Dziękujemy za odwiedzenie Nature.com. Wersja przeglądarki, której używasz, ma ograniczoną obsługę CSS. Aby uzyskać najlepsze wrażenia, zalecamy korzystanie ze zaktualizowanej przeglądarki (lub wyłączenie trybu zgodności w programie Internet Explorer). W międzyczasie, aby zapewnić ciągłą obsługę, będziemy renderować witrynę bez stylów i JavaScript.
Nowe metody immunologiczne i spektrometrii masowej do kompleksowej analizy trwałych oligosacharydów w słomie kukurydzianej poddanej wstępnej obróbce AFEX. Biomasa lignocelulozowa jest zrównoważoną alternatywą dla paliw kopalnych i jest szeroko stosowana do opracowywania biotechnologii do produkcji produktów takich jak żywność, pasze, paliwa i chemikalia. Kluczem do tych technologii jest opracowanie konkurencyjnych pod względem kosztów procesów przekształcania złożonych węglowodanów obecnych w ścianach komórkowych roślin w proste cukry, takie jak glukoza, ksyloza i arabinoza. Ponieważ biomasa lignocelulozowa jest bardzo uparta, musi być poddawana obróbce termochemicznej (np. złuszczaniu włókien amoniakiem (AFEX), rozcieńczonym kwasom (DA), cieczom jonowym (IL)) i obróbce biologicznej (np. hydrolizie enzymatycznej i fermentacji mikrobiologicznej) w połączeniu, aby uzyskać pożądany produkt. . Jednakże, gdy komercyjne enzymy grzybowe są używane w procesie hydrolizy, tylko 75-85% rozpuszczalnych cukrów to monosacharydy, a pozostałe 15-25% to rozpuszczalne, nieusuwalne oligosacharydy, które nie zawsze są dostępne dla mikroorganizmów. Wcześniej, udało nam się wyizolować i oczyścić rozpuszczalne, uporczywe oligosacharydy, stosując kombinację rozdziału węgla i ziemi okrzemkowej oraz chromatografii wykluczania wielkości, a także zbadaliśmy ich właściwości hamujące enzymy. Odkryliśmy, że oligosacharydy zawierające substytucje kwasu uronowego metylowanego o wyższym stopniu polimeryzacji (DP) są trudniejsze do przetworzenia za pomocą komercyjnych mieszanek enzymów niż oligosacharydy o niskim DP i neutralne. W niniejszym artykule przedstawiamy zastosowanie kilku dodatkowych metod, w tym profilowania glikanów przy użyciu przeciwciał monoklonalnych (mAbs) specyficznych dla glikanów biomasy roślinnej w celu scharakteryzowania wiązań glikanowych w ścianach komórkowych roślin i enzymatycznych hydrolizatach, jonizacji desorpcyjnej laserowej wspomaganej matrycą, spektrometrii masowej z pomiarem czasu przelotu. . MALDI-TOF-MS) wykorzystuje diagnostyczne piki informujące o strukturze uzyskane za pomocą spektroskopii po wtórnym rozpadzie jonów ujemnych, chromatografii gazowej i spektrometrii masowej (GC-MS) w celu scharakteryzowania wiązań oligosacharydowych z derywatyzacją i bez niej. Ze względu na niewielki rozmiar oligosacharydów (DP 4–20) cząsteczki te są trudne do wykorzystania do wiązania i charakteryzowania mAb. Aby przezwyciężyć ten problem, zastosowaliśmy nową metodę unieruchamiania oligosacharydów opartą na koniugacji biotyny, która skutecznie znakowała większość rozpuszczalnych oligosacharydów o niskim DP na powierzchni mikropłytki, które następnie wykorzystano w wysokowydajnym systemie mAb do analizy specyficznej ligacji. Ta nowa metoda ułatwi w przyszłości opracowanie bardziej zaawansowanych wysokowydajnych testów glikomowych, które mogą być używane do izolowania i charakteryzowania oligosacharydów obecnych w biomarkerach w celach diagnostycznych.
Biomasa lignocelulozowa, składająca się z materiałów rolniczych, leśnych, trawiastych i drzewnych, jest potencjalnym surowcem do produkcji produktów biologicznych, w tym żywności, pasz, paliw i prekursorów chemicznych w celu wytwarzania produktów o wyższej wartości1. Węglowodany (takie jak celuloza i hemiceluloza) obecne w ścianach komórkowych roślin są depolimeryzowane do monosacharydów poprzez przetwarzanie chemiczne i biotransformację (taką jak hydroliza enzymatyczna i fermentacja mikrobiologiczna). Typowe wstępne obróbki obejmują ekspansję włókien amoniakowych (AFEX), rozcieńczony kwas (DA), ciecz jonową (IL) i eksplozję parową (SE), które wykorzystują kombinację chemikaliów i ciepła w celu zmniejszenia produkcji lignocelulozy poprzez otwieranie ścian komórkowych roślin3,4. uporczywość materii, 5. Hydroliza enzymatyczna jest przeprowadzana przy wysokim obciążeniu substancjami stałymi przy użyciu komercyjnych enzymów zawierających aktywne węglowodany (CAZymes) i fermentacji mikrobiologicznej przy użyciu drożdży transgenicznych lub bakterii w celu produkcji paliw i chemikaliów biologicznych6.
