Nature.com-এ আসার জন্য আপনাকে ধন্যবাদ। আপনি যে ব্রাউজার সংস্করণটি ব্যবহার করছেন তাতে CSS-এর সমর্থন সীমিত। সর্বোত্তম অভিজ্ঞতার জন্য, আমরা আপনাকে একটি হালনাগাদ ব্রাউজার ব্যবহার করার পরামর্শ দিচ্ছি (অথবা ইন্টারনেট এক্সপ্লোরারে কম্প্যাটিবিলিটি মোড নিষ্ক্রিয় করুন)। আপাতত, নিরবচ্ছিন্ন সমর্থন নিশ্চিত করার জন্য, আমরা স্টাইল এবং জাভাস্ক্রিপ্ট ছাড়াই সাইটটি রেন্ডার করব।
AFEX দ্বারা প্রিট্রিটেড ভুট্টার খড়ে স্থায়ী অলিগোস্যাকারাইডের জটিল বিশ্লেষণের জন্য নতুন ইমিউনোলজিক্যাল এবং মাস স্পেকট্রোমেট্রিক পদ্ধতি। লিগনোসেলুলোসিক বায়োমাস জীবাশ্ম জ্বালানির একটি টেকসই বিকল্প এবং খাদ্য, পশুখাদ্য, জ্বালানি ও রাসায়নিক পদার্থের মতো পণ্য উৎপাদনের জন্য জৈবপ্রযুক্তি বিকাশে এটি ব্যাপকভাবে ব্যবহৃত হয়। এই প্রযুক্তিগুলোর মূল চাবিকাঠি হলো উদ্ভিদের কোষ প্রাচীরে উপস্থিত জটিল কার্বোহাইড্রেটকে গ্লুকোজ, জাইলোজ এবং অ্যারাবিনোজের মতো সরল শর্করায় রূপান্তর করার জন্য ব্যয়-প্রতিযোগিতামূলক প্রক্রিয়ার বিকাশ। যেহেতু লিগনোসেলুলোসিক বায়োমাস খুব অনমনীয়, তাই কাঙ্ক্ষিত পণ্যটি পাওয়ার জন্য এটিকে অবশ্যই তাপ-রাসায়নিক ট্রিটমেন্ট (যেমন, অ্যামোনিয়া ফাইবার এক্সফোলিয়েশন (AFEX), লঘু অ্যাসিড (DA), আয়নিক তরল (IL)) এবং জৈবিক ট্রিটমেন্ট (যেমন, এনজাইমেটিক হাইড্রোলাইসিস এবং মাইক্রোবিয়াল ফারমেন্টেশন) একত্রে প্রয়োগ করতে হয়। তবে, যখন হাইড্রোলাইসিস প্রক্রিয়ায় বাণিজ্যিক ছত্রাক এনজাইম ব্যবহার করা হয়, তখন উৎপন্ন দ্রবণীয় শর্করার মাত্র ৭৫-৮৫% হয় মনোস্যাকারাইড, এবং অবশিষ্ট ১৫-২৫% হলো দ্রবণীয়, অদ্রবণীয় অলিগোস্যাকারাইড, যা অণুজীবের জন্য সবসময় সহজলভ্য হয় না। পূর্বে, আমরা কার্বন ও ডায়াটোমেশিয়াস আর্থ পৃথকীকরণ এবং সাইজ এক্সক্লুশন ক্রোমাটোগ্রাফির সমন্বয়ে দ্রবণীয় কঠিন অলিগোস্যাকারাইড সফলভাবে পৃথক ও বিশুদ্ধ করেছি এবং তাদের এনজাইম প্রতিরোধক বৈশিষ্ট্যও অনুসন্ধান করেছি। আমরা দেখেছি যে, কম ডিপি এবং নিরপেক্ষ অলিগোস্যাকারাইডের তুলনায় উচ্চ ডিপি (DP) যুক্ত মিথাইলেটেড ইউরোনিক অ্যাসিড প্রতিস্থাপনযুক্ত অলিগোস্যাকারাইডগুলো বাণিজ্যিক এনজাইম মিশ্রণ দিয়ে প্রক্রিয়াজাত করা বেশি কঠিন। এখানে আমরা বেশ কিছু অতিরিক্ত পদ্ধতির ব্যবহার তুলে ধরছি, যার মধ্যে রয়েছে উদ্ভিদ কোষ প্রাচীর এবং এনজাইমেটিক হাইড্রোলাইসেটে গ্লাইক্যান বন্ধনের বৈশিষ্ট্য নির্ণয়ের জন্য উদ্ভিদ বায়োমাস গ্লাইক্যানের প্রতি নির্দিষ্ট মনোক্লোনাল অ্যান্টিবডি (mAbs) ব্যবহার করে গ্লাইক্যান প্রোফাইলিং, ম্যাট্রিক্স-অ্যাসিস্টেড লেজার ডিসর্পশন আয়োনাইজেশন, টাইম-অফ-ফ্লাইট মাস স্পেকট্রোমেট্রি। MALDI-TOF-MS, নেগেটিভ আয়নের সেকেন্ডারি ডিকে-এর পর স্পেকট্রোস্কোপি, গ্যাস ক্রোমাটোগ্রাফি এবং মাস স্পেকট্রোমেট্রি (GC-MS) থেকে প্রাপ্ত গঠন-তথ্যপূর্ণ ডায়াগনস্টিক পিক ব্যবহার করে ডেরিভেটাইজেশন সহ এবং ডেরিভেটাইজেশন ছাড়া অলিগোস্যাকারাইড বন্ধনের বৈশিষ্ট্য নিরূপণ করে। অলিগোস্যাকারাইডের ছোট আকারের (DP ৪–২০) কারণে, এই অণুগুলো mAb বাইন্ডিং এবং বৈশিষ্ট্য নিরূপণের জন্য ব্যবহার করা কঠিন। এই সমস্যাটি কাটিয়ে উঠতে, আমরা একটি নতুন বায়োটিন কনজুগেশন-ভিত্তিক অলিগোস্যাকারাইড ইমোবিলাইজেশন পদ্ধতি প্রয়োগ করেছি যা সফলভাবে মাইক্রোপ্লেটের পৃষ্ঠে বেশিরভাগ কম DP-যুক্ত দ্রবণীয় অলিগোস্যাকারাইডকে লেবেল করেছে, যা পরবর্তীতে নির্দিষ্ট লাইগেশন বিশ্লেষণের জন্য একটি হাই-থ্রুপুট mAb সিস্টেমে ব্যবহৃত হয়েছিল। এই নতুন পদ্ধতিটি ভবিষ্যতে আরও উন্নত হাই-থ্রুপুট গ্লাইকোম অ্যাসে তৈরির পথ সুগম করবে, যা ডায়াগনস্টিক উদ্দেশ্যে বায়োমার্কারে উপস্থিত অলিগোস্যাকারাইডগুলোকে পৃথক করতে এবং তাদের বৈশিষ্ট্য নিরূপণ করতে ব্যবহার করা যেতে পারে।
লিগনোসেলুলোসিক বায়োমাস, যা কৃষি, বনজ, ঘাস এবং কাষ্ঠল পদার্থ দ্বারা গঠিত, খাদ্য, পশুখাদ্য, জ্বালানি এবং উচ্চমূল্যের পণ্য উৎপাদনের জন্য রাসায়নিক পূর্বসূরীসহ জৈব-ভিত্তিক পণ্য উৎপাদনের একটি সম্ভাব্য কাঁচামাল¹। উদ্ভিদ কোষ প্রাচীরে উপস্থিত কার্বোহাইড্রেট (যেমন সেলুলোজ এবং হেমিসেলুলোজ) রাসায়নিক প্রক্রিয়াকরণ এবং জৈব-রূপান্তরের (যেমন এনজাইমেটিক হাইড্রোলাইসিস এবং মাইক্রোবিয়াল ফারমেন্টেশন) মাধ্যমে মনোস্যাকারাইডে রূপান্তরিত হয়। সাধারণ প্রাক-প্রক্রিয়াগুলির মধ্যে রয়েছে অ্যামোনিয়া ফাইবার এক্সপ্যানশন (AFEX), ডাইলুট অ্যাসিড (DA), আয়নিক লিকুইড (IL), এবং স্টিম এক্সপ্লোশন (SE), যা রাসায়নিক এবং তাপের সংমিশ্রণ ব্যবহার করে উদ্ভিদ কোষ প্রাচীরের দৃঢ়তা খুলে লিগনোসেলুলোজ উৎপাদন হ্রাস করে³,⁴। বাণিজ্যিক সক্রিয় কার্বোহাইড্রেট-ধারণকারী এনজাইম (CAZymes) ব্যবহার করে উচ্চ কঠিন পদার্থ লোডে এনজাইমেটিক হাইড্রোলাইসিস এবং ট্রান্সজেনিক ইস্ট বা ব্যাকটেরিয়া ব্যবহার করে মাইক্রোবিয়াল ফারমেন্টেশন করা হয় জৈব-ভিত্তিক জ্বালানি এবং রাসায়নিক পদার্থ উৎপাদনের জন্য⁶।
