Cảm ơn bạn đã ghé thăm Nature.com. Phiên bản trình duyệt bạn đang sử dụng có hỗ trợ CSS hạn chế. Để có trải nghiệm tốt nhất, chúng tôi khuyên bạn nên sử dụng trình duyệt đã cập nhật (hoặc tắt Chế độ tương thích trong Internet Explorer). Trong thời gian chờ đợi, để đảm bảo hỗ trợ liên tục, chúng tôi sẽ hiển thị trang web mà không có kiểu dáng và JavaScript.
Phương pháp miễn dịch học và khối phổ mới để phân tích phức tạp các oligosaccharides dai dẳng trong thân ngô được xử lý trước bằng AFEX. Sinh khối lignocellulosic là một giải pháp thay thế bền vững cho nhiên liệu hóa thạch và được sử dụng rộng rãi để phát triển công nghệ sinh học nhằm sản xuất các sản phẩm như thực phẩm, thức ăn chăn nuôi, nhiên liệu và hóa chất. Chìa khóa của các công nghệ này là phát triển các quy trình cạnh tranh về chi phí để chuyển đổi carbohydrate phức tạp có trong thành tế bào thực vật thành các loại đường đơn giản như glucose, xylose và arabinose. Vì sinh khối lignocellulosic rất cứng đầu nên phải trải qua các phương pháp xử lý nhiệt hóa học (ví dụ: tách sợi amoniac (AFEX), axit loãng (DA), chất lỏng ion (IL)) và các phương pháp xử lý sinh học (ví dụ: thủy phân bằng enzym và lên men vi sinh) kết hợp để thu được sản phẩm mong muốn. Tuy nhiên, khi sử dụng các enzym nấm thương mại trong quá trình thủy phân, chỉ có 75-85% lượng đường hòa tan được hình thành là monosaccharide, và 15-25% còn lại là oligosaccharides hòa tan, khó phân hủy, không phải lúc nào cũng có sẵn cho vi sinh vật. Trước đây, chúng tôi đã thành công trong việc phân lập và tinh chế các oligosacarit cứng đầu hòa tan bằng cách kết hợp tách cacbon và đất tảo cát và sắc ký loại trừ kích thước, đồng thời cũng nghiên cứu các đặc tính ức chế enzym của chúng. Chúng tôi nhận thấy rằng các oligosacarit chứa các chất thay thế axit uronic metyl hóa có độ trùng hợp (DP) cao hơn khó xử lý hơn bằng hỗn hợp enzym thương mại so với các oligosacarit trung tính và có độ DP thấp. Ở đây, chúng tôi báo cáo việc sử dụng một số phương pháp bổ sung, bao gồm lập hồ sơ glycan bằng kháng thể đơn dòng (mAb) đặc hiệu với glycan sinh khối thực vật để xác định đặc điểm liên kết glycan trong thành tế bào thực vật và dịch thủy phân enzym, ion hóa giải hấp phụ bằng laser hỗ trợ ma trận, khối phổ thời gian bay. . MALDI-TOF-MS) sử dụng các đỉnh chẩn đoán cung cấp thông tin về cấu trúc thu được bằng phương pháp quang phổ sau khi phân rã thứ cấp các ion âm, sắc ký khí và khối phổ (GC-MS) để xác định đặc điểm liên kết oligosacarit có và không có dẫn xuất. Do kích thước nhỏ của oligosaccharide (DP 4–20), các phân tử này khó sử dụng để liên kết và định tính mAb. Để khắc phục vấn đề này, chúng tôi đã áp dụng một phương pháp cố định oligosaccharide dựa trên liên hợp biotin mới, phương pháp này đã dán nhãn thành công phần lớn các oligosaccharide hòa tan có DP thấp trên bề mặt vi mảng, sau đó được sử dụng trong hệ thống mAb thông lượng cao để phân tích liên kết đặc hiệu. Phương pháp mới này sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho việc phát triển các xét nghiệm glycome thông lượng cao tiên tiến hơn trong tương lai, có thể được sử dụng để phân lập và định tính các oligosaccharide có trong các dấu ấn sinh học cho mục đích chẩn đoán.
Sinh khối lignocellulose, bao gồm các vật liệu nông nghiệp, lâm nghiệp, cỏ và gỗ, là nguyên liệu tiềm năng để sản xuất các sản phẩm có nguồn gốc sinh học, bao gồm thực phẩm, thức ăn chăn nuôi, nhiên liệu và tiền chất hóa học để tạo ra các sản phẩm có giá trị cao hơn1. Carbohydrate (như cellulose và hemicellulose) có trong thành tế bào thực vật được khử trùng thành monosaccharides bằng quá trình xử lý hóa học và chuyển đổi sinh học (như thủy phân bằng enzym và lên men vi sinh). Các phương pháp xử lý trước phổ biến bao gồm giãn nở sợi amoniac (AFEX), axit loãng (DA), chất lỏng ion (IL) và nổ hơi nước (SE), sử dụng kết hợp hóa chất và nhiệt để giảm sản xuất lignocellulose bằng cách mở thành tế bào thực vật3,4. sự cứng đầu của vật chất, 5. Thủy phân bằng enzym được thực hiện ở tải lượng chất rắn cao bằng cách sử dụng các enzym chứa carbohydrate hoạt tính thương mại (CAZymes) và lên men vi sinh bằng cách sử dụng nấm men hoặc vi khuẩn chuyển gen để sản xuất nhiên liệu và hóa chất có nguồn gốc sinh học6.
