Dziękujemy za odwiedzenie Nature.com. Używana przez Ciebie wersja przeglądarki ma ograniczoną obsługę CSS. Aby zapewnić Ci najlepsze wrażenia, zalecamy korzystanie z nowszej wersji przeglądarki (lub wyłączenie trybu zgodności w Internet Explorerze). W międzyczasie, aby zapewnić ciągłą obsługę, będziemy renderować witrynę bez stylów i JavaScriptu.
Nowe metody immunologiczne i spektrometrii mas do kompleksowej analizy trwałych oligosacharydów w słomie kukurydzianej poddanej wstępnej obróbce AFEX. Biomasa lignocelulozowa stanowi zrównoważoną alternatywę dla paliw kopalnych i jest szeroko wykorzystywana w rozwoju biotechnologii do produkcji takich produktów jak żywność, pasze, paliwa i chemikalia. Kluczem do tych technologii jest opracowanie konkurencyjnych cenowo procesów przekształcania złożonych węglowodanów obecnych w ścianach komórkowych roślin w cukry proste, takie jak glukoza, ksyloza i arabinoza. Ponieważ biomasa lignocelulozowa jest bardzo oporna, musi być poddawana obróbce termochemicznej (np. złuszczaniu włókien amoniakiem (AFEX), działaniu rozcieńczonych kwasów (DA), cieczy jonowych (IL)) oraz biologicznej (np. hydrolizie enzymatycznej i fermentacji mikrobiologicznej) w celu uzyskania pożądanego produktu. Jednakże, gdy w procesie hydrolizy stosuje się komercyjne enzymy grzybowe, tylko 75-85% powstających cukrów rozpuszczalnych to monosacharydy, a pozostałe 15-25% to rozpuszczalne, trudne do usunięcia oligosacharydy, które nie zawsze są dostępne dla mikroorganizmów. Wcześniej z powodzeniem wyizolowaliśmy i oczyściliśmy rozpuszczalne, oporne oligosacharydy, stosując połączenie rozdziału węglem i ziemią okrzemkową oraz chromatografii wykluczania wielkości, a także zbadaliśmy ich właściwości hamujące enzymy. Stwierdziliśmy, że oligosacharydy zawierające substytucje kwasu uronowego o wyższym stopniu polimeryzacji (DP) są trudniejsze do przetworzenia za pomocą komercyjnych mieszanek enzymów niż oligosacharydy o niskim stopniu polimeryzacji (DP) i oligosacharydy obojętne. W niniejszym artykule przedstawiamy zastosowanie kilku dodatkowych metod, w tym profilowania glikanów z użyciem przeciwciał monoklonalnych (mAb) specyficznych dla glikanów biomasy roślinnej w celu scharakteryzowania wiązań glikanowych w ścianach komórkowych roślin i hydrolizatach enzymatycznych, desorpcji laserowej wspomaganej matrycą (MAS) oraz spektrometrii masowej z analizą czasu przelotu (TFT). MALDI-TOF-MS wykorzystuje piki diagnostyczne o wysokiej wartości strukturalnej, uzyskane metodą spektroskopii po wtórnym rozpadzie jonów ujemnych, chromatografii gazowej i spektrometrii masowej (GC-MS), do scharakteryzowania wiązań oligosacharydowych z derywatyzacją i bez niej. Ze względu na niewielki rozmiar oligosacharydów (DP 4–20) cząsteczki te są trudne do wykorzystania do wiązania i charakteryzacji przeciwciał monoklonalnych (mAb). Aby rozwiązać ten problem, zastosowaliśmy nową metodę immobilizacji oligosacharydów opartą na koniugacji biotyny, która skutecznie znakowała większość rozpuszczalnych oligosacharydów o niskim DP na powierzchni mikropłytki. Oligosacharydy te zostały następnie wykorzystane w wysokoprzepustowym systemie przeciwciał monoklonalnych (mAb) do analizy specyficznej ligacji. Ta nowa metoda ułatwi w przyszłości opracowanie bardziej zaawansowanych, wysokoprzepustowych testów glikomowych, które będą mogły być wykorzystywane do izolowania i charakteryzowania oligosacharydów obecnych w biomarkerach w celach diagnostycznych.
Biomasa lignocelulozowa, składająca się z materiałów rolniczych, leśnych, trawiastych i drzewnych, jest potencjalnym surowcem do produkcji bioproduktów, w tym żywności, pasz, paliw i prekursorów chemicznych w celu wytwarzania produktów o wyższej wartości1. Węglowodany (takie jak celuloza i hemiceluloza) obecne w ścianach komórkowych roślin są depolimeryzowane do monosacharydów poprzez przetwarzanie chemiczne i biotransformację (takie jak hydroliza enzymatyczna i fermentacja mikrobiologiczna). Typowe obróbki wstępne obejmują ekspansję włókien amoniakowych (AFEX), rozcieńczony kwas (DA), ciecz jonową (IL) i eksplozję parową (SE), które wykorzystują kombinację chemikaliów i ciepła w celu zmniejszenia produkcji lignocelulozy poprzez otwieranie ścian komórkowych roślin3,4. uporczywość materii, 5. Hydroliza enzymatyczna jest przeprowadzana przy wysokim obciążeniu substancjami stałymi z wykorzystaniem komercyjnych enzymów zawierających aktywne węglowodany (CAZymes) i fermentacji mikrobiologicznej z wykorzystaniem drożdży transgenicznych lub bakterii w celu produkcji biopaliw i chemikaliów6.
