Vă mulțumim că ați vizitat Nature.com. Versiunea browserului pe care o utilizați are suport limitat pentru CSS. Pentru o experiență optimă, vă recomandăm să utilizați un browser actualizat (sau să dezactivați Modul de compatibilitate în Internet Explorer). Între timp, pentru a asigura asistență continuă, vom reda site-ul fără stiluri și JavaScript.
Noi metode imunologice și spectrometrice de masă pentru analiza complexă a oligozaharidelor persistente din pășunile de porumb pretratate cu AFEX. Biomasa lignocelulozică este o alternativă sustenabilă la combustibilii fosili și este utilizată pe scară largă pentru dezvoltarea biotehnologiilor pentru producția de produse precum alimente, hrană pentru animale, combustibili și substanțe chimice. Cheia acestor tehnologii este dezvoltarea unor procese competitive din punct de vedere al costurilor pentru transformarea carbohidraților complecși prezenți în pereții celulari ai plantelor în zaharuri simple, cum ar fi glucoza, xiloza și arabinoza. Deoarece biomasa lignocelulozică este foarte încăpățânată, aceasta trebuie supusă unor tratamente termochimice (de exemplu, exfolierea fibrelor de amoniac (AFEX), acizi diluați (DA), lichide ionice (IL)) și tratamente biologice (de exemplu, hidroliză enzimatică și fermentație microbiană) în combinație pentru a obține produsul dorit. Cu toate acestea, atunci când enzimele fungice comerciale sunt utilizate în procesul de hidroliză, doar 75-85% din zaharurile solubile formate sunt monozaharide, iar restul de 15-25% sunt oligozaharide solubile, intratabile, care nu sunt întotdeauna disponibile microorganismelor. Anterior, am izolat și purificat cu succes oligozaharide persistente solubile folosind o combinație de separare cu carbon și pământ de diatomee și cromatografie de excluziune dimensională și am investigat, de asemenea, proprietățile lor inhibitoare enzimatice. Am descoperit că oligozaharidele care conțin substituții de acid uronic metilat cu grad mai mare de polimerizare (DP) sunt mai dificil de procesat cu amestecuri de enzime comerciale decât oligozaharidele cu DP scăzut și neutre. Aici raportăm utilizarea mai multor metode suplimentare, inclusiv profilarea glicanilor folosind anticorpi monoclonali (mAb) specifici glicanii din biomasa vegetală pentru a caracteriza legăturile glicanice din pereții celulari ai plantelor și hidrolizatele enzimatice, ionizarea prin desorbție laser asistată de matrice, spectrometria de masă în timp de zbor. MALDI-TOF-MS) utilizează vârfuri diagnostice informative privind structura obținute prin spectroscopie după dezintegrarea secundară a ionilor negativi, cromatografie gazoasă și spectrometrie de masă (GC-MS) pentru a caracteriza legăturile oligozaharidelor cu și fără derivatizare. Datorită dimensiunii mici a oligozaharidelor (DP 4-20), aceste molecule sunt dificil de utilizat pentru legarea și caracterizarea anticorpilor monoclonali (mAb). Pentru a depăși această problemă, am aplicat o nouă metodă de imobilizare a oligozaharidelor bazată pe conjugarea biotinei, care a marcat cu succes majoritatea oligozaharidelor solubile cu DP scăzut de pe suprafața microplăcii, metodă care a fost apoi utilizată într-un sistem mAb cu randament ridicat pentru analiza specifică de ligatură. Această nouă metodă va facilita dezvoltarea unor teste de glicom cu randament ridicat mai avansate în viitor, care pot fi utilizate pentru izolarea și caracterizarea oligozaharidelor prezente în biomarkeri în scopuri diagnostice.
Biomasa lignocelulozică, compusă din materiale agricole, forestiere, iarbă și lemnoase, este o materie primă potențială pentru producția de produse biologice, inclusiv alimente, hrană pentru animale, combustibili și precursori chimici pentru a produce produse cu valoare mai mare1. Carbohidrații (cum ar fi celuloza și hemiceluloza) prezenți în pereții celulari ai plantelor sunt depolimerizați în monozaharide prin procesare chimică și biotransformare (cum ar fi hidroliza enzimatică și fermentația microbiană). Pretratările obișnuite includ expansiunea fibrelor de amoniac (AFEX), acidul diluat (DA), lichidul ionic (IL) și explozia cu abur (SE), care utilizează o combinație de substanțe chimice și căldură pentru a reduce producția de lignoceluloză prin deschiderea pereților celulari ai plantelor3,4. încăpățânarea materiei, 5. Hidroliza enzimatică se efectuează la o încărcătură mare de solide folosind enzime comerciale active care conțin carbohidrați (CAZyme) și fermentația microbiană folosind drojdii sau bacterii transgenice pentru a produce combustibili și substanțe chimice biologice6.