CAZymes trong các enzyme thương mại bao gồm một hỗn hợp phức tạp các enzyme có tác dụng hiệp đồng cắt các liên kết carbohydrate-đường phức tạp để tạo thành monosaccharide2,7. Như chúng tôi đã báo cáo trước đó, mạng lưới phức tạp của các polyme thơm của lignin với carbohydrate khiến chúng rất khó phân hủy, dẫn đến quá trình chuyển đổi đường không hoàn toàn, tích tụ 15-25% oligosaccharide giới tính không được tạo ra trong quá trình thủy phân bằng enzyme của sinh khối đã được xử lý trước. Đây là một vấn đề phổ biến với nhiều phương pháp xử lý trước sinh khối. Một số lý do gây ra tình trạng tắc nghẽn này bao gồm ức chế enzyme trong quá trình thủy phân hoặc thiếu hoặc nồng độ thấp các enzyme thiết yếu cần thiết để phá vỡ các liên kết đường trong sinh khối thực vật. Việc hiểu được thành phần và đặc điểm cấu trúc của đường, chẳng hạn như các liên kết đường trong oligosaccharide, sẽ giúp chúng ta cải thiện quá trình chuyển đổi đường trong quá trình thủy phân, giúp các quy trình công nghệ sinh học có khả năng cạnh tranh về chi phí với các sản phẩm có nguồn gốc từ dầu mỏ.
Việc xác định cấu trúc của carbohydrate là một thách thức và đòi hỏi sự kết hợp của các phương pháp như sắc ký lỏng (LC)11,12, phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)13, điện di mao quản (CE)14,15,16 và phổ khối (MS)17. ,mười tám. Các phương pháp MS như phổ khối thời gian bay với giải hấp laser và ion hóa bằng ma trận (MALDI-TOF-MS) là một phương pháp đa năng để xác định cấu trúc carbohydrate. Gần đây, MS song song phân ly do va chạm (CID) của các chất cộng ion natri đã được sử dụng rộng rãi nhất để xác định dấu vân tay tương ứng với vị trí gắn oligosaccharide, cấu hình anomeric, trình tự và vị trí phân nhánh 20, 21 .
Phân tích Glycan là một công cụ tuyệt vời để xác định sâu các liên kết carbohydrate22. Phương pháp này sử dụng kháng thể đơn dòng (mAb) hướng đến glycan thành tế bào thực vật làm đầu dò để hiểu các liên kết carbohydrate phức tạp. Hơn 250 mAb có sẵn trên toàn thế giới, được thiết kế chống lại nhiều loại oligosacarit tuyến tính và phân nhánh bằng nhiều loại saccharide khác nhau24. Một số mAb đã được sử dụng rộng rãi để mô tả cấu trúc, thành phần và các biến đổi của thành tế bào thực vật, vì có sự khác biệt đáng kể tùy thuộc vào loại tế bào thực vật, cơ quan, độ tuổi, giai đoạn phát triển và môi trường tăng trưởng25,26. Gần đây hơn, phương pháp này đã được sử dụng để hiểu các quần thể túi trong hệ thống thực vật và động vật và vai trò tương ứng của chúng trong quá trình vận chuyển glycan được xác định bởi các dấu hiệu dưới tế bào, giai đoạn phát triển hoặc kích thích môi trường và để xác định hoạt động của enzym. Một số cấu trúc khác nhau của glycan và xylan đã được xác định bao gồm pectin (P), xylan (X), mannan (M), xyloglucan (XylG), glucan liên kết hỗn hợp (MLG), arabinoxylan (ArbX), galactomannan (GalG), axit glucuronic-arabinoxylan (GArbX) và arabino-galactan (ArbG)29.
Tuy nhiên, bất chấp tất cả những nỗ lực nghiên cứu này, chỉ có một số ít nghiên cứu tập trung vào bản chất của sự tích tụ oligosaccharide trong quá trình thủy phân tải chất rắn cao (HSL), bao gồm giải phóng oligosaccharide, thay đổi độ dài chuỗi oligomeric trong quá trình thủy phân, nhiều loại polyme DP thấp và các đường cong phân bố của chúng. 30,31,32. Trong khi đó, mặc dù phân tích glycan đã chứng minh là một công cụ hữu ích để phân tích toàn diện cấu trúc glycan, nhưng rất khó để đánh giá các oligosaccharide DP thấp hòa tan trong nước bằng phương pháp kháng thể. Các oligosaccharide DP nhỏ hơn có trọng lượng phân tử dưới 5-10 kDa không liên kết với các đĩa ELISA 33, 34 và bị rửa trôi trước khi bổ sung kháng thể.
Ở đây, lần đầu tiên, chúng tôi trình bày xét nghiệm ELISA trên các tấm phủ avidin sử dụng kháng thể đơn dòng, kết hợp quy trình biotin hóa một bước cho oligosaccharides khó tan với phân tích glycome. Phương pháp phân tích glycome của chúng tôi đã được xác nhận bằng phân tích dựa trên MALDI-TOF-MS và GC-MS về các liên kết oligosaccharide bổ sung sử dụng dẫn xuất trimethylsilyl (TMS) của các thành phần đường thủy phân. Phương pháp tiếp cận sáng tạo này có thể được phát triển thành một phương pháp thông lượng cao trong tương lai và tìm thấy ứng dụng rộng rãi hơn trong nghiên cứu y sinh35.