CAZymy w enzymach komercyjnych składają się ze złożonej mieszaniny enzymów, które synergistycznie rozszczepiają złożone wiązania węglowodanowo-cukrowe, tworząc monosacharydy2,7. Jak informowaliśmy wcześniej, złożona sieć aromatycznych polimerów ligniny z węglowodanami sprawia, że ​​są one wysoce nieusuwalne, co prowadzi do niepełnej konwersji cukru, akumulując 15-25% oligosacharydów płciowych, które nie powstają podczas enzymatycznej hydrolizy wstępnie przetworzonej biomasy. Jest to częsty problem w przypadku różnych metod wstępnej obróbki biomasy. Niektóre z przyczyn tego wąskiego gardła obejmują hamowanie enzymów podczas hydrolizy lub brak lub niski poziom niezbędnych enzymów niezbędnych do rozbicia wiązań cukrowych w biomasie roślinnej. Zrozumienie składu i cech strukturalnych cukrów, takich jak wiązania cukrowe w oligosacharydach, pomoże nam usprawnić konwersję cukru podczas hydrolizy, dzięki czemu procesy biotechnologiczne staną się konkurencyjne cenowo w porównaniu z produktami ropopochodnymi.
Określenie struktury węglowodanów jest trudne i wymaga połączenia metod, takich jak chromatografia cieczowa (LC)11,12, spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR)13, elektroforeza kapilarna (CE)14,15,16 oraz spektrometria mas (MS)17. ,osiemnaście. Metody MS, takie jak spektrometria mas z desorbcją i jonizacją laserową z wykorzystaniem matrycy (MALDI-TOF-MS), są wszechstronną metodą identyfikacji struktur węglowodanów. Ostatnio do identyfikacji odcisków palców odpowiadających pozycjom przyłączenia oligosacharydów, konfiguracjom anomerowym, sekwencjom i pozycjom rozgałęzień najczęściej stosuje się tandemową spektroskopię masową adduktów jonów sodu z dysocjacją indukowaną zderzeniami (CID)20,21.
Analiza glikanów to doskonałe narzędzie do dogłębnej identyfikacji wiązań węglowodanowych22. Metoda ta wykorzystuje przeciwciała monoklonalne (mAb) skierowane przeciwko glikanowi ściany komórkowej roślin jako sondy do zrozumienia złożonych wiązań węglowodanowych. Na całym świecie dostępnych jest ponad 250 mAb, zaprojektowanych przeciwko różnym liniowym i rozgałęzionym oligosacharydom z wykorzystaniem różnych sacharydów24. Kilka mAb zostało szeroko wykorzystanych do scharakteryzowania struktury, składu i modyfikacji ściany komórkowej roślin, ponieważ istnieją znaczne różnice w zależności od rodzaju komórki roślinnej, organu, wieku, stadium rozwoju i środowiska wzrostu25,26. Niedawno metoda ta została wykorzystana do zrozumienia populacji pęcherzyków w systemach roślinnych i zwierzęcych oraz ich roli w transporcie glikanów, określonej przez markery subkomórkowe, stadia rozwojowe lub bodźce środowiskowe, a także do określenia aktywności enzymatycznej. Niektóre ze zidentyfikowanych struktur glikanów i ksylanów obejmują pektynę (P), ksylan (X), mannan (M), ksyloglukany (XylG), glukany o wiązaniach mieszanych (MLG), arabinoksylan (ArbX), galaktomannan (GalG), kwas glukuronowy-arabinoksylan (GArbX) i arabino-galaktan (ArbG)29.
Jednak pomimo tych wszystkich wysiłków badawczych, jedynie kilka badań skupiło się na naturze akumulacji oligosacharydów podczas hydrolizy z wysokim obciążeniem substancjami stałymi (HSL), w tym na uwalnianiu oligosacharydów, zmianach długości łańcucha oligomerycznego podczas hydrolizy, różnych polimerach o niskim DP i ich krzywych rozkładu [30, 31, 32]. Tymczasem, chociaż analiza glikanów okazała się użytecznym narzędziem do kompleksowej analizy struktury glikanów, trudno jest ocenić rozpuszczalne w wodzie oligosacharydy o niskim DP za pomocą metod przeciwciałowych. Mniejsze oligosacharydy o niskim DP, o masie cząsteczkowej poniżej 5–10 kDa, nie wiążą się z płytkami ELISA [33, 34] i są wypłukiwane przed dodaniem przeciwciał.
W niniejszym artykule, po raz pierwszy, prezentujemy test ELISA na płytkach pokrytych awidyną z użyciem przeciwciał monoklonalnych, łączący jednoetapową procedurę biotynylacji rozpuszczalnych, opornych oligosacharydów z analizą glikomu. Nasze podejście do analizy glikomu zostało zweryfikowane za pomocą analizy komplementarnych wiązań oligosacharydowych, opartej na MALDI-TOF-MS i GC-MS, z wykorzystaniem derywatyzacji trimetylosililowej (TMS) hydrolizowanych kompozycji cukrowych. To innowacyjne podejście może w przyszłości zostać rozwinięte jako metoda wysokoprzepustowa i znaleźć szersze zastosowanie w badaniach biomedycznych35.
Potranslacyjne modyfikacje enzymów i przeciwciał, takie jak glikozylacja,36 wpływają na ich aktywność biologiczną. Na przykład zmiany glikozylacji białek surowicy odgrywają istotną rolę w zapaleniu stawów, a zmiany glikozylacji są wykorzystywane jako markery diagnostyczne37. W literaturze opisano występowanie różnych glikanów w różnych chorobach, w tym w przewlekłych chorobach zapalnych przewodu pokarmowego i wątroby, infekcjach wirusowych, raku jajnika, piersi i prostaty38,39,40. Zrozumienie struktury glikanów za pomocą metod ELISA opartych na przeciwciałach zwiększy pewność diagnozy chorób bez konieczności stosowania skomplikowanych metod MS.
