Nature.com தளத்திற்கு வருகை தந்ததற்கு நன்றி. நீங்கள் பயன்படுத்தும் உலாவியில் CSS ஆதரவு குறைவாக உள்ளது. சிறந்த அனுபவத்தைப் பெற, மேம்படுத்தப்பட்ட உலாவியைப் பயன்படுத்துமாறு (அல்லது இன்டர்நெட் எக்ஸ்ப்ளோரரில் இணக்கப் பயன்முறையை முடக்குமாறு) பரிந்துரைக்கிறோம். இதற்கிடையில், தொடர்ச்சியான ஆதரவை உறுதிசெய்யும் வகையில், நாங்கள் இந்தத் தளத்தை ஸ்டைல்கள் மற்றும் ஜாவாஸ்கிரிப்ட் இல்லாமல் வழங்குவோம்.
AFEX கொண்டு முன்சிகிச்சை செய்யப்பட்ட மக்காச்சோளத் தழையில் உள்ள நிலைத்தன்மை வாய்ந்த ஒலிகோசாக்கரைடுகளின் சிக்கலான பகுப்பாய்விற்கான புதிய நோயெதிர்ப்பு மற்றும் நிறை நிறமாலை அளவியல் முறைகள். லிக்னோசெல்லுலோசிக் உயிரிப்பொருள், புதைபடிவ எரிபொருள்களுக்கு ஒரு நிலையான மாற்றாகும். மேலும் இது உணவு, தீவனம், எரிபொருள்கள் மற்றும் வேதிப்பொருட்கள் போன்ற பொருட்களை உற்பத்தி செய்வதற்கான உயிரித்தொழில்நுட்பங்களை உருவாக்க பரவலாகப் பயன்படுத்தப்படுகிறது. தாவர செல் சுவர்களில் உள்ள சிக்கலான கார்போஹைட்ரேட்டுகளை, குளுக்கோஸ், சைலோஸ் மற்றும் அரபினோஸ் போன்ற எளிய சர்க்கரைகளாக மாற்றுவதற்கான செலவு குறைந்த செயல்முறைகளை உருவாக்குவதே இந்தத் தொழில்நுட்பங்களின் திறவுகோலாகும். லிக்னோசெல்லுலோசிக் உயிரிப்பொருள் மிகவும் பிடிவாதமானது என்பதால், விரும்பிய பொருளைப் பெறுவதற்கு, அதனை வெப்பவேதியியல் சிகிச்சைகள் (எ.கா., அம்மோனியா நார் உரித்தல் (AFEX), நீர்த்த அமிலங்கள் (DA), அயனி திரவங்கள் (IL)) மற்றும் உயிரியல் சிகிச்சைகள் (எ.கா., நொதிய நீராற்பகுப்பு மற்றும் நுண்ணுயிர் நொதித்தல்) ஆகியவற்றுக்கு ஒருங்கிணைந்து உட்படுத்த வேண்டும். இருப்பினும், நீராற்பகுப்புச் செயல்பாட்டில் வணிகப் பூஞ்சை நொதிகள் பயன்படுத்தப்படும்போது, ​​உருவாகும் கரையக்கூடிய சர்க்கரைகளில் 75-85% மட்டுமே மோனோசாக்கரைடுகளாகவும், மீதமுள்ள 15-25% கரையக்கூடிய, கையாளக் கடினமான ஒலிகோசாக்கரைடுகளாகவும் உள்ளன; இவை நுண்ணுயிரிகளுக்கு எப்போதும் கிடைப்பதில்லை. முன்னதாக, கார்பன் மற்றும் டயட்டோமேசியஸ் எர்த் பிரிப்பு மற்றும் அளவு விலக்கல் நிறப்பிரிகை ஆகியவற்றின் கலவையைப் பயன்படுத்தி, கரையக்கூடிய பிடிவாதமான ஒலிகோசாக்கரைடுகளை நாங்கள் வெற்றிகரமாகப் பிரித்தெடுத்துத் தூய்மைப்படுத்தியுள்ளோம், மேலும் அவற்றின் நொதித் தடுப்புப் பண்புகளையும் ஆராய்ந்துள்ளோம். குறைந்த பாலிமரைசேஷன் அளவு (DP) மற்றும் நடுநிலை ஒலிகோசாக்கரைடுகளை விட, அதிக பாலிமரைசேஷன் அளவு (DP) கொண்ட மெத்திலேட்டட் யூரோனிக் அமிலப் பதிலீடுகளைக் கொண்ட ஒலிகோசாக்கரைடுகளை வணிக நொதிக் கலவைகளைக் கொண்டு செயலாக்குவது மிகவும் கடினம் என்பதை நாங்கள் கண்டறிந்துள்ளோம். தாவர செல் சுவர்கள் மற்றும் நொதிய நீராற்பகுப்புகளில் உள்ள கிளைக்கான் பிணைப்புகளை வகைப்படுத்த, தாவர உயிரித்திரள் கிளைக்கான்களுக்கு குறிப்பிட்ட மோனோகுளோனல் ஆன்டிபாடிகளை (mAbs) பயன்படுத்தி கிளைக்கான் விவரக்குறிப்பு செய்தல், மேட்ரிக்ஸ்-உதவியுடனான லேசர் நீக்க அயனியாக்கம், நேர-பறப்பு நிறை நிறமாலையியல் உள்ளிட்ட பல கூடுதல் முறைகளின் பயன்பாட்டை இங்கு நாங்கள் விவரிக்கிறோம். எதிர்மறை அயனிகளின் இரண்டாம் நிலை சிதைவுக்குப் பிறகு நிறமாலையியல் மூலம் பெறப்பட்ட அமைப்பு-தகவல் தரும் கண்டறியும் சிகரங்களைப் பயன்படுத்தும் MALDI-TOF-MS, மற்றும் வழித்தோன்றல் செய்யப்பட்ட மற்றும் செய்யப்படாத ஒலிகோசாக்கரைடு பிணைப்புகளை வகைப்படுத்த வாயு நிறப்பிரிகை மற்றும் நிறை நிறமாலையியல் (GC-MS) ஆகியவையும் இதில் அடங்கும். ஒலிகோசாக்கரைடுகளின் சிறிய அளவு (DP 4–20) காரணமாக, இந்த மூலக்கூறுகளை mAb பிணைப்பு மற்றும் வகைப்படுத்தலுக்குப் பயன்படுத்துவது கடினம். இந்தச் சிக்கலைச் சமாளிக்க, நாங்கள் ஒரு புதிய பயோட்டின் இணைவு அடிப்படையிலான ஒலிகோசாக்கரைடு நிலைப்படுத்தல் முறையைப் பயன்படுத்தினோம். இது மைக்ரோபிளேட் மேற்பரப்பில் பெரும்பாலான குறைந்த DP கரையக்கூடிய ஒலிகோசாக்கரைடுகளை வெற்றிகரமாகக் குறித்தது, பின்னர் இது குறிப்பிட்ட பிணைப்புப் பகுப்பாய்விற்காக ஒரு உயர் செயல்திறன் கொண்ட mAb அமைப்பில் பயன்படுத்தப்பட்டது. இந்த புதிய முறையானது, நோயறிதல் நோக்கங்களுக்காக உயிர் அடையாளங்களில் உள்ள ஒலிகோசாக்கரைடுகளைப் பிரித்தெடுத்து வகைப்படுத்தப் பயன்படும், மேலும் மேம்பட்ட அதிவேக கிளைகோம் சோதனைகளை எதிர்காலத்தில் உருவாக்குவதற்கு வழிவகுக்கும்.
வேளாண்மை, வனவியல், புல் மற்றும் மரப் பொருட்களால் ஆன லிக்னோசெல்லுலோஸ் உயிரிப்பொருள், உணவு, தீவனம், எரிபொருள் மற்றும் அதிக மதிப்புள்ள பொருட்களை உற்பத்தி செய்வதற்கான இரசாயன முன்னோடிகள் உள்ளிட்ட உயிரி சார்ந்த பொருட்களை உற்பத்தி செய்வதற்கான ஒரு சாத்தியமான மூலப்பொருளாகும்¹. தாவர செல் சுவர்களில் உள்ள கார்போஹைட்ரேட்டுகள் (செல்லுலோஸ் மற்றும் ஹெமிசெல்லுலோஸ் போன்றவை) இரசாயன செயலாக்கம் மற்றும் உயிரிமாற்றம் (நொதி நீராற்பகுப்பு மற்றும் நுண்ணுயிர் நொதித்தல் போன்றவை) மூலம் மோனோசாக்கரைடுகளாக சிதைக்கப்படுகின்றன. பொதுவான முன்-சிகிச்சைகளில் அம்மோனியா ஃபைபர் விரிவாக்கம் (AFEX), நீர்த்த அமிலம் (DA), அயனி திரவம் (IL) மற்றும் நீராவி வெடிப்பு (SE) ஆகியவை அடங்கும், இவை தாவர செல் சுவர்களைத் திறப்பதன் மூலம் லிக்னோசெல்லுலோஸ் உற்பத்தியைக் குறைக்க இரசாயனங்கள் மற்றும் வெப்பத்தின் கலவையைப் பயன்படுத்துகின்றன³,⁴. பொருளின் பிடிவாதம்,⁵. நொதி நீராற்பகுப்பு அதிக திடப்பொருட்களின் சுமையில் வணிக ரீதியான செயல்படும் கார்போஹைட்ரேட் கொண்ட நொதிகளை (CAZymes) பயன்படுத்தி மேற்கொள்ளப்படுகிறது மற்றும் மரபணு மாற்றப்பட்ட ஈஸ்டுகள் அல்லது பாக்டீரியாக்களைப் பயன்படுத்தி நுண்ணுயிர் நொதித்தல் மூலம் உயிரி சார்ந்த எரிபொருள்கள் மற்றும் இரசாயனங்கள் உற்பத்தி செய்யப்படுகின்றன⁶.