বাণিজ্যিক এনজাইমগুলিতে থাকা CAZymes হলো এনজাইমের একটি জটিল মিশ্রণ যা সমন্বিতভাবে জটিল কার্বোহাইড্রেট-শর্করা বন্ধন ভেঙে মনোস্যাকারাইড তৈরি করে²⁻⁷। আমরা পূর্বে যেমন উল্লেখ করেছি, লিগনিনের অ্যারোমেটিক পলিমারের সাথে কার্বোহাইড্রেটের জটিল নেটওয়ার্ক সেগুলোকে অত্যন্ত অনমনীয় করে তোলে, যার ফলে শর্করার রূপান্তর অসম্পূর্ণ থেকে যায় এবং ১৫-২৫% অলিগোস্যাকারাইড জমা হয় যা প্রিট্রিটেড বায়োমাসের এনজাইমেটিক হাইড্রোলাইসিসের সময় উৎপাদিত হয় না। এটি বিভিন্ন বায়োমাস প্রিট্রিটমেন্ট পদ্ধতির একটি সাধারণ সমস্যা। এই প্রতিবন্ধকতার কিছু কারণের মধ্যে রয়েছে হাইড্রোলাইসিসের সময় এনজাইমের বাধা, অথবা উদ্ভিদ বায়োমাসে শর্করার বন্ধন ভাঙার জন্য প্রয়োজনীয় এনজাইমের অনুপস্থিতি বা স্বল্প পরিমাণ। শর্করার গঠন এবং কাঠামোগত বৈশিষ্ট্য, যেমন অলিগোস্যাকারাইডের শর্করার বন্ধন, সম্পর্কে জ্ঞান আমাদের হাইড্রোলাইসিসের সময় শর্করার রূপান্তর উন্নত করতে সাহায্য করবে, যা জৈবপ্রযুক্তিগত প্রক্রিয়াগুলোকে পেট্রোলিয়াম-জাত পণ্যের সাথে ব্যয়-প্রতিযোগিতামূলক করে তুলবে।
কার্বোহাইড্রেটের গঠন নির্ধারণ করা একটি কঠিন কাজ এবং এর জন্য লিকুইড ক্রোমাটোগ্রাফি (LC)¹¹,¹², নিউক্লিয়ার ম্যাগনেটিক রেজোন্যান্স স্পেকট্রোস্কোপি (NMR)¹³, ক্যাপিলারি ইলেক্ট্রোফোরেসিস (CE)¹⁴,¹⁵,¹⁶ এবং মাস স্পেকট্রোস্কোপি (MS)¹⁷,¹¹-এর মতো বিভিন্ন পদ্ধতির সমন্বয় প্রয়োজন। ম্যাট্রিক্স ব্যবহার করে লেজার ডিসর্পশন এবং আয়োনাইজেশন সহ টাইম-অফ-ফ্লাইট মাস স্পেকট্রোস্কোপি (MALDI-TOF-MS)-এর মতো MS পদ্ধতিগুলো কার্বোহাইড্রেটের গঠন শনাক্ত করার জন্য একটি বহুমুখী পদ্ধতি। সম্প্রতি, অলিগোস্যাকারাইড সংযুক্তি অবস্থান, অ্যানোমেরিক কনফিগারেশন, সিকোয়েন্স এবং ব্রাঞ্চিং পজিশন²⁰,²¹-এর সাথে সম্পর্কিত ফিঙ্গারপ্রিন্ট শনাক্ত করার জন্য সোডিয়াম আয়ন অ্যাডাক্টের কলিশন-ইনডিউসড ডিসোসিয়েশন (CID) ট্যান্ডেম MS সবচেয়ে ব্যাপকভাবে ব্যবহৃত হয়েছে।
কার্বোহাইড্রেট বন্ধনের গভীর শনাক্তকরণের জন্য গ্লাইক্যান বিশ্লেষণ একটি চমৎকার উপায়। এই পদ্ধতিতে জটিল কার্বোহাইড্রেট সংযোগ বোঝার জন্য উদ্ভিদ কোষ প্রাচীরের গ্লাইক্যানের প্রতি নির্দেশিত মনোক্লোনাল অ্যান্টিবডি (mAbs) প্রোব হিসাবে ব্যবহৃত হয়। বিশ্বব্যাপী ২৫০টিরও বেশি mAbs পাওয়া যায়, যা বিভিন্ন স্যাকারিড ব্যবহার করে নানা রৈখিক এবং শাখাযুক্ত অলিগোস্যাকারাইডের বিরুদ্ধে ডিজাইন করা হয়েছে। উদ্ভিদ কোষের ধরন, অঙ্গ, বয়স, বিকাশের পর্যায় এবং বৃদ্ধির পরিবেশের উপর নির্ভর করে উল্লেখযোগ্য পার্থক্য থাকায়, উদ্ভিদ কোষ প্রাচীরের গঠন, উপাদান এবং পরিবর্তনসমূহ চিহ্নিত করার জন্য বেশ কয়েকটি mAbs ব্যাপকভাবে ব্যবহৃত হয়েছে। অতি সম্প্রতি, এই পদ্ধতিটি উদ্ভিদ এবং প্রাণী সিস্টেমে ভেসিকল পপুলেশন এবং সাবসেলুলার মার্কার, বিকাশের পর্যায় বা পরিবেশগত উদ্দীপনা দ্বারা নির্ধারিত গ্লাইক্যান পরিবহনে তাদের নিজ নিজ ভূমিকা বোঝার জন্য এবং এনজাইমেটিক কার্যকলাপ নির্ধারণের জন্য ব্যবহৃত হচ্ছে। গ্লাইক্যান এবং জাইলানের যে বিভিন্ন গঠনগুলি শনাক্ত করা হয়েছে তার মধ্যে কয়েকটি হল পেকটিন (P), জাইলান (X), ম্যানান (M), জাইলোগ্লুকান (XylG), মিশ্র বন্ধন গ্লুকান (MLG), অ্যারাবিনোজাইলান (ArbX), গ্যালাক্টোম্যানান (GalG), গ্লুকুরোনিক অ্যাসিড-অ্যারাবিনোজাইলান (GArbX) এবং অ্যারাবিনো-গ্যালাক্টান (ArbG)29।
তবে, এই সমস্ত গবেষণা প্রচেষ্টা সত্ত্বেও, উচ্চ কঠিন পদার্থ লোড (HSL) হাইড্রোলাইসিসের সময় অলিগোস্যাকারাইড সঞ্চয়ের প্রকৃতির উপর মাত্র কয়েকটি গবেষণা করা হয়েছে, যার মধ্যে রয়েছে অলিগোস্যাকারাইড নিঃসরণ, হাইড্রোলাইসিসের সময় অলিগোমেরিক চেইনের দৈর্ঘ্যের পরিবর্তন, বিভিন্ন কম ডিপি পলিমার এবং তাদের বন্টন বক্ররেখা 30,31,32। এদিকে, যদিও গ্লাইক্যান কাঠামোর ব্যাপক বিশ্লেষণের জন্য গ্লাইক্যান বিশ্লেষণ একটি কার্যকর হাতিয়ার হিসেবে প্রমাণিত হয়েছে, অ্যান্টিবডি পদ্ধতি ব্যবহার করে জলে দ্রবণীয় কম ডিপি অলিগোস্যাকারাইড মূল্যায়ন করা কঠিন। 5-10 kDa-এর কম আণবিক ওজনের ছোট ডিপি অলিগোস্যাকারাইড ELISA প্লেটে আবদ্ধ হয় না 33, 34 এবং অ্যান্টিবডি যোগ করার আগেই ধুয়ে যায়।
এখানে, প্রথমবারের মতো, আমরা মনোক্লোনাল অ্যান্টিবডি ব্যবহার করে অ্যাভিডিন-কোটেড প্লেটে একটি ELISA অ্যাসে প্রদর্শন করছি, যা দ্রবণীয় দুর্ভেদ্য অলিগোস্যাকারাইডের জন্য এক-ধাপ বায়োটিনাইলেশন পদ্ধতির সাথে গ্লাইকোম বিশ্লেষণকে একত্রিত করে। হাইড্রোলাইজড চিনির মিশ্রণের ট্রাইমিথাইলসাইলিল (TMS) ডেরিভেটাইজেশন ব্যবহার করে পরিপূরক অলিগোস্যাকারাইড সংযোগের MALDI-TOF-MS এবং GC-MS ভিত্তিক বিশ্লেষণের মাধ্যমে আমাদের গ্লাইকোম বিশ্লেষণ পদ্ধতিটি যাচাই করা হয়েছে। এই উদ্ভাবনী পদ্ধতিটি ভবিষ্যতে একটি হাই-থ্রুপুট পদ্ধতি হিসাবে বিকশিত হতে পারে এবং বায়োমেডিকেল গবেষণায় এর ব্যাপক প্রয়োগ খুঁজে পাওয়া যেতে পারে।
এনজাইম এবং অ্যান্টিবডির পোস্ট-ট্রান্সলেশনাল মডিফিকেশন, যেমন গ্লাইকোসিলেশন, তাদের জৈবিক কার্যকলাপকে প্রভাবিত করে। উদাহরণস্বরূপ, সিরাম প্রোটিনের গ্লাইকোসিলেশনের পরিবর্তন প্রদাহজনিত আর্থ্রাইটিসে একটি গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করে, এবং গ্লাইকোসিলেশনের পরিবর্তনগুলি ডায়াগনস্টিক মার্কার হিসাবে ব্যবহৃত হয়। সাহিত্যে বিভিন্ন গ্লাইক্যানের উপস্থিতি বিভিন্ন রোগে সহজেই দেখা যায় বলে জানা গেছে, যার মধ্যে রয়েছে পরিপাকতন্ত্র এবং যকৃতের দীর্ঘস্থায়ী প্রদাহজনিত রোগ, ভাইরাল সংক্রমণ, ডিম্বাশয়, স্তন এবং প্রোস্টেট ক্যান্সার। অ্যান্টিবডি-ভিত্তিক গ্লাইক্যান ELISA পদ্ধতি ব্যবহার করে গ্লাইক্যানের গঠন বোঝা জটিল MS পদ্ধতি ব্যবহার না করেই রোগ নির্ণয়ে অতিরিক্ত আস্থা প্রদান করবে।