Nasze poprzednie badanie wykazało, że uporczywe oligosacharydy pozostały niezhydrolizowane po wstępnej obróbce i hydrolizie enzymatycznej (rysunek 1). W naszej wcześniejszej opublikowanej pracy opracowaliśmy metodę ekstrakcji w fazie stałej z użyciem węgla aktywowanego w celu wyizolowania oligosacharydów z hydrolizatu słomy kukurydzianej (ACSH) poddanego wstępnej obróbce AFEX8. Po wstępnej ekstrakcji i separacji oligosacharydy zostały dodatkowo frakcjonowane metodą chromatografii wykluczania wielkości (SEC) i zebrane według masy cząsteczkowej. Monomery i oligomery cukrów uwolnione z różnych wstępnych obróbek zostały przeanalizowane poprzez analizę składu cukru. Porównując zawartość oligomerów cukrów uzyskanych różnymi metodami wstępnej obróbki, obecność uporczywych oligosacharydów jest częstym problemem w konwersji biomasy do monosacharydów i może prowadzić do zmniejszenia wydajności cukru o co najmniej 10-15%, a nawet do 18%. Metoda ta jest wykorzystywana do dalszej produkcji frakcji oligosacharydów na dużą skalę. Powstały ACH i jego frakcje o różnych masach cząsteczkowych zostały wykorzystane jako materiał eksperymentalny do charakteryzacji oligosacharydów w niniejszej pracy.
Po wstępnej obróbce i hydrolizie enzymatycznej, trwałe oligosacharydy pozostały niezhydrolizowane. W niniejszym przykładzie (A) przedstawiono metodę separacji oligosacharydów, w której oligosacharydy są izolowane z hydrolizatu słomy kukurydzianej (ACSH) poddanego wstępnej obróbce AFEX przy użyciu złoża węgla aktywnego i ziemi okrzemkowej; (B) Metoda separacji oligosacharydów. Oligosacharydy rozdzielono dalej metodą chromatografii wykluczania wielkości (SEC); (C) Monomery i oligomery sacharydów uwolnione z różnych wstępnych obróbek (rozcieńczony kwas: DA, ciecz jonowa: IL i AFEX). Warunki hydrolizy enzymatycznej: wysoka zawartość substancji stałych wynosząca 25% (w/w) (około 8% zawartości glukanu), 96 godzin hydrolizy, 20 mg/g komercyjnej zawartości enzymu (stosunek Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) oraz (D) Monomery cukru i oligomery glukozy, ksylozy i arabinozy uwolnione ze słomy kukurydzianej (ACS) poddanej wstępnej obróbce AFEX.
Analiza glikanów okazała się użytecznym narzędziem do kompleksowej analizy strukturalnej glikanów w ekstraktach izolowanych z pozostałości biomasy stałej. Jednakże, sacharydy rozpuszczalne w wodzie są niedostatecznie reprezentowane w tej tradycyjnej metodzie41, ponieważ oligosacharydy o niskiej masie cząsteczkowej są trudne do immobilizacji na płytkach ELISA i są wypłukiwane przed dodaniem przeciwciała. Dlatego do wiązania i charakteryzacji przeciwciał zastosowano jednoetapową metodę biotynylacji do powlekania rozpuszczalnych, niekompatybilnych oligosacharydów na płytkach ELISA pokrytych awidyną. Metodę tę przetestowano z wykorzystaniem wcześniej wyprodukowanego przez nas ACSH oraz frakcji opartej na jej masie cząsteczkowej (lub stopniu polimeryzacji, DP). Jednoetapową biotynylację zastosowano w celu zwiększenia powinowactwa wiązania oligosacharydów poprzez dodanie hydrazydu biotynylo-LC do redukującego końca węglowodanu (ryc. 2). W roztworze grupa hemiacetalowa na końcu redukującym reaguje z grupą hydrazydową hydrazydu biotyny-LC, tworząc wiązanie hydrazonowe. W obecności czynnika redukującego NaCNBH3 wiązanie hydrazonowe ulega redukcji do stabilnego biotynylowanego produktu końcowego. Dzięki modyfikacji końca redukującego cukier, wiązanie oligosacharydów o niskim DP z płytkami ELISA stało się możliwe, a w naszym badaniu zostało to przeprowadzone na płytkach pokrytych awidyną z użyciem przeciwciał monoklonalnych ukierunkowanych na glikany.
Badanie przesiewowe przeciwciał monoklonalnych w oparciu o test ELISA w kierunku biotynylowanych oligosacharydów. Przedstawiono (A) połączoną biotynylację oligosacharydów i późniejszą analizę przesiewową ELISA z przeciwciałami monoklonalnymi ukierunkowanymi na glikany na płytkach pokrytych NeutrAwidyną oraz (B) jednoetapową procedurę biotynylacji produktów reakcji.
Następnie do przeciwciał pierwotnych i wtórnych dodano płytki pokryte awidyną z przeciwciałami sprzężonymi z oligosacharydami, a następnie przemyto je w medium światłoczułym i wrażliwym na czas. Po całkowitym związaniu przeciwciała, dodano substrat TMB w celu inkubacji płytki. Reakcję ostatecznie zatrzymano kwasem siarkowym. Inkubowane płytki analizowano za pomocą czytnika ELISA w celu określenia siły wiązania każdego przeciwciała i wykrycia specyficznego dla przeciwciała sieciowania. Szczegółowe informacje i parametry eksperymentu znajdują się w odpowiedniej sekcji „Materiały i metody”.
