Rad Aminex HPX-87H багана дээрх автосоригч, багана халаагч, изократ насос, хугарлын илтгэгч мэдрэгчээр тоноглогдсон Shimadzu HPLC системийг ашиглан хүчиллэг гидролизийн биомасс дахь глюкоз, ксилоз, арабинозын концентрацийг шинжиллээ.Баганыг 50°С хэмд байлгаж, 0.6 мл/мин 5 мМ H2SO4-тэй усаар зайлна.урсгал.
Гидролизатын дээд давхаргыг шингэлж, мономер ба олигосахаридын агууламжийг шинжлэв.Ферментийн гидролизийн дараа олж авсан мономер сахарыг Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P багана, үнсний хамгаалалтын багана бүхий HPLC төхөөрөмжөөр шинжилэв.Баганын температурыг 80 хэмд байлгаж, усыг 0.6 мл/мин урсгалын хурдтайгаар хөдөлгөөнт фаз болгон ашигласан.Олигосахаридуудыг 121°С-т шингэрүүлсэн хүчилд гидролизийн аргаар тодорхойлсон аргуудын дагуу тодорхойлсон.41, 48, 49.
Сахаридын шинжилгээг түүхий, AFEX-ийн урьдчилан боловсруулсан болон бүх гидролизжүүлээгүй биомассын үлдэгдэлд (цуваа эсийн ханын хандыг үйлдвэрлэх, тэдгээрийн мАб скринингийг оролцуулан) өмнө тайлбарласан 27, 43, 50, 51 процедурыг ашиглан хийсэн.Гликомын шинжилгээ хийхийн тулд ургамлын эсийн ханын материалын спиртэнд уусдаггүй үлдэгдлийг биомассын үлдэгдэлээс бэлтгэж, аммонийн оксалат (50 мМ), натрийн карбонат (50 мМ ба 0.5% х/х), CON зэрэг улам бүр түрэмгий урвалжаар цувуулан олборлодог.(1М ба 4М, хоёулаа 1% натрийн боргидридтэй) болон өмнө нь тайлбарласны дагуу хүчил хлорит52,53.Дараа нь хандыг эсийн ханын гликан руу чиглэсэн mAb50-ийн нарийн төвөгтэй хавтангийн эсрэг ELISA-д хамруулж, мАб холбох урвалыг дулааны зураг хэлбэрээр үзүүлэв.Ургамлын эсийн ханын гликанд чиглэсэн mAbs-ийг лабораторийн нөөцөөс (CCRC, JIM болон MAC цуврал) худалдаж авсан.
Олигосахаридын нэг үе шаттай биотинилжилт.Нүүрс усыг биотин-LC-гидразидтай холбох ажлыг дараах процедурыг ашиглан гүйцэтгэсэн.Биотин-LC-гидразидыг (4.6 мг/12 мкмоль) диметил сульфоксид (DMSO, 70 мкл) -д хүчтэй хутгаж, 65°С-т 1 минутын турш халааж уусгав.Мөсөн цууны хүчил (30 мкл) нэмээд хольцыг натрийн цианоборогидрид (6.4 мг/100 мкмоль) дээр асгаж, 65 хэмд 1 минут орчим халаасны дараа бүрэн уусгана.Дараа нь 5-8 мкл урвалын хольцыг хатаасан олигосахарид (1-100 нмоль) дээр нэмж, бууруулагчийн төгсгөлөөс 10 дахин буюу түүнээс дээш молийн илүүдэлтэй шошгыг олж авна.Урвалыг 65 градусын температурт 2 цагийн турш хийж, дараа нь дээжийг нэн даруй цэвэрлэв.Шошгоны туршилтанд натрийн цианоборогидридийг бууруулалгүйгээр ашиглаагүй бөгөөд дээжийг 65 хэмд 2.5 цагийн турш урвалд оруулав.
Биотинжүүлсэн олигосахаридын дээжийг ELISA бүрэх, угаах.25 мкл биотинжүүлсэн дээжийг (баяжуулсан дээж тус бүрээс 100 мкл-ийг 5 мл 0.1 М Tris буферийн уусмалд (TBS) шингэлнэ) авидинаар бүрсэн хавтангийн нүх тус бүр дээр нэмсэн.Хяналтын цооногийг 0.1 M TBS-д 10 мкг/мл концентрацитай 50 мкл биотиноор бүрсэн.Хоосон хэмжилт хийхэд ионгүйжүүлсэн усыг бүрээс болгон ашигласан.Таблетыг тасалгааны температурт харанхуй газар 2 цагийн турш өсгөвөрлөнө.Уг хавтанг 0.1% тосгүй сүүгээр 0.1 M TBS-т 3 удаа програмын дугаараар угаана.Grenier flat 3A-д зориулсан 11.
Анхан шатны эсрэгбиемүүдийг нэмэх, угаах.Худаг бүрт 40 мкл анхдагч эсрэгбие нэмнэ.Бичил хавтанг тасалгааны температурт харанхуй газар 1 цагийн турш өсгөвөрлөнө.Дараа нь Grenier Flat 3A-д зориулсан №11 угаах программыг ашиглан ялтсуудыг 0.1% сүүгээр 0.1M TBS-т 3 удаа угаана.