Các sửa đổi sau dịch mã của các enzyme và kháng thể, chẳng hạn như glycosyl hóa,36 ảnh hưởng đến hoạt động sinh học của chúng. Ví dụ, những thay đổi trong glycosyl hóa của protein huyết thanh đóng vai trò quan trọng trong viêm khớp và những thay đổi trong glycosyl hóa được sử dụng làm dấu hiệu chẩn đoán37. Nhiều loại glycan khác nhau đã được báo cáo trong tài liệu là dễ dàng xuất hiện trong nhiều loại bệnh, bao gồm các bệnh viêm mãn tính ở đường tiêu hóa và gan, nhiễm trùng do vi-rút, ung thư buồng trứng, vú và tuyến tiền liệt38,39,40. Việc hiểu cấu trúc của glycan bằng phương pháp ELISA glycan dựa trên kháng thể sẽ cung cấp thêm sự tự tin trong chẩn đoán bệnh mà không cần sử dụng các phương pháp MS phức tạp.
Nghiên cứu trước đây của chúng tôi cho thấy các oligosacarit cứng đầu vẫn chưa thủy phân sau khi xử lý sơ bộ và thủy phân bằng enzym (Hình 1). Trong công trình đã công bố trước đây của chúng tôi, chúng tôi đã phát triển một phương pháp chiết xuất pha rắn bằng than hoạt tính để cô lập các oligosacarit từ thủy phân thân ngô đã xử lý sơ bộ bằng AFEX (ACSH)8. Sau khi chiết xuất và tách ban đầu, các oligosacarit được phân đoạn thêm bằng sắc ký loại trừ kích thước (SEC) và thu thập theo thứ tự trọng lượng phân tử. Các monome và oligome đường được giải phóng từ các quá trình xử lý sơ bộ khác nhau đã được phân tích bằng phân tích thành phần đường. Khi so sánh hàm lượng oligome đường thu được bằng các phương pháp xử lý sơ bộ khác nhau, sự hiện diện của các oligosacarit cứng đầu là một vấn đề phổ biến trong quá trình chuyển đổi sinh khối thành monosacarit và có thể dẫn đến giảm sản lượng đường ít nhất 10-15% và thậm chí lên đến 18%. Hoa Kỳ. Phương pháp này được sử dụng để sản xuất các phân đoạn oligosacarit quy mô lớn hơn nữa. ACH thu được và các phân đoạn tiếp theo của nó với trọng lượng phân tử khác nhau đã được sử dụng làm vật liệu thực nghiệm để mô tả đặc tính của oligosacarit trong công trình này.
Sau khi xử lý sơ bộ và thủy phân bằng enzym, các oligosaccharides dai dẳng vẫn chưa bị thủy phân. Ở đây (A) là phương pháp tách oligosaccharides trong đó oligosaccharides được phân lập từ dịch thủy phân thân ngô đã xử lý sơ bộ bằng AFEX (ACSH) bằng cách sử dụng một lớp than hoạt tính và đất diatomit được nhồi; (B) Phương pháp tách oligosaccharides. Các oligosaccharides được tách thêm bằng sắc ký loại trừ kích thước (SEC); (C) Các monome và oligome saccharide được giải phóng từ nhiều quá trình xử lý sơ bộ khác nhau (axit loãng: DA, chất lỏng ion: IL và AFEX). Điều kiện thủy phân bằng enzym: tải chất rắn cao 25% (w/w) (tải glucan khoảng 8%), thủy phân 96 giờ, tải enzyme thương mại 20 mg/g (tỷ lệ Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) và (D) Các monome và oligome đường của glucose, xylose và arabinose được giải phóng từ thân ngô đã xử lý sơ bộ bằng AFEX (ACS).
Phân tích glycan đã chứng minh là một công cụ hữu ích cho phân tích cấu trúc toàn diện của glycan trong chiết xuất được phân lập từ các chất thải sinh khối rắn. Tuy nhiên, các saccharide hòa tan trong nước không được đại diện đầy đủ khi sử dụng phương pháp truyền thống này41 vì các oligosaccharide có trọng lượng phân tử thấp khó cố định trên các đĩa ELISA và bị rửa sạch trước khi thêm kháng thể. Do đó, để liên kết và đặc tính kháng thể, phương pháp biotin hóa một bước đã được sử dụng để phủ các oligosaccharide hòa tan, không tuân thủ trên các đĩa ELISA phủ avidin. Phương pháp này đã được thử nghiệm bằng cách sử dụng ACSH do chúng tôi sản xuất trước đó và một phần dựa trên trọng lượng phân tử của nó (hoặc mức độ trùng hợp, DP). Biotin hóa một bước đã được sử dụng để tăng ái lực liên kết oligosaccharide bằng cách thêm biotin-LC-hydrazide vào đầu khử của carbohydrate (Hình 2). Trong dung dịch, nhóm hemiacetal ở đầu khử phản ứng với nhóm hydrazide của biotin-LC-hydrazide để tạo thành liên kết hydrazone. Với sự có mặt của chất khử NaCNBH3, liên kết hydrazone bị khử thành sản phẩm cuối biotin hóa ổn định. Với sự biến đổi của đầu khử đường, việc liên kết oligosaccharides DP thấp với các đĩa ELISA trở nên khả thi và trong nghiên cứu của chúng tôi, điều này được thực hiện trên các đĩa phủ avidin bằng cách sử dụng mAb nhắm mục tiêu glycan.
Sàng lọc kháng thể đơn dòng dựa trên ELISA đối với oligosacarit biotin. Ở đây (A) kết hợp biotin hóa oligosacarit và sàng lọc ELISA tiếp theo với mAb nhắm mục tiêu glycan trên các tấm phủ NeutrAvidin và (B) cho thấy quy trình một bước để biotin hóa các sản phẩm phản ứng.