வணிக நொதிகளில் உள்ள நொதிகள், சிக்கலான கார்போஹைட்ரேட்-சர்க்கரை பிணைப்புகளை ஒருங்கிணைந்து உடைத்து மோனோசாக்கரைடுகளை உருவாக்கும் நொதிகளின் ஒரு சிக்கலான கலவையால் ஆனவை²⁷. நாங்கள் முன்பு தெரிவித்தபடி, கார்போஹைட்ரேட்டுகளுடன் கூடிய லிக்னினின் நறுமண பாலிமர்களின் சிக்கலான வலைப்பின்னல் அவற்றை மிகவும் கையாள முடியாததாக ஆக்குகிறது. இது முழுமையற்ற சர்க்கரை மாற்றத்திற்கு வழிவகுக்கிறது, மேலும் முன்சிகிச்சை செய்யப்பட்ட உயிரிப்பொருளின் நொதி நீராற்பகுப்பின் போது உற்பத்தி செய்யப்படாத 15-25% பாலின ஒலிகோசாக்கரைடுகளைக் குவிக்கிறது. இது பல்வேறு உயிரிப்பொருள் முன்சிகிச்சை முறைகளில் காணப்படும் ஒரு பொதுவான பிரச்சனையாகும். இந்தத் தடைக்கான சில காரணங்களில், நீராற்பகுப்பின் போது ஏற்படும் நொதித் தடுப்பு, அல்லது தாவர உயிரிப்பொருளில் உள்ள சர்க்கரைப் பிணைப்புகளை உடைக்கத் தேவையான அத்தியாவசிய நொதிகள் இல்லாதிருத்தல் அல்லது குறைந்த அளவில் இருத்தல் ஆகியவை அடங்கும். ஒலிகோசாக்கரைடுகளில் உள்ள சர்க்கரைப் பிணைப்புகள் போன்ற சர்க்கரைகளின் கலவை மற்றும் கட்டமைப்புப் பண்புகளைப் புரிந்துகொள்வது, நீராற்பகுப்பின் போது சர்க்கரை மாற்றத்தை மேம்படுத்த நமக்கு உதவும். இதன் மூலம், உயிரித்தொழில்நுட்ப செயல்முறைகளை பெட்ரோலியத்திலிருந்து பெறப்படும் பொருட்களுடன் செலவு அடிப்படையில் போட்டித்தன்மை வாய்ந்ததாக மாற்ற முடியும்.
கார்போஹைட்ரேட்டுகளின் கட்டமைப்பைத் தீர்மானிப்பது சவாலானது மற்றும் திரவ நிறப்பிரிகை (LC)11,12, அணு காந்த ஒத்ததிர்வு நிறமாலையியல் (NMR)13, நுண்குழாய் மின்புலப் பெயர்ச்சி (CE)14,15,16 மற்றும் நிறை நிறமாலையியல் (MS)17,18 போன்ற முறைகளின் கலவையைக் கோருகிறது. லேசர் நீக்க மற்றும் ஒரு மேட்ரிக்ஸைப் பயன்படுத்தி அயனியாக்கம் (MALDI-TOF-MS) கொண்ட நேர-பறப்பு நிறை நிறமாலையியல் போன்ற MS முறைகள் கார்போஹைட்ரேட் கட்டமைப்புகளை அடையாளம் காண்பதற்கான ஒரு பல்துறை முறையாகும். சமீபத்தில், சோடியம் அயனி சேர்க்கைகளின் மோதல்-தூண்டப்பட்ட சிதைவு (CID) டேன்டம் MS, ஒலிகோசாக்கரைடு இணைப்பு நிலைகள், அனோமெரிக் உள்ளமைவுகள், வரிசைகள் மற்றும் கிளை நிலைகளுக்கு 20, 21 தொடர்புடைய கைரேகைகளை அடையாளம் காண மிகவும் பரவலாகப் பயன்படுத்தப்படுகிறது.
கார்போஹைட்ரேட் பிணைப்புகளை ஆழமாக அடையாளம் காண்பதற்கு கிளைக்கான் பகுப்பாய்வு ஒரு சிறந்த கருவியாகும்²². இந்த முறையானது, சிக்கலான கார்போஹைட்ரேட் இணைப்புகளைப் புரிந்துகொள்வதற்காக, தாவர செல் சுவர் கிளைக்கானை இலக்காகக் கொண்ட மோனோகுளோனல் ஆன்டிபாடிகளை (mAbs) ஆய்வுக் கருவிகளாகப் பயன்படுத்துகிறது. உலகளவில் 250-க்கும் மேற்பட்ட mAbs கிடைக்கின்றன; இவை பல்வேறு சர்க்கரைகளைப் பயன்படுத்தி, பலவிதமான நேரியல் மற்றும் கிளைத்த ஒலிகோசாக்கரைடுகளுக்கு எதிராக வடிவமைக்கப்பட்டுள்ளன²⁴. தாவர செல் வகை, உறுப்பு, வயது, வளர்ச்சி நிலை மற்றும் வளர்ச்சிச் சூழல் ஆகியவற்றைப் பொறுத்து குறிப்பிடத்தக்க வேறுபாடுகள் இருப்பதால், தாவர செல் சுவரின் அமைப்பு, கலவை மற்றும் மாற்றங்களை வகைப்படுத்த பல mAbs பரவலாகப் பயன்படுத்தப்படுகின்றன²⁵,²⁶. மிக சமீபத்தில், இந்த முறையானது தாவர மற்றும் விலங்கு அமைப்புகளில் உள்ள வெசிகல் தொகுதிகளையும், துணை செல் குறிப்பான்கள், வளர்ச்சி நிலைகள் அல்லது சுற்றுச்சூழல் தூண்டுதல்களால் தீர்மானிக்கப்படும் கிளைக்கான் போக்குவரத்தில் அவற்றின் பங்குகளையும் புரிந்துகொள்ளவும், நொதி செயல்பாட்டைத் தீர்மானிக்கவும் பயன்படுத்தப்படுகிறது. அடையாளம் காணப்பட்ட கிளைக்கான்கள் மற்றும் சைலான்களின் சில வெவ்வேறு கட்டமைப்புகளில் பெக்டின் (P), சைலான் (X), மன்னான் (M), சைலோகுளுக்கான்கள் (XylG), கலப்புப் பிணைப்பு குளுக்கான்கள் (MLG), அரபினோசைலான் (ArbX), கேலக்டோமன்னான் (GalG), குளுக்கூரோனிக் அமிலம்-அரபினோசைலான் (GArbX) மற்றும் அரபினோ-கேலக்டான் (ArbG)29 ஆகியவை அடங்கும்.
இருப்பினும், இந்த அனைத்து ஆராய்ச்சி முயற்சிகள் இருந்தபோதிலும், அதிக திடப்பொருட்கள் சுமை (HSL) நீராற்பகுப்பின் போது ஒலிகோசாக்கரைடு குவிப்பின் தன்மை, ஒலிகோசாக்கரைடு வெளியீடு, நீராற்பகுப்பின் போது ஒலிகோமெரிக் சங்கிலி நீள மாற்றங்கள், பல்வேறு குறைந்த DP பாலிமர்கள் மற்றும் அவற்றின் வளைவுப் பரவல்கள் 30,31,32 உள்ளிட்டவற்றில் ஒரு சில ஆய்வுகள் மட்டுமே கவனம் செலுத்தியுள்ளன. இதற்கிடையில், கிளைக்கான் கட்டமைப்பின் விரிவான பகுப்பாய்விற்கு கிளைக்கான் பகுப்பாய்வு ஒரு பயனுள்ள கருவியாக நிரூபிக்கப்பட்டிருந்தாலும், ஆன்டிபாடி முறைகளைப் பயன்படுத்தி நீரில் கரையக்கூடிய குறைந்த DP ஒலிகோசாக்கரைடுகளை மதிப்பிடுவது கடினம். 5-10 kDa க்கும் குறைவான மூலக்கூறு எடையைக் கொண்ட சிறிய DP ஒலிகோசாக்கரைடுகள் ELISA தட்டுகளில் பிணைவதில்லை 33, 34 மற்றும் ஆன்டிபாடி சேர்ப்பதற்கு முன்பு கழுவி அகற்றப்படுகின்றன.
இங்கு, முதல் முறையாக, கரையக்கூடிய கடினமான ஒலிகோசாக்கரைடுகளுக்கான ஒரு-படி பயோட்டினிலேஷன் செயல்முறையை கிளைகோம் பகுப்பாய்வுடன் இணைத்து, மோனோக்ளோனல் ஆன்டிபாடிகளைப் பயன்படுத்தி அவிடின் பூசப்பட்ட தட்டுகளில் ஒரு ELISA சோதனையை நாங்கள் செய்து காட்டுகிறோம். கிளைகோம் பகுப்பாய்வுக்கான எங்கள் அணுகுமுறை, நீராற்பகுக்கப்பட்ட சர்க்கரைக் கலவைகளின் ட்ரைமெத்தில்சிலில் (TMS) வழிப்பொருளாக்கத்தைப் பயன்படுத்தி, நிரப்பு ஒலிகோசாக்கரைடு பிணைப்புகளின் MALDI-TOF-MS மற்றும் GC-MS அடிப்படையிலான பகுப்பாய்வு மூலம் சரிபார்க்கப்பட்டது. இந்த புதுமையான அணுகுமுறையை எதிர்காலத்தில் ஒரு உயர்-செயல்திறன் முறையாக உருவாக்க முடியும் மற்றும் உயிர்மருத்துவ ஆராய்ச்சியில்35 பரந்த பயன்பாட்டைக் காணலாம்.
கிளைகோசைலேஷன்36 போன்ற நொதிகள் மற்றும் ஆன்டிபாடிகளின் மொழிபெயர்ப்புக்குப் பிந்தைய மாற்றங்கள் அவற்றின் உயிரியல் செயல்பாட்டைப் பாதிக்கின்றன. எடுத்துக்காட்டாக, சீரம் புரதங்களின் கிளைகோசைலேஷனில் ஏற்படும் மாற்றங்கள் அழற்சி மூட்டுவலியின் முக்கிய பங்கு வகிக்கின்றன, மேலும் கிளைகோசைலேஷனில் ஏற்படும் மாற்றங்கள் நோயறிதல் குறிப்பான்களாகப் பயன்படுத்தப்படுகின்றன37. இரைப்பைக் குடல் மற்றும் கல்லீரலின் நாள்பட்ட அழற்சி நோய்கள், வைரஸ் தொற்றுகள், கருப்பை, மார்பகம் மற்றும் புரோஸ்டேட் புற்றுநோய்கள்38,39,40 உள்ளிட்ட பல்வேறு நோய்களில் பலவிதமான கிளைக்கான்கள் எளிதில் தோன்றுவதாக இலக்கியங்களில் தெரிவிக்கப்பட்டுள்ளன. ஆன்டிபாடி அடிப்படையிலான கிளைக்கான் ELISA முறைகளைப் பயன்படுத்தி கிளைக்கான்களின் அமைப்பைப் புரிந்துகொள்வது, சிக்கலான MS முறைகளைப் பயன்படுத்தாமல் நோய் கண்டறிதலில் கூடுதல் நம்பிக்கையை வழங்கும்.