আমাদের পূর্ববর্তী গবেষণায় দেখা গেছে যে প্রিট্রিটমেন্ট এবং এনজাইমেটিক হাইড্রোলাইসিসের পরেও অনমনীয় অলিগোস্যাকারাইডগুলি অপরিবর্তিত থেকে যায় (চিত্র ১)। আমাদের পূর্বে প্রকাশিত গবেষণাপত্রে, আমরা AFEX-প্রিট্রিটেড কর্ন স্টোভার হাইড্রোলাইজেট (ACSH)8 থেকে অলিগোস্যাকারাইড পৃথক করার জন্য একটি অ্যাক্টিভেটেড চারকোল সলিড-ফেজ এক্সট্র্যাকশন পদ্ধতি তৈরি করেছি। প্রাথমিক নিষ্কাশন এবং পৃথকীকরণের পরে, অলিগোস্যাকারাইডগুলিকে সাইজ এক্সক্লুশন ক্রোমাটোগ্রাফি (SEC) দ্বারা আরও ভগ্নাংশে বিভক্ত করা হয়েছিল এবং আণবিক ওজন অনুসারে সংগ্রহ করা হয়েছিল। বিভিন্ন প্রিট্রিটমেন্ট থেকে নির্গত সুগার মনোমার এবং অলিগোমারগুলি সুগার কম্পোজিশন অ্যানালাইসিস দ্বারা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। বিভিন্ন প্রিট্রিটমেন্ট পদ্ধতি দ্বারা প্রাপ্ত সুগার অলিগোমারের পরিমাণ তুলনা করার সময়, বায়োমাসকে মনোস্যাকারাইডে রূপান্তরের ক্ষেত্রে অনমনীয় অলিগোস্যাকারাইডের উপস্থিতি একটি সাধারণ সমস্যা এবং এটি চিনির ফলন কমপক্ষে ১০-১৫% এবং এমনকি ১৮% পর্যন্ত হ্রাস করতে পারে। এই পদ্ধতিটি অলিগোস্যাকারাইড ভগ্নাংশগুলির পরবর্তী বৃহৎ-মাপের উৎপাদনের জন্য ব্যবহৃত হয়। এই গবেষণায় অলিগোস্যাকারাইডের বৈশিষ্ট্য নিরূপণের জন্য প্রাপ্ত ACH এবং এর পরবর্তী বিভিন্ন আণবিক ওজনের ভগ্নাংশগুলিকে পরীক্ষামূলক উপাদান হিসাবে ব্যবহার করা হয়েছিল।
প্রিট্রিটমেন্ট এবং এনজাইমেটিক হাইড্রোলাইসিসের পরেও, স্থায়ী অলিগোস্যাকারাইডগুলি হাইড্রোলাইজড হয়নি। এখানে (A) একটি অলিগোস্যাকারাইড পৃথকীকরণ পদ্ধতি দেখানো হয়েছে, যেখানে অ্যাক্টিভেটেড কার্বন এবং ডায়াটোমেশিয়াস আর্থের একটি প্যাকড বেড ব্যবহার করে AFEX-প্রিট্রিটেড কর্ন স্টোভার হাইড্রোলাইসেট (ACSH) থেকে অলিগোস্যাকারাইডগুলিকে পৃথক করা হয়; (B) অলিগোস্যাকারাইড পৃথকীকরণের পদ্ধতি। অলিগোস্যাকারাইডগুলিকে পরবর্তীতে সাইজ এক্সক্লুশন ক্রোমাটোগ্রাফি (SEC) দ্বারা পৃথক করা হয়েছিল; (C) বিভিন্ন প্রিট্রিটমেন্ট (লঘু অ্যাসিড: DA, আয়নিক তরল: IL এবং AFEX) থেকে নির্গত স্যাকারিড মনোমার এবং অলিগোমার। এনজাইমেটিক হাইড্রোলাইসিসের শর্তাবলী: ২৫% (w/w) উচ্চ সলিড লোডিং (প্রায় ৮% গ্লুকান লোডিং), ৯৬ ঘন্টা হাইড্রোলাইসিস, ২০ মিলিগ্রাম/গ্রাম বাণিজ্যিক এনজাইম লোডিং (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 অনুপাতে) এবং (D) AFEX প্রিট্রিটেড কর্ন স্টোভার (ACS) থেকে নির্গত গ্লুকোজ, জাইলোজ এবং অ্যারাবিনোজের সুগার মনোমার এবং অলিগোমার।
কঠিন জৈববস্তু অবশেষ থেকে নিষ্কাশিত নির্যাসে গ্লাইক্যানের ব্যাপক গাঠনিক বিশ্লেষণের জন্য গ্লাইক্যান বিশ্লেষণ একটি কার্যকর পদ্ধতি হিসেবে প্রমাণিত হয়েছে। তবে, এই প্রচলিত পদ্ধতিতে জলে দ্রবণীয় স্যাকারিডগুলোর প্রতিনিধিত্ব কম থাকে⁴¹ কারণ কম আণবিক ওজনের অলিগোস্যাকারাইডগুলোকে ELISA প্লেটে স্থির করা কঠিন এবং অ্যান্টিবডি যোগ করার আগেই তা ধুয়ে যায়। তাই, অ্যান্টিবডি বন্ধন এবং বৈশিষ্ট্য নিরূপণের জন্য, অ্যাভিডিন-কোটেড ELISA প্লেটে দ্রবণীয়, অনমনীয় অলিগোস্যাকারাইডগুলোকে প্রলেপ দিতে একটি এক-ধাপ বায়োটিনাইলেশন পদ্ধতি ব্যবহার করা হয়েছিল। এই পদ্ধতিটি আমাদের পূর্বে উৎপাদিত ACSH এবং এর আণবিক ওজন (বা পলিমারাইজেশনের মাত্রা, DP) ভিত্তিক একটি ভগ্নাংশ ব্যবহার করে পরীক্ষা করা হয়েছিল। কার্বোহাইড্রেটের রিডিউসিং প্রান্তে বায়োটিন-এলসি-হাইড্রাজাইড যোগ করে অলিগোস্যাকারাইডের বন্ধন আসক্তি বাড়ানোর জন্য এক-ধাপ বায়োটিনাইলেশন ব্যবহার করা হয়েছিল (চিত্র ২)। দ্রবণে, রিডিউসিং প্রান্তের হেমিঅ্যাসিটাল গ্রুপটি বায়োটিন-এলসি-হাইড্রাজাইডের হাইড্রাজাইড গ্রুপের সাথে বিক্রিয়া করে একটি হাইড্রাজোন বন্ধন তৈরি করে। বিজারক পদার্থ NaCNBH3-এর উপস্থিতিতে, হাইড্রাজন বন্ধনী বিজারিত হয়ে একটি স্থিতিশীল বায়োটিনযুক্ত অন্তিম উৎপাদে পরিণত হয়। শর্করার বিজারক প্রান্তের এই পরিবর্তনের ফলে, কম ডিপি (DP) যুক্ত অলিগোস্যাকারাইডকে এলিসা (ELISA) প্লেটে আবদ্ধ করা সম্ভব হয়েছে, এবং আমাদের গবেষণায় এটি গ্লাইক্যান-লক্ষ্যযুক্ত মনোক্লোনাল অ্যান্টিবডি (mAbs) ব্যবহার করে অ্যাভিডিন-প্রলিপ্ত প্লেটে করা হয়েছে।
বায়োটিনাইলেটেড অলিগোস্যাকারাইডের জন্য ELISA-ভিত্তিক মনোক্লোনাল অ্যান্টিবডির স্ক্রিনিং। এখানে (A)-তে অলিগোস্যাকারাইডের সম্মিলিত বায়োটিনাইলেশন এবং পরবর্তীতে নিউট্রাঅ্যাভিডিন প্রলিপ্ত প্লেটে গ্লাইক্যান-টার্গেটেড mAbs দ্বারা ELISA স্ক্রিনিং দেখানো হয়েছে এবং (B)-তে বিক্রিয়াজাত পদার্থের বায়োটিনাইলেশনের জন্য একটি এক-ধাপ পদ্ধতি দেখানো হয়েছে।
অলিগোস্যাকারাইড-সংযুক্ত অ্যান্টিবডিসহ অ্যাভিডিন-প্রলিপ্ত প্লেটগুলিতে প্রাইমারি ও সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি যোগ করা হয় এবং একটি আলোক ও সময়-সংবেদনশীল মাধ্যমে ধৌত করা হয়। অ্যান্টিবডির বন্ধন সম্পূর্ণ হলে, প্লেটটি ইনকিউবেট করার জন্য TMB সাবস্ট্রেট যোগ করা হয়। সবশেষে সালফিউরিক অ্যাসিড দিয়ে বিক্রিয়াটি বন্ধ করা হয়। অ্যান্টিবডি-নির্দিষ্ট ক্রস-লিঙ্কিং শনাক্ত করার জন্য প্রতিটি অ্যান্টিবডির বন্ধন শক্তি নির্ধারণ করতে ইনকিউবেট করা প্লেটগুলি একটি ELISA রিডার ব্যবহার করে বিশ্লেষণ করা হয়। এই পরীক্ষার বিস্তারিত বিবরণ ও প্যারামিটারের জন্য, সংশ্লিষ্ট অনুচ্ছেদ “উপকরণ ও পদ্ধতি” দেখুন।