Wykazujemy użyteczność tej nowo opracowanej metody w konkretnych zastosowaniach, charakteryzując rozpuszczalne oligosacharydy obecne w ACSH, a także w surowych i oczyszczonych frakcjach oligosacharydów izolowanych z hydrolizatów lignocelulozowych. Jak pokazano na rysunku 3, najczęściej występującymi ksylanami z substytucją epitopową, identyfikowanymi w ACSH za pomocą metod oznaczania bioacylowanego glikomu, są zazwyczaj arabinogalaktany uronowe (U) lub metylouronowe (MeU) oraz pektynowe. Większość z nich została również zidentyfikowana w naszym poprzednim badaniu dotyczącym analizy glikanów w niehydrolizowanych substancjach stałych (UHS)43.
Wykrywanie opornych epitopów oligosacharydowych za pomocą przeciwciała monoklonalnego skierowanego przeciwko glikanowi ściany komórkowej. Frakcja „obojętna” to frakcja ACN, a frakcja „kwaśna” to frakcja FA. Jaśniejsze odcienie czerwieni na mapie cieplnej oznaczają wyższą zawartość epitopów, a jaśniejsze odcienie błękitu oznaczają puste tło. Wartości kolorów na skali oparte są na surowych wartościach OD dla formulacji N=2. Główne epitopy rozpoznawane przez przeciwciała przedstawiono po prawej stronie.
Te struktury niecelulozowe nie mogły zostać rozszczepione przez najpopularniejsze celulazy i hemicelulazy w testowanej komercyjnej mieszaninie enzymów, która zawiera najczęściej stosowane enzymy komercyjne. Dlatego do ich hydrolizy niezbędne są nowe enzymy pomocnicze. Bez niezbędnych enzymów pomocniczych niecelulozowych, te wiązania niecelulozowe uniemożliwiają całkowitą konwersję do monosacharydów, nawet jeśli ich macierzyste polimery cukrowe są w znacznym stopniu hydrolizowane na krótsze fragmenty i rozpuszczane za pomocą komercyjnych mieszanin enzymów.
Dalsze badania rozkładu sygnału i jego siły wiązania wykazały, że epitopy wiążące były niższe we frakcjach cukru o wysokim DP (A, B, C, DP do 20+) niż we frakcjach o niskim DP (D, E, F, DP) w dimerach (rys. 1). Fragmenty kwasowe są częstsze w epitopach niecelulozowych niż fragmenty obojętne. Zjawiska te są zgodne ze schematem obserwowanym w naszym poprzednim badaniu, gdzie fragmenty o wysokim DP i kwasowe były bardziej odporne na hydrolizę enzymatyczną. Dlatego obecność epitopów glikanowych niecelulozowych oraz podstawień U i MeU może w znacznym stopniu przyczynić się do stabilności oligosacharydów. Należy zauważyć, że wydajność wiązania i wykrywania może być problematyczna w przypadku oligosacharydów o niskim DP, zwłaszcza jeśli epitop jest oligosacharydem dimerycznym lub trimerycznym. Można to przetestować przy użyciu komercyjnych oligosacharydów o różnej długości, z których każdy zawiera tylko jeden epitop wiążący się ze specyficznym przeciwciałem monoklonalnym.
Zatem zastosowanie przeciwciał strukturalnie specyficznych ujawniło pewne rodzaje opornych wiązań. W zależności od rodzaju użytego przeciwciała, odpowiedniego wzoru ligacji oraz siły sygnału, jaki ono wytwarza (najbardziej lub najmniej obficie), nowe enzymy można zidentyfikować i dodać półilościowo do mieszaniny enzymów, aby zapewnić pełniejszą glikokonwersję. Biorąc za przykład analizę oligosacharydów ACSH, możemy stworzyć bazę danych wiązań glikanowych dla każdego materiału biomasy. Należy zauważyć, że należy wziąć pod uwagę różne powinowactwo przeciwciał, a jeśli ich powinowactwo jest nieznane, może to stwarzać pewne trudności przy porównywaniu sygnałów różnych przeciwciał. Ponadto porównanie wiązań glikanowych może działać najlepiej między próbkami dla tego samego przeciwciała. Te oporne wiązania można następnie połączyć z bazą danych CAZyme, na podstawie której możemy identyfikować enzymy, wybierać enzymy kandydujące i testować pod kątem enzymów rozrywających wiązania lub opracowywać systemy mikrobiologiczne do ekspresji tych enzymów do wykorzystania w biorafineriach44.
Aby ocenić, w jaki sposób metody immunologiczne uzupełniają alternatywne metody charakteryzowania oligosacharydów o niskiej masie cząsteczkowej obecnych w hydrolizatach lignocelulozowych, przeprowadziliśmy analizę MALDI (rys. 4, S1-S8) oraz analizę sacharydów pochodzących z TMS w oparciu o GC-MS na tym samym panelu (rys. 5) części oligosacharydowej. MALDI służy do porównania, czy rozkład masy cząsteczek oligosacharydów odpowiada zamierzonej strukturze. Na rys. 4 przedstawiono MS neutralnych składników ACN-A i ACN-B. Analiza ACN-A potwierdziła zakres cukrów pentozowych od DP 4–8 (rys. 4) do DP 22 (rys. S1), których masy odpowiadają oligosacharydom MeU-ksylanowym. Analiza ACN-B potwierdziła szereg pentoz i glukoksylanów o DP 8–15. W materiałach uzupełniających, takich jak rysunek S3, mapy rozkładu masy kwaśnych fragmentów FA-C pokazują zakres podstawionych (Me)U cukrów pentozowych o DP 8–15, co jest zgodne z podstawionymi ksylanami wykrytymi w badaniu przesiewowym przeciwciał monoklonalnych metodą ELISA. Epitopy są spójne.