முன்சிகிச்சை மற்றும் நொதி நீராற்பகுப்பிற்குப் பிறகும் பிடிவாதமான ஒலிகோசாக்கரைடுகள் நீராற்பகுக்கப்படாமல் இருந்தன என்பதை எங்கள் முந்தைய ஆய்வு காட்டியது (படம் 1). நாங்கள் முன்பு வெளியிட்ட ஆய்வில், AFEX-முன்சிகிச்சை செய்யப்பட்ட சோளத்தண்டு நீராற்பகுப்பிலிருந்து (ACSH)8 ஒலிகோசாக்கரைடுகளைப் பிரித்தெடுக்க, ஒரு செயல்படுத்தப்பட்ட கரி திட-கட்ட பிரித்தெடுப்பு முறையை உருவாக்கினோம். ஆரம்ப பிரித்தெடுத்தல் மற்றும் பிரித்தலுக்குப் பிறகு, ஒலிகோசாக்கரைடுகள் அளவு விலக்கல் நிறப்பிரிகை (SEC) மூலம் மேலும் பகுக்கப்பட்டு, மூலக்கூறு எடையின் வரிசையில் சேகரிக்கப்பட்டன. பல்வேறு முன்சிகிச்சைகளிலிருந்து வெளியிடப்பட்ட சர்க்கரை மோனோமர்கள் மற்றும் ஒலிகோமர்கள் சர்க்கரை கலவை பகுப்பாய்வு மூலம் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன. பல்வேறு முன்சிகிச்சை முறைகளால் பெறப்பட்ட சர்க்கரை ஒலிகோமர்களின் உள்ளடக்கத்தை ஒப்பிடும்போது, ​​உயிரிப்பொருளை மோனோசாக்கரைடுகளாக மாற்றுவதில் பிடிவாதமான ஒலிகோசாக்கரைடுகளின் இருப்பு ஒரு பொதுவான பிரச்சனையாகும், மேலும் இது சர்க்கரை விளைச்சலில் குறைந்தது 10-15% மற்றும் 18% வரை கூட குறைப்புக்கு வழிவகுக்கும். இந்த முறை ஒலிகோசாக்கரைடு பின்னங்களின் மேலும் பெரிய அளவிலான உற்பத்திக்கு பயன்படுத்தப்படுகிறது. இந்த ஆய்வில், ஒலிகோசாக்கரைடுகளின் பண்புகளை வரையறுப்பதற்காக, அதன் விளைவாக உருவான ACH மற்றும் வெவ்வேறு மூலக்கூறு எடைகளைக் கொண்ட அதன் அடுத்தடுத்த கூறுகள் சோதனைப் பொருளாகப் பயன்படுத்தப்பட்டன.
முன்சிகிச்சை மற்றும் நொதி நீராற்பகுப்பிற்குப் பிறகு, நிலைத்திருக்கும் ஒலிகோசாக்கரைடுகள் நீராற்பகுக்கப்படாமல் இருந்தன. இங்கு (A) என்பது, AFEX-ஆல் முன்சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட சோளத்தண்டு நீராற்பகுப்பிலிருந்து (ACSH) ஆக்டிவேட்டட் கார்பன் மற்றும் டயட்டோமேசியஸ் எர்த் ஆகியவற்றின் நிரப்பப்பட்ட படுக்கையைப் பயன்படுத்தி ஒலிகோசாக்கரைடுகளைப் பிரித்தெடுக்கும் ஒரு முறையாகும்; (B) ஒலிகோசாக்கரைடுகளைப் பிரித்தெடுப்பதற்கான முறை. ஒலிகோசாக்கரைடுகள் அளவு விலக்கல் நிறப்பிரிகை (SEC) மூலம் மேலும் பிரிக்கப்பட்டன; (C) பல்வேறு முன்சிகிச்சைகளிலிருந்து (நீர்த்த அமிலம்: DA, அயனித் திரவம்: IL மற்றும் AFEX) வெளியிடப்பட்ட சாக்கரைடு மோனோமர்கள் மற்றும் ஒலிகோமர்கள். நொதி நீராற்பகுப்பு நிலைமைகள்: 25% (w/w) அதிக திடப்பொருட்கள் ஏற்றம் (தோராயமாக 8% குளுக்கான் ஏற்றம்), 96 மணிநேர நீராற்பகுப்பு, 20 மி.கி/கி வணிக நொதி ஏற்றம் (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 விகிதம்) மற்றும் (D) AFEX முன்-பதப்படுத்தப்பட்ட மக்காச்சோளத் தட்டையிலிருந்து (ACS) வெளியிடப்பட்ட குளுக்கோஸ், சைலோஸ் மற்றும் அரபினோஸின் சர்க்கரை ஒற்றை மூலக்கூறுகள் மற்றும் பல மூலக்கூறுகள்.
திடமான உயிரிப் பொருள் எச்சங்களிலிருந்து பிரித்தெடுக்கப்பட்ட சாறுகளில் உள்ள கிளைக்கான்களின் விரிவான கட்டமைப்புப் பகுப்பாய்விற்கு, கிளைக்கான் பகுப்பாய்வு ஒரு பயனுள்ள கருவியாக நிரூபிக்கப்பட்டுள்ளது. இருப்பினும், இந்த பாரம்பரிய முறையைப் பயன்படுத்தி நீரில் கரையக்கூடிய சர்க்கரைக்கூறுகள் குறைவாகவே கண்டறியப்படுகின்றன41, ஏனெனில் குறைந்த மூலக்கூறு எடை கொண்ட ஒலிகோசாக்கரைடுகளை ELISA தட்டுகளில் நிலைநிறுத்துவது கடினம் மற்றும் ஆன்டிபாடி சேர்ப்பதற்கு முன்பு அவை கழுவி அகற்றப்படுகின்றன. எனவே, ஆன்டிபாடி பிணைப்பு மற்றும் பண்பறிதலுக்காக, கரையக்கூடிய, இணக்கமற்ற ஒலிகோசாக்கரைடுகளை அவிடின் பூசப்பட்ட ELISA தட்டுகளில் பூசுவதற்கு ஒரு-படி பயோட்டினிலேஷன் முறை பயன்படுத்தப்பட்டது. இந்த முறை, நாங்கள் முன்பு தயாரித்த ACSH மற்றும் அதன் மூலக்கூறு எடை (அல்லது பாலிமரைசேஷன் அளவு, DP) அடிப்படையிலான ஒரு பகுதியைப் பயன்படுத்தி சோதிக்கப்பட்டது. கார்போஹைட்ரேட்டின் ஒடுக்கும் முனையில் பயோட்டின்-LC-ஹைட்ரசைடைச் சேர்ப்பதன் மூலம் ஒலிகோசாக்கரைடு பிணைப்பு நாட்டத்தை அதிகரிக்க ஒரு-படி பயோட்டினிலேஷன் பயன்படுத்தப்பட்டது (படம் 2). கரைசலில், ஒடுக்கும் முனையில் உள்ள ஹெமியாசெட்டால் குழு, பயோட்டின்-LC-ஹைட்ரசைடின் ஹைட்ரசைடு குழுவுடன் வினைபுரிந்து ஒரு ஹைட்ரசோன் பிணைப்பை உருவாக்குகிறது. NaCNBH3 எனும் ஒடுக்கும் காரணியின் முன்னிலையில், ஹைட்ரசோன் பிணைப்பானது ஒரு நிலையான பயோட்டினிலேட்டட் இறுதி விளைபொருளாக ஒடுக்கப்படுகிறது. சர்க்கரையின் ஒடுக்கும் முனையை மாற்றியமைத்ததன் மூலம், குறைந்த DP கொண்ட ஒலிகோசாக்கரைடுகளை ELISA தட்டுகளில் பிணைப்பது சாத்தியமானது. எங்கள் ஆய்வில், கிளைக்கானை இலக்காகக் கொண்ட mAbs-ஐப் பயன்படுத்தி, அவிடின் பூசப்பட்ட தட்டுகளில் இது செய்யப்பட்டது.
பயோட்டினிலேட்டட் ஒலிகோசாக்கரைடுகளுக்கான ELISA அடிப்படையிலான மோனோகுளோனல் ஆன்டிபாடிகளின் திரையிடல். இங்கே (A) நியூட்ராவிடின் பூசப்பட்ட தட்டுகளில் கிளைக்கான்-இலக்கு mAbs உடன் ஒலிகோசாக்கரைடுகளின் ஒருங்கிணைந்த பயோட்டினிலேஷன் மற்றும் அதைத் தொடர்ந்த ELISA திரையிடல் மற்றும் (B) வினை விளைபொருட்களின் பயோட்டினிலேஷனுக்கான ஒரு-படி செயல்முறையைக் காட்டுகிறது.
பின்னர், ஒலிகோசாக்கரைடு-இணைக்கப்பட்ட ஆன்டிபாடிகள் கொண்ட அவிடின் பூசப்பட்ட தட்டுகளில் முதன்மை மற்றும் இரண்டாம் நிலை ஆன்டிபாடிகள் சேர்க்கப்பட்டு, ஒளி மற்றும் நேர உணர்திறன் கொண்ட ஊடகத்தில் கழுவப்பட்டன. ஆன்டிபாடி பிணைப்பு முடிந்த பிறகு, தட்டை அடைகாக்க TMB அடி மூலக்கூறு சேர்க்கப்பட்டது. இறுதியாக, சல்பூரிக் அமிலத்தைக் கொண்டு வினை நிறுத்தப்பட்டது. அடைகாக்கப்பட்ட தட்டுகள், ஒவ்வொரு ஆன்டிபாடியின் பிணைப்பு வலிமையைத் தீர்மானிக்கவும், ஆன்டிபாடி-குறிப்பிட்ட குறுக்கு-இணைப்பைக் கண்டறியவும் ELISA ரீடரைப் பயன்படுத்தி பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன. பரிசோதனையின் விவரங்கள் மற்றும் அளவுருக்களுக்கு, தொடர்புடைய "பொருட்கள் மற்றும் முறைகள்" பகுதியைப் பார்க்கவும்.