Các tấm phủ avidin với kháng thể liên hợp oligosaccharide sau đó được thêm vào kháng thể sơ cấp và thứ cấp và rửa trong môi trường nhạy sáng và thời gian. Sau khi liên kết kháng thể hoàn tất, thêm chất nền TMB để ủ tấm. Phản ứng cuối cùng được dừng lại bằng axit sulfuric. Các tấm ủ được phân tích bằng máy đọc ELISA để xác định cường độ liên kết của từng kháng thể nhằm phát hiện liên kết chéo đặc hiệu kháng thể. Để biết chi tiết và thông số của thí nghiệm, hãy xem phần tương ứng “Vật liệu và phương pháp”.
Chúng tôi chứng minh tính hữu ích của phương pháp mới phát triển này cho các ứng dụng cụ thể bằng cách mô tả các oligosaccharide hòa tan có trong ACSH cũng như trong các phân đoạn oligosaccharide thô và tinh khiết được phân lập từ thủy phân lignocellulose. Như thể hiện trong Hình 3, các xylan thay thế epitope phổ biến nhất được xác định trong ACSH bằng các phương pháp thử nghiệm glycome sinh học thường là uronic (U) hoặc methyluronic (MeU) và pectic arabinogalactan. Hầu hết trong số chúng cũng được tìm thấy trong nghiên cứu trước đây của chúng tôi về phân tích glycan của chất rắn không thủy phân (UHS)43.
Phát hiện các epitope oligosaccharide kháng thuốc bằng cách sử dụng kháng thể đơn dòng hướng đến glycan thành tế bào. Phân đoạn "trung tính" là phân đoạn ACN và phân đoạn "có tính axit" là phân đoạn FA. Màu đỏ sáng hơn trên bản đồ nhiệt biểu thị hàm lượng epitope cao hơn và màu xanh lam sáng hơn biểu thị nền trống. Giá trị màu trên thang đo dựa trên giá trị OD thô đối với các công thức N = 2. Các epitope chính được các kháng thể nhận dạng được hiển thị ở bên phải.
Những cấu trúc không phải cellulose này không thể bị cắt bởi các cellulase và hemicellulase phổ biến nhất trong hỗn hợp enzyme thương mại được thử nghiệm, bao gồm các enzyme thương mại được sử dụng phổ biến nhất. Do đó, cần có các enzyme phụ trợ mới cho quá trình thủy phân của chúng. Nếu không có các enzyme phụ trợ không phải cellulose cần thiết, các liên kết không phải cellulose này sẽ ngăn cản quá trình chuyển đổi hoàn toàn thành monosaccharide, ngay cả khi các polyme đường gốc của chúng được thủy phân rộng rãi thành các đoạn ngắn hơn và hòa tan bằng các hỗn hợp enzyme thương mại.
Nghiên cứu sâu hơn về phân bố tín hiệu và cường độ liên kết của nó cho thấy các epitope liên kết thấp hơn ở các phân đoạn đường DP cao (A, B, C, DP lên đến 20+) so với các phân đoạn DP thấp (D, E, F, DP) trong các dimer) (Hình 1). Các mảnh axit phổ biến hơn ở các epitope không phải cellulose so với các mảnh trung tính. Những hiện tượng này phù hợp với mô hình quan sát được trong nghiên cứu trước đây của chúng tôi, trong đó các phần DP và axit cao có khả năng chống lại quá trình thủy phân bằng enzym cao hơn. Do đó, sự hiện diện của các epitope glycan không phải cellulose và các thế U và MeU có thể góp phần đáng kể vào tính ổn định của oligosacarit. Cần lưu ý rằng hiệu quả liên kết và phát hiện có thể là vấn đề đối với các oligosacarit DP thấp, đặc biệt nếu epitope là oligosacarit dimeric hoặc trimeric. Điều này có thể được thử nghiệm bằng cách sử dụng các oligosacarit thương mại có độ dài khác nhau, mỗi oligosacarit chỉ chứa một epitope liên kết với một mAb cụ thể.
Do đó, việc sử dụng kháng thể đặc hiệu cấu trúc đã tiết lộ một số loại liên kết kháng thuốc. Tùy thuộc vào loại kháng thể được sử dụng, kiểu liên kết thích hợp và cường độ tín hiệu mà nó tạo ra (nhiều nhất và ít nhất), các enzyme mới có thể được xác định và thêm bán định lượng vào hỗn hợp enzyme để chuyển đổi glyco hoàn thiện hơn. Lấy phân tích oligosaccharide ACSH làm ví dụ, chúng ta có thể tạo cơ sở dữ liệu về các liên kết glycan cho từng vật liệu sinh khối. Cần lưu ý ở đây rằng cần tính đến ái lực khác nhau của các kháng thể và nếu ái lực của chúng không rõ, điều này sẽ tạo ra một số khó khăn khi so sánh tín hiệu của các kháng thể khác nhau. Ngoài ra, việc so sánh các liên kết glycan có thể hiệu quả nhất giữa các mẫu đối với cùng một kháng thể. Sau đó, các liên kết cứng đầu này có thể được liên kết với cơ sở dữ liệu CAZyme, từ đó chúng ta có thể xác định các enzyme, chọn các enzyme ứng viên và thử nghiệm các enzyme phá vỡ liên kết hoặc phát triển các hệ thống vi khuẩn để biểu hiện các enzyme này để sử dụng trong các nhà máy lọc sinh học44.