CAZymes w komercyjnych enzymach składają się ze złożonej mieszanki enzymów, które synergicznie rozszczepiają złożone wiązania węglowodanowo-cukrowe, tworząc monosacharydy2,7. Jak informowaliśmy wcześniej, złożona sieć aromatycznych polimerów ligniny z węglowodanami sprawia, że ​​są one wysoce nieusuwalne, co prowadzi do niepełnej konwersji cukru, gromadząc 15-25% oligosacharydów płciowych, które nie są wytwarzane podczas enzymatycznej hydrolizy wstępnie przetworzonej biomasy. Jest to powszechny problem w przypadku różnych metod wstępnej obróbki biomasy. Niektóre z przyczyn tego wąskiego gardła obejmują hamowanie enzymów podczas hydrolizy lub brak lub niski poziom niezbędnych enzymów niezbędnych do rozbicia wiązań cukrowych w biomasie roślinnej. Zrozumienie składu i cech strukturalnych cukrów, takich jak wiązania cukrowe w oligosacharydach, pomoże nam ulepszyć konwersję cukru podczas hydrolizy, dzięki czemu procesy biotechnologiczne będą konkurencyjne cenowo w porównaniu z produktami pochodzącymi z ropy naftowej.
Określenie struktury węglowodanów jest trudne i wymaga połączenia metod, takich jak chromatografia cieczowa (LC)11,12, spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR)13, elektroforeza kapilarna (CE)14,15,16 i spektrometria mas (MS)17. ,osiemnaście. Metody MS, takie jak spektrometria mas z analizą czasu przelotu z desorpcją laserową i jonizacją przy użyciu matrycy (MALDI-TOF-MS), są wszechstronną metodą identyfikacji struktur węglowodanów. Ostatnio tandemowa spektroskopia masowa adduktów jonów sodu z dysocjacją indukowaną zderzeniami (CID) była najczęściej stosowana do identyfikacji odcisków palców odpowiadających pozycjom przyłączenia oligosacharydów, konfiguracjom anomerycznym, sekwencjom i pozycjom rozgałęzień 20, 21 .
Analiza glikanów jest doskonałym narzędziem do dogłębnej identyfikacji wiązań węglowodanowych22. Ta metoda wykorzystuje przeciwciała monoklonalne (mAbs) skierowane do glikanów ścian komórkowych roślin jako sondy do zrozumienia złożonych wiązań węglowodanowych. Na całym świecie dostępnych jest ponad 250 mAbs, zaprojektowanych przeciwko różnym liniowym i rozgałęzionym oligosacharydom przy użyciu różnych sacharydów24. Kilka mAbs było szeroko stosowanych do scharakteryzowania struktury, składu i modyfikacji ścian komórkowych roślin, ponieważ istnieją znaczące różnice w zależności od typu komórki roślinnej, organu, wieku, stadium rozwoju i środowiska wzrostu25,26. Niedawno tę metodę wykorzystano do zrozumienia populacji pęcherzyków w systemach roślinnych i zwierzęcych oraz ich odpowiednich ról w transporcie glikanów, co zostało określone przez markery subkomórkowe, stadia rozwojowe lub bodźce środowiskowe, a także do określenia aktywności enzymatycznej. Niektóre ze zidentyfikowanych struktur glikanów i ksylanów obejmują pektynę (P), ksylan (X), mannan (M), ksyloglukany (XylG), glukany o mieszanych wiązaniach (MLG), arabinoksylan (ArbX), galaktomannan (GalG), kwas glukuronowy-arabinoksylan (GArbX) i arabino-galaktan (ArbG)29.
Jednak pomimo wszystkich tych wysiłków badawczych, tylko kilka badań skupiło się na naturze akumulacji oligosacharydów podczas hydrolizy o dużym ładunku substancji stałych (HSL), w tym na uwalnianiu oligosacharydów, zmianach długości łańcucha oligomerycznego podczas hydrolizy, różnych polimerach o niskim DP i ich krzywych. rozkłady 30,31,32. Tymczasem, chociaż analiza glikanów okazała się użytecznym narzędziem do kompleksowej analizy struktury glikanów, trudno jest ocenić rozpuszczalne w wodzie oligosacharydy o niskim DP przy użyciu metod przeciwciał. Mniejsze oligosacharydy DP o masie cząsteczkowej mniejszej niż 5-10 kDa nie wiążą się z płytkami ELISA 33, 34 i są wypłukiwane przed dodaniem przeciwciał.
Tutaj po raz pierwszy demonstrujemy test ELISA na płytkach pokrytych awidyną przy użyciu przeciwciał monoklonalnych, łącząc jednoetapową procedurę biotynylacji rozpuszczalnych opornych oligosacharydów z analizą glikomu. Nasze podejście do analizy glikomu zostało zweryfikowane przez analizę komplementarnych wiązań oligosacharydowych opartą na MALDI-TOF-MS i GC-MS przy użyciu derywatyzacji trimetylosilylowej (TMS) hydrolizowanych kompozycji cukrowych. To innowacyjne podejście może zostać rozwinięte jako metoda o wysokiej przepustowości w przyszłości i znaleźć szersze zastosowanie w badaniach biomedycznych35.