லிக்னோசெல்லுலோசிக் ஹைட்ரோலைசேட்டுகளிலிருந்து பிரித்தெடுக்கப்பட்ட கச்சா மற்றும் சுத்திகரிக்கப்பட்ட ஒலிகோசாக்கரைடு பின்னங்கள் மற்றும் ACSH-இல் உள்ள கரையக்கூடிய ஒலிகோசாக்கரைடுகளைப் பண்புப்படுத்துவதன் மூலம், குறிப்பிட்ட பயன்பாடுகளுக்கான இந்த புதிதாக உருவாக்கப்பட்ட முறையின் பயனை நாங்கள் நிரூபிக்கிறோம். படம் 3-இல் காட்டப்பட்டுள்ளபடி, பயோஅசைலேட்டட் கிளைகோம் மதிப்பீட்டு முறைகளைப் பயன்படுத்தி ACSH-இல் அடையாளம் காணப்பட்ட மிகவும் பொதுவான எபிடோப்-பதிலீடு செய்யப்பட்ட சைலான்கள் பொதுவாக யூரோனிக் (U) அல்லது மெத்தில்யூரோனிக் (MeU) மற்றும் பெக்டிக் அரபினோகலக்டான்கள் ஆகும். அவற்றில் பெரும்பாலானவை, நீராற்பகுக்கப்படாத திடப்பொருட்களின் (UHS) கிளைக்கான்கள் பற்றிய எங்கள் முந்தைய ஆய்விலும் காணப்பட்டன43.
செல் சுவர் கிளைக்கானை இலக்காகக் கொண்ட ஒரு மோனோகுளோனல் ஆன்டிபாடியைப் பயன்படுத்தி, பிடிவாதமான ஒலிகோசாக்கரைடு எபிடோப்களைக் கண்டறிதல். "நடுநிலை" பகுதி என்பது ACN பகுதியாகும், மற்றும் "அமில" பகுதி என்பது FA பகுதியாகும். வெப்ப வரைபடத்தில் உள்ள பிரகாசமான சிவப்பு நிறங்கள் அதிக எபிடோப் உள்ளடக்கத்தையும், பிரகாசமான நீல நிறங்கள் வெற்றுப் பின்னணியையும் குறிக்கின்றன. அளவுகோலில் உள்ள வண்ண மதிப்புகள், N=2 ஃபார்முலேஷன்களுக்கான மூல OD மதிப்புகளை அடிப்படையாகக் கொண்டவை. ஆன்டிபாடிகள் மூலம் அடையாளம் காணப்பட்ட முக்கிய எபிடோப்கள் வலதுபுறத்தில் காட்டப்பட்டுள்ளன.
மிகவும் பரவலாகப் பயன்படுத்தப்படும் வணிக நொதிகளை உள்ளடக்கிய, சோதிக்கப்பட்ட வணிக நொதிக் கலவையில் உள்ள மிகவும் பொதுவான செல்லுலேஸ்கள் மற்றும் ஹெமிகெல்லுலேஸ்களால் இந்த செல்லுலோஸ் அல்லாத கட்டமைப்புகளைப் பிளக்க முடியவில்லை. எனவே, அவற்றின் நீராற்பகுப்பிற்கு புதிய துணை நொதிகள் தேவைப்படுகின்றன. தேவையான செல்லுலோஸ் அல்லாத துணை நொதிகள் இல்லாமல், அவற்றின் மூல சர்க்கரை பாலிமர்கள் வணிக நொதிக் கலவைகளைப் பயன்படுத்தி சிறிய துண்டுகளாக விரிவாக நீராற்பகுக்கப்பட்டு கரைக்கப்பட்டாலும் கூட, இந்த செல்லுலோஸ் அல்லாத பிணைப்புகள் மோனோசாக்கரைடுகளாக முழுமையாக மாறுவதைத் தடுக்கின்றன.
சமிக்ஞைப் பரவல் மற்றும் அதன் பிணைப்பு வலிமை குறித்த மேலதிக ஆய்வில், டைமர்களில் உள்ள குறைந்த DP பின்னங்களை (D, E, F, DP) விட, உயர் DP சர்க்கரைப் பின்னங்களில் (A, B, C, DP 20+ வரை) பிணைப்பு எபிடோப்கள் குறைவாக இருந்தன என்பது தெரியவந்தது (படம் 1). நடுநிலைத் துண்டுகளை விட, செல்லுலோஸ் அல்லாத எபிடோப்களில் அமிலத் துண்டுகள் அதிகமாகக் காணப்படுகின்றன. இந்த நிகழ்வுகள், எங்களின் முந்தைய ஆய்வில் காணப்பட்ட வடிவத்துடன் ஒத்துப்போகின்றன; அதில், உயர் DP மற்றும் அமிலப் பகுதிகள் நொதிய நீராற்பகுப்பிற்கு அதிக எதிர்ப்புத் திறன் கொண்டவையாக இருந்தன. எனவே, செல்லுலோஸ் அல்லாத கிளைக்கான் எபிடோப்கள் மற்றும் U, MeU பதிலீடுகளின் இருப்பு, ஒலிகோசாக்கரைடுகளின் நிலைத்தன்மைக்கு பெரிதும் பங்களிக்கக்கூடும். குறைந்த DP ஒலிகோசாக்கரைடுகளுக்கு, குறிப்பாக எபிடோப் ஒரு டைமெரிக் அல்லது ட்ரைமெரிக் ஒலிகோசாக்கரைடாக இருந்தால், பிணைப்பு மற்றும் கண்டறிதல் செயல்திறன் சிக்கலாக இருக்கலாம் என்பது குறிப்பிடத்தக்கது. ஒரு குறிப்பிட்ட mAb உடன் பிணைக்கும் ஒரே ஒரு எபிடோப்பை மட்டும் கொண்டிருக்கும், வெவ்வேறு நீளங்களைக் கொண்ட வணிக ஒலிகோசாக்கரைடுகளைப் பயன்படுத்தி இதைச் சோதிக்கலாம்.
இவ்வாறு, அமைப்பு-சார்ந்த ஆன்டிபாடிகளின் பயன்பாடு சில வகையான பிடிவாதமான பிணைப்புகளை வெளிப்படுத்தியது. பயன்படுத்தப்படும் ஆன்டிபாடியின் வகை, பொருத்தமான பிணைப்பு முறை, மற்றும் அது உருவாக்கும் சமிக்ஞையின் வலிமை (அதிகம் மற்றும் குறைவாகக் காணப்படும்) ஆகியவற்றைப் பொறுத்து, புதிய நொதிகளை அடையாளம் கண்டு, அவற்றை மேலும் முழுமையான கிளைக்கோமாற்றத்திற்காக நொதிக் கலவையில் பகுதி-அளவறி முறையில் சேர்க்கலாம். ACSH ஒலிகோசாக்கரைடுகளின் பகுப்பாய்வை ஒரு உதாரணமாக எடுத்துக்கொண்டால், ஒவ்வொரு உயிரிப்பொருளுக்கும் கிளைக்கான் பிணைப்புகளின் தரவுத்தளத்தை நாம் உருவாக்கலாம். ஆன்டிபாடிகளின் வெவ்வேறு ஈர்ப்புத்திறனைக் கணக்கில் எடுத்துக்கொள்ள வேண்டும் என்பதை இங்கு கவனிக்க வேண்டும், மேலும் அவற்றின் ஈர்ப்புத்திறன் தெரியவில்லை என்றால், வெவ்வேறு ஆன்டிபாடிகளின் சமிக்ஞைகளை ஒப்பிடும்போது இது சில சிரமங்களை உருவாக்கும். கூடுதலாக, ஒரே ஆன்டிபாடிக்கு, மாதிரிகளுக்கு இடையில் கிளைக்கான் பிணைப்புகளின் ஒப்பீடு சிறப்பாகச் செயல்படக்கூடும். இந்த பிடிவாதமான பிணைப்புகளை பின்னர் CAZyme தரவுத்தளத்துடன் இணைக்கலாம், அதிலிருந்து நாம் நொதிகளை அடையாளம் காணலாம், தகுதியான நொதிகளைத் தேர்ந்தெடுக்கலாம் மற்றும் பிணைப்புகளை உடைக்கும் நொதிகளைச் சோதிக்கலாம், அல்லது உயிரி சுத்திகரிப்பு நிலையங்களில் பயன்படுத்துவதற்காக இந்த நொதிகளை வெளிப்படுத்த நுண்ணுயிர் அமைப்புகளை உருவாக்கலாம்44.
லிக்னோசெல்லுலோசிக் ஹைட்ரோலைசேட்டுகளில் உள்ள குறைந்த மூலக்கூறு எடை கொண்ட ஒலிகோசாக்கரைடுகளை வகைப்படுத்துவதற்கான மாற்று முறைகளுக்கு, நோயெதிர்ப்பு முறைகள் எவ்வாறு துணைபுரிகின்றன என்பதை மதிப்பிடுவதற்காக, நாங்கள் MALDI (படம் 4, S1-S8) மற்றும் அதே பேனலின் (படம் 5) ஒலிகோசாக்கரைடு பகுதியில் GC-MS அடிப்படையிலான TMS-வழித்தோன்றல் சாக்கரைடுகளின் பகுப்பாய்வைச் செய்தோம். ஒலிகோசாக்கரைடு மூலக்கூறுகளின் நிறை பரவல், நோக்கம் கொண்ட அமைப்புடன் பொருந்துகிறதா என்பதை ஒப்பிடுவதற்கு MALDI பயன்படுத்தப்படுகிறது. படம் 4, நடுநிலைக் கூறுகளான ACN-A மற்றும் ACN-B ஆகியவற்றின் MS-ஐக் காட்டுகிறது. ACN-A பகுப்பாய்வு, DP 4–8 (படம் 4) முதல் DP 22 (படம் S1) வரையிலான பென்டோஸ் சர்க்கரைகளின் வரம்பை உறுதிப்படுத்தியது, அவற்றின் எடைகள் MeU-சைலான் ஒலிகோசாக்கரைடுகளுடன் ஒத்துப்போகின்றன. ACN-B பகுப்பாய்வு, DP 8-15 கொண்ட பென்டோஸ் மற்றும் குளுகோசைலான் தொடர்களை உறுதிப்படுத்தியது. படம் S3 போன்ற துணைப் பொருட்களில், FA-C அமிலக் கூறு நிறை பரவல் வரைபடங்கள், ELISA அடிப்படையிலான mAb திரையிடலில் கண்டறியப்பட்ட பதிலிடப்பட்ட சைலான்களுடன் ஒத்துப்போகும், 8-15 வரையிலான DP கொண்ட (Me)U பதிலிடப்பட்ட பென்டோஸ் சர்க்கரைகளின் ஒரு வரம்பைக் காட்டுகின்றன. எபிடோப்கள் ஒத்துப்போகின்றன.