Để đánh giá cách các phương pháp miễn dịch bổ sung cho các phương pháp thay thế để mô tả các oligosacarit có trọng lượng phân tử thấp có trong thủy phân lignocellulose, chúng tôi đã thực hiện MALDI (Hình 4, S1-S8) và phân tích các sacarit có nguồn gốc từ TMS dựa trên GC-MS trên cùng một bảng (Hình 5) phần oligosacarit. MALDI được sử dụng để so sánh xem sự phân bố khối lượng của các phân tử oligosacarit có khớp với cấu trúc mong muốn hay không. Trên hình 4 cho thấy MS của các thành phần trung tính ACN-A và ACN-B. Phân tích ACN-A đã xác nhận một loạt các loại đường pentose từ DP 4–8 (Hình 4) đến DP 22 (Hình S1), có trọng lượng tương ứng với oligosacarit MeU-xylan. Phân tích ACN-B đã xác nhận chuỗi pentose và glucoxylan với DP 8-15. Trong tài liệu bổ sung như Hình S3, bản đồ phân bố khối lượng của nhóm axit FA-C cho thấy một loạt các loại đường pentose thay thế (Me)U với DP từ 8-15 phù hợp với các xylan thay thế được tìm thấy trong sàng lọc mAb dựa trên ELISA. Các epitope phù hợp.
Phổ MALDI-MS của các oligosaccharide không tuân thủ hòa tan có trong ACS. Ở đây, (A) Các phân đoạn có trọng lượng thấp ACN-A chứa các oligosaccharide glucuroxylan thay thế bằng axit uronic đã methyl hóa (DP 4-8) và (B) Các oligosaccharide axit uronic đã methyl hóa và xylan ACN-B thay thế bằng glucuroxylan (DP 8-15).
Phân tích thành phần của phần còn lại glycan của oligosaccharides chịu nhiệt. Ở đây (A) Thành phần saccharide TMS của nhiều phân đoạn oligosaccharide khác nhau thu được bằng cách sử dụng phân tích GC-MS. (B) Cấu trúc của nhiều loại đường có nguồn gốc từ TMS có trong oligosaccharides. ACN – phân đoạn acetonitrile chứa oligosaccharides trung tính và FA – phân đoạn axit ferulic chứa oligosaccharides axit.
Một kết luận thú vị khác được rút ra từ phân tích LC-MS của phân đoạn oligosaccharide, như thể hiện trong Hình S9 (có thể xem phương pháp trong tài liệu bổ sung điện tử). Các mảnh nhóm hexose và -OAc được quan sát nhiều lần trong quá trình gắn kết phân đoạn ACN-B. Phát hiện này không chỉ xác nhận sự phân mảnh được quan sát thấy trong phân tích glycome và MALDI-TOF, mà còn cung cấp thông tin mới về các dẫn xuất carbohydrate tiềm năng trong sinh khối lignocellulose được xử lý trước.
Chúng tôi cũng đã thực hiện phân tích thành phần glycan của các phân đoạn oligosaccharide bằng cách sử dụng dẫn xuất glycan TMS. Sử dụng GC-MS, chúng tôi đã xác định thành phần của đường thần kinh (không dẫn xuất) và đường axit (GluA và GalA) trong phân đoạn oligosaccharide (Hình 5). Axit glucuronic được tìm thấy trong các thành phần axit C và D, trong khi axit galacturonic được tìm thấy trong các thành phần axit A và B, cả hai đều là thành phần DP cao của đường axit. Những kết quả này không chỉ xác nhận dữ liệu ELISA và MALDI của chúng tôi mà còn phù hợp với các nghiên cứu trước đây của chúng tôi về sự tích tụ oligosaccharide. Do đó, chúng tôi tin rằng các phương pháp miễn dịch học hiện đại sử dụng biotin hóa oligosaccharide và sàng lọc ELISA tiếp theo là đủ để phát hiện các oligosaccharide khó chữa hòa tan trong các mẫu sinh học khác nhau.
Vì các phương pháp sàng lọc mAb dựa trên ELISA đã được xác nhận bằng một số phương pháp khác nhau, chúng tôi muốn khám phá thêm tiềm năng của phương pháp định lượng mới này. Hai oligosaccharide thương mại, xylohexasacarit oligosaccharide (XHE) và 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX), đã được mua và thử nghiệm bằng cách sử dụng phương pháp mAb mới nhắm vào glycan thành tế bào. Hình 6 cho thấy mối tương quan tuyến tính giữa tín hiệu liên kết biotin và nồng độ logarit của nồng độ oligosaccharide, gợi ý về một mô hình hấp phụ Langmuir khả thi. Trong số các mAb, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 và CCRC-M151 tương quan với XHE, và CCRC-M108, CCRC-M109 và LM11 tương quan với A2XX trong phạm vi từ 1 nm đến 100 nano. Do tính khả dụng hạn chế của kháng thể trong quá trình thử nghiệm, nên các thí nghiệm giới hạn đã được thực hiện với từng nồng độ oligosaccharide. Cần lưu ý ở đây rằng một số kháng thể phản ứng rất khác nhau với cùng một oligosaccharide như một chất nền, có lẽ là do chúng liên kết với các epitope hơi khác nhau và có thể có ái lực liên kết rất khác nhau. Các cơ chế và ý nghĩa của việc xác định epitope chính xác sẽ phức tạp hơn nhiều khi phương pháp mAb mới được áp dụng cho các mẫu thực tế.
Hai oligosaccharide thương mại đã được sử dụng để xác định phạm vi phát hiện của nhiều mAb nhắm mục tiêu glycan. Ở đây, các tương quan tuyến tính với nồng độ logarit của nồng độ oligosaccharide chỉ ra các mẫu hấp phụ Langmuir đối với (A) XHE với mAb và (B) A2XX với mAb. Các epitope tương ứng chỉ ra cấu trúc của các oligosaccharide thương mại được sử dụng làm chất nền trong xét nghiệm.