Potranslacyjne modyfikacje enzymów i przeciwciał, takie jak glikozylacja,36 wpływają na ich aktywność biologiczną. Na przykład zmiany glikozylacji białek surowicy odgrywają ważną rolę w zapaleniu stawów, a zmiany glikozylacji są wykorzystywane jako markery diagnostyczne37. W literaturze opisano, że różne glikany łatwo pojawiają się w różnych chorobach, w tym w przewlekłych chorobach zapalnych przewodu pokarmowego i wątroby, zakażeniach wirusowych, raku jajników, piersi i prostaty38,39,40. Zrozumienie struktury glikanów za pomocą metod ELISA opartych na przeciwciałach zapewni dodatkową pewność w diagnozie choroby bez stosowania złożonych metod MS.
Nasze poprzednie badanie wykazało, że uporczywe oligosacharydy pozostały niezhydrolizowane po wstępnej obróbce i hydrolizie enzymatycznej (rysunek 1). W naszej wcześniej opublikowanej pracy opracowaliśmy metodę ekstrakcji fazy stałej węglem aktywnym w celu wyizolowania oligosacharydów z hydrolizatu słomy kukurydzianej poddanej wstępnej obróbce AFEX (ACSH)8. Po wstępnej ekstrakcji i separacji oligosacharydy zostały dodatkowo frakcjonowane za pomocą chromatografii wykluczania wielkości (SEC) i zebrane według masy cząsteczkowej. Monomery i oligomery cukru uwolnione z różnych wstępnych obróbek zostały przeanalizowane za pomocą analizy składu cukru. Porównując zawartość oligomerów cukru uzyskanych różnymi metodami wstępnej obróbki, obecność uporczywych oligosacharydów jest powszechnym problemem w konwersji biomasy do monosacharydów i może prowadzić do zmniejszenia wydajności cukru o co najmniej 10-15%, a nawet do 18%. US. Ta metoda jest stosowana do dalszej produkcji frakcji oligosacharydów na dużą skalę. Powstały ACH i jego kolejne frakcje o różnych masach cząsteczkowych zostały wykorzystane jako materiał eksperymentalny do charakteryzacji oligosacharydów w tej pracy.
Po wstępnej obróbce i hydrolizie enzymatycznej trwałe oligosacharydy pozostały niezhydrolizowane. Tutaj (A) jest metoda separacji oligosacharydów, w której oligosacharydy są izolowane z hydrolizatu słomy kukurydzianej poddanej wstępnej obróbce AFEX (ACSH) przy użyciu złoża węgla aktywowanego i ziemi okrzemkowej; (B) Metoda separacji oligosacharydów. Oligosacharydy były dalej rozdzielane za pomocą chromatografii wykluczania wielkości (SEC); (C) Monomery i oligomery sacharydów uwolnione z różnych wstępnych obróbek (rozcieńczony kwas: DA, ciecz jonowa: IL i AFEX). Warunki hydrolizy enzymatycznej: wysoki ładunek substancji stałych wynoszący 25% (w/w) (około 8% ładunku glukanu), 96 godzin hydrolizy, ładunek komercyjnego enzymu 20 mg/g (stosunek Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) oraz (D) Monomery cukru i oligomery glukozy, ksylozy i arabinozy uwolnione z wstępnie obrobionej słomy kukurydzianej (ACS) AFEX.
Analiza glikanów okazała się użytecznym narzędziem do kompleksowej analizy strukturalnej glikanów w ekstraktach izolowanych z pozostałości stałej biomasy. Jednakże rozpuszczalne w wodzie sacharydy są niedoreprezentowane przy użyciu tej tradycyjnej metody41, ponieważ oligosacharydy o niskiej masie cząsteczkowej są trudne do unieruchomienia na płytkach ELISA i są wypłukiwane przed dodaniem przeciwciała. Dlatego do wiązania przeciwciał i charakteryzowania zastosowano metodę biotynylacji jednoetapowej, aby pokryć rozpuszczalne, niezgodne oligosacharydy na płytkach ELISA pokrytych awidyną. Metodę tę przetestowano przy użyciu naszego wcześniej wyprodukowanego ACSH i frakcji opartej na jej masie cząsteczkowej (lub stopniu polimeryzacji, DP). Jednoetapowa biotynylacja została użyta do zwiększenia powinowactwa wiązania oligosacharydów poprzez dodanie biotyny-LC-hydrazydu do redukującego końca węglowodanu (rys. 2). W roztworze grupa hemiacetalowa na końcu redukującym reaguje z grupą hydrazidową biotyny-LC-hydrazidu, tworząc wiązanie hydrazonowe. W obecności środka redukującego NaCNBH3 wiązanie hydrazonowe jest redukowane do stabilnego biotynylowanego produktu końcowego. Dzięki modyfikacji końca redukującego cukier możliwe stało się wiązanie oligosacharydów o niskim DP do płytek ELISA, a w naszym badaniu zostało to wykonane na płytkach pokrytych awidyną przy użyciu przeciwciał monoklonalnych ukierunkowanych na glikan.
Badanie przesiewowe przeciwciał monoklonalnych na podstawie testu ELISA w celu wykrycia biotynylowanych oligosacharydów. Tutaj (A) połączona biotynylacja oligosacharydów i późniejsze badanie przesiewowe ELISA z przeciwciałami monoklonalnymi ukierunkowanymi na glikany na płytkach pokrytych NeutrAvidin oraz (B) przedstawia jednoetapową procedurę biotynylacji produktów reakcji.