ACS-இல் உள்ள கரையக்கூடிய இணக்கமற்ற ஒலிகோசாக்கரைடுகளின் MALDI-MS நிறமாலை. இதில், (A) மெத்திலேட்டட் யூரோனிக் அமிலம் (DP 4-8) பதிலீடு செய்யப்பட்ட குளுகுராக்ஸைலான் ஒலிகோசாக்கரைடுகளைக் கொண்ட ACN-A குறைந்த எடை வரம்புப் பகுதிகள் மற்றும் (B) குளுகுராக்ஸைலான் (DP 8-15) பதிலீடு செய்யப்பட்ட சைலான் மற்றும் மெத்திலேட்டட் யூரோனிக் அமில ஒலிகோசாக்கரைடுகளைக் கொண்ட ACN-B.
கடினமான ஒலிகோசாக்கரைடுகளின் கிளைக்கான் எச்சத்தின் அமைப்புப் பகுப்பாய்வு. இங்கே (A) GC-MS பகுப்பாய்வைப் பயன்படுத்திப் பெறப்பட்ட பல்வேறு ஒலிகோசாக்கரைடுப் பின்னங்களின் TMS சாக்கரைடு அமைப்பு. (B) ஒலிகோசாக்கரைடுகளில் உள்ள பல்வேறு TMS-வழித்தோன்றல் சர்க்கரைகளின் கட்டமைப்புகள். ACN – நடுநிலை ஒலிகோசாக்கரைடுகளைக் கொண்ட அசிட்டோநைட்ரைல் பின்னம் மற்றும் FA – அமில ஒலிகோசாக்கரைடுகளைக் கொண்ட ஃபெருலிக் அமிலப் பின்னம்.
ஒலிகோசாக்கரைடுப் பகுதியின் LC-MS பகுப்பாய்விலிருந்து மற்றொரு சுவாரசியமான முடிவு எடுக்கப்பட்டது, இது படம் S9-இல் காட்டப்பட்டுள்ளது (முறைகளை மின்னணு துணைப் பொருளில் காணலாம்). ACN-B பகுதியின் பிணைப்பின் போது ஹெக்ஸோஸ் மற்றும் -OAc குழுக்களின் துண்டுகள் மீண்டும் மீண்டும் காணப்பட்டன. இந்தக் கண்டுபிடிப்பு, கிளைகோம் மற்றும் MALDI-TOF பகுப்பாய்வில் காணப்பட்ட துண்டாதலை உறுதிப்படுத்துவது மட்டுமல்லாமல், முன் பதப்படுத்தப்பட்ட லிக்னோசெல்லுலோசிக் உயிரித்திரளில் உள்ள சாத்தியமான கார்போஹைட்ரேட் வழிப்பொருட்கள் பற்றிய புதிய தகவல்களையும் வழங்குகிறது.
நாங்கள் TMS கிளைக்கான் வழித்தோன்றல் முறையைப் பயன்படுத்தி, ஒலிகோசாக்கரைடு பின்னங்களின் கிளைக்கான் கலவைப் பகுப்பாய்வையும் செய்தோம். GC-MS-ஐப் பயன்படுத்தி, ஒலிகோசாக்கரைடு பின்னத்தில் உள்ள நடுநிலை (வழித்தோன்றல் அல்லாத) மற்றும் அமில சர்க்கரைகளின் (GluA மற்றும் GalA) கலவையை நாங்கள் கண்டறிந்தோம் (படம் 5). குளுக்கூரோனிக் அமிலம் அமிலக் கூறுகள் C மற்றும் D-இல் காணப்படுகிறது, அதே சமயம் கேலக்டூரோனிக் அமிலம் அமிலக் கூறுகள் A மற்றும் B-இல் காணப்படுகிறது; இவை இரண்டும் அமில சர்க்கரைகளின் உயர் DP கூறுகளாகும். இந்த முடிவுகள் எங்களின் ELISA மற்றும் MALDI தரவுகளை உறுதிப்படுத்துவது மட்டுமல்லாமல், ஒலிகோசாக்கரைடு திரட்சி குறித்த எங்களின் முந்தைய ஆய்வுகளுடனும் ஒத்துப்போகின்றன. எனவே, ஒலிகோசாக்கரைடுகளின் பயோட்டினேற்றம் மற்றும் அதைத் தொடர்ந்த ELISA பரிசோதனையைப் பயன்படுத்தும் நவீன நோயெதிர்ப்பு முறைகள், பல்வேறு உயிரியல் மாதிரிகளில் கரையக்கூடிய பிடிவாதமான ஒலிகோசாக்கரைடுகளைக் கண்டறியப் போதுமானவை என்று நாங்கள் நம்புகிறோம்.
ELISA-அடிப்படையிலான mAb திரையிடல் முறைகள் பல்வேறு முறைகளால் சரிபார்க்கப்பட்டுள்ளதால், இந்த புதிய அளவுசார் முறையின் திறனை நாங்கள் மேலும் ஆராய விரும்பினோம். சைலோஹெக்ஸாசாக்கரைடு ஒலிகோசாக்கரைடு (XHE) மற்றும் 23-α-L-அரபினோஃபியூரானோசில்-சைலோட்ரையோஸ் (A2XX) ஆகிய இரண்டு வணிக ஒலிகோசாக்கரைடுகள் வாங்கப்பட்டு, செல் சுவர் கிளைக்கானை இலக்காகக் கொண்ட ஒரு புதிய mAb அணுகுமுறையைப் பயன்படுத்தி சோதிக்கப்பட்டன. படம் 6, பயோட்டினிலேட்டட் பிணைப்பு சமிக்ஞைக்கும் ஒலிகோசாக்கரைடு செறிவின் மடக்கை செறிவுக்கும் இடையே ஒரு நேரியல் தொடர்பைக் காட்டுகிறது, இது ஒரு சாத்தியமான லாங்முயர் உறிஞ்சுதல் மாதிரியைக் குறிக்கிறது. mAbs-களில், CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148, மற்றும் CCRC-M151 ஆகியவை XHE உடன் தொடர்பு கொண்டிருந்தன, மற்றும் CCRC-M108, CCRC-M109, மற்றும் LM11 ஆகியவை A2XX உடன் 1 நானோமீட்டர் முதல் 100 நானோமீட்டர் வரையிலான வரம்பில் தொடர்பு கொண்டிருந்தன. சோதனையின் போது ஆன்டிபாடிகளின் வரையறுக்கப்பட்ட கிடைப்புத்தன்மையின் காரணமாக, ஒவ்வொரு ஒலிகோசாக்கரைடு செறிவிலும் வரையறுக்கப்பட்ட சோதனைகளே மேற்கொள்ளப்பட்டன. ஒரே ஒலிகோசாக்கரைடை அடி மூலக்கூறாகக் கொண்டு சில ஆன்டிபாடிகள் மிகவும் வித்தியாசமாக வினைபுரிகின்றன என்பதை இங்கு கவனிக்க வேண்டும்; ஒருவேளை, அவை சற்றே மாறுபட்ட எபிடோப்புகளுடன் பிணைவதாலும், மிகவும் மாறுபட்ட பிணைப்பு நாட்டங்களைக் கொண்டிருக்கக்கூடும் என்பதாலும் இது நிகழலாம். புதிய மோனோகுளோனல் ஆன்டிபாடி (mAb) அணுகுமுறை உண்மையான மாதிரிகளில் பயன்படுத்தப்படும்போது, ​​துல்லியமான எபிடோப் அடையாளங்காணலின் வழிமுறைகளும் தாக்கங்களும் மிகவும் சிக்கலானதாக இருக்கும்.
பல்வேறு கிளைக்கான்-இலக்கு மோனோகுளோனல் ஆன்டிபாடிகளின் (mAbs) கண்டறியும் வரம்பைத் தீர்மானிக்க இரண்டு வணிக ஒலிகோசாக்கரைடுகள் பயன்படுத்தப்பட்டன. இங்கே, ஒலிகோசாக்கரைடு செறிவின் மடக்கை செறிவுடனான நேரியல் தொடர்புகள், (A) mAb உடனான XHE மற்றும் (B) mAb உடனான A2XX ஆகியவற்றிற்கான லாங்முயர் உறிஞ்சுதல் வடிவங்களைக் குறிக்கின்றன. தொடர்புடைய எபிடோப்கள், இந்தச் சோதனையில் அடி மூலக்கூறுகளாகப் பயன்படுத்தப்பட்ட வணிக ஒலிகோசாக்கரைடுகளின் கட்டமைப்புகளைக் குறிப்பிடுகின்றன.
கிளைக்கான்-இலக்கு கொண்ட மோனோகுளோனல் ஆன்டிபாடிகளின் (கிளைக்கோகோமிக் பகுப்பாய்வு அல்லது ELISA-அடிப்படையிலான mAb திரையிடல்) பயன்பாடு, தாவர உயிர்மத்தை உருவாக்கும் பெரும்பாலான முக்கிய செல்சுவர் கிளைக்கான்களை ஆழமாக வகைப்படுத்துவதற்கான ஒரு சக்திவாய்ந்த கருவியாகும். இருப்பினும், பாரம்பரிய கிளைக்கான் பகுப்பாய்வு பெரிய செல்சுவர் கிளைக்கான்களை மட்டுமே வகைப்படுத்துகிறது, ஏனெனில் பெரும்பாலான ஒலிகோசாக்கரைடுகள் ELISA தட்டுகளில் திறமையாக நிலைநிறுத்தப்படுவதில்லை. இந்த ஆய்வில், AFEX-ஆல் முன்சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட மக்காச்சோளத் தண்டு, அதிக திடப்பொருட்கள் உள்ளடக்கத்தில் நொதியியல் ரீதியாக நீராற்பகுக்கப்பட்டது. நீராற்பகுக்கப்பட்ட கரைசலில் உள்ள பிடிவாதமான செல்சுவர் கார்போஹைட்ரேட்டுகளின் அமைப்பைத் தீர்மானிக்க சர்க்கரைப் பகுப்பாய்வு பயன்படுத்தப்பட்டது. இருப்பினும், நீராற்பகுக்கப்பட்ட கரைசல்களில் உள்ள சிறிய ஒலிகோசாக்கரைடுகளின் mAb பகுப்பாய்வு குறைவாக மதிப்பிடப்படுகிறது, மேலும் ஒலிகோசாக்கரைடுகளை ELISA தட்டுகளில் திறம்பட நிலைநிறுத்த கூடுதல் கருவிகள் தேவைப்படுகின்றன.