Việc sử dụng kháng thể đơn dòng nhắm mục tiêu glycan (phân tích glycocomic hoặc sàng lọc mAb dựa trên ELISA) là một công cụ mạnh mẽ để mô tả chuyên sâu hầu hết các glycan thành tế bào chính tạo nên sinh khối thực vật. Tuy nhiên, phân tích glycan cổ điển chỉ mô tả các glycan thành tế bào lớn hơn, vì hầu hết các oligosacarit không được cố định hiệu quả trên các đĩa ELISA. Trong nghiên cứu này, thân ngô được xử lý trước bằng AFEX đã được thủy phân bằng enzym ở hàm lượng chất rắn cao. Phân tích đường được sử dụng để xác định thành phần của carbohydrate thành tế bào khó phản ứng trong dịch thủy phân. Tuy nhiên, phân tích mAb của các oligosacarit nhỏ hơn trong dịch thủy phân bị đánh giá thấp và cần có thêm các công cụ để cố định hiệu quả các oligosacarit trên các đĩa ELISA.
Chúng tôi báo cáo ở đây một phương pháp cố định oligosaccharide mới và hiệu quả để sàng lọc mAb bằng cách kết hợp biotin hóa oligosaccharide tiếp theo là sàng lọc ELISA trên các tấm phủ NeutrAvidin™. Các oligosaccharide biotin hóa cố định cho thấy ái lực đủ đối với kháng thể để có thể phát hiện nhanh chóng và hiệu quả các oligosaccharide kháng thuốc. Phân tích thành phần của các oligosaccharide cứng đầu này dựa trên phép đo phổ khối đã xác nhận kết quả của phương pháp sàng lọc miễn dịch mới này. Do đó, các nghiên cứu này chứng minh rằng sự kết hợp giữa biotin hóa oligosaccharide và sàng lọc ELISA với kháng thể đơn dòng nhắm mục tiêu glycan có thể được sử dụng để phát hiện các liên kết chéo trong oligosaccharide và có thể được áp dụng rộng rãi trong các nghiên cứu sinh hóa khác mô tả cấu trúc của oligosaccharide.
Phương pháp lập hồ sơ glycan dựa trên biotin này là báo cáo đầu tiên có khả năng nghiên cứu các liên kết carbohydrate khó phục hồi của oligosaccharides hòa tan trong sinh khối thực vật. Điều này giúp hiểu lý do tại sao một số bộ phận của sinh khối lại rất cứng đầu khi nói đến sản xuất nhiên liệu sinh học. Phương pháp này lấp đầy một khoảng trống quan trọng trong các phương pháp phân tích glycome và mở rộng ứng dụng của nó sang nhiều loại chất nền hơn ngoài oligosaccharides thực vật. Trong tương lai, chúng tôi có thể sử dụng robot để biotin hóa và sử dụng phương pháp mà chúng tôi đã phát triển để phân tích mẫu thông lượng cao bằng ELISA.
Rơm ngô (CS) được trồng từ hạt giống lai Pioneer 33A14 đã được thu hoạch vào năm 2010 từ Kramer Farms ở Ray, Colorado. Với sự cho phép của chủ đất, sinh khối này có thể được sử dụng cho mục đích nghiên cứu. Các mẫu được bảo quản khô, độ ẩm < 6% trong túi khóa kéo ở nhiệt độ phòng. Các mẫu được bảo quản khô, độ ẩm < 6% trong túi khóa kéo ở nhiệt độ phòng. Tỷ lệ người dân có thể kiếm được nhiều tiền hơn < 6% trong số tiền bạn có thể kiếm được từ việc mua sắm của bạn. Các mẫu được bảo quản khô ở độ ẩm <6% trong túi có khóa kéo ở nhiệt độ phòng.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Tỷ lệ người tiêu dùng có thể đạt được mức lợi nhuận dưới 6%. Mẫu được bảo quản trong túi khóa kéo ở nhiệt độ phòng với độ ẩm < 6%.Nghiên cứu tuân thủ các hướng dẫn của địa phương và quốc gia. Phân tích thành phần được thực hiện bằng giao thức NREL. Thành phần được tìm thấy chứa 31,4% glucan, 18,7% xylan, 3,3% arabinan, 1,2% galactan, 2,2% acetyl, 14,3% lignin, 1,7% protein và 13,4% tro.
Cellic® CTec2 (138 mg protein/ml, lô VCNI 0001) là hỗn hợp phức hợp của cellulase, β-glucosidase và Cellic® HTec2 (157 mg protein/ml, lô VHN00001) từ Novozymes (Franklinton, NC, Hoa Kỳ)). Multifect Pectinase® (72 mg protein/mL), hỗn hợp phức hợp của các enzyme phân hủy pectin, được DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, Hoa Kỳ) tài trợ. Nồng độ protein của enzyme được xác định bằng cách ước tính hàm lượng protein (và trừ đi sự đóng góp của nitơ không phải protein) bằng cách sử dụng phân tích nitơ Kjeldahl (phương pháp AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, Hoa Kỳ). Đất tảo cát 545 được mua từ EMD Millipore (Billerica, MA). Than hoạt tính (DARCO, hạt lưới 100), Avicel (PH-101), xylan gỗ sồi và tất cả các hóa chất khác được mua từ Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
Tiền xử lý AFEX được thực hiện tại GLBRC (Phòng thí nghiệm nghiên cứu chuyển đổi sinh khối, MSU, Lansing, MI, Hoa Kỳ). Tiền xử lý được thực hiện ở 140° C trong 15 phút. 46 thời gian lưu trú ở tỷ lệ 1:1 của amoniac khan với sinh khối ở mức tải 60% (w/w) trong lò phản ứng mẻ để bàn bằng thép không gỉ (Công ty Parr Instruments). Quá trình này mất 30 phút. Lò phản ứng được đưa đến 140°C và amoniac được giải phóng nhanh chóng, cho phép sinh khối nhanh chóng trở lại nhiệt độ phòng. Thành phần của thân ngô được xử lý trước bằng AFEX (ACS) tương tự như thành phần của thân ngô chưa xử lý (UT-CS).