CAZ-urile din enzimele comerciale sunt compuse dintr-un amestec complex de enzime care scindează sinergic legăturile complexe carbohidrat-zahăr pentru a forma monozaharide2,7. Așa cum am menționat anterior, rețeaua complexă de polimeri aromatici ai ligninei cu carbohidrații îi face extrem de dificil de gestionat, ceea ce duce la o conversie incompletă a zahărului, acumulând 15-25% din oligozaharidele sexuale care nu sunt produse în timpul hidrolizei enzimatice a biomasei pretratate. Aceasta este o problemă comună în cazul diferitelor metode de pretratare a biomasei. Printre motivele acestui blocaj se numără inhibarea enzimelor în timpul hidrolizei sau absența sau nivelurile scăzute de enzime esențiale necesare pentru a rupe legăturile de zahăr din biomasa vegetală. Înțelegerea compoziției și caracteristicilor structurale ale zaharurilor, cum ar fi legăturile de zahăr din oligozaharide, ne va ajuta să îmbunătățim conversia zahărului în timpul hidrolizei, făcând procesele biotehnologice competitive din punct de vedere al costurilor cu produsele derivate din petrol.
Determinarea structurii carbohidraților este o provocare și necesită o combinație de metode precum cromatografia lichidă (LC)11,12, spectroscopia de rezonanță magnetică nucleară (RMN)13, electroforeza capilară (CE)14,15,16 și spectrometria de masă (MS)17. Optsprezece. Metodele MS, cum ar fi spectrometria de masă în timp de zbor cu desorbție laser și ionizare utilizând o matrice (MALDI-TOF-MS), reprezintă o metodă versatilă pentru identificarea structurilor carbohidraților. Recent, spectrometria de masă în tandem cu disociere indusă de coliziune (CID) a aductilor de ioni de sodiu a fost cea mai utilizată pentru a identifica amprentele corespunzătoare pozițiilor de atașare a oligozaharidelor, configurațiilor anomerice, secvențelor și pozițiilor de ramificare20, 21.
Analiza glicanilor este un instrument excelent pentru identificarea aprofundată a legăturilor carbohidraților22. Această metodă utilizează anticorpi monoclonali (mAb) direcționați către glicanul din peretele celular al plantei ca sonde pentru a înțelege legăturile complexe dintre carbohidrați. Peste 250 de mAb sunt disponibili la nivel mondial, concepuți împotriva diferitelor oligozaharide liniare și ramificate folosind diverse zaharide24. Mai mulți mAb au fost utilizați pe scară largă pentru a caracteriza structura, compoziția și modificările peretelui celular al plantei, deoarece există diferențe semnificative în funcție de tipul de celulă vegetală, organ, vârstă, stadiul de dezvoltare și mediul de creștere25,26. Mai recent, această metodă a fost utilizată pentru a înțelege populațiile de vezicule din sistemele vegetale și animale și rolurile lor respective în transportul glicanilor, determinate de markeri subcelulari, stadii de dezvoltare sau stimuli de mediu, și pentru a determina activitatea enzimatică. Printre diferitele structuri identificate ale glicanilor și xilanilor se numără pectina (P), xilanul (X), mananul (M), xiloglucanii (XylG), glucanii cu legături mixte (MLG), arabinoxilanul (ArbX), galactomananul (GalG), acidul glucuronic-arabinoxilanul (GArbX) și arabino-galactanul (ArbG)29.
Cu toate acestea, în ciuda tuturor acestor eforturi de cercetare, doar câteva studii s-au concentrat asupra naturii acumulării de oligozaharide în timpul hidrolizei cu încărcătură mare de solide (HSL), inclusiv eliberarea de oligozaharide, modificările lungimii lanțului oligomeric în timpul hidrolizei, diverși polimeri cu DP scăzut și curbele acestora. distribuții 30,31,32. Între timp, deși analiza glicanilor s-a dovedit a fi un instrument util pentru o analiză cuprinzătoare a structurii glicanilor, este dificil să se evalueze oligozaharidele solubile în apă cu DP scăzut folosind metode cu anticorpi. Oligozaharidele DP mai mici, cu o greutate moleculară mai mică de 5-10 kDa, nu se leagă de plăcile ELISA 33, 34 și sunt spălate înainte de adăugarea de anticorpi.
Aici, pentru prima dată, demonstrăm un test ELISA pe plăci acoperite cu avidină utilizând anticorpi monoclonali, combinând o procedură de biotinilare într-o singură etapă pentru oligozaharide refractare solubile cu analiza glicomului. Abordarea noastră de analiză a glicomului a fost validată prin analiza bazată pe MALDI-TOF-MS și GC-MS a legăturilor oligozaharidice complementare utilizând derivatizarea cu trimetilsilil (TMS) a compozițiilor de zahăr hidrolizat. Această abordare inovatoare poate fi dezvoltată ca o metodă de randament ridicat în viitor și poate găsi aplicații mai largi în cercetarea biomedicală35.