நியூட்ராவிடின்™ பூசப்பட்ட தட்டுகளில் ஒலிகோசாக்கரைடு பயோட்டினிலேஷனைத் தொடர்ந்து ELISA ஸ்கிரீனிங் செய்வதன் மூலம், மோனோகுளோனல் ஆன்டிபாடி (mAb) ஸ்கிரீனிங்கிற்கான ஒரு புதுமையான மற்றும் திறமையான ஒலிகோசாக்கரைடு நிலைப்படுத்தல் முறையை நாங்கள் இங்கு விவரிக்கிறோம். இவ்வாறு நிலைப்படுத்தப்பட்ட பயோட்டினிலேட்டட் ஒலிகோசாக்கரைடுகள், பிடிவாதமான ஒலிகோசாக்கரைடுகளை விரைவாகவும் திறமையாகவும் கண்டறிய உதவும் வகையில், ஆன்டிபாடியுடன் போதுமான ஈர்ப்பைக் காட்டின. நிறை நிறமாலையியல் (mass spectrometry) அடிப்படையில் இந்த பிடிவாதமான ஒலிகோசாக்கரைடுகளின் கலவை குறித்த பகுப்பாய்வு, இம்யூனோஸ்கிரீனிங்கிற்கான இந்த புதிய அணுகுமுறையின் முடிவுகளை உறுதிப்படுத்தியது. இவ்வாறு, கிளைக்கானை இலக்காகக் கொண்ட மோனோகுளோனல் ஆன்டிபாடிகளைக் கொண்டு ஒலிகோசாக்கரைடு பயோட்டினிலேஷன் மற்றும் ELISA ஸ்கிரீனிங் ஆகியவற்றை இணைப்பது, ஒலிகோசாக்கரைடுகளில் உள்ள குறுக்கு இணைப்புகளைக் கண்டறியப் பயன்படும் என்பதையும், ஒலிகோசாக்கரைடுகளின் கட்டமைப்பை விவரிக்கும் பிற உயிர்வேதியியல் ஆய்வுகளில் இது பரவலாகப் பயன்படுத்தப்படலாம் என்பதையும் இந்த ஆய்வுகள் நிரூபிக்கின்றன.
இந்த பயோட்டின் அடிப்படையிலான கிளைக்கான் விவரக்குறிப்பு முறையானது, தாவர உயிரிப்பொருளில் உள்ள கரையக்கூடிய ஒலிகோசாக்கரைடுகளின் பிடிவாதமான கார்போஹைட்ரேட் பிணைப்புகளை ஆராயும் திறன் கொண்ட முதல் அறிக்கையாகும். உயிரி எரிபொருள் உற்பத்தியைப் பொறுத்தவரை, உயிரிப்பொருளின் சில பகுதிகள் ஏன் மிகவும் பிடிவாதமாக இருக்கின்றன என்பதைப் புரிந்துகொள்ள இது உதவுகிறது. இந்த முறையானது கிளைக்கோம் பகுப்பாய்வு முறைகளில் உள்ள ஒரு முக்கிய இடைவெளியை நிரப்புகிறது மற்றும் அதன் பயன்பாட்டை தாவர ஒலிகோசாக்கரைடுகளுக்கு அப்பாற்பட்ட பரந்த அளவிலான மூலப்பொருள்களுக்கு விரிவுபடுத்துகிறது. எதிர்காலத்தில், பயோட்டினேற்றத்திற்கு ரோபோட்டிக்ஸைப் பயன்படுத்தலாம் மற்றும் ELISA-வைப் பயன்படுத்தி மாதிரிகளின் அதிவேகப் பகுப்பாய்விற்காக நாங்கள் உருவாக்கிய இந்த முறையைப் பயன்படுத்தலாம்.
பயோனியர் 33A14 கலப்பின விதைகளிலிருந்து விளைந்த மக்காச்சோள வைக்கோல் (CS), 2010-ஆம் ஆண்டில் கொலராடோவின் ரே நகரில் உள்ள கிராமர் பண்ணைகளிலிருந்து அறுவடை செய்யப்பட்டது. நில உரிமையாளரின் அனுமதியுடன், இந்த உயிரிப்பொருளை ஆராய்ச்சிக்காகப் பயன்படுத்தலாம். மாதிரிகள் அறை வெப்பநிலையில், 6%க்கும் குறைவான ஈரப்பதத்துடன் உலர்ந்த நிலையில் ஜிப்-லாக் பைகளில் சேமிக்கப்பட்டன. மாதிரிகள் அறை வெப்பநிலையில், 6%க்கும் குறைவான ஈரப்பதத்துடன் உலர்ந்த நிலையில் ஜிப்-லாக் பைகளில் சேமிக்கப்பட்டன. Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежkoy-молнией при комнатной темпер. மாதிரிகள் அறை வெப்பநிலையில், 6%க்கும் குறைவான ஈரப்பதத்தில், ஜிப் பொருத்தப்பட்ட பைகளில் உலர்ந்த நிலையில் சேமிக்கப்பட்டன.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежkoy-Molniey pri comnatnoy temperaturre s влажностью < 6%. மாதிரிகள், 6%க்கும் குறைவான ஈரப்பதம் உள்ள அறை வெப்பநிலையில் ஜிப்பர் பைகளில் சேமிக்கப்படுகின்றன.இந்த ஆய்வு உள்ளூர் மற்றும் தேசிய வழிகாட்டுதல்களுக்கு இணங்க நடத்தப்பட்டது. NREL நெறிமுறையைப் பயன்படுத்தி உட்கூறு பகுப்பாய்வு மேற்கொள்ளப்பட்டது. அதன் உட்கூறுகளில் 31.4% குளுக்கான், 18.7% சைலான், 3.3% அரபினான், 1.2% கேலக்டான், 2.2% அசிடைல், 14.3% லிக்னின், 1.7% புரதம் மற்றும் 13.4% சாம்பல் ஆகியவை அடங்கியிருப்பது கண்டறியப்பட்டது.
செல்லிக்® CTec2 (138 மி.கி புரதம்/மி.லி, லாட் VCNI 0001) என்பது செல்லுலேஸ், β-குளுக்கோசிடேஸ் மற்றும் நோவோசைம்ஸ் (ஃபிராங்க்ளின்டன், NC, USA) நிறுவனத்தின் செல்லிக்® HTec2 (157 மி.கி புரதம்/மி.லி, லாட் VHN00001) ஆகியவற்றின் ஒரு சிக்கலான கலவையாகும். பெக்டினைச் சிதைக்கும் நொதிகளின் சிக்கலான கலவையான மல்டிஃபெக்ட் பெக்டினேஸ்® (72 மி.கி புரதம்/மி.லி), டூபாண்ட் இண்டஸ்ட்ரியல் பயோசயின்சஸ் (பாலோ ஆல்டோ, CA, USA) நிறுவனத்தால் நன்கொடையாக வழங்கப்பட்டது. நொதிப் புரதச் செறிவுகள், கெல்டால் நைட்ரஜன் பகுப்பாய்வைப் (AOAC முறை 2001.11, டெய்ரி ஒன் கோஆபரேட்டிவ் இன்க்., இத்தாக்கா, NY, USA) பயன்படுத்தி, புரத உள்ளடக்கத்தை மதிப்பிடுவதன் மூலமும் (மற்றும் புரதமல்லாத நைட்ரஜனின் பங்களிப்பைக் கழிப்பதன் மூலமும்) தீர்மானிக்கப்பட்டன. டயட்டோமேசியஸ் எர்த் 545, EMD மில்லிபோர் (பில்லெரிகா, MA) நிறுவனத்திடமிருந்து வாங்கப்பட்டது. செயல்படுத்தப்பட்ட கரி (டார்கோ, 100 மெஷ் துகள்கள்), அவிகெல் (பிஎச்-101), பீச் சைலான் மற்றும் பிற அனைத்து வேதிப்பொருட்களும் சிக்மா-ஆல்ட்ரிச் (செயின்ட் லூயிஸ், மிசூரி) நிறுவனத்திடமிருந்து வாங்கப்பட்டன.
AFEX முன்சிகிச்சையானது GLBRC (பயோமாஸ் மாற்ற ஆராய்ச்சி ஆய்வகம், MSU, லான்சிங், MI, USA) இல் மேற்கொள்ளப்பட்டது. முன்சிகிச்சையானது 140° C வெப்பநிலையில் 15 நிமிடங்களுக்கு மேற்கொள்ளப்பட்டது. துருப்பிடிக்காத எஃகு மேசைத்தளத் தொகுதி உலைக்கலனில் (பார் இன்ஸ்ட்ரூமென்ட்ஸ் நிறுவனம்) 60% (w/w) சுமையில், நீரற்ற அம்மோனியா மற்றும் பயோமாஸ் ஆகியவற்றின் 1:1 விகிதத்தில் 46 தங்கு நேரம் இருந்தது. இதற்கு 30 நிமிடங்கள் ஆனது. உலைக்கலன் 140°C வெப்பநிலைக்குக் கொண்டுவரப்பட்டு, அம்மோனியா விரைவாக வெளியிடப்பட்டது, இது பயோமாஸ் விரைவாக அறை வெப்பநிலைக்குத் திரும்ப அனுமதித்தது. AFEX முன்சிகிச்சை செய்யப்பட்ட மக்காச்சோளத் தழையின் (ACS) கலவை, முன்சிகிச்சை செய்யப்படாத மக்காச்சோளத் தழையின் (UT-CS) கலவையை ஒத்திருந்தது.