Chất rắn cao ACSH 25% (w/w) (khoảng 8% tải dextran) được chuẩn bị như một nguyên liệu đầu vào cho sản xuất oligosacarit quy mô lớn. Thủy phân bằng enzym của ACS được thực hiện bằng cách sử dụng hỗn hợp enzym thương mại bao gồm Cellic® Ctec2 10 mg protein/g glucan (trong sinh khối đã xử lý trước), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg protein/g glucan và Multifect Pectinase (Genencor Inc, Hoa Kỳ). ). ), 5 mg protein/g dextran. Thủy phân bằng enzym được thực hiện trong lò phản ứng sinh học 5 lít với thể tích làm việc là 3 lít, pH 4,8, 50°C và 250 vòng/phút. Sau khi thủy phân trong 96 giờ, dịch thủy phân được thu thập bằng cách ly tâm ở tốc độ 6000 vòng/phút trong 30 phút và sau đó ở tốc độ 14000 vòng/phút trong 30 phút để loại bỏ chất rắn chưa thủy phân. Sau đó, thủy phân được lọc vô trùng qua cốc lọc 0,22 mm. Thủy phân đã lọc được bảo quản trong các chai vô trùng ở 4° C và sau đó được phân đoạn trên than.
Phân tích thành phần của các mẫu sinh khối chiết xuất theo quy trình phân tích trong phòng thí nghiệm của NREL: chuẩn bị mẫu để phân tích thành phần (NREL/TP-510-42620) và xác định carbohydrate cấu trúc và lignin trong sinh khối (NREL/TP-510 – 42618)47.
Phân tích oligosaccharide của dòng thủy phân được thực hiện trên thang đo 2 ml bằng phương pháp thủy phân axit dựa trên nồi hấp. Trộn mẫu thủy phân với 69,7 µl axit sunfuric 72% trong ống nuôi cấy có nắp vặn 10 ml và ủ trong 1 giờ trên mặt bàn ở 121 °C, làm lạnh trên đá và lọc vào lọ sắc ký lỏng hiệu suất cao (HPLC). Nồng độ oligosaccharide được xác định bằng cách trừ nồng độ monosaccharide trong mẫu không thủy phân khỏi nồng độ đường tổng trong mẫu thủy phân axit.
Nồng độ glucose, xylose và arabinose trong sinh khối thủy phân axit được phân tích bằng hệ thống HPLC Shimadzu được trang bị máy lấy mẫu tự động, bộ gia nhiệt cột, bơm isocratic và máy dò chiết suất trên cột Bio-Rad Aminex HPX-87H. Cột được duy trì ở 50°C và rửa giải bằng 0,6 ml/phút 5 mM H2SO4 trong nước. dòng chảy.
Dịch thủy phân được pha loãng và phân tích hàm lượng monome và oligosaccharide. Đường monome thu được sau quá trình thủy phân bằng enzym được phân tích bằng HPLC được trang bị cột Aminex HPX-87P của Bio-Rad (Hercules, CA) và cột ash guard. Nhiệt độ cột được duy trì ở 80°C, nước được sử dụng làm pha động với tốc độ dòng chảy là 0,6 ml/phút. Oligosaccharide được xác định bằng cách thủy phân trong axit loãng ở 121°C theo các phương pháp được mô tả trong các tài liệu tham khảo 41, 48, 49.
Phân tích saccharide được thực hiện trên các chất cặn sinh khối thô, đã xử lý trước bằng AFEX và tất cả các chất cặn sinh khối chưa thủy phân (bao gồm sản xuất chiết xuất thành tế bào theo chuỗi và sàng lọc mAb của chúng) bằng các quy trình đã mô tả trước đây 27, 43, 50, 51 . Đối với phân tích glycome, các chất cặn không tan trong cồn của vật liệu thành tế bào thực vật được chuẩn bị từ các chất cặn sinh khối và trải qua quá trình chiết xuất theo chuỗi với các thuốc thử ngày càng mạnh như amoni oxalat (50 mM), natri cacbonat (50 mM và 0,5% w/v), CON. (1M và 4M, cả hai đều có 1% w/v natri borohydride) và axit clorit như đã mô tả trước đây52,53. Sau đó, các chất chiết xuất được tiến hành ELISA với một nhóm phức hợp các mAb50 hướng đến glycan thành tế bào và các phản ứng liên kết mAb được trình bày dưới dạng bản đồ nhiệt. Các mAb nhắm mục tiêu glycan thành tế bào thực vật được mua từ các kho dự trữ trong phòng thí nghiệm (loạt CCRC, JIM và MAC).
Biotin hóa một bước của oligosacarit. Quá trình liên hợp carbohydrate với biotin-LC-hydrazide được thực hiện bằng quy trình sau. Biotin-LC-hydrazide (4,6 mg/12 μmol) được hòa tan trong dimethyl sulfoxide (DMSO, 70 μl) bằng cách khuấy mạnh và đun nóng ở 65° C trong 1 phút. Axit axetic băng (30 µl) được thêm vào và hỗn hợp được đổ vào natri cyanoborohydride (6,4 mg/100 µmol) và hòa tan hoàn toàn sau khi đun nóng ở 65° C trong khoảng 1 phút. Sau đó, từ 5 đến 8 μl hỗn hợp phản ứng được thêm vào oligosacarit khô (1-100 nmol) để thu được lượng dư mol gấp 10 lần hoặc nhiều hơn của nhãn trên đầu khử. Phản ứng được thực hiện ở 65°C trong 2 giờ, sau đó các mẫu được tinh chế ngay lập tức. Không sử dụng natri cyanoborohydride trong các thí nghiệm dán nhãn mà không có quá trình khử và các mẫu được phản ứng ở 65° C trong 2,5 giờ.