Modificările post-translaționale ale enzimelor și anticorpilor, cum ar fi glicozilarea36, afectează activitatea lor biologică. De exemplu, modificările glicozilării proteinelor serice joacă un rol important în artrita inflamatorie, iar modificările glicozilării sunt utilizate ca markeri diagnostici37. În literatura de specialitate s-a raportat că diverși glicani apar cu ușurință într-o varietate de boli, inclusiv boli inflamatorii cronice ale tractului gastrointestinal și ficatului, infecții virale, cancere ovariene, de sân și de prostată38,39,40. Înțelegerea structurii glicanilor folosind metode ELISA pentru glicani bazate pe anticorpi va oferi încredere suplimentară în diagnosticarea bolilor fără utilizarea metodelor MS complexe.
Studiul nostru anterior a arătat că oligozaharidele persistente au rămas nehidrolizate după pretratare și hidroliză enzimatică (Figura 1). În lucrarea noastră publicată anterior, am dezvoltat o metodă de extracție în fază solidă cu cărbune activ pentru a izola oligozaharidele din hidrolizatul de porumb pretratat cu AFEX (ACSH)8. După extracția și separarea inițială, oligozaharidele au fost fracționate în continuare prin cromatografie de excluziune dimensională (SEC) și colectate în ordinea greutății moleculare. Monomerii și oligomerii de zahăr eliberați din diverse pretratări au fost analizați prin analiza compoziției zahărului. Atunci când se compară conținutul de oligomeri de zahăr obținuți prin diverse metode de pretratare, prezența oligozaharidelor persistente este o problemă comună în conversia biomasei în monozaharide și poate duce la o reducere a randamentului de zahăr de cel puțin 10-15% și chiar până la 18%. Această metodă este utilizată pentru producția ulterioară la scară largă de fracțiuni de oligozaharide. ACH rezultat și fracțiunile sale ulterioare cu greutăți moleculare diferite au fost utilizate ca material experimental pentru caracterizarea oligozaharidelor în această lucrare.
După pretratare și hidroliză enzimatică, oligozaharidele persistente au rămas nehidrolizate. Aici este prezentată (A) o metodă de separare a oligozaharidelor în care oligozaharidele sunt izolate din hidrolizatul de păduri de porumb (ACSH) pretratat cu AFEX folosind un pat compactat de cărbune activ și pământ de diatomee; (B) Metodă de separare a oligozaharidelor. Oligozaharidele au fost separate în continuare prin cromatografie de excluziune dimensională (SEC); (C) Monomeri și oligomeri de zaharidă eliberați din diverse pretratări (acid diluat: DA, lichid ionic: IL și AFEX). Condiții de hidroliză enzimatică: încărcare mare de solide de 25% (g/g) (aproximativ 8% încărcare de glucan), hidroliză timp de 96 de ore, încărcare de enzimă comercială de 20 mg/g (raport Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) și (D) Monomeri și oligomeri de zahăr de glucoză, xiloză și arabinoză eliberați din păduri de porumb (ACS) pretratate cu AFEX.
Analiza glicanilor s-a dovedit a fi un instrument util pentru o analiză structurală cuprinzătoare a glicanilor în extractele izolate din reziduuri de biomasă solidă. Cu toate acestea, zaharidele solubile în apă sunt subreprezentate folosind această metodă tradițională41, deoarece oligozaharidele cu greutate moleculară mică sunt dificil de imobilizat pe plăci ELISA și sunt spălate înainte de adăugarea anticorpilor. Prin urmare, pentru legarea și caracterizarea anticorpilor, a fost utilizată o metodă de biotinilare într-o singură etapă pentru a acoperi oligozaharidele solubile, neconforme, pe plăci ELISA acoperite cu avidină. Această metodă a fost testată folosind ACSH produs anterior și o fracție bazată pe greutatea sa moleculară (sau gradul de polimerizare, DP). Biotinilarea într-o singură etapă a fost utilizată pentru a crește afinitatea de legare a oligozaharidelor prin adăugarea de biotină-LC-hidrazidă la capătul reducător al carbohidratului (Fig. 2). În soluție, gruparea hemiacetal de la capătul reducător reacționează cu gruparea hidrazidei biotină-LC-hidrazidei pentru a forma o legătură hidrazonică. În prezența agentului reducător NaCNBH3, legătura hidrazonică este redusă la un produs final biotinilat stabil. Odată cu modificarea capătului reducător de zahăr, legarea oligozaharidelor cu DP scăzut la plăcile ELISA a devenit posibilă, iar în studiul nostru aceasta s-a făcut pe plăci acoperite cu avidină folosind anticorpi monoclonali direcționați către glicani.
Screening-ul anticorpilor monoclonali bazat pe ELISA pentru oligozaharide biotinilate. Aici (A) se combină biotinilarea oligozaharidelor și screening-ul ELISA ulterior cu anticorpi monoclonali direcționați către glicani pe plăci acoperite cu NeutrAvidină și (B) se prezintă o procedură într-o singură etapă pentru biotinilarea produselor de reacție.
Plăcile acoperite cu avidină cu anticorpi conjugați cu oligozaharide au fost apoi adăugate la anticorpii primari și secundari și spălate într-un mediu sensibil la lumină și timp. După ce legarea anticorpilor este completă, se adaugă substratul TMB pentru a incuba placa. Reacția a fost în final oprită cu acid sulfuric. Plăcile incubate au fost analizate utilizând un cititor ELISA pentru a determina puterea de legare a fiecărui anticorp și pentru a detecta reticularea specifică anticorpilor. Pentru detalii și parametrii experimentului, consultați secțiunea corespunzătoare „Materiale și metode”.