ஒலிகோசாக்கரைடுகளைப் பெருமளவில் உற்பத்தி செய்வதற்கான ஒரு தொடக்கப் பொருளாக, அதிக திடப்பொருட்கள் கொண்ட ACSH 25% (எடைக்கு எடை) (சுமார் 8% டெக்ஸ்ட்ரான் உள்ளடக்கம்) தயாரிக்கப்பட்டது. முன் பதப்படுத்தப்பட்ட உயிரிப்பொருளில் உள்ள Cellic® Ctec2 10 மி.கி புரதம்/கி குளுக்கான், Novozymes (ஃபிராங்க்ளின்டன், NC) நிறுவனத்தின் Htec2 5 மி.கி புரதம்/கி குளுக்கான், மற்றும் Genencor Inc, USA நிறுவனத்தின் Multifect Pectinase 5 மி.கி புரதம்/கி டெக்ஸ்ட்ரான் ஆகியவற்றை உள்ளடக்கிய ஒரு வணிக நொதிக் கலவையைப் பயன்படுத்தி ACS-இன் நொதிவழி நீராற்பகுப்பு செய்யப்பட்டது. இந்த நொதிவழி நீராற்பகுப்பு, 3 லிட்டர் செயல்படும் கொள்ளளவு, pH 4.8, 50°C மற்றும் 250 rpm கொண்ட ஒரு 5-லிட்டர் உயிரிவினைக்கலனில் மேற்கொள்ளப்பட்டது. 96 மணிநேர நீராற்பகுப்பிற்குப் பிறகு, நீராற்பகுக்கப்படாத திடப்பொருட்களை அகற்றுவதற்காக, நீராற்பகுக்கப்பட்ட திரவமானது 30 நிமிடங்களுக்கு 6000 rpm வேகத்திலும், பின்னர் 30 நிமிடங்களுக்கு 14000 rpm வேகத்திலும் மையவிலக்கு முறையில் சேகரிக்கப்பட்டது. பின்னர், அந்த நீராற்பகுக்கப்பட்ட கலவையானது 0.22 மிமீ வடிகட்டி குவளை வழியாக கிருமியழிக்கப்பட்ட வடிகட்டலுக்கு உட்படுத்தப்பட்டது. வடிகட்டப்பட்ட நீராற்பகுக்கப்பட்ட கலவையானது கிருமியழிக்கப்பட்ட புட்டிகளில் 4° C வெப்பநிலையில் சேமிக்கப்பட்டு, பின்னர் கார்பனில் பின்னப் பிரிப்பு செய்யப்பட்டது.
NREL ஆய்வகப் பகுப்பாய்வு நடைமுறைகளின்படி சாறு அடிப்படையிலான உயிரித்திரள் மாதிரிகளின் கலவைப் பகுப்பாய்வு: கலவைப் பகுப்பாய்விற்கான மாதிரிகளைத் தயாரித்தல் (NREL/TP-510-42620) மற்றும் உயிரித்திரளில் உள்ள கட்டமைப்பு கார்போஹைட்ரேட்டுகள் மற்றும் லிக்னின் ஆகியவற்றைக் கண்டறிதல் (NREL/TP-510 – 42618)47.
ஆட்டோகிளேவ் அடிப்படையிலான அமில நீராற்பகுப்பு முறையைப் பயன்படுத்தி, 2 மில்லி அளவில் நீராற்பகுக்கப்பட்ட கலவையின் ஒலிகோசாக்கரைடு பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது. நீராற்பகுக்கப்பட்ட மாதிரியை 10 மில்லி திருகு மூடி கொண்ட வளர்ப்புக் குழாயில் 69.7 மைக்ரோலிட்டர் 72% கந்தக அமிலத்துடன் கலந்து, 121 °C வெப்பநிலையில் மேசையின் மீது 1 மணி நேரம் அடைகாக்கவும். பின்னர், பனிக்கட்டியில் குளிர்வித்து, உயர் செயல்திறன் திரவ நிறப்பிரிகை (HPLC) குப்பியில் வடிகட்டவும். அமில நீராற்பகுக்கப்பட்ட மாதிரியில் உள்ள மொத்த சர்க்கரைச் செறிவிலிருந்து, நீராற்பகுக்கப்படாத மாதிரியில் உள்ள மோனோசாக்கரைடுகளின் செறிவைக் கழிப்பதன் மூலம் ஒலிகோசாக்கரைடுகளின் செறிவு கண்டறியப்பட்டது.
அமிலத்தால் நீராற்பகுக்கப்பட்ட உயிரிப்பொருளிலுள்ள குளுக்கோஸ், சைலோஸ் மற்றும் அரபினோஸ் செறிவுகள், பயோ-ராட் அமினெக்ஸ் HPX-87H நிரலில், தானியங்கி மாதிரி எடுப்பான், நிரல் வெப்பமூட்டி, ஐசோக்ராடிக் பம்ப் மற்றும் ஒளிவிலகல் குறியீட்டு உணரி ஆகியவற்றைக் கொண்ட ஷிமாட்சு HPLC அமைப்பைப் பயன்படுத்திப் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன. அந்த நிரல் 50°C வெப்பநிலையில் பராமரிக்கப்பட்டு, 0.6 மி.லி/நிமிடம் என்ற அளவில் 5 mM H2SO4 நீரில் கலந்து வெளியேற்றப்பட்டது.
நீராற்பகுக்கப்பட்ட மேல்தேக்கம் நீர்த்தப்பட்டு, மோனோமர் மற்றும் ஒலிகோசாக்கரைடு உள்ளடக்கத்திற்காகப் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது. நொதி நீராற்பகுப்பிற்குப் பிறகு பெறப்பட்ட மோனோமெரிக் சர்க்கரைகள், பயோ-ராட் (ஹெர்குலஸ், CA) அமினெக்ஸ் HPX-87P நிரல் மற்றும் ஒரு சாம்பல் காப்பு நிரல் பொருத்தப்பட்ட HPLC மூலம் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன. நிரலின் வெப்பநிலை 80°C இல் பராமரிக்கப்பட்டது, மேலும் 0.6 மிலி/நிமிடம் பாய்வு விகிதத்தில் நீர் நகரும் கட்டமாகப் பயன்படுத்தப்பட்டது. ஒலிகோசாக்கரைடுகள், மேற்கோள்கள் 41, 48, 49 இல் விவரிக்கப்பட்டுள்ள முறைகளின்படி, 121°C வெப்பநிலையில் நீர்த்த அமிலத்தில் நீராற்பகுப்பு செய்வதன் மூலம் கண்டறியப்பட்டன.
முன்னர் விவரிக்கப்பட்ட செயல்முறைகள் 27, 43, 50, 51-ஐப் பயன்படுத்தி, பதப்படுத்தப்படாத, AFEX-ஆல் முன்-பதப்படுத்தப்பட்ட மற்றும் நீராற்பகுக்கப்படாத அனைத்து உயிரித்திரள் எச்சங்களிலும் (தொடர் செல்சுவர் சாறுகளின் உற்பத்தி மற்றும் அவற்றின் mAb திரையிடல் உட்பட) சர்க்கரைக்கூறு பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது. கிளைக்கோம் பகுப்பாய்விற்காக, தாவர செல்சுவர் பொருளின் ஆல்கஹாலில் கரையாத எச்சங்கள் உயிரித்திரள் எச்சங்களிலிருந்து தயாரிக்கப்பட்டு, முன்னர் விவரிக்கப்பட்டபடி 52, 53, அம்மோனியம் ஆக்சலேட் (50 mM), சோடியம் கார்பனேட் (50 mM மற்றும் 0.5% w/v), CON. (1M மற்றும் 4M, இரண்டும் 1% w/v சோடியம் போரோஹைட்ரைடுடன்) மற்றும் அமில குளோரைட் போன்ற படிப்படியாக வீரியம் கூடும் வினைப்பொருட்களைக் கொண்டு தொடர் பிரித்தெடுத்தலுக்கு உட்படுத்தப்பட்டன. பின்னர் அந்த சாறுகள், செல்சுவர் கிளைக்கானை இலக்காகக் கொண்ட mAb50-களின் ஒரு சிக்கலான குழுவிற்கு எதிராக ELISA சோதனைக்கு உட்படுத்தப்பட்டன, மேலும் mAb பிணைப்பு வினைகள் ஒரு வெப்ப வரைபடமாக வழங்கப்பட்டன. தாவர செல்சுவர் கிளைக்கானை இலக்காகக் கொண்ட mAb-கள் ஆய்வக இருப்புகளிலிருந்து (CCRC, JIM மற்றும் MAC தொடர்கள்) வாங்கப்பட்டன.
ஒலிகோசாக்கரைடுகளின் ஒரு-படி பயோட்டினிலேற்றம். கார்போஹைட்ரேட்டுகளை பயோட்டின்-எல்சி-ஹைட்ரசைடுடன் இணைக்கும் செயல்முறை பின்வரும் வழிமுறையைப் பயன்படுத்தி மேற்கொள்ளப்பட்டது. பயோட்டின்-எல்சி-ஹைட்ரசைடு (4.6 மி.கி/12 μmol) டைமெத்தில் சல்ஃபாக்சைடில் (DMSO, 70 μl) தீவிரமாகக் கலக்கி, 65° C வெப்பநிலையில் 1 நிமிடம் சூடுபடுத்தி கரைக்கப்பட்டது. பின்னர், பனிப்பாறை அசிட்டிக் அமிலம் (30 µl) சேர்க்கப்பட்டு, அந்தக் கலவை சோடியம் சயனோபோரோஹைட்ரைடு (6.4 மி.கி/100 µmol) மீது ஊற்றப்பட்டு, 65° C வெப்பநிலையில் சுமார் 1 நிமிடம் சூடுபடுத்திய பிறகு முழுமையாகக் கரைக்கப்பட்டது. பிறகு, வினைக்கலவையிலிருந்து 5 முதல் 8 μl வரை, உலர்ந்த ஒலிகோசாக்கரைடுடன் (1-100 nmol) சேர்க்கப்பட்டு, ஒடுக்கும் முனையை விட 10 மடங்கு அல்லது அதற்கும் அதிகமான மோலார் அளவில் லேபிள் பெறப்பட்டது. இந்த வினை 65°C வெப்பநிலையில் 2 மணி நேரம் மேற்கொள்ளப்பட்டது, அதன் பிறகு மாதிரிகள் உடனடியாகத் தூய்மைப்படுத்தப்பட்டன. ஒடுக்கம் இல்லாத குறியிடும் சோதனைகளில் சோடியம் சயனோபோரோஹைட்ரைடு பயன்படுத்தப்படவில்லை, மேலும் மாதிரிகள் 65° C வெப்பநிலையில் 2.5 மணி நேரம் வினைபுரிய வைக்கப்பட்டன.