আমরা ACSH-এ উপস্থিত দ্রবণীয় অলিগোস্যাকারাইডগুলির পাশাপাশি লিগনোসেলুলোসিক হাইড্রোলাইসেট থেকে বিচ্ছিন্ন অপরিশোধিত এবং পরিশোধিত অলিগোস্যাকারাইড ভগ্নাংশগুলির বৈশিষ্ট্য নির্ধারণের মাধ্যমে নির্দিষ্ট প্রয়োগের জন্য এই নতুন বিকশিত পদ্ধতির উপযোগিতা প্রদর্শন করি। চিত্র ৩-এ যেমন দেখানো হয়েছে, বায়োঅ্যাসাইলেটেড গ্লাইকোম অ্যাসে পদ্ধতি ব্যবহার করে ACSH-এ শনাক্ত করা সবচেয়ে সাধারণ এপিটোপ-প্রতিস্থাপিত জাইলানগুলি সাধারণত ইউরোনিক (U) বা মিথাইলইউরোনিক (MeU) এবং পেক্টিক অ্যারাবিনোগ্যালাক্টান। এদের বেশিরভাগই নন-হাইড্রোলাইজড সলিড (UHS)⁴³-এর গ্লাইক্যান বিশ্লেষণের উপর আমাদের পূর্ববর্তী গবেষণায়ও পাওয়া গিয়েছিল।
কোষ প্রাচীরের গ্লাইক্যানের প্রতি নির্দেশিত একটি মনোক্লোনাল অ্যান্টিবডি ব্যবহার করে দুর্ভেদ্য অলিগোস্যাকারাইড এপিটোপ সনাক্তকরণ। “নিরপেক্ষ” অংশটি হলো ACN অংশ এবং “অম্লীয়” অংশটি হলো FA অংশ। হিটম্যাপে উজ্জ্বলতর লাল রঙ উচ্চতর এপিটোপের পরিমাণ নির্দেশ করে এবং উজ্জ্বলতর নীল রঙ একটি ফাঁকা পটভূমি নির্দেশ করে। স্কেলের রঙের মান N=2 ফর্মুলেশনের কাঁচা OD মানের উপর ভিত্তি করে নির্ধারিত। অ্যান্টিবডিগুলো দ্বারা স্বীকৃত প্রধান এপিটোপগুলো ডানদিকে দেখানো হয়েছে।
পরীক্ষিত বাণিজ্যিক এনজাইম মিশ্রণে থাকা সবচেয়ে সাধারণ সেলুলেজ এবং হেমিসেলুলেজগুলো দ্বারা এই নন-সেলুলোজ কাঠামোসমূহকে ভাঙা সম্ভব হয়নি, যদিও এই মিশ্রণে সর্বাধিক ব্যবহৃত বাণিজ্যিক এনজাইমগুলো অন্তর্ভুক্ত রয়েছে। তাই, এদের হাইড্রোলাইসিসের জন্য নতুন সহায়ক এনজাইমের প্রয়োজন। প্রয়োজনীয় নন-সেলুলোজ সহায়ক এনজাইমগুলো ছাড়া, এই নন-সেলুলোজ বন্ধনগুলো মনোস্যাকারাইডে সম্পূর্ণ রূপান্তরে বাধা দেয়, এমনকি যদি বাণিজ্যিক এনজাইম মিশ্রণ ব্যবহার করে এদের মূল শর্করা পলিমারগুলোকে ব্যাপকভাবে হাইড্রোলাইজ করে ছোট ছোট খণ্ডে পরিণত করা হয় এবং দ্রবীভূত করা হয়।
সিগন্যাল ডিস্ট্রিবিউশন এবং এর বাইন্ডিং স্ট্রেংথের উপর আরও গবেষণায় দেখা গেছে যে, উচ্চ ডিপি সুগার ফ্র্যাকশন (এ, বি, সি, ডিপি ২০+ পর্যন্ত)-এর তুলনায় নিম্ন ডিপি ফ্র্যাকশন (ডি, ই, এফ, ডিপি ডাইমারে)-এ বাইন্ডিং এপিটোপ কম ছিল (চিত্র ১)। নন-সেলুলোজ এপিটোপে নিউট্রাল ফ্র্যাগমেন্টের চেয়ে অ্যাসিড ফ্র্যাগমেন্ট বেশি সাধারণ। এই ঘটনাগুলো আমাদের পূর্ববর্তী গবেষণায় পর্যবেক্ষণ করা প্যাটার্নের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ, যেখানে উচ্চ ডিপি এবং অ্যাসিড ময়েটিগুলো এনজাইমেটিক হাইড্রোলাইসিসের বিরুদ্ধে বেশি প্রতিরোধী ছিল। অতএব, নন-সেলুলোজ গ্লাইক্যান এপিটোপ এবং ইউ ও এমইইউ প্রতিস্থাপনের উপস্থিতি অলিগোস্যাকারাইডের স্থিতিশীলতায় ব্যাপকভাবে অবদান রাখতে পারে। এটি উল্লেখ্য যে, নিম্ন ডিপি অলিগোস্যাকারাইডের জন্য বাইন্ডিং এবং ডিটেকশন দক্ষতা সমস্যাযুক্ত হতে পারে, বিশেষ করে যদি এপিটোপটি একটি ডাইমেরিক বা ট্রাইমেরিক অলিগোস্যাকারাইড হয়। এটি বিভিন্ন দৈর্ঘ্যের বাণিজ্যিক অলিগোস্যাকারাইড ব্যবহার করে পরীক্ষা করা যেতে পারে, যার প্রতিটিতে একটি নির্দিষ্ট এমএবি-এর সাথে আবদ্ধ হওয়া কেবল একটি এপিটোপ থাকে।
এইভাবে, গঠন-নির্দিষ্ট অ্যান্টিবডির ব্যবহার কিছু নির্দিষ্ট ধরণের অনমনীয় বন্ধন প্রকাশ করেছে। ব্যবহৃত অ্যান্টিবডির ধরণ, উপযুক্ত লাইগেশন প্যাটার্ন এবং এর দ্বারা উৎপাদিত সংকেতের শক্তির (সর্বাধিক এবং সর্বনিম্ন) উপর নির্ভর করে, নতুন এনজাইম শনাক্ত করা যেতে পারে এবং আরও সম্পূর্ণ গ্লাইকোকনভার্সনের জন্য এনজাইম মিশ্রণে আধা-পরিমাণগতভাবে যোগ করা যেতে পারে। ACSH অলিগোস্যাকারাইডের বিশ্লেষণকে উদাহরণ হিসেবে নিলে, আমরা প্রতিটি বায়োমাস উপাদানের জন্য গ্লাইক্যান বন্ধনের একটি ডেটাবেস তৈরি করতে পারি। এখানে উল্লেখ্য যে, অ্যান্টিবডিগুলির বিভিন্ন অ্যাফিনিটি বিবেচনায় নেওয়া উচিত, এবং যদি তাদের অ্যাফিনিটি অজানা থাকে, তবে বিভিন্ন অ্যান্টিবডির সংকেত তুলনা করার সময় এটি কিছু অসুবিধা তৈরি করবে। এছাড়াও, একই অ্যান্টিবডির জন্য নমুনাগুলির মধ্যে গ্লাইক্যান বন্ধনের তুলনা সবচেয়ে ভালোভাবে কাজ করতে পারে। এই অনমনীয় বন্ধনগুলিকে তখন CAZyme ডেটাবেসের সাথে সংযুক্ত করা যেতে পারে, যেখান থেকে আমরা এনজাইম শনাক্ত করতে, সম্ভাব্য এনজাইম নির্বাচন করতে এবং বন্ধন-ভাঙ্গার এনজাইমের জন্য পরীক্ষা করতে পারি, অথবা বায়োরিফাইনারিতে ব্যবহারের জন্য এই এনজাইমগুলি প্রকাশের জন্য মাইক্রোবিয়াল সিস্টেম তৈরি করতে পারি।
লিগনোসেলুলোসিক হাইড্রোলাইসেটে উপস্থিত কম আণবিক ওজনের অলিগোস্যাকারাইডের বৈশিষ্ট্য নির্ণয়ের জন্য ইমিউনোলজিক্যাল পদ্ধতিগুলো বিকল্প পদ্ধতির পরিপূরক হিসেবে কীভাবে কাজ করে তা মূল্যায়ন করতে, আমরা একই প্যানেলের (চিত্র ৫) অলিগোস্যাকারাইড অংশে MALDI (চিত্র ৪, S1-S8) এবং GC-MS ভিত্তিক TMS-উদ্ভূত স্যাকারাইডের বিশ্লেষণ সম্পন্ন করেছি। অলিগোস্যাকারাইড অণুর ভর বন্টন উদ্দিষ্ট কাঠামোর সাথে মেলে কিনা তা তুলনা করার জন্য MALDI ব্যবহার করা হয়। চিত্র ৪-এ নিরপেক্ষ উপাদান ACN-A এবং ACN-B-এর MS দেখানো হয়েছে। ACN-A বিশ্লেষণে DP ৪-৮ (চিত্র ৪) থেকে DP ২২ (চিত্র S1) পর্যন্ত পেন্টোজ শর্করার একটি পরিসর নিশ্চিত করা হয়েছে, যার ওজন MeU-জাইলান অলিগোস্যাকারাইডের সাথে মিলে যায়। ACN-B বিশ্লেষণে DP ৮-১৫ সহ পেন্টোজ এবং গ্লুকোক্সাইলান সিরিজ নিশ্চিত করা হয়েছে। চিত্র S3-এর মতো পরিপূরক উপাদানে, FA-C অ্যাসিডিক ময়েটির ভর বন্টন মানচিত্রগুলো ৮-১৫ DP বিশিষ্ট (Me)U প্রতিস্থাপিত পেন্টোজ শর্করার একটি পরিসর দেখায়, যা ELISA-ভিত্তিক mAb স্ক্রিনিং-এ প্রাপ্ত প্রতিস্থাপিত জাইলানগুলোর সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ। এপিটোপগুলোও সামঞ্জস্যপূর্ণ।