Demonstrăm utilitatea acestei metode nou dezvoltate pentru aplicații specifice prin caracterizarea oligozaharidelor solubile prezente în ACSH, precum și în fracțiile de oligozaharide brute și purificate izolate din hidrolizate lignocelulozice. După cum se arată în Figura 3, cei mai comuni xilani substituiți cu epitopi identificați în ACSH folosind metode de testare a glicomului bioacilat sunt de obicei arabinogalactanii uronic (U) sau metiluronic (MeU) și pectici. Majoritatea au fost găsiți și în studiul nostru anterior privind analiza glicanilor din solide nehidrolizate (UHS)43.
Detectarea epitopilor oligozaharidici recalcitranți utilizând un anticorp monoclonal direcționat către glicanul peretelui celular. Fracția „neutră” este fracția ACN, iar fracția „acidă” este fracția FA. Roșiile mai strălucitoare de pe harta termică indică un conținut mai mare de epitopi, iar albastrul mai strălucitor indică un fundal gol. Valorile culorilor de pe scală se bazează pe valorile OD brute pentru formulările N=2. Principalii epitopi recunoscuți de anticorpi sunt arătați în dreapta.
Aceste structuri non-celulozice nu au putut fi scindate de cele mai comune celulaze și hemicelulaze din amestecul de enzime comercial testat, care include cele mai frecvent utilizate enzime comerciale. Prin urmare, sunt necesare noi enzime auxiliare pentru hidroliza lor. Fără enzimele accesorii non-celulozice necesare, aceste legături non-celulozice împiedică conversia completă în monozaharide, chiar dacă polimerii lor de zahăr de bază sunt hidrolizați extensiv în fragmente mai scurte și dizolvați folosind amestecuri de enzime comerciale.
Studii suplimentare ale distribuției semnalului și ale puterii sale de legare au arătat că epitopii de legare au fost mai puțini în fracțiile de zahăr cu DP ridicat (A, B, C, DP până la 20+) decât în ​​fracțiile cu DP scăzut (D, E, F, DP) în dimeri (Fig. 1). Fragmentele acide sunt mai frecvente în epitopii non-celulozici decât în ​​fragmentele neutre. Aceste fenomene sunt în concordanță cu modelul observat în studiul nostru anterior, unde DP ridicat și grupările acide au fost mai rezistente la hidroliza enzimatică. Prin urmare, prezența epitopilor de glican non-celulozici și a substituțiilor U și MeU pot contribui semnificativ la stabilitatea oligozaharidelor. Trebuie menționat că eficiența legării și a detecției poate fi problematică pentru oligozaharidele cu DP scăzut, în special dacă epitopul este un oligozaharid dimeric sau trimeric. Acest lucru poate fi testat folosind oligozaharide comerciale de lungimi diferite, fiecare conținând un singur epitop care se leagă de un anumit anticorp monoclonal.
Astfel, utilizarea anticorpilor specifici structurii a relevat anumite tipuri de legături recalcitrante. În funcție de tipul de anticorp utilizat, de modelul de ligaturare adecvat și de intensitatea semnalului produs de acesta (cel mai abundent și cel mai puțin abundent), enzime noi pot fi identificate și adăugate semicantitativ în amestecul de enzime pentru o glicoconversie mai completă. Luând ca exemplu analiza oligozaharidelor ACSH, putem crea o bază de date cu legături glicanice pentru fiecare material biomasă. Trebuie menționat aici că trebuie luată în considerare afinitatea diferită a anticorpilor și, dacă afinitatea lor este necunoscută, acest lucru va crea anumite dificultăți la compararea semnalelor diferiților anticorpi. În plus, compararea legăturilor glicanice poate funcționa cel mai bine între probe pentru același anticorp. Aceste legături persistente pot fi apoi legate de baza de date CAZyme, din care putem identifica enzime, selecta enzime candidate și testa enzime care rupe legăturile sau dezvolta sisteme microbiene pentru a exprima aceste enzime pentru utilizare în biorafinării44.
Pentru a evalua modul în care metodele imunologice completează metodele alternative de caracterizare a oligozaharidelor cu greutate moleculară mică prezente în hidrolizatele lignocelulozice, am efectuat MALDI (Fig. 4, S1-S8) și analiza zaharidelor derivate din TMS pe baza GC-MS pe același panou (Fig. 5) de oligozaharide. MALDI este utilizat pentru a compara dacă distribuția masei moleculelor de oligozaharide corespunde cu structura dorită. În Fig. 4 se prezintă MS pentru componentele neutre ACN-A și ACN-B. Analiza ACN-A a confirmat o gamă de zaharuri pentoză de la DP 4-8 (Fig. 4) până la DP 22 (Fig. S1), ale căror greutăți corespund oligozaharidelor MeU-xilan. Analiza ACN-B a confirmat seria de pentoze și glucoxilan cu DP 8-15. În materiale suplimentare, cum ar fi Figura S3, hărțile de distribuție a masei grupării acide FA-C prezintă o gamă de zaharuri pentoză substituite cu (Me)U cu un DP de 8-15, care sunt în concordanță cu xilanii substituiți găsiți în screening-ul anticorpilor monoclonali (mAb) bazat pe ELISA. Epitopii sunt consecvenți.