Następnie płytki pokryte awidyną z przeciwciałami sprzężonymi z oligosacharydami dodano do przeciwciał pierwotnych i wtórnych i przemyto w medium wrażliwym na światło i czas. Po całkowitym związaniu przeciwciała dodano substrat TMB w celu inkubacji płytki. Reakcję zatrzymano ostatecznie kwasem siarkowym. Inkubowane płytki analizowano przy użyciu czytnika ELISA w celu określenia siły wiązania każdego przeciwciała w celu wykrycia specyficznego dla przeciwciał usieciowania. Szczegóły i parametry eksperymentu można znaleźć w odpowiedniej sekcji „Materiały i metody”.
Wykazujemy użyteczność tej nowo opracowanej metody w konkretnych zastosowaniach, charakteryzując rozpuszczalne oligosacharydy obecne w ACSH, jak również w surowych i oczyszczonych frakcjach oligosacharydów wyizolowanych z hydrolizatów lignocelulozowych. Jak pokazano na rysunku 3, najczęściej podstawione epitopem ksylany zidentyfikowane w ACSH przy użyciu metod bioacylowanego glikomu to zazwyczaj uronowe (U) lub metylouronowe (MeU) i pektynowe arabinogalaktany. Większość z nich znaleziono również w naszym poprzednim badaniu dotyczącym analizy glikanów niehydrolizowanych ciał stałych (UHS)43.
Wykrywanie opornych epitopów oligosacharydowych przy użyciu przeciwciała monoklonalnego skierowanego do glikanu ściany komórkowej. Frakcja „obojętna” to frakcja ACN, a frakcja „kwaśna” to frakcja FA. Jaśniejsze czerwienie na mapie cieplnej wskazują na wyższą zawartość epitopu, a jaśniejsze błękity oznaczają puste tło. Wartości kolorów na skali są oparte na surowych wartościach OD dla formulacji N=2. Główne epitopy rozpoznawane przez przeciwciała są pokazane po prawej stronie.
Te struktury niecelulozowe nie mogły zostać rozszczepione przez najpowszechniejsze celulazy i hemicelulazy w testowanej komercyjnej mieszance enzymów, która obejmuje najczęściej używane komercyjne enzymy. Dlatego do ich hydrolizy wymagane są nowe enzymy pomocnicze. Bez niezbędnych dodatkowych enzymów niecelulozowych te wiązania niecelulozowe uniemożliwiają całkowitą konwersję do monosacharydów, nawet jeśli ich macierzyste polimery cukrowe są w znacznym stopniu hydrolizowane na krótsze fragmenty i rozpuszczane przy użyciu komercyjnych mieszanek enzymów.
Dalsze badanie rozkładu sygnału i jego siły wiązania wykazało, że epitopy wiążące były niższe we frakcjach cukru o wysokim DP (A, B, C, DP do 20+) niż we frakcjach o niskim DP (D, E, F, DP) w dimerach) (rys. 1). Fragmenty kwasowe są częstsze w epitopach niecelulozowych niż fragmenty neutralne. Zjawiska te są zgodne ze schematem zaobserwowanym w naszym poprzednim badaniu, gdzie wysokie DP i fragmenty kwasowe były bardziej odporne na hydrolizę enzymatyczną. Dlatego obecność epitopów glikanowych niecelulozowych oraz podstawień U i MeU może w znacznym stopniu przyczynić się do stabilności oligosacharydów. Należy zauważyć, że wydajność wiązania i wykrywania może być problematyczna w przypadku oligosacharydów o niskim DP, szczególnie jeśli epitop jest oligosacharydem dimerycznym lub trimerycznym. Można to przetestować przy użyciu komercyjnych oligosacharydów o różnej długości, z których każdy zawiera tylko jeden epitop wiążący się ze specyficznym przeciwciałem monoklonalnym.
Tak więc zastosowanie przeciwciał specyficznych dla struktury ujawniło pewne rodzaje opornych wiązań. W zależności od rodzaju użytego przeciwciała, odpowiedniego wzoru ligacji i siły sygnału, jaki wytwarza (najbardziej i najmniej obfitego), nowe enzymy mogą być identyfikowane i dodawane półilościowo do mieszaniny enzymów w celu pełniejszej glikokonwersji. Biorąc za przykład analizę oligosacharydów ACSH, możemy utworzyć bazę danych wiązań glikanowych dla każdego materiału biomasy. Należy tutaj zauważyć, że należy wziąć pod uwagę różne powinowactwo przeciwciał, a jeśli ich powinowactwo jest nieznane, spowoduje to pewne trudności przy porównywaniu sygnałów różnych przeciwciał. Ponadto porównanie wiązań glikanowych może działać najlepiej między próbkami dla tego samego przeciwciała. Te uparte wiązania można następnie połączyć z bazą danych CAZyme, z której możemy identyfikować enzymy, wybierać enzymy kandydujące i testować pod kątem enzymów rozrywających wiązania lub opracowywać systemy mikrobiologiczne w celu ekspresji tych enzymów do wykorzystania w biorafineriach44.