Widmo MALDI-MS rozpuszczalnych, niezgodnych oligosacharydów obecnych w ACS. W tym przypadku (A) frakcje ACN-A o niskiej masie zawierające metylowany kwas uronowy (DP 4-8) podstawione oligosacharydami glukuroksylanowymi oraz (B) oligosacharydy ksylanowe i metylowane kwasy uronowe ACN-B podstawione glukuroksylanem (DP 8-15).
Analiza składu reszt glikanowych w oligosacharydach opornych. Poniżej (A) Skład sacharydów TMS w różnych frakcjach oligosacharydów uzyskany za pomocą analizy GC-MS. (B) Struktury różnych cukrów pochodzących z TMS obecnych w oligosacharydach. ACN – frakcja acetonitrylu zawierająca obojętne oligosacharydy i FA – frakcja kwasu ferulowego zawierająca kwaśne oligosacharydy.
Kolejny interesujący wniosek wyciągnięto z analizy LC-MS frakcji oligosacharydowej, jak pokazano na rysunku S9 (metody można znaleźć w elektronicznym materiale uzupełniającym). Fragmenty grup heksozy i -OAc były wielokrotnie obserwowane podczas ligacji frakcji ACN-B. Odkrycie to nie tylko potwierdza fragmentację obserwowaną w analizie glikomu i MALDI-TOF, ale także dostarcza nowych informacji na temat potencjalnych pochodnych węglowodanów w wstępnie przetworzonej biomasie lignocelulozowej.
Przeprowadziliśmy również analizę składu glikanów we frakcjach oligosacharydowych, wykorzystując derywatyzację glikanów metodą TMS. Za pomocą GC-MS określiliśmy skład cukrów neuronalnych (niepochodnych) i kwaśnych (GluA i GalA) we frakcji oligosacharydowej (ryc. 5). Kwas glukuronowy znajduje się w kwaśnych składnikach C i D, natomiast kwas galakturonowy w kwaśnych składnikach A i B, które są składnikami cukrów kwaśnych o wysokim DP. Wyniki te nie tylko potwierdzają nasze dane z testów ELISA i MALDI, ale są również zgodne z naszymi wcześniejszymi badaniami nad akumulacją oligosacharydów. Dlatego uważamy, że nowoczesne metody immunologiczne wykorzystujące biotynylację oligosacharydów i późniejsze badania przesiewowe ELISA są wystarczające do wykrycia rozpuszczalnych, opornych oligosacharydów w różnych próbkach biologicznych.
Ponieważ metody przesiewowe przeciwciał monoklonalnych oparte na teście ELISA zostały zweryfikowane kilkoma różnymi metodami, chcieliśmy dalej badać potencjał tej nowej metody ilościowej. Zakupiono dwa komercyjne oligosacharydy: ksyloheksasacharyd oligosacharyd (XHE) i 23-α-L-arabinofuranozylo-ksylotriozę (A2XX), a następnie przetestowano je przy użyciu nowego podejścia opartego na przeciwciałach monoklonalnych ukierunkowanych na glikan ściany komórkowej. Rysunek 6 przedstawia liniową korelację między sygnałem wiązania biotynylowanego a logarytmem stężenia oligosacharydu, co sugeruje możliwy model adsorpcji Langmuira. Wśród przeciwciał monoklonalnych (mAb), CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 i CCRC-M151 korelowały z XHE, a CCRC-M108, CCRC-M109 i LM11 korelowały z A2XX w zakresie od 1 nm do 100 nano. Ze względu na ograniczoną dostępność przeciwciał w trakcie eksperymentu, przeprowadzono ograniczoną liczbę eksperymentów dla każdego stężenia oligosacharydu. Należy zauważyć, że niektóre przeciwciała reagują bardzo odmiennie na ten sam oligosacharyd jako substrat, prawdopodobnie dlatego, że wiążą się z nieznacznie różnymi epitopami i mogą mieć bardzo różne powinowactwa wiązania. Mechanizmy i implikacje dokładnej identyfikacji epitopu będą znacznie bardziej złożone, gdy nowe podejście oparte na przeciwciałach monoklonalnych zostanie zastosowane w rzeczywistych próbkach.
Do określenia zakresu detekcji różnych przeciwciał monoklonalnych (mAb) ukierunkowanych na glikany wykorzystano dwa komercyjne oligosacharydy. W tym przypadku liniowe korelacje z logarytmem stężenia oligosacharydu wskazują na wzorce adsorpcji Langmuira dla (A) XHE z przeciwciałem monoklonalnym i (B) A2XX z przeciwciałem monoklonalnym. Odpowiednie epitopy wskazują na struktury komercyjnych oligosacharydów użytych jako substraty w teście.