Spectrul MALDI-MS al oligozaharidelor solubile neconforme prezente în ACS. Aici, (A) fracții ACN-A cu greutate mică conținând oligozaharide glucuroxilan substituite cu acid uronic metilat (DP 4-8) și (B) oligozaharide ACN-B xilan și acid uronic metilat substituite cu glucuroxilan (DP 8-15).
Analiza compoziției reziduurilor de glican din oligozaharidele refractare. Aici (A) Compoziția zaharidelor TMS a diferitelor fracțiuni de oligozaharide obținute prin analiza GC-MS. (B) Structurile diferitelor zaharuri derivate din TMS prezente în oligozaharide. ACN – fracțiunea de acetonitril care conține oligozaharide neutre și FA – fracțiunea de acid ferulic care conține oligozaharide acide.
O altă concluzie interesantă a fost trasă din analiza LC-MS a fracției de oligozaharide, așa cum se arată în Figura S9 (metodele pot fi văzute în materialul suplimentar electronic). Fragmente de hexoză și grupări -OAc au fost observate în mod repetat în timpul ligării fracției ACN-B. Această constatare nu numai că confirmă fragmentarea observată în analiza glicomului și MALDI-TOF, dar oferă și informații noi despre potențialii derivați de carbohidrați din biomasa lignocelulozică pretratată.
De asemenea, am efectuat o analiză a compoziției glicanilor din fracțiile de oligozaharide utilizând derivatizarea glicanilor prin TMS. Folosind GC-MS, am determinat compoziția zaharurilor neuronale (nederivate) și acide (GluA și GalA) din fracțiunea de oligozaharide (Fig. 5). Acidul glucuronic se găsește în componentele acide C și D, în timp ce acidul galacturonic se găsește în componentele acide A și B, ambele fiind componente cu DP ridicat ale zaharurilor acide. Aceste rezultate nu numai că confirmă datele noastre ELISA și MALDI, dar sunt și în concordanță cu studiile noastre anterioare privind acumularea de oligozaharide. Prin urmare, considerăm că metodele imunologice moderne care utilizează biotinilarea oligozaharidelor și screening-ul ELISA ulterior sunt suficiente pentru a detecta oligozaharidele recalcitrante solubile în diverse probe biologice.
Întrucât metodele de screening ale anticorpilor monoclonali (mAb) bazate pe ELISA au fost validate prin mai multe metode diferite, am dorit să explorăm în continuare potențialul acestei noi metode cantitative. Două oligozaharide comerciale, oligozaharida xilohexazaharidă (XHE) și 23-α-L-arabinofuranozil-xilotrioza (A2XX), au fost achiziționate și testate folosind o nouă abordare mAb care vizează glicanul peretelui celular. Figura 6 prezintă o corelație liniară între semnalul de legare biotinilat și concentrația logaritmică a oligozaharidelor, sugerând un posibil model de adsorbție Langmuir. Printre mAb-uri, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 și CCRC-M151 s-au corelat cu XHE, iar CCRC-M108, CCRC-M109 și LM11 s-au corelat cu A2XX pe un interval de la 1 nm la 100 nano. Datorită disponibilității limitate a anticorpilor în timpul experimentului, au fost efectuate experimente limitate cu fiecare concentrație de oligozaharidă. Trebuie menționat aici că unii anticorpi reacționează foarte diferit la același oligozaharid ca substrat, probabil pentru că se leagă de epitopi ușor diferiți și pot avea afinități de legare foarte diferite. Mecanismele și implicațiile identificării precise a epitopilor vor fi mult mai complexe atunci când noua abordare mAb va fi aplicată probelor reale.
Două oligozaharide comerciale au fost utilizate pentru a determina intervalul de detecție al diferitelor anticorpi monoclonali (mAb) care vizează glicanii. Aici, corelațiile liniare cu concentrația logaritmică a oligozaharidelor indică modele de adsorbție Langmuir pentru (A) XHE cu mAb și (B) A2XX cu mAb. Epitopii corespunzători indică structurile oligozaharidelor comerciale utilizate ca substraturi în test.
Utilizarea anticorpilor monoclonali direcționați către glicani (analiza glicocomică sau screening-ul anticorpilor monoclonali bazat pe ELISA) este un instrument puternic pentru caracterizarea aprofundată a majorității glicanilor principali ai peretelui celular care alcătuiesc biomasa plantelor. Cu toate acestea, analiza clasică a glicanilor caracterizează doar glicanii mai mari ai peretelui celular, deoarece majoritatea oligozaharidelor nu sunt imobilizate eficient pe plăcile ELISA. În acest studiu, pășunile de porumb pretratate cu AFEX au fost hidrolizate enzimatic la un conținut ridicat de solide. Analiza zahărului a fost utilizată pentru a determina compoziția carbohidraților recalcitranți ai peretelui celular din hidrolizat. Cu toate acestea, analiza anticorpilor monoclonali a oligozaharidelor mai mici din hidrolizate este subestimată și sunt necesare instrumente suplimentare pentru a imobiliza eficient oligozaharidele pe plăcile ELISA.
