Спасибо за посещение сайта Nature.com. Версия вашего браузера имеет ограниченную поддержку CSS. Для наилучшего взаимодействия с сайтом мы рекомендуем использовать обновлённую версию браузера (или отключить режим совместимости в Internet Explorer). В настоящее время, для обеспечения дальнейшей поддержки, мы будем отображать сайт без стилей и JavaScript.
Новые иммунологические и масс-спектрометрические методы комплексного анализа стойких олигосахаридов в кукурузной соломе, предварительно обработанной AFEX. Лигноцеллюлозная биомасса является устойчивой альтернативой ископаемому топливу и широко используется для разработки биотехнологий производства таких продуктов, как продукты питания, корма, топливо и химические вещества. Ключом к этим технологиям является разработка экономически конкурентоспособных процессов преобразования сложных углеводов, присутствующих в клеточных стенках растений, в простые сахара, такие как глюкоза, ксилоза и арабиноза. Поскольку лигноцеллюлозная биомасса очень устойчива, для получения желаемого продукта ее необходимо подвергать термохимической обработке (например, аммиачной эксфолиации волокон (AFEX), разбавленным кислотам (DA), ионным жидкостям (IL)) и биологической обработке (например, ферментативному гидролизу и микробной ферментации) в сочетании. Однако при использовании коммерческих грибковых ферментов в процессе гидролиза только 75-85% образующихся растворимых сахаров являются моносахаридами, а оставшиеся 15-25% — растворимыми, труднорастворимыми олигосахаридами, которые не всегда доступны микроорганизмам. Ранее мы успешно выделили и очистили растворимые труднорастворимые олигосахариды, используя комбинацию разделения на углероде и диатомитовой земле и эксклюзионной хроматографии, а также исследовали их ингибирующие свойства в отношении ферментов. Мы обнаружили, что олигосахариды, содержащие метилированные уроновые кислоты с более высокой степенью полимеризации (DP), труднее обрабатываются коммерческими ферментными смесями, чем олигосахариды с низкой степенью полимеризации и нейтральные олигосахариды. В данной работе мы описываем использование нескольких дополнительных методов, включая профилирование гликозидов с использованием моноклональных антител (мАт), специфичных для гликозидов растительной биомассы, для характеристики гликозидных связей в клеточных стенках растений и ферментативных гидролизатах, матрично-ассистированную лазерную десорбционную ионизацию и времяпролетную масс-спектрометрию. Метод MALDI-TOF-MS использует структурно-информативные диагностические пики, полученные с помощью спектроскопии после вторичного распада отрицательных ионов, газовой хроматографии и масс-спектрометрии (ГХ-МС), для характеристики олигосахаридных связей с дериватизацией и без нее. Из-за малого размера олигосахаридов (DP 4–20) эти молекулы трудно использовать для связывания и характеристики моноклональных антител. Для решения этой проблемы мы применили новый метод иммобилизации олигосахаридов на основе конъюгации с биотином, который успешно метил большинство растворимых олигосахаридов с низкой степенью DP на поверхности микропланшета, который затем использовался в высокопроизводительной системе моноклональных антител для специфического анализа лигирования. Этот новый метод будет способствовать разработке более совершенных высокопроизводительных анализов гликома в будущем, которые можно будет использовать для выделения и характеристики олигосахаридов, присутствующих в биомаркерах для диагностических целей.
Лигноцеллюлозная биомасса, состоящая из сельскохозяйственных, лесных, травяных и древесных материалов, является потенциальным сырьем для производства биопродуктов, включая продукты питания, корма, топливо и химические прекурсоры для производства продуктов с более высокой добавленной стоимостью1. Углеводы (такие как целлюлоза и гемицеллюлоза), присутствующие в клеточных стенках растений, деполимеризуются в моносахариды путем химической обработки и биотрансформации (например, ферментативного гидролиза и микробной ферментации). Распространенные методы предварительной обработки включают расширение волокон аммиаком (AFEX), разбавленную кислоту (DA), ионную жидкость (IL) и паровой взрыв (SE), которые используют комбинацию химических веществ и тепла для снижения образования лигноцеллюлозы путем вскрытия клеточных стенок растений3,4. Ферментативный гидролиз проводится при высокой загрузке твердых веществ с использованием коммерческих активных ферментов, содержащих углеводы (CAZymes), а микробная ферментация — с использованием трансгенных дрожжей или бактерий для производства биотоплива и химических веществ6.