ACS-এ উপস্থিত দ্রবণীয় নন-কমপ্লায়েন্ট অলিগোস্যাকারাইডের MALDI-MS স্পেকট্রাম। এখানে, (A) ACN-A নিম্ন ওজন পরিসরের ফ্র্যাকশন, যাতে মিথাইলেটেড ইউরোনিক অ্যাসিড (DP 4-8) প্রতিস্থাপিত গ্লুকুরোক্সিলান অলিগোস্যাকারাইড রয়েছে এবং (B) ACN-B জাইলান এবং মিথাইলেটেড ইউরোনিক অ্যাসিড অলিগোস্যাকারাইড, যা গ্লুকুরোক্সিলান (DP 8-15) দ্বারা প্রতিস্থাপিত।
দুর্ভেদ্য অলিগোস্যাকারাইডের গ্লাইক্যান অবশেষের গঠন বিশ্লেষণ। এখানে (A) GC-MS বিশ্লেষণ ব্যবহার করে প্রাপ্ত বিভিন্ন অলিগোস্যাকারাইড ভগ্নাংশের TMS স্যাকারাইড গঠন। (B) অলিগোস্যাকারাইডে উপস্থিত বিভিন্ন TMS-উদ্ভূত শর্করার গঠন। ACN – অ্যাসিটোনাইট্রাইল ভগ্নাংশ যাতে নিরপেক্ষ অলিগোস্যাকারাইড থাকে এবং FA – ফেরুলিক অ্যাসিড ভগ্নাংশ যাতে অম্লীয় অলিগোস্যাকারাইড থাকে।
অলিগোস্যাকারাইড ভগ্নাংশের LC-MS বিশ্লেষণ থেকে আরেকটি আকর্ষণীয় উপসংহার টানা হয়েছে, যা চিত্র S9-এ দেখানো হয়েছে (পদ্ধতিসমূহ ইলেকট্রনিক সম্পূরক উপাদানে দেখা যাবে)। ACN-B ভগ্নাংশের লাইগেশনের সময় হেক্সোজ এবং -OAc গ্রুপের খণ্ডাংশ বারবার পরিলক্ষিত হয়েছে। এই আবিষ্কারটি কেবল গ্লাইকোম এবং MALDI-TOF বিশ্লেষণে পরিলক্ষিত খণ্ডায়নকেই নিশ্চিত করে না, বরং পূর্ব-প্রক্রিয়াজাত লিগনোসেলুলোসিক বায়োমাসে সম্ভাব্য কার্বোহাইড্রেট ডেরিভেটিভ সম্পর্কেও নতুন তথ্য প্রদান করে।
আমরা টিএমএস গ্লাইক্যান ডেরিভেটাইজেশন ব্যবহার করে অলিগোস্যাকারাইড ভগ্নাংশগুলির গ্লাইক্যান গঠন বিশ্লেষণও করেছি। জিসি-এমএস ব্যবহার করে, আমরা অলিগোস্যাকারাইড ভগ্নাংশে নিউরাল (নন-ডেরিভেটিভ) এবং অ্যাসিডিক শর্করা (GluA এবং GalA)-এর গঠন নির্ধারণ করেছি (চিত্র ৫)। গ্লুকুরোনিক অ্যাসিড অ্যাসিডিক উপাদান C এবং D-তে পাওয়া যায়, যেখানে গ্যালাকচুরোনিক অ্যাসিড অ্যাসিডিক উপাদান A এবং B-তে পাওয়া যায়, উভয়ই অ্যাসিডিক শর্করার উচ্চ ডিপি উপাদান। এই ফলাফলগুলি কেবল আমাদের এলিসা এবং মালডি ডেটাকেই নিশ্চিত করে না, বরং অলিগোস্যাকারাইড সঞ্চয়ন সম্পর্কিত আমাদের পূর্ববর্তী গবেষণার সাথেও সামঞ্জস্যপূর্ণ। অতএব, আমরা বিশ্বাস করি যে অলিগোস্যাকারাইডের বায়োটিনাইলেশন এবং পরবর্তী এলিসা স্ক্রিনিং ব্যবহার করে আধুনিক ইমিউনোলজিক্যাল পদ্ধতিগুলি বিভিন্ন জৈবিক নমুনায় দ্রবণীয় দুর্লভ অলিগোস্যাকারাইড সনাক্ত করার জন্য যথেষ্ট।
যেহেতু ELISA-ভিত্তিক mAb স্ক্রিনিং পদ্ধতি বিভিন্ন পদ্ধতির মাধ্যমে যাচাই করা হয়েছে, তাই আমরা এই নতুন পরিমাণগত পদ্ধতির সম্ভাবনা আরও অন্বেষণ করতে চেয়েছিলাম। দুটি বাণিজ্যিক অলিগোস্যাকারাইড, জাইলোহেক্সাস্যাকারাইড অলিগোস্যাকারাইড (XHE) এবং 23-α-L-অ্যারাবিনোফিউরানোসিল-জাইলোট্রায়োজ (A2XX), কেনা হয়েছিল এবং কোষ প্রাচীরের গ্লাইক্যানকে লক্ষ্য করে একটি নতুন mAb পদ্ধতি ব্যবহার করে পরীক্ষা করা হয়েছিল। চিত্র ৬ বায়োটিনিলেটেড বাইন্ডিং সিগন্যাল এবং অলিগোস্যাকারাইডের ঘনত্বের লগারিদমিক ঘনত্বের মধ্যে একটি রৈখিক সম্পর্ক দেখায়, যা একটি সম্ভাব্য ল্যাংমিউর অ্যাডসর্পশন মডেলের ইঙ্গিত দেয়। mAb-গুলোর মধ্যে, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148, এবং CCRC-M151, XHE-এর সাথে এবং CCRC-M108, CCRC-M109, এবং LM11, ১ ন্যানোমিটার থেকে ১০০ ন্যানো পর্যন্ত পরিসরে A2XX-এর সাথে সম্পর্কযুক্ত ছিল। পরীক্ষার সময় অ্যান্টিবডির সীমিত প্রাপ্যতার কারণে, প্রতিটি অলিগোস্যাকারাইড ঘনত্ব দিয়ে সীমিত সংখ্যক পরীক্ষা করা হয়েছিল। এখানে উল্লেখ্য যে, কিছু অ্যান্টিবডি একই অলিগোস্যাকারাইডকে সাবস্ট্রেট হিসেবে ব্যবহার করে খুব ভিন্নভাবে প্রতিক্রিয়া করে, সম্ভবত কারণ তারা সামান্য ভিন্ন এপিটোপের সাথে আবদ্ধ হয় এবং তাদের বাইন্ডিং অ্যাফিনিটি খুব ভিন্ন হতে পারে। যখন নতুন mAb পদ্ধতিটি বাস্তব নমুনার উপর প্রয়োগ করা হবে, তখন সঠিক এপিটোপ শনাক্তকরণের প্রক্রিয়া এবং এর প্রভাব আরও অনেক বেশি জটিল হয়ে উঠবে।
বিভিন্ন গ্লাইক্যান-টার্গেটিং মনোক্লোনাল অ্যান্টিবডি (mAbs)-এর সনাক্তকরণ পরিসীমা নির্ধারণ করতে দুটি বাণিজ্যিক অলিগোস্যাকারাইড ব্যবহার করা হয়েছিল। এখানে, অলিগোস্যাকারাইডের ঘনত্বের লগারিদমিক ঘনত্বের সাথে রৈখিক সম্পর্ক (A) mAb-এর সাথে XHE এবং (B) mAb-এর সাথে A2XX-এর জন্য ল্যাংমিউর শোষণ প্যাটার্ন নির্দেশ করে। সংশ্লিষ্ট এপিটোপগুলো এই পরীক্ষায় সাবস্ট্রেট হিসেবে ব্যবহৃত বাণিজ্যিক অলিগোস্যাকারাইডগুলোর গঠন নির্দেশ করে।
উদ্ভিদ বায়োমাস গঠনকারী অধিকাংশ প্রধান কোষ প্রাচীর গ্লাইক্যানের গভীর বৈশিষ্ট্য নিরূপণের জন্য গ্লাইক্যান-টার্গেটেড মনোক্লোনাল অ্যান্টিবডির (গ্লাইকোকোমিক বিশ্লেষণ বা ELISA-ভিত্তিক mAb স্ক্রিনিং) ব্যবহার একটি শক্তিশালী উপায়। তবে, চিরায়ত গ্লাইক্যান বিশ্লেষণ কেবল বৃহত্তর কোষ প্রাচীর গ্লাইক্যানগুলোর বৈশিষ্ট্য নিরূপণ করে, কারণ বেশিরভাগ অলিগোস্যাকারাইড ELISA প্লেটে দক্ষতার সাথে স্থির করা যায় না। এই গবেষণায়, AFEX-প্রিট্রিটেড ভুট্টার খড়কে উচ্চ কঠিন পদার্থের উপস্থিতিতে এনজাইমের সাহায্যে হাইড্রোলাইজ করা হয়েছিল। হাইড্রোলাইজেটে থাকা দুর্লভ কোষ প্রাচীর কার্বোহাইড্রেটের গঠন নির্ধারণের জন্য শর্করা বিশ্লেষণ ব্যবহার করা হয়েছিল। তবে, হাইড্রোলাইজেটে থাকা ক্ষুদ্রতর অলিগোস্যাকারাইডের mAb বিশ্লেষণকে অবমূল্যায়ন করা হয়, এবং অলিগোস্যাকারাইডগুলোকে কার্যকরভাবে ELISA প্লেটে স্থির করার জন্য অতিরিক্ত পদ্ধতির প্রয়োজন।