Prezentăm aici o metodă nouă și eficientă de imobilizare a oligozaharidelor pentru screening-ul anticorpilor monoclonali (mAb) prin combinarea biotinilării oligozaharidelor urmată de screening ELISA pe plăci acoperite cu NeutrAvidin™. Oligozaharidele biotinilate imobilizate au prezentat o afinitate suficientă pentru anticorp pentru a permite detectarea rapidă și eficientă a oligozaharidelor recalcitrante. Analiza compoziției acestor oligozaharide persistente pe baza spectrometriei de masă a confirmat rezultatele acestei noi abordări a imunoscreening-ului. Astfel, aceste studii demonstrează că combinarea biotinilării oligozaharidelor și a screening-ului ELISA cu anticorpi monoclonali direcționați către glicani poate fi utilizată pentru a detecta legături încrucișate în oligozaharide și poate fi aplicată pe scară largă în alte studii biochimice care caracterizează structura oligozaharidelor.
Această metodă de profilare a glicanilor pe bază de biotină este primul raport capabil să investigheze legăturile carbohidraților recalcitranți ai oligozaharidelor solubile din biomasa vegetală. Acest lucru ajută la înțelegerea motivului pentru care unele părți ale biomasei sunt atât de încăpățânate când vine vorba de producerea de biocombustibili. Această metodă umple o lacună importantă în metodele de analiză a glicomului și își extinde aplicarea la o gamă mai largă de substraturi dincolo de oligozaharidele vegetale. În viitor, am putea folosi robotica pentru biotinilare și metoda pe care am dezvoltat-o ​​pentru analiza de mare randament a probelor folosind ELISA.
Paiele de porumb (CS) cultivate din semințe hibride Pioneer 33A14 au fost recoltate în 2010 de la fermele Kramer din Ray, Colorado. Cu permisiunea proprietarului terenului, această biomasă poate fi utilizată pentru cercetare. Probele au fost depozitate la temperatura camerei, la temperaturi uscate, cu umiditate < 6%, în pungi cu fermoar. Probele au fost depozitate la temperatura camerei, la temperaturi uscate, cu umiditate < 6%, în pungi cu fermoar. Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комтнат. Probele au fost depozitate în condiții uscate, la o umiditate <6%, în pungi cu fermoar, la temperatura camerei.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < 6%. Probele sunt depozitate în pungi cu fermoar la temperatura camerei cu o umiditate < 6%.Studiul a respectat directivele locale și naționale. Analiza compozițională a fost efectuată utilizând protocolul NREL. S-a constatat că compoziția conține 31,4% glucan, 18,7% xilan, 3,3% arabinan, 1,2% galactan, 2,2% acetil, 14,3% lignină, 1,7% proteine ​​și 13,4% cenușă.
Cellic® CTec2 (138 mg proteină/ml, lot VCNI 0001) este un amestec complex de celulază, β-glucozidază și Cellic® HTec2 (157 mg proteină/ml, lot VHN00001) de la Novozymes (Franklinton, NC, SUA)). Multifect Pectinase® (72 mg proteină/mL), un amestec complex de enzime care degradează pectina, a fost donat de DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, SUA). Concentrațiile de proteine ​​enzimatice au fost determinate prin estimarea conținutului de proteine ​​(și scăderea contribuției azotului non-proteic) utilizând analiza azotului Kjeldahl (metoda AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, SUA). Pământul de diatomee 545 a fost achiziționat de la EMD Millipore (Billerica, MA). Cărbunele activ (DARCO, granule de 100 mesh), Avicel (PH-101), xilanul de fag și toate celelalte substanțe chimice au fost achiziționate de la Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
Pretratarea cu AFEX a fost efectuată la GLBRC (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, SUA). Pretratarea a fost efectuată la 140°C timp de 15 minute. Timp de rezidență de 46 de secunde la un raport de 1:1 de amoniac anhidru la biomasă, la o încărcare de 60% (g/g), într-un reactor discontinuu din oțel inoxidabil (Parr Instruments Company). A durat 30 de minute. Reactorul a fost adus la 140°C, iar amoniacul a fost eliberat rapid, permițând biomasei să revină rapid la temperatura camerei. Compoziția pădurii de porumb pretratate cu AFEX (ACS) a fost similară cu cea a pădurii de porumb netratate (UT-CS).