பயோட்டினிலேட்டட் ஒலிகோசாக்கரைடுகளின் மாதிரிகளை ELISA முறையில் பூசுதல் மற்றும் கழுவுதல். அவிடின் பூசப்பட்ட தட்டின் ஒவ்வொரு கிணற்றிலும் 25 μl பயோட்டினிலேட்டட் மாதிரிகள் (ஒவ்வொரு செறிவூட்டப்பட்ட மாதிரியிலிருந்தும் 100 μl, 5 ml 0.1 M டிரிஸ் பஃபர் கரைசலில் (TBS) நீர்க்கப்பட்டது) சேர்க்கப்பட்டன. கட்டுப்பாட்டுக் கிணறுகள் 0.1 M TBS-இல் 10 μg/ml செறிவில் 50 μl பயோட்டினால் பூசப்பட்டன. வெற்று அளவீடுகளுக்கு, அயனியகற்றப்பட்ட நீர் பூச்சாகப் பயன்படுத்தப்பட்டது. மாத்திரை அறை வெப்பநிலையில் இருட்டில் 2 மணி நேரம் அடைகாக்கப்பட்டது. கிரெனியர் பிளாட் 3A-க்கான நிரல் எண் 11-ஐப் பயன்படுத்தி, 0.1 M TBS-இல் உள்ள 0.1% கொழுப்பு நீக்கப்பட்ட பாலுடன் தட்டை 3 முறை கழுவவும்.
முதன்மை ஆன்டிபாடிகளைச் சேர்த்தல் மற்றும் கழுவுதல். ஒவ்வொரு கிணற்றிலும் 40 µl முதன்மை ஆன்டிபாடியைச் சேர்க்கவும். மைக்ரோபிளேட்டை அறை வெப்பநிலையில் இருட்டில் 1 மணி நேரம் அடைகாக்கவும். பின்னர், கிரெனியர் பிளாட் 3A-க்கான கழுவும் நிரல் #11-ஐப் பயன்படுத்தி, 0.1M TBS-இல் உள்ள 0.1% பால் கொண்டு தட்டுகள் 3 முறை கழுவப்பட்டன.
இரண்டாம் நிலை ஆன்டிபாடியைச் சேர்த்து கழுவவும். ஒவ்வொரு கிணற்றிலும் 50 µl எலி/பெருச்சாளி இரண்டாம் நிலை ஆன்டிபாடியைச் (0.1 M TBS-இல் உள்ள 0.1% பாலில் 1:5000 என்ற விகிதத்தில் நீர்க்கப்பட்டது) சேர்க்கவும். மைக்ரோபிளேட்டை அறை வெப்பநிலையில் இருட்டில் 1 மணி நேரம் அடைகாக்கவும். பின்னர், கிரெனியர் பிளாட் 5A பிளேட் வாஷ் புரோகிராம் #12-ஐப் பயன்படுத்தி, மைக்ரோபிளேட்டுகள் 0.1 M TBS-இல் உள்ள 0.1% பாலில் 5 முறை கழுவப்பட்டன.
அடி மூலக்கூறைச் சேர்த்தல். அடிப்படை அடி மூலக்கூறுடன் 50 µl 3,3′,5,5′-டெட்ராமெத்தில்பென்சிடின் (TMB) சேர்க்கவும் (15 மிலி அயனியகற்றப்பட்ட நீரில் 2 சொட்டு பஃபர், 3 சொட்டு TMB, 2 சொட்டு ஹைட்ரஜன் பெராக்சைடு ஆகியவற்றைச் சேர்ப்பதன் மூலம்). TMB அடி மூலக்கூறைத் தயார் செய்யவும். பயன்படுத்துவதற்கு முன் சுழற்றி கலக்கவும். மைக்ரோபிளேட்டை அறை வெப்பநிலையில் 30 நிமிடங்களுக்கு இருட்டில் அடைகாக்கவும்.
படிநிலையை நிறைவுசெய்து மாத்திரையைப் படிக்கவும். ஒவ்வொரு குழியிலும் 50 µl 1 N சல்ஃபியூரிக் அமிலத்தைச் சேர்த்து, ELISA ரீடரைப் பயன்படுத்தி 450 முதல் 655 nm வரையிலான உறிஞ்சுதிறனைப் பதிவு செய்யவும்.
இந்த பகுப்பாய்வுப் பொருட்களின் 1 mg/ml கரைசல்களை அயனியகற்றப்பட்ட நீரில் தயாரிக்கவும்: அரபினோஸ், ராம்னோஸ், ஃபுகோஸ், சைலோஸ், கேலக்டூரோனிக் அமிலம் (GalA), குளுக்கூரோனிக் அமிலம் (GlcA), மேனோஸ், குளுக்கோஸ், கேலக்டோஸ், லாக்டோஸ், N-அசிடைல்மேனோசமைன் (manNAc), N-அசிடைல்குளுக்கோசமைன் (glcNAc), N-அசிடைல்கேலக்டோசமைன் (galNAc), இனோசிட்டால் (உள் தரநிலை). அட்டவணை 1-இல் காட்டப்பட்டுள்ள 1 mg/mL சர்க்கரைக் கரைசல்களைச் சேர்ப்பதன் மூலம் இரண்டு தரநிலைகள் தயாரிக்கப்பட்டன. மாதிரிகள் உறையவைக்கப்பட்டு, அனைத்து நீரும் அகற்றப்படும் வரை (பொதுவாக சுமார் 12-18 மணிநேரம்) -80° C-இல் உறைநிலை உலர்த்தல் செய்யப்படுகின்றன.
பகுப்பாய்வுத் தராசின் மீதுள்ள திருகு மூடி குழாய்களில் 100–500 µg மாதிரியைச் சேர்க்கவும். சேர்க்கப்பட்ட அளவைப் பதிவு செய்யவும். மாதிரியை ஒரு குறிப்பிட்ட செறிவுள்ள கரைப்பானில் கரைத்து, அதை ஒரு திரவப் பகுதியாகக் குழாயில் சேர்ப்பது சிறந்தது. ஒவ்வொரு மாதிரிக் குழாய்க்கும் 20 µl அளவுள்ள 1 mg/ml இனோசிட்டாலை உள் தரநிலையாகப் பயன்படுத்தவும். மாதிரியில் சேர்க்கப்படும் உள் தரநிலையின் அளவு, தரநிலைக் குழாயில் சேர்க்கப்படும் உள் தரநிலையின் அளவுக்குச் சமமாக இருக்க வேண்டும்.
திருகு மூடி கொண்ட ஒரு குப்பியில் 8 மில்லி நீரற்ற மெத்தனாலைச் சேர்க்கவும். பின்னர், 4 மில்லி 3 N மெத்தனால் கலந்த HCl கரைசலைச் சேர்த்து, மூடியை மூடி நன்கு குலுக்கவும். இந்தச் செயல்முறைக்குத் தண்ணீர் பயன்படுத்தப்படுவதில்லை.
ஒலிகோசாக்கரைடு மாதிரிகள் மற்றும் நிலையான TMS குழாய்களில் 500 µl 1 M HCl மெத்தனால் கரைசலைச் சேர்க்கவும். மாதிரிகள் ஒரு வெப்பத் தொகுதியில் 80° C வெப்பநிலையில் இரவு முழுவதும் (168 மணிநேரம்) அடைகாக்கப்பட்டன. உலர்த்தும் பன்மடங்கு கருவியைப் பயன்படுத்தி மெத்தனால் பகுப்பு விளைபொருளை அறை வெப்பநிலையில் உலர்த்தவும். 200 µl MeOH சேர்த்து மீண்டும் உலர்த்தவும். இந்த செயல்முறை இரண்டு முறை மீண்டும் செய்யப்படுகிறது. மாதிரியுடன் 200 µl மெத்தனால், 100 µl பைரிடின் மற்றும் 100 µl அசிட்டிக் அன்ஹைட்ரைடு சேர்த்து நன்கு கலக்கவும். மாதிரிகளை அறை வெப்பநிலையில் 30 நிமிடங்கள் அடைகாத்து உலர்த்தவும். 200 µl மெத்தனால் சேர்த்து மீண்டும் உலர்த்தவும்.
200 µl ட்ரை-சில் சேர்த்து, மூடியுள்ள குழாயை 80°C வெப்பநிலையில் 20 நிமிடங்களுக்குச் சூடாக்கவும், பின்னர் அறை வெப்பநிலைக்குக் குளிர்விக்கவும். உலர்த்தும் கருவியைப் பயன்படுத்தி, மாதிரியைச் சுமார் 50 µl கனஅளவிற்கு மேலும் உலர்த்தவும். மாதிரிகளை நாங்கள் முழுமையாக உலர அனுமதிக்கவில்லை என்பதைக் கவனத்தில் கொள்வது அவசியம்.
2 மிலி ஹெக்ஸேன் சேர்த்து, வோர்டெக்ஸிங் மூலம் நன்றாகக் கலக்கவும். 5-3/4 அங்குல விட்டம் கொண்ட பாஸ்டர் பிப்பெட்டின் (5-8 மிமீ) மேல் ஒரு கண்ணாடிப் பஞ்சுத் துண்டைச் செருகி, அதன் முனைகளை நிரப்பவும். மாதிரிகள் 2 நிமிடங்களுக்கு 3000 g வேகத்தில் மையவிலக்கம் செய்யப்பட்டன. கரையாத எச்சங்கள் ஏதேனும் இருந்தால் வீழ்படிவாகும். மாதிரியை 100-150 µl அளவிற்கு உலர்த்தவும். சுமார் 1 μl அளவு, 80 °C ஆரம்ப வெப்பநிலையிலும் 2.0 நிமிட ஆரம்ப நேரத்திலும் GC-MS கருவியில் உட்செலுத்தப்பட்டது (அட்டவணை 2).