আমরা এখানে অলিগোস্যাকারাইড বায়োটিনাইলেশন এবং তারপরে নিউট্রাভিডিন™ প্রলিপ্ত প্লেটে এলিসা স্ক্রিনিং-এর সমন্বয়ে মনোক্লোনাল অ্যান্টিবডি (mAb) স্ক্রিনিং-এর জন্য একটি অভিনব এবং কার্যকর অলিগোস্যাকারাইড ইমোবিলাইজেশন পদ্ধতির কথা জানাচ্ছি। ইমোবিলাইজড বায়োটিনাইলেটেড অলিগোস্যাকারাইডগুলো অ্যান্টিবডির প্রতি যথেষ্ট আকর্ষণ দেখিয়েছে, যা সহজে শনাক্ত করা যায় না এমন অলিগোস্যাকারাইডগুলোর দ্রুত এবং কার্যকর সনাক্তকরণে সক্ষম করে। ভর বর্ণালিবীক্ষণ (mass spectrometry) ব্যবহার করে এই কঠিন অলিগোস্যাকারাইডগুলোর গঠন বিশ্লেষণ ইমিউনোস্ক্রিনিং-এর এই নতুন পদ্ধতির ফলাফলকে নিশ্চিত করেছে। সুতরাং, এই গবেষণাগুলো প্রমাণ করে যে অলিগোস্যাকারাইড বায়োটিনাইলেশন এবং গ্লাইক্যান-টার্গেটেড মনোক্লোনাল অ্যান্টিবডি দিয়ে এলিসা স্ক্রিনিং-এর সমন্বয় অলিগোস্যাকারাইডের ক্রসলিঙ্ক সনাক্ত করতে ব্যবহার করা যেতে পারে এবং অলিগোস্যাকারাইডের গঠন বৈশিষ্ট্য নিরূপণকারী অন্যান্য জৈব-রাসায়নিক গবেষণায় এটি ব্যাপকভাবে প্রয়োগ করা সম্ভব।
এই বায়োটিন-ভিত্তিক গ্লাইক্যান প্রোফাইলিং পদ্ধতিটিই প্রথম প্রতিবেদন যা উদ্ভিদ বায়োমাসে থাকা দ্রবণীয় অলিগোস্যাকারাইডের দুর্ভেদ্য কার্বোহাইড্রেট বন্ধনগুলো পরীক্ষা করতে সক্ষম। এটি বুঝতে সাহায্য করে যে, জৈবজ্বালানি উৎপাদনের ক্ষেত্রে বায়োমাসের কিছু অংশ কেন এত অনমনীয় হয়। এই পদ্ধতিটি গ্লাইকোম বিশ্লেষণ পদ্ধতির একটি গুরুত্বপূর্ণ শূন্যস্থান পূরণ করে এবং উদ্ভিদ অলিগোস্যাকারাইডের বাইরেও বিস্তৃত পরিসরের সাবস্ট্রেটের ক্ষেত্রে এর প্রয়োগ প্রসারিত করে। ভবিষ্যতে, আমরা বায়োটিনাইলেশনের জন্য রোবোটিক্স ব্যবহার করতে পারি এবং ELISA ব্যবহার করে নমুনার উচ্চ-ক্ষমতাসম্পন্ন বিশ্লেষণের জন্য আমাদের উদ্ভাবিত পদ্ধতিটি প্রয়োগ করতে পারি।
পাইওনিয়ার 33A14 হাইব্রিড বীজ থেকে উৎপাদিত ভুট্টার খড় (CS) ২০১০ সালে কলোরাডোর রে-তে অবস্থিত ক্রেমার ফার্মস থেকে সংগ্রহ করা হয়েছিল। জমির মালিকের অনুমতি সাপেক্ষে এই জৈববস্তু গবেষণার কাজে ব্যবহার করা যেতে পারে। নমুনাগুলো কক্ষ তাপমাত্রায় জিপ-লক ব্যাগে শুষ্ক অবস্থায় (৬%-এর কম আর্দ্রতায়) সংরক্ষণ করা হয়েছিল। নমুনাগুলো কক্ষ তাপমাত্রায় জিপ-লক ব্যাগে শুষ্ক অবস্থায় (৬%-এর কম আর্দ্রতায়) সংরক্ষণ করা হয়েছিল। Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре. নমুনাগুলো কক্ষ তাপমাত্রায় জিপারযুক্ত ব্যাগে ৬%-এর কম আর্দ্রতায় শুষ্ক অবস্থায় সংরক্ষণ করা হয়েছিল।样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中.样品在室温下以干燥<6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < 6%। নমুনাগুলো জিপার ব্যাগে কক্ষ তাপমাত্রায় এবং ৬%-এর কম আর্দ্রতায় সংরক্ষণ করা হয়।গবেষণাটি স্থানীয় ও জাতীয় নির্দেশিকা মেনে করা হয়েছে। NREL প্রোটোকল ব্যবহার করে এর গাঠনিক বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। এতে ৩১.৪% গ্লুকান, ১৮.৭% জাইলান, ৩.৩% অ্যারাবিনান, ১.২% গ্যালাক্টান, ২.২% অ্যাসিটাইল, ১৪.৩% লিগনিন, ১.৭% প্রোটিন এবং ১৩.৪% ভস্ম পাওয়া গেছে।
সেলিক® সিটেক২ (১৩৮ মিলিগ্রাম প্রোটিন/মিলি, লট ভিসিএনআই ০০০১) হলো সেলুলেজ, বিটা-গ্লুকোসিডেজ এবং নোভোজাইমস (ফ্র্যাঙ্কলিনটন, এনসি, ইউএসএ) থেকে প্রাপ্ত সেলিক® এইচটেক২ (১৫৭ মিলিগ্রাম প্রোটিন/মিলি, লট ভিএইচএন০০০০১)-এর একটি জটিল মিশ্রণ। মাল্টিফেক্ট পেকটিনেজ® (৭২ মিলিগ্রাম প্রোটিন/মিলি), পেকটিন বিয়োজনকারী এনজাইমের একটি জটিল মিশ্রণ, ডুপন্ট ইন্ডাস্ট্রিয়াল বায়োসায়েন্সেস (পালো অল্টো, সিএ, ইউএসএ) কর্তৃক দান করা হয়েছিল। এনজাইম প্রোটিনের ঘনত্ব নির্ধারণ করা হয়েছিল কিয়েলডাল নাইট্রোজেন বিশ্লেষণ (এওএসি পদ্ধতি ২০০১.১১, ডেইরি ওয়ান কোঅপারেটিভ ইনকর্পোরেটেড, ইথাকা, এনওয়াই, ইউএসএ) ব্যবহার করে প্রোটিনের পরিমাণ অনুমান করে (এবং নন-প্রোটিন নাইট্রোজেনের অবদান বিয়োগ করে)। ডায়াটোমেশিয়াস আর্থ ৫৪৫ ইএমডি মিলিপোর (বিলেরিকা, এমএ) থেকে কেনা হয়েছিল। অ্যাক্টিভেটেড কার্বন (ডার্কো, ১০০ মেশ গ্র্যানিউল), অ্যাভিসেল (পিএইচ-১০১), বিচ জাইলান এবং অন্যান্য সকল রাসায়নিক পদার্থ সিগমা-অলড্রিচ (সেন্ট লুইস, এমও) থেকে ক্রয় করা হয়েছিল।
AFEX প্রি-ট্রিটমেন্টটি GLBRC (বায়োমাস কনভার্সন রিসার্চ ল্যাবরেটরি, MSU, ল্যানসিং, MI, USA)-তে সম্পন্ন করা হয়েছিল। প্রি-ট্রিটমেন্টটি একটি স্টেইনলেস স্টিল বেঞ্চটপ ব্যাচ রিঅ্যাক্টরে (Parr Instruments Company) ১৪০° সেলসিয়াস তাপমাত্রায় ১৫ মিনিটের জন্য করা হয়েছিল। এতে বায়োমাসের সাথে ১:১ অনুপাতে অনার্দ্র অ্যামোনিয়া ৬০% (w/w) লোডিংয়ে ৪৬ মিনিট রেসিডেন্স টাইম লেগেছিল। রিঅ্যাক্টরটিকে ১৪০° সেলসিয়াস তাপমাত্রায় আনা হয়েছিল এবং অ্যামোনিয়া দ্রুত নির্গত করা হয়েছিল, যার ফলে বায়োমাস দ্রুত ঘরের তাপমাত্রায় ফিরে আসতে পেরেছিল। AFEX প্রি-ট্রিটেড কর্ন স্টোভারের (ACS) গঠন অপরিশোধিত কর্ন স্টোভারের (UT-CS) গঠনের অনুরূপ ছিল।