ACSH cu conținut ridicat de solide 25% (g/g) (aproximativ 8% încărcare cu dextran) a fost preparat ca material de pornire pentru producția la scară largă de oligozaharide. Hidroliza enzimatică a ACS a fost efectuată utilizând un amestec comercial de enzime, inclusiv Cellic® Ctec2 10 mg proteină/g glucan (în biomasă pretratată), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg proteină/g glucan și Multifect Pectinase (Genencor Inc, SUA). ), 5 mg proteină/g dextran. Hidroliza enzimatică a fost efectuată într-un bioreactor de 5 litri cu un volum de lucru de 3 litri, pH 4,8, 50°C și 250 rpm. După hidroliză timp de 96 de ore, hidrolizatul a fost colectat prin centrifugare la 6000 rpm timp de 30 de minute și apoi la 14000 rpm timp de 30 de minute pentru a îndepărta solidele nehidrolizate. Hidrolizatul a fost apoi supus unei filtrări sterile printr-un pahar cu filtru de 0,22 mm. Hidrolizatul filtrat a fost depozitat în sticle sterile la 4°C și apoi fracționat pe cărbune.
Analiza compoziției probelor de biomasă pe bază de extract conform procedurilor de analiză de laborator NREL: pregătirea probelor pentru analiza compoziției (NREL/TP-510-42620) și determinarea carbohidraților structurali și a ligninei din biomasă (NREL/TP-510 – 42618)47.
Analiza oligozaharidelor din fluxul de hidrolizat a fost efectuată la o scară de 2 ml utilizând o metodă de hidroliză acidă bazată pe autoclavă. Se amestecă proba de hidrolizat cu 69,7 µl de acid sulfuric 72% într-un tub de cultură cu capac filetat de 10 ml și se incubează timp de 1 oră pe o bancă la 121 °C, se răcește pe gheață și se filtrează într-o fiolă de cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC). Concentrația de oligozaharide a fost determinată prin scăderea concentrației de monozaharide din proba nehidrolizată din concentrația totală de zahăr din proba hidrolizată cu acid.
Concentrațiile de glucoză, xiloză și arabinoză din biomasa hidrolizată acidă au fost analizate utilizând un sistem HPLC Shimadzu echipat cu un autosampler, un încălzitor de coloană, o pompă izocratică și un detector de indice de refracție pe o coloană Bio-Rad Aminex HPX-87H. Coloana a fost menținută la 50°C și eluată cu 0,6 ml/min H2SO4 5 mM în flux de apă.
Supernatantul hidrolizatului a fost diluat și analizat pentru conținutul de monomeri și oligozaharide. Zaharurile monomerice obținute după hidroliza enzimatică au fost analizate prin HPLC echipat cu o coloană Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P și o coloană de protecție a cenușii. Temperatura coloanei a fost menținută la 80°C, apa fiind utilizată ca fază mobilă cu un debit de 0,6 ml/min. Oligozaharidele au fost determinate prin hidroliză în acid diluat la 121°C conform metodelor descrise în ref. 41, 48, 49.
Analiza zaharidelor a fost efectuată pe reziduuri de biomasă brute, pretratate cu AFEX și pe toate reziduurile de biomasă nehidrolizate (inclusiv producerea de extracte seriale ale peretelui celular și screening-ul acestora pentru anticorpi monoclonali) utilizând procedurile descrise anterior 27, 43, 50, 51. Pentru analiza glicomului, reziduurile insolubile în alcool ale materialului peretelui celular al plantei sunt preparate din reziduuri de biomasă și supuse extracției seriale cu reactivi din ce în ce mai agresivi, cum ar fi oxalatul de amoniu (50 mM), carbonatul de sodiu (50 mM și 0,5% g/v), CON. (1M și 4M, ambele cu 1% g/v borohidrură de sodiu) și clorit acid, așa cum s-a descris anterior 52,53. Extractele au fost apoi supuse testului ELISA împotriva unui panel complex de anticorpi monoclonali (mAb50) direcționați către glicanul peretelui celular, iar reacțiile de legare a mAb au fost prezentate sub forma unei harti termice. mAb-urile care vizează glicanul peretelui celular al plantei au fost achiziționate din stocuri de laborator (seriile CCRC, JIM și MAC).
Biotinilarea oligozaharidelor într-o singură etapă. Conjugarea carbohidraților cu biotină-LC-hidrazidă a fost efectuată utilizând următoarea procedură. Biotina-LC-hidrazida (4,6 mg/12 μmol) a fost dizolvată în dimetilsulfoxid (DMSO, 70 μl) prin agitare energică și încălzire la 65°C timp de 1 minut. S-a adăugat acid acetic glacial (30 µl) și amestecul a fost turnat peste cianoborohidrură de sodiu (6,4 mg/100 µmol) și complet dizolvat după încălzire la 65°C timp de aproximativ 1 minut. Apoi, s-au adăugat 5 până la 8 μl din amestecul de reacție la oligozaharida uscată (1-100 nmol) pentru a obține un exces molar de 10 ori sau mai mult al marcajului față de capătul reducător. Reacția a fost efectuată la 65°C timp de 2 ore, după care probele au fost imediat purificate. În experimentele de marcare fără reducere nu s-a utilizat cianoborohidrură de sodiu, iar probele au reacționat la 65°C timp de 2,5 ore.