Phủ ELISA và rửa mẫu oligosaccharide biotin. 25 μl mẫu biotin (100 μl của mỗi mẫu cô đặc pha loãng trong 5 ml dung dịch đệm Tris 0,1 M (TBS)) được thêm vào mỗi giếng của đĩa phủ avidin. Các giếng đối chứng được phủ 50 μl biotin ở nồng độ 10 μg/ml trong TBS 0,1 M. Nước khử ion được sử dụng làm lớp phủ cho các phép đo mẫu trắng. Viên nén được ủ trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng trong bóng tối. Rửa đĩa 3 lần bằng sữa tách kem 0,1% trong TBS 0,1 M bằng chương trình số 11 cho Grenier phẳng 3A.
Thêm và rửa kháng thể chính. Thêm 40 µl kháng thể chính vào mỗi giếng. Ủ microplate trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng trong bóng tối. Sau đó, rửa các tấm 3 lần bằng sữa 0,1% trong TBS 0,1M bằng chương trình rửa #11 cho Grenier Flat 3A.
Thêm kháng thể thứ cấp và rửa. Thêm 50 µl kháng thể thứ cấp của chuột/chuột cống (pha loãng 1:5000 trong sữa 0,1% trong TBS 0,1 M) vào mỗi giếng. Ủ đĩa vi mô trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng trong bóng tối. Sau đó, rửa các đĩa vi mô 5 lần bằng sữa 0,1% trong TBS 0,1 M bằng chương trình rửa đĩa Grenier Flat 5A #12.
Thêm chất nền. Thêm 50 µl 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) vào chất nền cơ bản (bằng cách thêm 2 giọt đệm, 3 giọt TMB, 2 giọt hydrogen peroxide vào 15 ml nước khử ion). Chuẩn bị chất nền TMB. và vortex trước khi sử dụng). Ủ microplate ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Trong bóng tối.
Hoàn tất bước này và đọc viên thuốc. Thêm 50 µl axit sulfuric 1 N vào mỗi giếng và ghi lại độ hấp thụ từ 450 đến 655 nm bằng máy đọc ELISA.
Chuẩn bị dung dịch 1 mg/ml của các chất phân tích này trong nước khử ion: arabinose, rhamnose, fucose, xylose, axit galacturonic (GalA), axit glucuronic (GlcA), mannose, glucose, galactose, lactose, N-acetylmannosamine (manNAc), N-acetylglucosamine . (glcNAc), N-acetylgalactosamine (galNAc), inositol (chuẩn nội). Hai chuẩn được chuẩn bị bằng cách thêm dung dịch đường 1 mg/mL được hiển thị trong Bảng 1. Các mẫu được đông lạnh và đông khô ở -80° C. cho đến khi loại bỏ hết nước (thường mất khoảng 12-18 giờ).
Thêm 100–500 µg mẫu vào ống nắp vặn trên cân phân tích. Ghi lại lượng thêm vào. Tốt nhất là hòa tan mẫu trong một nồng độ dung môi cụ thể và thêm vào ống dưới dạng một phần lỏng. Sử dụng 20 µl inositol 1 mg/ml làm chuẩn nội cho mỗi ống mẫu. Lượng chuẩn nội thêm vào mẫu phải bằng lượng chuẩn nội thêm vào ống chuẩn.
Thêm 8 ml methanol khan vào lọ có nắp vặn. Sau đó thêm 4 ml dung dịch HCl methanol 3 N, đậy nắp và lắc. Quá trình này không sử dụng nước.
Thêm 500 µl dung dịch HCl methanol 1 M vào các mẫu oligosaccharide và ống TMS chuẩn. Các mẫu được ủ qua đêm (168 giờ) ở 80° C. trong một khối nhiệt. Làm khô sản phẩm methanol phân ở nhiệt độ phòng bằng cách sử dụng ống phân phối sấy. Thêm 200 µl MeOH và sấy khô lại. Quá trình này được lặp lại hai lần. Thêm 200 µl methanol, 100 µl pyridine và 100 µl acetic anhydride vào mẫu và trộn đều. Ủ các mẫu ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. và sấy khô. Thêm 200 µl methanol và sấy khô lại.
Thêm 200 µl Tri-Sil và đậy nắp ống trong 20 phút. 80°C, sau đó làm nguội đến nhiệt độ phòng. Sử dụng ống phân phối sấy để sấy mẫu thêm đến thể tích khoảng 50 µl. Điều quan trọng cần lưu ý là chúng tôi không để mẫu khô hoàn toàn.
Thêm 2 ml hexan và trộn đều bằng cách xoáy. Đổ đầy đầu pipet Pasteur (5-8 mm) bằng một miếng bông thủy tinh bằng cách chèn bông thủy tinh lên trên một pipet có đường kính 5-3/4 inch. Các mẫu được ly tâm ở tốc độ 3000 g trong 2 phút. Bất kỳ chất cặn không hòa tan nào đều được kết tủa. Làm khô mẫu đến 100-150 µl. Một thể tích khoảng 1 μl được tiêm vào GC-MS ở nhiệt độ ban đầu là 80 °C và thời gian ban đầu là 2,0 phút (Bảng 2).