Aby ocenić, w jaki sposób metody immunologiczne uzupełniają alternatywne metody charakteryzowania oligosacharydów o niskiej masie cząsteczkowej obecnych w hydrolizatach lignocelulozowych, przeprowadziliśmy analizę MALDI (rys. 4, S1-S8) i analizę sacharydów pochodzących z TMS w oparciu o GC-MS na tym samym panelu (rys. 5) części oligosacharydowej. MALDI jest używane do porównywania, czy rozkład masy cząsteczek oligosacharydów odpowiada zamierzonej strukturze. Na rys. 4 przedstawiono MS neutralnych składników ACN-A i ACN-B. Analiza ACN-A potwierdziła zakres cukrów pentozowych od DP 4–8 (rys. 4) do DP 22 (rys. S1), których masy odpowiadają oligosacharydom MeU-ksylanowym. Analiza ACN-B potwierdziła szereg pentoz i glukoksylanów o DP 8-15. W materiałach uzupełniających, takich jak Rycina S3, mapy rozkładu masy kwaśnych fragmentów FA-C pokazują zakres podstawionych cukrów pentozowych (Me)U o DP 8-15, które są zgodne z podstawionymi ksylanami znalezionymi w przesiewie przeciwciał monoklonalnych opartym na teście ELISA. Epitopy są zgodne.
Widmo MALDI-MS rozpuszczalnych niezgodnych oligosacharydów obecnych w ACS. Tutaj (A) frakcje ACN-A o niskiej masie zawierające metylowany kwas uronowy (DP 4-8) podstawione oligosacharydy glukuroksylanowe i (B) ksylan ACN-B i metylowane oligosacharydy kwasu uronowego podstawione glukuroksylanem (DP 8-15).
Analiza składu reszt glikonowych opornych oligosacharydów. Tutaj (A) Skład sacharydów TMS różnych frakcji oligosacharydów uzyskanych za pomocą analizy GC-MS. (B) Struktury różnych cukrów pochodzących z TMS obecnych w oligosacharydach. ACN – frakcja acetonitrylu zawierająca obojętne oligosacharydy i FA – frakcja kwasu ferulowego zawierająca kwaśne oligosacharydy.
Inny interesujący wniosek wyciągnięto z analizy LC-MS frakcji oligosacharydowej, jak pokazano na rysunku S9 (metody można zobaczyć w elektronicznym materiale uzupełniającym). Fragmenty grup heksozy i -OAc były wielokrotnie obserwowane podczas ligacji frakcji ACN-B. To odkrycie nie tylko potwierdza fragmentację obserwowaną w analizie glikomu i MALDI-TOF, ale także dostarcza nowych informacji o potencjalnych pochodnych węglowodanów w wstępnie przetworzonej biomasie lignocelulozowej.
Wykonaliśmy również analizę składu glikanów frakcji oligosacharydowych przy użyciu derywatyzacji glikanów TMS. Używając GC-MS, określiliśmy skład cukrów neuronalnych (niepochodnych) i kwaśnych (GluA i GalA) we frakcji oligosacharydowej (rys. 5). Kwas glukuronowy znajduje się w kwaśnych składnikach C i D, podczas gdy kwas galakturonowy znajduje się w kwaśnych składnikach A i B, które są składnikami o wysokim DP kwaśnych cukrów. Wyniki te nie tylko potwierdzają nasze dane ELISA i MALDI, ale są również zgodne z naszymi wcześniejszymi badaniami nad akumulacją oligosacharydów. Dlatego uważamy, że nowoczesne metody immunologiczne wykorzystujące biotynylację oligosacharydów i późniejsze przesiewowe badanie ELISA są wystarczające do wykrycia rozpuszczalnych opornych oligosacharydów w różnych próbkach biologicznych.
Ponieważ metody przesiewowe mAb oparte na ELISA zostały zweryfikowane kilkoma różnymi metodami, chcieliśmy dalej badać potencjał tej nowej ilościowej metody. Dwa komercyjne oligosacharydy, ksyloheksasacharyd oligosacharyd (XHE) i 23-α-L-arabinofuranozylo-ksylotrioza (A2XX), zostały zakupione i przetestowane przy użyciu nowego podejścia mAb ukierunkowanego na glikan ściany komórkowej. Rysunek 6 przedstawia liniową korelację między biotynylowanym sygnałem wiązania a logarytmem stężenia oligosacharydu, co sugeruje możliwy model adsorpcji Langmuira. Wśród przeciwciał monoklonalnych CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 i CCRC-M151 korelowały z XHE, a CCRC-M108, CCRC-M109 i LM11 korelowały z A2XX w zakresie od 1 nm do 100 nano. Ze względu na ograniczoną dostępność przeciwciał podczas eksperymentu, przeprowadzono ograniczone eksperymenty z każdym stężeniem oligosacharydu. Należy zauważyć, że niektóre przeciwciała reagują bardzo różnie na ten sam oligosacharyd jako substrat, prawdopodobnie dlatego, że wiążą się z nieznacznie różnymi epitopami i mogą mieć bardzo różne powinowactwa wiązania. Mechanizmy i implikacje dokładnej identyfikacji epitopu będą znacznie bardziej złożone, gdy nowe podejście mAb zostanie zastosowane do rzeczywistych próbek.
Do określenia zakresu wykrywania różnych przeciwciał monoklonalnych ukierunkowanych na glikany użyto dwóch komercyjnych oligosacharydów. W tym przypadku liniowe korelacje z logarytmem stężenia oligosacharydu wskazują na wzorce adsorpcji Langmuira dla (A) XHE z przeciwciałem monoklonalnym i (B) A2XX z przeciwciałem monoklonalnym. Odpowiednie epitopy wskazują struktury komercyjnych oligosacharydów użytych jako substraty w teście.