Хоёрдогч эсрэгбие нэмээд угаана.Худаг тус бүрт 50 мкл хулгана/хархны хоёрдогч эсрэгбие (0.1% сүүнд 1:5000 харьцаагаар шингэлнэ) нэмнэ.Бичил хавтанг тасалгааны температурт харанхуй газар 1 цагийн турш өсгөвөрлөнө.Дараа нь микропласнуудыг Grenier Flat 5A хавтан угаах №12 программыг ашиглан 0.1 M TBS-т 0.1% сүүгээр 5 удаа угаана.
Субстрат нэмэх.Үндсэн субстрат дээр 50 мкл 3,3′,5,5′-тетраметилбензидин (TMB) нэмнэ (15 мл ионгүйжүүлсэн усанд 2 дусал буфер, 3 дусал TMB, 2 дусал устөрөгчийн хэт исэл нэмнэ).TMB субстратыг бэлтгэ.хэрэглэхийн өмнө эргүүлэх).Бичил хавтанг тасалгааны температурт 30 минутын турш өсгөвөрлөнө.Харанхуйд.
Алхамыг дуусгаад таблетыг уншина уу.Худаг тус бүрт 50 мкл 1 N хүхрийн хүчил нэмж, ELISA уншигч ашиглан 450-655 нм-ийн шингээлтийг тэмдэглэнэ.
Ионгүйжүүлсэн усанд 1 мг/мл уусмал бэлтгэнэ: арабиноз, рамноз, фукоз, ксилоз, галактуроны хүчил (ГалА), глюкуроны хүчил (GlcA), манноз, глюкоз, галактоз, лактоз, N-ацетилманнозамин (манНАклукосамин), N-ацетил.(glcNAc), N-ацетилгалактозамин (galNAc), инозитол (дотоод стандарт).Хүснэгт 1-д үзүүлсэн 1 мг/мл элсэн чихрийн уусмалыг нэмж хоёр стандартыг бэлтгэсэн. Дээжийг хөлдөөж, бүх усыг зайлуулж дуустал -80°С-т лиофильжүүлнэ (ихэвчлэн 12-18 цаг).
Аналитик баланс дээр 100-500 мкг дээжийг таглаатай хоолойд нэмнэ.Нэмэгдсэн дүнг тэмдэглэ.Дээжийг уусгагчийн тодорхой концентрацид уусгаж, шингэн хэсэг болгон хоолойд нэмэх нь хамгийн сайн арга юм.Дээжний хоолой бүрт 20 мкл 1 мг/мл инозитолыг дотоод стандарт болгон хэрэглэнэ.Дээжэнд нэмсэн дотоод стандартын хэмжээ нь стандарт хоолойд нэмсэн дотоод стандартын хэмжээтэй ижил байх ёстой.
Шураг таглаатай саванд 8 мл усгүй метанол нэмнэ.Дараа нь 4 мл 3 N. метанолын HCl уусмалыг таглаад сэгсэрнэ.Энэ процесс нь ус хэрэглэдэггүй.
Олигосахаридын дээж болон стандарт TMS хоолойд 500 мкл 1 М HCl метанолын уусмал нэмнэ.Дээжийг дулааны блок дотор 80 хэмд шөнийн турш (168 цаг) өсгөвөрлөсөн.Метанолизийн бүтээгдэхүүнийг тасалгааны температурт хатаах коллектор ашиглан хатаана.200 мкл MeOH нэмээд дахин хатаана.Энэ процессыг хоёр удаа давтана.Дээжинд 200 мкл метанол, 100 мкл пиридин, 100 мкл цууны ангидрид нэмээд сайтар холино.Дээжийг тасалгааны температурт 30 минутын турш өсгөвөрлөнө.ба хатаасан.200 мкл метанол нэмээд дахин хатаана.
200 мкл Tri-Sil нэмээд таглаатай хоолойг 20 минут халаана.80 ° C, дараа нь өрөөний температурт хөргөнө.Дээжийг ойролцоогоор 50 мкл хүртэл хатаахын тулд хатаах коллектор ашиглана.Бид дээжийг бүрэн хатаахыг зөвшөөрөөгүй гэдгийг анхаарах нь чухал юм.
2 мл гексан нэмээд эргүүлж сайтар холино.Пастерийн пипеткийн (5-8 мм) үзүүрийг шилэн ноосоор дүүргэж, 5-3/4 инчийн диаметртэй пипеткийн орой дээр шилэн ноосыг хийнэ.Дээжийг 3000 г-т 2 минутын турш центрифуглав.Аливаа уусдаггүй үлдэгдэл тунадас үүснэ.Дээжийг 100-150 мкл хүртэл хатаана.Ойролцоогоор 1 мкл-ийн эзэлхүүнийг GC-MS-д 80 ° C-ийн анхны температур, 2.0 минутын эхний хугацаанд тарьсан (Хүснэгт 2).