Acoperire ELISA și spălare a probelor de oligozaharide biotinilate. 25 μl de probe biotinilate (100 μl din fiecare probă concentrată diluată în 5 ml de soluție tampon Tris 0,1 M (TBS)) au fost adăugați în fiecare godeu al plăcii acoperite cu avidină. Godeurile de control au fost acoperite cu 50 μl de biotină la o concentrație de 10 μg/ml în TBS 0,1 M. Apa deionizată a fost utilizată ca acoperire pentru măsurătorile martor. Tableta a fost incubată timp de 2 ore la temperatura camerei, la întuneric. Spălați placa de 3 ori cu lapte degresat 0,1% în TBS 0,1 M folosind programul nr. 11 pentru placa Grenier flat 3A.
Adăugarea și spălarea anticorpilor primari. Se adaugă 40 µl de anticorp primar în fiecare godeu. Se incubează microplaca timp de 1 oră la temperatura camerei, la întuneric. Plăcile au fost apoi spălate de 3 ori cu lapte 0,1% în soluție TBS 0,1M, utilizând programul de spălare nr. 11 pentru Grenier Flat 3A.
Se adaugă anticorpul secundar și se spală. Se adaugă 50 µl de anticorp secundar de șoarece/șobolan (diluat 1:5000 în lapte 0,1% în soluție de sârmă 0,1 M) în fiecare godeu. Se incubează microplaca timp de 1 oră la temperatura camerei, la întuneric. Microplacile au fost apoi spălate de 5 ori cu lapte 0,1% în soluție de sârmă 0,1 M, utilizând programul de spălare a plăcilor Grenier Flat 5A nr. 12.
Adăugarea unui substrat. Adăugați 50 µl de 3,3′,5,5′-tetrametilbenzidină (TMB) la substratul de bază (prin adăugarea a 2 picături de soluție tampon, 3 picături de TMB, 2 picături de peroxid de hidrogen la 15 ml de apă deionizată). Pregătiți substratul TMB și agitați vortex înainte de utilizare. Incubați microplaca la temperatura camerei timp de 30 de minute, la întuneric.
Finalizați pasul și citiți comprimatul. Adăugați 50 µl de acid sulfuric 1 N în fiecare godeu și înregistrați absorbanța de la 450 la 655 nm folosind un cititor ELISA.
Se prepară soluții de 1 mg/ml din acești analiți în apă deionizată: arabinoză, ramnoză, fucoză, xiloză, acid galacturonic (GalA), acid glucuronic (GlcA), manoză, glucoză, galactoză, lactoză, N-acetilmanozamină (manNAc), N-acetilglucozamină (glcNAc), N-acetilgalactozamină (galNAc), inozitol (standard intern). Două standarde au fost preparate prin adăugarea soluțiilor de zahăr de 1 mg/ml prezentate în Tabelul 1. Probele sunt congelate și liofilizate la -80°C până când toată apa este îndepărtată (de obicei aproximativ 12-18 ore).
Adăugați 100–500 µg de probă în eprubetele cu capac filetat, folosind o balanță analitică. Înregistrați cantitatea adăugată. Cel mai bine este să dizolvați proba într-o concentrație specifică de solvent și să o adăugați în eprubetă ca alicotă lichidă. Folosiți 20 µl de inozitol 1 mg/ml ca standard intern pentru fiecare eprubetă de probă. Cantitatea de standard intern adăugată în eprubetă trebuie să fie aceeași cu cantitatea de standard intern adăugată în eprubeta standard.
Adăugați 8 ml de metanol anhidru într-o fiolă cu capac cu filet. Apoi, adăugați 4 ml de soluție 3 N de HCl metanolic, închideți flaconul și agitați. Acest proces nu utilizează apă.
Se adaugă 500 µl de soluție de HCl 1 M în metanol la probele de oligozaharide și la tuburile TMS standard. Probele au fost incubate peste noapte (168 de ore) la 80°C într-un bloc termic. Se usucă produsul de metanoliză la temperatura camerei folosind un colector de uscare. Se adaugă 200 µl de MeOH și se usucă din nou. Acest proces se repetă de două ori. Se adaugă 200 µl de metanol, 100 µl de piridină și 100 µl de anhidridă acetică la probă și se amestecă bine. Se incubează probele la temperatura camerei timp de 30 de minute și se usucă. Se adaugă 200 µl de metanol și se usucă din nou.
Adăugați 200 µl de Tri-Sil și încălziți tubul cu capac timp de 20 de minute la 80°C, apoi răciți la temperatura camerei. Folosiți un colector de uscare pentru a usca în continuare proba până la un volum de aproximativ 50 µl. Este important de reținut că nu am lăsat probele să se usuce complet.
Se adaugă 2 ml de hexan și se amestecă bine prin vortexare. Se umple vârfurile pipetelor Pasteur (5-8 mm) cu o bucată de vată de sticlă, introducând vata de sticlă deasupra unei pipete cu diametrul de 5-3/4 inch. Probele au fost centrifugate la 3000 g timp de 2 minute. Orice reziduuri insolubile precipită. Se usucă proba până la 100-150 µl. Un volum de aproximativ 1 μl a fost injectat în GC-MS la o temperatură inițială de 80 °C și un timp inițial de 2,0 minute (Tabelul 2).