Zastosowanie przeciwciał monoklonalnych ukierunkowanych na glikany (analiza glikokomowa lub przesiewowe przeciwciała monoklonalne oparte na teście ELISA) jest potężnym narzędziem do dogłębnej charakterystyki większości głównych glikanów ścian komórkowych, które tworzą biomasę roślinną. Jednak klasyczna analiza glikanów charakteryzuje tylko większe glikany ścian komórkowych, ponieważ większość oligosacharydów nie jest skutecznie unieruchamiana na płytkach ELISA. W tym badaniu wstępnie obrobiona AFEX-em słoma kukurydziana została poddana enzymatycznej hydrolizie przy wysokiej zawartości substancji stałych. Analiza cukru została użyta do określenia składu opornych węglowodanów ścian komórkowych w hydrolizacie. Jednak analiza przeciwciał monoklonalnych mniejszych oligosacharydów w hydrolizatach jest niedoceniana, a do skutecznego unieruchomienia oligosacharydów na płytkach ELISA potrzebne są dodatkowe narzędzia.
Przedstawiamy tutaj nową i wydajną metodę unieruchomienia oligosacharydów do przesiewu mAb poprzez połączenie biotynylacji oligosacharydów, a następnie przesiewu ELISA na płytkach pokrytych NeutrAvidin™. Unieruchomione biotynylowane oligosacharydy wykazały wystarczające powinowactwo do przeciwciała, aby umożliwić szybkie i wydajne wykrywanie opornych oligosacharydów. Analiza składu tych uporczywych oligosacharydów oparta na spektrometrii masowej potwierdziła wyniki tego nowego podejścia do immunoprzesiewu. Zatem badania te wykazują, że połączenie biotynylacji oligosacharydów i przesiewu ELISA z monoklonalnymi przeciwciałami ukierunkowanymi na glikany może być stosowane do wykrywania wiązań poprzecznych w oligosacharydach i może być szeroko stosowane w innych badaniach biochemicznych charakteryzujących strukturę oligosacharydów.
Ta oparta na biotynie metoda profilowania glikanów jest pierwszym raportem, który umożliwia zbadanie opornych wiązań węglowodanowych rozpuszczalnych oligosacharydów w biomasie roślinnej. Pomaga to zrozumieć, dlaczego niektóre części biomasy są tak uparte, jeśli chodzi o produkcję biopaliw. Ta metoda wypełnia ważną lukę w metodach analizy glikomu i rozszerza jej zastosowanie na szerszy zakres substratów wykraczających poza oligosacharydy roślinne. W przyszłości możemy wykorzystać robotykę do biotynylacji i zastosować opracowaną przez nas metodę do analizy próbek o wysokiej przepustowości przy użyciu testu ELISA.
Słoma kukurydziana (CS) wyhodowana z nasion hybrydowych Pioneer 33A14 została zebrana w 2010 r. w Kramer Farms w Ray, Kolorado. Za zgodą właściciela ziemi biomasa ta może być wykorzystywana do badań. Próbki przechowywano w suchych workach strunowych, w temperaturze pokojowej, z wilgotnością < 6%. Próbki przechowywano w suchych workach strunowych, w temperaturze pokojowej, z wilgotnością < 6%. Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре. Próbki przechowywano w suchych workach zamykanych na suwak, w temperaturze pokojowej, przy wilgotności <6%.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < 6%. Próbki przechowuje się w woreczkach strunowych w temperaturze pokojowej i przy wilgotności < 6%.Badanie było zgodne z lokalnymi i krajowymi wytycznymi. Analiza składu została przeprowadzona przy użyciu protokołu NREL. Stwierdzono, że skład zawierał 31,4% glukanu, 18,7% ksylanu, 3,3% arabinanu, 1,2% galaktanu, 2,2% acetylu, 14,3% ligniny, 1,7% białka i 13,4% popiołu.
Cellic® CTec2 (138 mg białka/ml, partia VCNI 0001) to złożona mieszanina celulazy, β-glukozydazy i Cellic® HTec2 (157 mg białka/ml, partia VHN00001) od Novozymes (Franklinton, NC, USA). Multifect Pectinase® (72 mg białka/ml), złożona mieszanka enzymów rozkładających pektynę, została przekazana przez DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, USA). Stężenia białka enzymatycznego określono, szacując zawartość białka (i odejmując udział azotu niebiałkowego) przy użyciu analizy azotu Kjeldahla (metoda AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA). Ziemię okrzemkową 545 zakupiono od EMD Millipore (Billerica, MA). Węgiel aktywowany (DARCO, granulat 100 mesh), Avicel (PH-101), ksylan bukowy i wszystkie inne substancje chemiczne zakupiono od firmy Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
Wstępne przetwarzanie AFEX przeprowadzono w GLBRC (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, USA). Wstępne przetwarzanie przeprowadzono w temperaturze 140° C. przez 15 minut. 46 czas przebywania przy stosunku 1:1 bezwodnego amoniaku do biomasy przy obciążeniu 60% (w/w) w stalowym reaktorze wsadowym (Parr Instruments Company). Zajęło to 30 minut. Reaktor doprowadzono do temperatury 140°C, a amoniak został szybko uwolniony, co pozwoliło biomasie szybko powrócić do temperatury pokojowej. Skład wstępnie przetworzonej słomy kukurydzianej (ACS) AFEX był podobny do składu nieprzetworzonej słomy kukurydzianej (UT-CS).