অলিগোস্যাকারাইডের বৃহৎ পরিসরে উৎপাদনের জন্য প্রাথমিক উপাদান হিসেবে উচ্চ কঠিন পদার্থযুক্ত ACSH ২৫% (ওজন/ওজন) (প্রায় ৮% ডেক্সট্রান লোডিং) প্রস্তুত করা হয়েছিল। ACS-এর এনজাইমেটিক হাইড্রোলাইসিস একটি বাণিজ্যিক এনজাইম মিশ্রণ ব্যবহার করে সম্পন্ন করা হয়েছিল, যার মধ্যে ছিল Cellic® Ctec2 (১০ মিলিগ্রাম প্রোটিন/গ্রাম গ্লুকান, প্রি-ট্রিটেড বায়োমাসে), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC) (৫ মিলিগ্রাম প্রোটিন/গ্রাম গ্লুকান), এবং Multifect Pectinase (Genencor Inc, USA) (৫ মিলিগ্রাম প্রোটিন/গ্রাম ডেক্সট্রান)। এনজাইমেটিক হাইড্রোলাইসিস একটি ৫-লিটার বায়োরিয়্যাক্টরে সম্পন্ন করা হয়েছিল, যার কার্যকরী আয়তন ছিল ৩ লিটার, pH ৪.৮, তাপমাত্রা ৫০°C এবং গতি ছিল ২৫০ rpm। ৯৬ ঘণ্টা হাইড্রোলাইসিসের পর, হাইড্রোলাইজেটটি প্রথমে ৩০ মিনিটের জন্য ৬০০০ rpm-এ এবং তারপর ৩০ মিনিটের জন্য ১৪০০০ rpm-এ সেন্ট্রিফিউগেশন করে সংগ্রহ করা হয়েছিল, যাতে হাইড্রোলাইসিস না হওয়া কঠিন পদার্থগুলো অপসারণ করা যায়। এরপর হাইড্রোলাইজেটটিকে একটি ০.২২ মিমি ফিল্টার বিকারের মাধ্যমে জীবাণুমুক্তভাবে পরিস্রাবণ করা হয়। পরিস্রুত হাইড্রোলাইজেটটিকে জীবাণুমুক্ত বোতলে ৪° সেলসিয়াস তাপমাত্রায় সংরক্ষণ করা হয় এবং তারপর কার্বনের উপর ভিত্তি করে এর ভগ্নাংশ বিশ্লেষণ করা হয়।
NREL পরীক্ষাগার বিশ্লেষণ পদ্ধতি অনুসারে নির্যাস-ভিত্তিক বায়োমাস নমুনার উপাদানের বিশ্লেষণ: উপাদান বিশ্লেষণের জন্য নমুনা প্রস্তুতকরণ (NREL/TP-510-42620) এবং বায়োমাসে কাঠামোগত কার্বোহাইড্রেট এবং লিগনিন নির্ধারণ (NREL/TP-510 – 42618)47।
একটি অটোক্লেভ-ভিত্তিক অ্যাসিড হাইড্রোলাইসিস পদ্ধতি ব্যবহার করে ২ মিলি স্কেলে হাইড্রোলাইজেট প্রবাহের অলিগোস্যাকারাইড বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। একটি ১০ মিলি স্ক্রু ক্যাপ কালচার টিউবে হাইড্রোলাইজেট নমুনার সাথে ৬৯.৭ মাইক্রোলিটার ৭২% সালফিউরিক অ্যাসিড মিশিয়ে ১২১ ডিগ্রি সেলসিয়াস তাপমাত্রায় বেঞ্চটপে ১ ঘণ্টা ইনকিউবেট করা হয়, বরফে রেখে ঠান্ডা করা হয় এবং একটি হাই পারফরম্যান্স লিকুইড ক্রোমাটোগ্রাফি (HPLC) ভায়ালে ফিল্টার করা হয়। অ্যাসিড-হাইড্রোলাইজড নমুনার মোট শর্করার ঘনত্ব থেকে নন-হাইড্রোলাইজড নমুনার মনোস্যাকারাইডের ঘনত্ব বিয়োগ করে অলিগোস্যাকারাইডের ঘনত্ব নির্ধারণ করা হয়েছিল।
একটি অটোস্যাম্পলার, কলাম হিটার, আইসোক্র্যাটিক পাম্প এবং রিফ্র্যাক্টিভ ইনডেক্স ডিটেক্টরযুক্ত শিমাজু এইচপিএলসি সিস্টেম ব্যবহার করে বায়ো-র‍্যাড অ্যামিনেক্স HPX-87H কলামে অ্যাসিড হাইড্রোলাইজড বায়োমাসের গ্লুকোজ, জাইলোজ এবং অ্যারাবিনোজের ঘনত্ব বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। কলামটিকে ৫০°C তাপমাত্রায় রাখা হয়েছিল এবং প্রতি মিনিটে ০.৬ মিলি প্রবাহে জলে দ্রবীভূত ৫ mM H2SO4 দিয়ে এলুশন করা হয়েছিল।
হাইড্রোলাইজেট সুপারন্যাট্যান্টকে লঘু করে মনোমার এবং অলিগোস্যাকারাইডের পরিমাণ নির্ণয়ের জন্য বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। এনজাইমেটিক হাইড্রোলাইসিসের পর প্রাপ্ত মনোমেরিক শর্করাসমূহ একটি বায়ো-র‍্যাড (হারকিউলিস, সিএ) অ্যামিনেক্স HPX-87P কলাম এবং একটি অ্যাশ গার্ড কলামযুক্ত HPLC দ্বারা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। কলামের তাপমাত্রা ৮০°C-এ স্থির রাখা হয়েছিল এবং ০.৬ মিলি/মিনিট প্রবাহ হারে জলকে মোবাইল ফেজ হিসেবে ব্যবহার করা হয়েছিল। ৪১, ৪৮, ৪৯ নং রেফারেন্সে বর্ণিত পদ্ধতি অনুসারে ১২১°C তাপমাত্রায় লঘু অ্যাসিডে হাইড্রোলাইসিসের মাধ্যমে অলিগোস্যাকারাইডসমূহ নির্ণয় করা হয়েছিল।
কাঁচা, AFEX দ্বারা প্রাক-চিকিৎসাকৃত এবং সমস্ত অ-হাইড্রোলাইজড বায়োমাস অবশেষের উপর স্যাকারিড বিশ্লেষণ করা হয়েছিল (ধারাবাহিক কোষ প্রাচীর নির্যাস উৎপাদন এবং তাদের mAb স্ক্রিনিং সহ) পূর্বে বর্ণিত পদ্ধতি 27, 43, 50, 51 ব্যবহার করে। গ্লাইকোম বিশ্লেষণের জন্য, বায়োমাস অবশেষ থেকে উদ্ভিদ কোষ প্রাচীর উপাদানের অ্যালকোহল-অদ্রবণীয় অবশেষ প্রস্তুত করা হয় এবং ক্রমবর্ধমান আক্রমণাত্মক বিকারক যেমন অ্যামোনিয়াম অক্সালেট (50 mM), সোডিয়াম কার্বনেট (50 mM এবং 0.5% w/v), CON. (1M এবং 4M, উভয়ই 1% w/v সোডিয়াম বোরোহাইড্রাইড সহ) এবং অ্যাসিড ক্লোরাইট দিয়ে ধারাবাহিকভাবে নিষ্কাশন করা হয়, যেমনটি পূর্বে বর্ণিত হয়েছে 52, 53। এরপর নির্যাসগুলিকে কোষ প্রাচীর গ্লাইক্যানের দিকে নির্দেশিত mAb50-এর একটি জটিল প্যানেলের বিরুদ্ধে ELISA করা হয় এবং mAb বাইন্ডিং প্রতিক্রিয়াগুলিকে একটি হিট ম্যাপ হিসাবে উপস্থাপন করা হয়। উদ্ভিদ কোষ প্রাচীর গ্লাইক্যানকে লক্ষ্য করে mAb গুলি পরীক্ষাগারের স্টক (CCRC, JIM এবং MAC সিরিজ) থেকে কেনা হয়েছিল।
অলিগোস্যাকারাইডের এক-ধাপ বায়োটিনাইলেশন। নিম্নলিখিত পদ্ধতি ব্যবহার করে কার্বোহাইড্রেটের সাথে বায়োটিন-এলসি-হাইড্রাজাইডের সংযোজন করা হয়েছিল। বায়োটিন-এলসি-হাইড্রাজাইড (৪.৬ মিলিগ্রাম/১২ মাইক্রোমোল) ডাইমিথাইল সালফোক্সাইড (ডিএমএসও, ৭০ মাইক্রোলিটার)-এ তীব্রভাবে নাড়িয়ে এবং ৬৫° সেলসিয়াস তাপমাত্রায় ১ মিনিট ধরে উত্তপ্ত করে দ্রবীভূত করা হয়েছিল। গ্লেসিয়াল অ্যাসিটিক অ্যাসিড (৩০ মাইক্রোলিটার) যোগ করা হয়েছিল এবং মিশ্রণটি সোডিয়াম সায়ানোবোরোহাইড্রাইডের (৬.৪ মিলিগ্রাম/১০০ মাইক্রোমোল) উপর ঢেলে দেওয়া হয়েছিল এবং ৬৫° সেলসিয়াস তাপমাত্রায় প্রায় ১ মিনিট ধরে উত্তপ্ত করার পর সম্পূর্ণরূপে দ্রবীভূত করা হয়েছিল। তারপর, বিক্রিয়া মিশ্রণের ৫ থেকে ৮ মাইক্রোলিটার শুষ্ক অলিগোস্যাকারাইডে (১-১০০ ন্যানোমোল) যোগ করা হয়েছিল, যাতে রিডিউসিং এন্ডের তুলনায় লেবেলের ১০ গুণ বা তার বেশি মোলার আধিক্য পাওয়া যায়। বিক্রিয়াটি ৬৫° সেলসিয়াস তাপমাত্রায় ২ ঘণ্টা ধরে চালানো হয়েছিল, যার পরে নমুনাগুলি অবিলম্বে বিশুদ্ধ করা হয়েছিল। বিজারণ ছাড়া লেবেলিং পরীক্ষাগুলোতে কোনো সোডিয়াম সায়ানোবোরোহাইড্রাইড ব্যবহার করা হয়নি এবং নমুনাগুলোকে ৬৫° সেলসিয়াস তাপমাত্রায় ২.৫ ঘণ্টা ধরে বিক্রিয়া করানো হয়েছিল।