Ферменты CAZymes в коммерческих препаратах представляют собой сложную смесь ферментов, которые синергически расщепляют сложные углеводно-сахарные связи, образуя моносахариды2,7. Как мы сообщали ранее, сложная сеть ароматических полимеров лигнина с углеводами делает их крайне трудно поддающимися обработке, что приводит к неполному превращению сахаров, накоплению 15-25% олигосахаридов, которые не образуются в процессе ферментативного гидролиза предварительно обработанной биомассы. Это распространенная проблема при различных методах предварительной обработки биомассы. К причинам этого «узкого места» относятся ингибирование ферментов во время гидролиза или отсутствие или низкий уровень необходимых ферментов, которые требуются для расщепления сахарных связей в растительной биомассе. Понимание состава и структурных характеристик сахаров, таких как сахарные связи в олигосахаридах, поможет нам улучшить превращение сахаров во время гидролиза, сделав биотехнологические процессы конкурентоспособными по стоимости с продуктами переработки нефти.
Определение структуры углеводов представляет собой сложную задачу и требует сочетания таких методов, как жидкостная хроматография (ЖХ)11,12, спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР)13, капиллярный электрофорез (КЭ)14,15,16 и масс-спектрометрия (МС)17, восемнадцать. Методы МС, такие как времяпролетная масс-спектрометрия с лазерной десорбцией и ионизацией с использованием матрицы (MALDI-TOF-MS), являются универсальным методом идентификации структур углеводов. В последнее время наиболее широко используется тандемная масс-спектрометрия с диссоциацией, индуцированной столкновениями (CID), аддуктов ионов натрия для идентификации «отпечатков пальцев», соответствующих положениям присоединения олигосахаридов, аномерным конфигурациям, последовательностям и положениям разветвления 20, 21.
Анализ гликанов — превосходный инструмент для углубленной идентификации углеводных связей22. Этот метод использует моноклональные антитела (мАт), направленные против гликанов клеточной стенки растений, в качестве зондов для понимания сложных углеводных связей. В мире доступно более 250 мАт, разработанных против различных линейных и разветвленных олигосахаридов с использованием различных сахаридов24. Несколько мАт широко используются для характеристики структуры, состава и модификаций клеточной стенки растений, поскольку существуют значительные различия в зависимости от типа растительной клетки, органа, возраста, стадии развития и условий роста25,26. В последнее время этот метод используется для понимания популяций везикул в растительных и животных системах и их соответствующей роли в транспорте гликанов, определяемой субклеточными маркерами, стадиями развития или стимулами окружающей среды, а также для определения ферментативной активности. К числу различных структур гликозидов и ксиланов, которые были идентифицированы, относятся пектин (P), ксилан (X), маннан (M), ксилоглюканы (XylG), глюканы со смешанными связями (MLG), арабиноксилан (ArbX), галактоманнан (GalG), глюкуроновая кислота-арабиноксилан (GArbX) и арабиногалактан (ArbG)29.
Однако, несмотря на все эти исследовательские усилия, лишь немногие работы были посвящены изучению природы накопления олигосахаридов во время гидролиза с высокой нагрузкой твердых веществ (HSL), включая высвобождение олигосахаридов, изменения длины олигомерных цепей во время гидролиза, различные полимеры с низкой степенью полимеризации и их распределение кривых 30,31,32. Между тем, хотя анализ гликозидов оказался полезным инструментом для всестороннего анализа структуры гликозидов, оценить водорастворимые олигосахариды с низкой степенью полимеризации с помощью методов с использованием антител сложно. Олигосахариды с меньшей степенью полимеризации и молекулярной массой менее 5-10 кДа не связываются с планшетами ELISA 33, 34 и смываются до добавления антител.
Впервые мы демонстрируем ИФА-анализ на планшетах, покрытых авидином, с использованием моноклональных антител, сочетающий одноэтапную процедуру биотинилирования растворимых труднорастворимых олигосахаридов с анализом гликома. Наш подход к анализу гликома был подтвержден анализом комплементарных олигосахаридных связей с помощью MALDI-TOF-MS и GC-MS с использованием триметилсилильного (TMS) дериватизации гидролизованных сахарных композиций. Этот инновационный подход может быть разработан в будущем как высокопроизводительный метод и найти более широкое применение в биомедицинских исследованиях35.