Wysoka zawartość stałych substancji ACSH 25% (w/w) (około 8% obciążenia dekstranem) została przygotowana jako materiał wyjściowy do produkcji oligosacharydów na dużą skalę. Enzymatyczna hydroliza ACS została przeprowadzona przy użyciu komercyjnej mieszanki enzymów, w tym Cellic® Ctec2 10 mg białka/g glukanu (w wstępnie przetworzonej biomasie), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg białka/g glukanu i Multifect Pectinase (Genencor Inc, USA). ). ), 5 mg białka/g dekstranu. Enzymatyczna hydroliza została przeprowadzona w 5-litrowym bioreaktorze o objętości roboczej 3 litrów, pH 4,8, 50°C i 250 obr./min. Po 96 godzinach hydrolizy hydrolizat zebrano przez wirowanie przy 6000 obr./min przez 30 minut, a następnie przy 14000 obr./min przez 30 minut, aby usunąć niezhydrolizowane ciała stałe. Następnie hydrolizat poddano sterylnej filtracji przez zlewkę filtracyjną o średnicy 0,22 mm. Przefiltrowany hydrolizat przechowywano w sterylnych butelkach w temperaturze 4° C, a następnie frakcjonowano na węglu.
Analiza składu próbek biomasy na bazie ekstraktów zgodnie z procedurami analizy laboratoryjnej NREL: przygotowanie próbek do analizy składu (NREL/TP-510-42620) oraz oznaczenie węglowodanów strukturalnych i ligniny w biomasie (NREL/TP-510 – 42618)47.
Analizę oligosacharydów strumienia hydrolizatu wykonano w skali 2 ml, stosując metodę hydrolizy kwasowej w autoklawie. Wymieszaj próbkę hydrolizatu z 69,7 µl 72% kwasu siarkowego w 10 ml probówce hodowlanej z zakrętką i inkubuj przez 1 h na blacie w temperaturze 121 °C, ostudź na lodzie i przefiltruj do fiolki do chromatografii cieczowej wysokosprawnej (HPLC). Stężenie oligosacharydów określono, odejmując stężenie monosacharydów w próbce niehydrolizowanej od całkowitego stężenia cukru w ​​próbce hydrolizowanej kwasem.
Stężenia glukozy, ksylozy i arabinozy w biomasie poddanej hydrolizie kwasowej analizowano przy użyciu systemu HPLC Shimadzu wyposażonego w autosampler, grzałkę kolumnową, pompę izokratyczną i detektor współczynnika refrakcji na kolumnie Bio-Rad Aminex HPX-87H. Kolumnę utrzymywano w temperaturze 50°C i eluowano przepływem 0,6 ml/min 5 mM H2SO4 w wodzie.
Nadsącz hydrolizatu rozcieńczono i przeanalizowano pod kątem zawartości monomerów i oligosacharydów. Cukry monomeryczne uzyskane po hydrolizie enzymatycznej analizowano metodą HPLC wyposażoną w kolumnę Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P i kolumnę Ash Guard. Temperaturę kolumny utrzymywano na poziomie 80°C, wodę stosowano jako fazę ruchomą z szybkością przepływu 0,6 ml/min. Oligosacharydy oznaczano przez hydrolizę w rozcieńczonym kwasie w temperaturze 121°C zgodnie z metodami opisanymi w ref. 41, 48, 49.
Analizę sacharydów wykonano na surowych, poddanych wstępnej obróbce AFEX i wszystkich niehydrolizowanych pozostałościach biomasy (w tym produkcję seryjnych ekstraktów ze ścian komórkowych i ich przesiewanie mAb) przy użyciu wcześniej opisanych procedur27, 43, 50, 51. Do analizy glikomu, nierozpuszczalne w alkoholu pozostałości materiału ze ścian komórkowych roślin są przygotowywane z pozostałości biomasy i poddawane seryjnej ekstrakcji przy użyciu coraz bardziej agresywnych odczynników, takich jak szczawian amonu (50 mM), węglan sodu (50 mM i 0,5% w/v), CON. (1M i 4M, oba z 1% w/v borowodorkiem sodu) i chloryn kwasowy, jak opisano wcześniej52,53. Następnie ekstrakty poddano testowi ELISA wobec złożonego panelu mAb50s skierowanych na glikan ściany komórkowej, a reakcje wiązania mAb przedstawiono w postaci mapy cieplnej. Przeciwciała monoklonalne skierowane przeciwko glikanom ścian komórkowych roślin zakupiono z zapasów laboratoryjnych (seria CCRC, JIM i MAC).
Jednoetapowa biotynylacja oligosacharydów. Sprzęganie węglowodanów z biotyną-LC-hydrazidem przeprowadzono stosując następującą procedurę. Biotyna-LC-hydrazid (4,6 mg/12 μmol) rozpuszczono w dimetylosulfotlenku (DMSO, 70 μl) przez energiczne mieszanie i ogrzewanie w temperaturze 65° C. przez 1 min. Dodano lodowaty kwas octowy (30 µl) i mieszaninę wylano na cyjanoborowodorek sodu (6,4 mg/100 µmol) i całkowicie rozpuszczono po ogrzewaniu w temperaturze 65° C. przez około 1 minutę. Następnie od 5 do 8 μl mieszaniny reakcyjnej dodano do wysuszonego oligosacharydu (1-100 nmol), aby uzyskać 10-krotny lub większy nadmiar molowy znacznika ponad koniec redukujący. Reakcję prowadzono w temperaturze 65°C przez 2 h, po czym próbki natychmiast oczyszczono. W eksperymentach znakowania nie stosowano cyjanoborowodorku sodu bez redukcji, a próbki poddawano reakcji w temperaturze 65°C przez 2,5 godziny.