Zastosowanie przeciwciał monoklonalnych ukierunkowanych na glikany (analiza glikokomiczna lub przesiewowe badania przeciwciał monoklonalnych metodą ELISA) jest skutecznym narzędziem do dogłębnej charakterystyki większości głównych glikanów ścian komórkowych, które tworzą biomasę roślinną. Jednak klasyczna analiza glikanów charakteryzuje tylko większe glikany ścian komórkowych, ponieważ większość oligosacharydów nie jest skutecznie immobilizowana na płytkach ELISA. W niniejszym badaniu słomę kukurydzianą wstępnie obrobioną AFEX-em poddano enzymatycznej hydrolizie przy wysokiej zawartości substancji stałych. Analiza cukrów została wykorzystana do określenia składu opornych węglowodanów ścian komórkowych w hydrolizacie. Jednak analiza przeciwciał monoklonalnych mniejszych oligosacharydów w hydrolizatach jest niedoceniana i potrzebne są dodatkowe narzędzia do skutecznej immobilizacji oligosacharydów na płytkach ELISA.
Przedstawiamy nową i skuteczną metodę immobilizacji oligosacharydów do badań przesiewowych przeciwciał monoklonalnych (mAb) poprzez połączenie biotynylacji oligosacharydów, a następnie badania przesiewowego ELISA na płytkach pokrytych NeutrAvidin™. Immobilizowane biotynylowane oligosacharydy wykazały wystarczające powinowactwo do przeciwciała, umożliwiając szybkie i skuteczne wykrywanie opornych oligosacharydów. Analiza składu tych opornych oligosacharydów oparta na spektrometrii mas potwierdziła wyniki tego nowego podejścia do immunoscreeningu. Zatem badania te dowodzą, że połączenie biotynylacji oligosacharydów i badania przesiewowego ELISA z użyciem monoklonalnych przeciwciał ukierunkowanych na glikany może być wykorzystane do wykrywania wiązań poprzecznych w oligosacharydach i może być szeroko stosowane w innych badaniach biochemicznych charakteryzujących strukturę oligosacharydów.
Ta oparta na biotynie metoda profilowania glikanów jest pierwszym opracowaniem umożliwiającym badanie opornych wiązań węglowodanowych rozpuszczalnych oligosacharydów w biomasie roślinnej. Pomaga to zrozumieć, dlaczego niektóre części biomasy są tak oporne na produkcję biopaliw. Metoda ta wypełnia istotną lukę w metodach analizy glikomów i rozszerza jej zastosowanie na szerszy zakres substratów wykraczający poza oligosacharydy roślinne. W przyszłości możemy wykorzystać robotykę do biotynylacji i wykorzystać opracowaną przez nas metodę do wysokoprzepustowej analizy próbek za pomocą testu ELISA.
Słoma kukurydziana (CS) wyhodowana z nasion hybrydowych Pioneer 33A14 została zebrana w 2010 roku w Kramer Farms w Ray w stanie Kolorado. Za zgodą właściciela gruntu, biomasa ta może być wykorzystana do badań. Próbki przechowywano w suchych, zamykanych woreczkach strunowych o wilgotności < 6% w temperaturze pokojowej. Próbki przechowywano w suchych, zamykanych woreczkach strunowych o wilgotności < 6% w temperaturze pokojowej. Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре. Próbki przechowywano w suchych, zapinanych na suwak torbach o wilgotności <6% w temperaturze pokojowej.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < 6%. Próbki przechowuje się w woreczkach strunowych w temperaturze pokojowej przy wilgotności < 6%.Badanie było zgodne z lokalnymi i krajowymi wytycznymi. Analizę składu przeprowadzono zgodnie z protokołem NREL. Stwierdzono, że skład zawierał 31,4% glukanu, 18,7% ksylanu, 3,3% arabinanu, 1,2% galaktanu, 2,2% acetylu, 14,3% ligniny, 1,7% białka i 13,4% popiołu.
Cellic® CTec2 (138 mg białka/ml, partia VCNI 0001) to złożona mieszanina celulazy, β-glukozydazy i Cellic® HTec2 (157 mg białka/ml, partia VHN00001) firmy Novozymes (Franklinton, Karolina Północna, USA). Multifect Pectinase® (72 mg białka/ml), złożona mieszanina enzymów degradujących pektyny, została przekazana przez firmę DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, Kalifornia, USA). Stężenia białek enzymatycznych określono, szacując zawartość białka (i odejmując udział azotu niebiałkowego) za pomocą analizy azotu metodą Kjeldahla (metoda AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, Nowy Jork, USA). Ziemię okrzemkową 545 zakupiono w firmie EMD Millipore (Billerica, Massachusetts). Węgiel aktywowany (DARCO, granulki 100 mesh), Avicel (PH-101), ksylan bukowy i wszystkie inne substancje chemiczne zakupiono od firmy Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
Wstępne przetwarzanie metodą AFEX przeprowadzono w GLBRC (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, USA). Wstępne przetwarzanie prowadzono w temperaturze 140°C przez 15 minut. Czas retencji wynosił 46 minut, przy stosunku bezwodnego amoniaku do biomasy 1:1, przy obciążeniu 60% (w/w) w stalowym reaktorze wsadowym (Parr Instruments Company). Trwało to 30 minut. Temperaturę w reaktorze podniesiono do 140°C, a amoniak został szybko uwolniony, co pozwoliło biomasie na szybki powrót do temperatury pokojowej. Skład wstępnie przetworzonej słomy kukurydzianej (ACS) metodą AFEX był podobny do składu nieprzetworzonej słomy kukurydzianej (UT-CS).