বায়োটিনযুক্ত অলিগোস্যাকারাইডের নমুনার ELISA কোটিং এবং ধৌতকরণ। অ্যাভিডিন-কোটেড প্লেটের প্রতিটি ওয়েলে ২৫ μl বায়োটিনযুক্ত নমুনা (প্রতিটি ঘনীভূত নমুনার ১০০ μl, যা ৫ ml ০.১ M ট্রিস বাফার সলিউশন (TBS)-এ মিশ্রিত) যোগ করা হয়েছিল। কন্ট্রোল ওয়েলগুলিতে ০.১ M TBS-এ ১০ μg/ml ঘনত্বের বায়োটিনের ৫০ μl দিয়ে কোটিং করা হয়েছিল। ব্ল্যাঙ্ক পরিমাপের জন্য কোটিং হিসেবে ডিআয়োনাইজড জল ব্যবহার করা হয়েছিল। ট্যাবলেটটি ঘরের তাপমাত্রায় অন্ধকারে ২ ঘন্টা ইনকিউবেট করা হয়েছিল। গ্রেনিয়ার ফ্ল্যাট 3A-এর জন্য প্রোগ্রাম নং ১১ ব্যবহার করে ০.১ M TBS-এ ০.১% স্কিমড মিল্ক দিয়ে প্লেটটি ৩ বার ধৌত করুন।
প্রাইমারি অ্যান্টিবডি যোগ করা এবং ধৌতকরণ। প্রতিটি ওয়েলে ৪০ µl প্রাইমারি অ্যান্টিবডি যোগ করুন। মাইক্রোপ্লেটটি ঘরের তাপমাত্রায় অন্ধকারে ১ ঘণ্টা ইনকিউবেট করুন। এরপর গ্রেনিয়ার ফ্ল্যাট 3A-এর জন্য ওয়াশ প্রোগ্রাম #১১ ব্যবহার করে প্লেটগুলো ০.১M TBS-এ ০.১% দুধ দিয়ে ৩ বার ধৌত করা হয়েছিল।
সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি যোগ করুন এবং ধুয়ে ফেলুন। প্রতিটি ওয়েলে ৫০ µl মাউস/র‍্যাট সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি (০.১ M TBS-এ ০.১% দুধে ১:৫০০০ অনুপাতে মিশ্রিত) যোগ করুন। মাইক্রোপ্লেটটি ঘরের তাপমাত্রায় অন্ধকারে ১ ঘন্টা ইনকিউবেট করুন। এরপর গ্রেনিয়ার ফ্ল্যাট 5A প্লেট ওয়াশ প্রোগ্রাম #১২ ব্যবহার করে মাইক্রোপ্লেটগুলো ০.১ M TBS-এ ০.১% দুধ দিয়ে ৫ বার ধোয়া হয়েছিল।
সাবস্ট্রেট যোগ করা। বেস সাবস্ট্রেটে (১৫ মিলি ডিআয়োনাইজড জলে ২ ফোঁটা বাফার, ৩ ফোঁটা টিএমবি এবং ২ ফোঁটা হাইড্রোজেন পারক্সাইড যোগ করে) ৫০ মাইক্রোলিটার ৩,৩′,৫,৫′-টেট্রামিথাইলবেঞ্জিডিন (টিএমবি) যোগ করুন। টিএমবি সাবস্ট্রেটটি প্রস্তুত করুন এবং ব্যবহারের আগে ভর্টেক্স করুন। মাইক্রোপ্লেটটি ঘরের তাপমাত্রায় ৩০ মিনিটের জন্য অন্ধকারে ইনকিউবেট করুন।
ধাপটি সম্পন্ন করুন এবং ট্যাবলেটটি পড়ুন। প্রতিটি ওয়েলে ৫০ µl ১ N সালফিউরিক অ্যাসিড যোগ করুন এবং একটি ELISA রিডার ব্যবহার করে ৪৫০ থেকে ৬৫৫ nm পর্যন্ত অ্যাবজর্বেন্স রেকর্ড করুন।
ডিআয়োনাইজড জলে এই অ্যানালাইটগুলির ১ মিলিগ্রাম/মিলি দ্রবণ প্রস্তুত করুন: অ্যারাবিনোজ, র‍্যামনোজ, ফিউকোজ, জাইলোজ, গ্যালাকচুরোনিক অ্যাসিড (GalA), গ্লুকুরোনিক অ্যাসিড (GlcA), ম্যানোজ, গ্লুকোজ, গ্যালাকটোজ, ল্যাকটোজ, এন-অ্যাসিটাইলম্যানোসামিন (manNAc), এন-অ্যাসিটাইলগ্লুকোসামিন (glcNAc), এন-অ্যাসিটাইলগ্যালাকটোসামিন (galNAc), ইনোসিটল (অভ্যন্তরীণ স্ট্যান্ডার্ড)। সারণি ১-এ দেখানো ১ মিলিগ্রাম/মিলি চিনির দ্রবণ যোগ করে দুটি স্ট্যান্ডার্ড প্রস্তুত করা হয়েছিল। নমুনাগুলিকে -৮০° সেলসিয়াস তাপমাত্রায় হিমায়িত এবং লাইওফিলাইজ করা হয় যতক্ষণ না সমস্ত জল অপসারিত হয় (সাধারণত প্রায় ১২-১৮ ঘন্টা)।
একটি অ্যানালিটিক্যাল ব্যালেন্সে স্ক্রু ক্যাপ টিউবে ১০০–৫০০ µg নমুনা যোগ করুন। যোগ করা পরিমাণটি রেকর্ড করুন। নমুনাটিকে একটি নির্দিষ্ট ঘনত্বের দ্রাবকে দ্রবীভূত করে তরল অ্যালিকোট হিসাবে টিউবে যোগ করা সবচেয়ে ভালো। প্রতিটি নমুনা টিউবের জন্য অভ্যন্তরীণ স্ট্যান্ডার্ড হিসাবে ২০ µl ১ mg/ml ইনোসিটল ব্যবহার করুন। নমুনায় যোগ করা অভ্যন্তরীণ স্ট্যান্ডার্ডের পরিমাণ অবশ্যই স্ট্যান্ডার্ড টিউবে যোগ করা অভ্যন্তরীণ স্ট্যান্ডার্ডের পরিমাণের সমান হতে হবে।
একটি স্ক্রু ক্যাপযুক্ত শিশিতে ৮ মিলি অনার্দ্র মিথানল নিন। তারপর ৪ মিলি ৩ নরমাল মিথানলিক এইচসিএল দ্রবণ যোগ করে, শিশিটির মুখ বন্ধ করে ঝাঁকান। এই প্রক্রিয়ায় জল ব্যবহার করা হয় না।
অলিগোস্যাকারাইড নমুনা এবং স্ট্যান্ডার্ড টিএমএস টিউবগুলিতে ৫০০ µl ১ M HCl মিথানল দ্রবণ যোগ করুন। নমুনাগুলিকে একটি থার্মাল ব্লকে ৮০° সেলসিয়াস তাপমাত্রায় সারারাত (১৬৮ ঘন্টা) ইনকিউবেট করা হয়েছিল। একটি ড্রাইং ম্যানিফোল্ড ব্যবহার করে মিথানলিসিস উৎপাদটিকে ঘরের তাপমাত্রায় শুকিয়ে নিন। ২০০ µl MeOH যোগ করুন এবং আবার শুকিয়ে নিন। এই প্রক্রিয়াটি দুইবার পুনরাবৃত্তি করা হয়। নমুনায় ২০০ µl মিথানল, ১০০ µl পাইরিডিন এবং ১০০ µl অ্যাসিটিক অ্যানহাইড্রাইড যোগ করে ভালোভাবে মেশান। নমুনাগুলিকে ৩০ মিনিটের জন্য ঘরের তাপমাত্রায় ইনকিউবেট করুন এবং শুকিয়ে নিন। ২০০ µl মিথানল যোগ করুন এবং আবার শুকিয়ে নিন।
২০০ µl ট্রাই-সিল যোগ করুন এবং মুখবন্ধ টিউবটি ২০ মিনিটের জন্য ৮০°C তাপমাত্রায় উত্তপ্ত করুন, তারপর এটিকে কক্ষ তাপমাত্রায় ঠান্ডা করুন। একটি ড্রাইং ম্যানিফোল্ড ব্যবহার করে নমুনাটিকে আরও শুকিয়ে প্রায় ৫০ µl আয়তনে নিয়ে আসুন। এটি উল্লেখ্য যে, আমরা নমুনাগুলোকে সম্পূর্ণরূপে শুকাতে দিইনি।
২ মিলি হেক্সেন যোগ করুন এবং ভর্টেক্সিং করে ভালোভাবে মেশান। ৫-৩/৪ ইঞ্চি ব্যাসের একটি পিপেটের উপরে এক টুকরো গ্লাস উল ঢুকিয়ে পাস্তুর পিপেটের (৫-৮ মিমি) অগ্রভাগ পূর্ণ করুন। নমুনাগুলোকে ৩০০০ g-তে ২ মিনিটের জন্য সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল। যেকোনো অদ্রবণীয় অবশেষ অধঃক্ষিপ্ত হয়। নমুনাটিকে ১০০-১৫০ µl-এ শুষ্ক করুন। প্রায় ১ μl আয়তনের নমুনা ৮০ °C প্রাথমিক তাপমাত্রা এবং ২.০ মিনিটের প্রাথমিক সময়ে GC-MS-এ ইনজেক্ট করা হয়েছিল (সারণি ২)।