Powłoka ELISA i płukanie próbek biotynylowanych oligosacharydów. Do każdego dołka płytki pokrytej awidyną dodano 25 μl biotynylowanych próbek (100 μl każdej skoncentrowanej próbki rozcieńczonej w 5 ml 0,1 M buforu Tris (TBS)). Dołki kontrolne pokryto 50 μl biotyny w stężeniu 10 μg/ml w 0,1 M TBS. Jako powłokę do pomiarów zerowych użyto wody dejonizowanej. Tabletkę inkubowano przez 2 godziny w temperaturze pokojowej w ciemności. Płytkę przemyto 3 razy 0,1% odtłuszczonego mleka w 0,1 M TBS, używając programu nr 11 dla Grenier flat 3A.
Dodanie i płukanie przeciwciał pierwotnych. Dodać 40 µl przeciwciała pierwotnego do każdego dołka. Inkubować mikropłytkę przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności. Następnie płytki płukano 3 razy 0,1% mlekiem w 0,1M TBS, stosując program płukania nr 11 dla Grenier Flat 3A.
Dodaj przeciwciało wtórne i umyj. Dodaj 50 µl przeciwciała wtórnego myszy/szczura (rozcieńczonego 1:5000 w 0,1% mleku w 0,1 M TBS) do każdego dołka. Inkubuj mikropłytkę przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności. Następnie mikropłytki przemyto 5 razy 0,1% mlekiem w 0,1 M TBS przy użyciu programu do mycia płytek Grenier Flat 5A #12.
Dodawanie substratu. Dodać 50 µl 3,3′,5,5′-tetrametylobenzydyny (TMB) do substratu bazowego (poprzez dodanie 2 kropli buforu, 3 kropli TMB, 2 kropli nadtlenku wodoru do 15 ml wody dejonizowanej). Przygotować substrat TMB. i zawirować przed użyciem). Inkubować mikropłytkę w temperaturze pokojowej przez 30 minut. W ciemności.
Wykonaj ten krok i odczytaj tabletkę. Dodaj 50 µl 1 N kwasu siarkowego do każdego dołka i zapisz absorbancję od 450 do 655 nm za pomocą czytnika ELISA.
Przygotuj roztwory 1 mg/ml następujących analitów w dejonizowanej wodzie: arabinoza, ramnoza, fukoza, ksyloza, kwas galakturonowy (GalA), kwas glukuronowy (GlcA), mannoza, glukoza, galaktoza, laktoza, N-acetylomannozamina (manNAc), N-acetyloglukozamina. (glcNAc), N-acetylogalaktozamina (galNAc), inozytol (standard wewnętrzny). Dwa standardy przygotowano przez dodanie roztworów cukru 1 mg/ml przedstawionych w Tabeli 1. Próbki zamraża się i liofilizuje w temperaturze -80° C. aż do usunięcia całej wody (zwykle około 12-18 godzin).
Dodaj 100–500 µg próbki do probówek z zakrętką na wadze analitycznej. Zapisz dodaną ilość. Najlepiej rozpuścić próbkę w określonym stężeniu rozpuszczalnika i dodać ją do probówki jako płynny alikwot. Użyj 20 µl 1 mg/ml inozytolu jako wewnętrznego standardu dla każdej probówki z próbką. Ilość wewnętrznego standardu dodana do próbki musi być taka sama, jak ilość wewnętrznego standardu dodana do probówki ze standardem.
Dodaj 8 ml bezwodnego metanolu do fiolki z zakrętką. Następnie 4 ml 3 N. metanolowego roztworu HCl, zamknij i wstrząśnij. W tym procesie nie używa się wody.
Dodaj 500 µl 1 M roztworu HCl metanolu do próbek oligosacharydów i standardowych probówek TMS. Próbki inkubowano przez noc (168 godzin) w temperaturze 80° C. w bloku termicznym. Wysusz produkt metanolizy w temperaturze pokojowej za pomocą kolektora suszącego. Dodaj 200 µl MeOH i ponownie osusz. Ten proces powtarza się dwukrotnie. Dodaj 200 µl metanolu, 100 µl pirydyny i 100 µl bezwodnika octowego do próbki i dobrze wymieszaj. Inkubuj próbki w temperaturze pokojowej przez 30 minut. i osusz. Dodaj 200 µl metanolu i ponownie osusz.
Dodaj 200 µl Tri-Sil i podgrzewaj probówkę z zatyczką przez 20 minut. 80°C, a następnie ostudź do temperatury pokojowej. Użyj kolektora suszącego, aby dodatkowo osuszyć próbkę do objętości około 50 µl. Ważne jest, aby pamiętać, że nie pozwoliliśmy próbkom całkowicie wyschnąć.
Dodaj 2 ml heksanu i dobrze wymieszaj przez wirowanie. Napełnij końcówki pipet Pasteura (5-8 mm) kawałkiem wełny szklanej, wkładając wełnę szklaną na wierzch pipety o średnicy 5-3/4 cala. Próbki wirowano przy 3000 g przez 2 minuty. Wszelkie nierozpuszczalne pozostałości wytrącają się. Wysusz próbkę do 100-150 µl. Objętość około 1 µl wstrzyknięto do GC-MS przy początkowej temperaturze 80 °C i początkowym czasie 2,0 minut (Tabela 2).