ACSH o wysokiej zawartości części stałych (25% w/w) (z około 8% udziałem dekstranu) przygotowano jako materiał wyjściowy do produkcji oligosacharydów na dużą skalę. Hydrolizę enzymatyczną ACS przeprowadzono przy użyciu komercyjnej mieszaniny enzymów, w tym Cellic® Ctec2 10 mg białka/g glukanu (w biomasie poddanej wstępnej obróbce), Htec2 (Novozymes, Franklinton, Karolina Północna), 5 mg białka/g glukanu oraz Multifect Pectinase (Genencor Inc, USA). ), 5 mg białka/g dekstranu. Hydrolizę enzymatyczną przeprowadzono w 5-litrowym bioreaktorze o objętości roboczej 3 litrów, pH 4,8, temperaturze 50°C i prędkości 250 obr./min. Po 96 godzinach hydrolizy, hydrolizat zebrano poprzez wirowanie z prędkością 6000 obr./min przez 30 minut, a następnie z prędkością 14000 obr./min przez 30 minut w celu usunięcia niezhydrolizowanych substancji stałych. Następnie hydrolizat poddano sterylnej filtracji przez zlewkę filtracyjną o średnicy porów 0,22 mm. Przefiltrowany hydrolizat przechowywano w sterylnych butelkach w temperaturze 4°C, a następnie frakcjonowano na węglu aktywnym.
Analiza składu próbek biomasy na bazie ekstraktów zgodnie z procedurami analizy laboratoryjnej NREL: przygotowanie próbek do analizy składu (NREL/TP-510-42620) oraz oznaczanie węglowodanów strukturalnych i ligniny w biomasie (NREL/TP-510 – 42618)47.
Analizę oligosacharydów w strumieniu hydrolizatu przeprowadzono w skali 2 ml, stosując metodę hydrolizy kwasowej w autoklawie. Próbkę hydrolizatu zmieszać z 69,7 µl 72% kwasu siarkowego w 10 ml probówce hodowlanej z zakrętką i inkubować przez 1 godzinę na stole laboratoryjnym w temperaturze 121°C, schłodzić w lodzie i przefiltrować do fiolki do wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC). Stężenie oligosacharydów określono, odejmując stężenie monosacharydów w próbce niehydrolizowanej od całkowitego stężenia cukrów w próbce hydrolizowanej kwasem.
Stężenia glukozy, ksylozy i arabinozy w biomasie poddanej hydrolizie kwasowej analizowano za pomocą systemu chromatografii cieczowej Shimadzu HPLC wyposażonego w autosampler, podgrzewacz kolumny, pompę izokratyczną i detektor współczynnika refrakcji na kolumnie Bio-Rad Aminex HPX-87H. Kolumnę utrzymywano w temperaturze 50°C i eluowano przepływem 0,6 ml/min 5 mM H2SO4 w wodzie.
Nadsącz hydrolizatu rozcieńczono i przeanalizowano pod kątem zawartości monomerów i oligosacharydów. Cukry monomeryczne uzyskane po hydrolizie enzymatycznej analizowano metodą HPLC z kolumną Aminex HPX-87P firmy Bio-Rad (Hercules, Kalifornia) i kolumną zabezpieczającą przed popiołem. Temperaturę kolumny utrzymywano na poziomie 80°C, a jako fazę ruchomą stosowano wodę o przepływie 0,6 ml/min. Oligosacharydy oznaczano metodą hydrolizy w rozcieńczonym kwasie w temperaturze 121°C, zgodnie z metodami opisanymi w pozycjach 41, 48, 49.
Analizę sacharydów przeprowadzono na surowych, wstępnie obrobionych AFEX i wszystkich niehydrolizowanych pozostałościach biomasy (w tym produkcję seryjnych ekstraktów ścian komórkowych i ich przesiewanie mAb) przy użyciu wcześniej opisanych procedur27, 43, 50, 51. Do analizy glikomu, nierozpuszczalne w alkoholu pozostałości materiału ścian komórkowych roślin są przygotowywane z pozostałości biomasy i poddawane seryjnej ekstrakcji przy użyciu coraz bardziej agresywnych odczynników, takich jak szczawian amonu (50 mM), węglan sodu (50 mM i 0,5% w/v), CON. (1M i 4M, oba z 1% w/v borowodorkiem sodu) i chloryn kwasowy, jak opisano wcześniej52,53. Następnie ekstrakty poddano testowi ELISA wobec złożonego panelu mAb50 skierowanych na glikan ściany komórkowej, a reakcje wiązania mAb przedstawiono w postaci mapy cieplnej. Przeciwciała monoklonalne skierowane przeciwko glikanom ścian komórkowych roślin zakupiono z zasobów laboratoryjnych (seria CCRC, JIM i MAC).
Jednoetapowa biotynylacja oligosacharydów. Sprzęganie węglowodanów z hydrazydem biotynylo-LC przeprowadzono zgodnie z poniższą procedurą. Hydrazyd biotynylo-LC (4,6 mg/12 μmol) rozpuszczono w dimetylosulfotlenku (DMSO, 70 μl) poprzez intensywne mieszanie i ogrzewanie w temperaturze 65°C przez 1 minutę. Dodano lodowaty kwas octowy (30 μl), a mieszaninę wylano na cyjanoborowodorek sodu (6,4 mg/100 μmol), który całkowicie rozpuścił się po ogrzewaniu w temperaturze 65°C przez około 1 minutę. Następnie do wysuszonego oligosacharydu dodano od 5 do 8 μl mieszaniny reakcyjnej (1-100 nmol), aby uzyskać 10-krotny lub większy nadmiar molowy znacznika nad końcem redukującym. Reakcję prowadzono w temperaturze 65°C przez 2 godziny, po czym próbki natychmiast oczyszczono. W eksperymentach znakowania nie stosowano cyjanoborowodorku sodu bez redukcji, a próbki poddawano reakcji w temperaturze 65°C przez 2,5 godziny.
Powlekanie i płukanie próbek biotynylowanych oligosacharydów metodą ELISA. Do każdego dołka płytki pokrytej awidyną dodano 25 μl biotynylowanych próbek (100 μl każdej stężonej próbki rozcieńczonej w 5 ml 0,1 M buforu Tris (TBS)). Dołki kontrolne pokryto 50 μl biotyny o stężeniu 10 μg/ml w 0,1 M TBS. Do próby ślepej użyto wody dejonizowanej. Tabletkę inkubowano przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, w ciemności. Płytkę przemyto 3-krotnie 0,1% odtłuszczonym mlekiem w 0,1 M TBS, używając programu nr 11 dla Grenier flat 3A.
Dodanie i płukanie przeciwciał pierwszorzędowych. Dodać 40 µl przeciwciał pierwszorzędowych do każdego dołka. Inkubować mikropłytkę przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, w ciemności. Następnie płytki przemyto 3-krotnie 0,1% mlekiem w 0,1M TBS, stosując program płukania nr 11 dla Grenier Flat 3A.
Dodaj przeciwciało drugorzędowe i przemyj. Dodaj 50 µl mysiego/szczurzego przeciwciała drugorzędowego (rozcieńczonego 1:5000 w 0,1% mleku w 0,1 M TBS) do każdego dołka. Inkubuj mikropłytkę przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, w ciemności. Następnie mikropłytki przemyto 5 razy 0,1% mlekiem w 0,1 M TBS, używając programu do płukania płytek Grenier Flat 5A nr 12.
Dodawanie substratu. Dodać 50 µl 3,3′,5,5′-tetrametylobenzydyny (TMB) do substratu bazowego (poprzez dodanie 2 kropli buforu, 3 kropli TMB i 2 kropli nadtlenku wodoru do 15 ml wody dejonizowanej). Przygotować substrat TMB i zawirować przed użyciem. Inkubować mikropłytkę w temperaturze pokojowej przez 30 minut. W ciemności.
Wykonaj krok i odczytaj wynik. Dodaj 50 µl 1N kwasu siarkowego do każdego dołka i zapisz absorbancję w zakresie od 450 do 655 nm za pomocą czytnika ELISA.
Przygotuj roztwory 1 mg/ml następujących analitów w wodzie dejonizowanej: arabinoza, ramnoza, fukoza, ksyloza, kwas galakturonowy (GalA), kwas glukuronowy (GlcA), mannoza, glukoza, galaktoza, laktoza, N-acetylomannozamina (manNAc), N-acetyloglukozamina (glcNAc), N-acetylogalaktozamina (galNAc), inozytol (standard wewnętrzny). Dwa standardy przygotowano przez dodanie roztworów cukru o stężeniu 1 mg/ml przedstawionych w Tabeli 1. Próbki zamraża się i liofilizuje w temperaturze -80°C do momentu usunięcia całej wody (zwykle około 12–18 godzin).
Dodać 100–500 µg próbki do probówek z zakrętkami na wadze analitycznej. Zanotować dodaną ilość. Najlepiej rozpuścić próbkę w rozpuszczalniku o określonym stężeniu i dodać ją do probówki jako alikwot. Do każdej probówki użyć 20 µl inozytolu o stężeniu 1 mg/ml jako wzorca wewnętrznego. Ilość wzorca wewnętrznego dodanego do próbki musi być taka sama, jak ilość wzorca wewnętrznego dodanego do probówki ze wzorcem.
Dodać 8 ml bezwodnego metanolu do fiolki z zakrętką. Następnie dodać 4 ml 3N roztworu HCl w metanolu, zamknąć i wstrząsnąć. W tym procesie nie używa się wody.
Dodać 500 µl 1 M roztworu HCl w metanolu do próbek oligosacharydów i standardowych probówek TMS. Próbki inkubowano przez noc (168 godzin) w temperaturze 80°C w bloku termicznym. Wysuszyć produkt metanolizy w temperaturze pokojowej za pomocą suszarki. Dodać 200 µl metanolu i ponownie wysuszyć. Proces ten powtórzyć dwukrotnie. Dodać 200 µl metanolu, 100 µl pirydyny i 100 µl bezwodnika octowego do próbki i dobrze wymieszać. Inkubować próbki w temperaturze pokojowej przez 30 minut i wysuszyć. Dodać 200 µl metanolu i ponownie wysuszyć.
Dodać 200 µl Tri-Sil i ogrzewać probówkę zamkniętą korkiem przez 20 minut do 80°C, a następnie schłodzić do temperatury pokojowej. Za pomocą suszarki dosuszać próbkę do objętości około 50 µl. Należy pamiętać, że nie dopuściliśmy do całkowitego wyschnięcia próbek.
Dodać 2 ml heksanu i dobrze wymieszać, wirując. Napełnić końcówki pipet Pasteura (5-8 mm) kawałkiem waty szklanej, umieszczając ją na pipecie o średnicy 5-3/4 cala. Próbki wirowano z prędkością 3000 g przez 2 minuty. Wszelkie nierozpuszczalne pozostałości wytrącają się. Wysuszyć próbkę do objętości 100-150 µl. Objętość około 1 µl wstrzyknięto do chromatografu gazowego GC-MS w temperaturze początkowej 80°C i czasie początkowym 2,0 minut (Tabela 2).