Посттрансляционные модификации ферментов и антител, такие как гликозилирование,36 влияют на их биологическую активность. Например, изменения в гликозилировании белков сыворотки играют важную роль при воспалительном артрите, а изменения в гликозилировании используются в качестве диагностических маркеров37. В литературе описаны различные гликозиды, которые легко обнаруживаются при различных заболеваниях, включая хронические воспалительные заболевания желудочно-кишечного тракта и печени, вирусные инфекции, рак яичников, молочной железы и предстательной железы38,39,40. Понимание структуры гликозидов с помощью методов ИФА на основе антител обеспечит дополнительную уверенность в диагностике заболеваний без использования сложных методов масс-спектрометрии.
Наше предыдущее исследование показало, что стойкие олигосахариды остаются негидролизованными после предварительной обработки и ферментативного гидролиза (рис. 1). В нашей ранее опубликованной работе мы разработали метод твердофазной экстракции с использованием активированного угля для выделения олигосахаридов из гидролизата кукурузной соломы, предварительно обработанного AFEX (ACSH)8. После первоначальной экстракции и разделения олигосахариды были дополнительно фракционированы методом эксклюзионной хроматографии (SEC) и собраны в порядке убывания молекулярной массы. Мономеры и олигомеры сахаров, высвобожденные из различных вариантов предварительной обработки, были проанализированы методом анализа состава сахаров. При сравнении содержания олигомеров сахаров, полученных различными методами предварительной обработки, наличие стойких олигосахаридов является распространенной проблемой при превращении биомассы в моносахариды и может привести к снижению выхода сахаров как минимум на 10-15% и даже до 18%. Этот метод используется для дальнейшего крупномасштабного производства фракций олигосахаридов. Полученный АХ и его последующие фракции с различной молекулярной массой были использованы в данной работе в качестве экспериментального материала для характеристики олигосахаридов.
После предварительной обработки и ферментативного гидролиза стойкие олигосахариды оставались негидролизованными. Здесь (A) — метод разделения олигосахаридов, при котором олигосахариды выделяются из гидролизата кукурузной соломы, предварительно обработанного AFEX (ACSH), с использованием набивного слоя активированного угля и диатомитовой земли; (B) — метод разделения олигосахаридов. Олигосахариды дополнительно разделялись методом эксклюзионной хроматографии (SEC); (C) — сахаридные мономеры и олигомеры, высвобожденные из различных образцов предварительной обработки (разбавленная кислота: DA, ионная жидкость: IL и AFEX). Условия ферментативного гидролиза: высокая концентрация сухих веществ 25% (масс./масс.) (приблизительно 8% глюкана), 96 часов гидролиза, 20 мг/г коммерческого фермента (соотношение Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) и (D) мономеры и олигомеры сахаров глюкозы, ксилозы и арабинозы, высвобожденные из предварительно обработанной AFEX кукурузной соломы (ACS).
Анализ гликозидов оказался полезным инструментом для всестороннего структурного анализа гликозидов в экстрактах, выделенных из твердых остатков биомассы. Однако водорастворимые сахариды недостаточно представлены при использовании этого традиционного метода41, поскольку низкомолекулярные олигосахариды трудно иммобилизовать на планшетах для ИФА и вымываются до добавления антител. Поэтому для связывания и характеристики антител был использован одноэтапный метод биотинилирования для покрытия растворимых, несовместимых олигосахаридов на планшетах для ИФА, покрытых авидином. Этот метод был протестирован с использованием ранее полученного нами ACSH и фракции, основанной на его молекулярной массе (или степени полимеризации, DP). Одноэтапное биотинилирование использовалось для повышения сродства связывания олигосахаридов путем добавления биотинил-LC-гидразида к восстанавливающему концу углевода (рис. 2). В растворе гемиацетальная группа на восстанавливающем конце реагирует с гидразидной группой биотинил-LC-гидразида, образуя гидразоновую связь. В присутствии восстанавливающего агента NaCNBH3 гидразонная связь восстанавливается до стабильного биотинилированного конечного продукта. Модификация восстанавливающего конца сахара позволила связывать олигосахариды с низкой степенью полимеризации с планшетами для ИФА, и в нашем исследовании это было сделано на планшетах, покрытых авидином, с использованием моноклональных антител, нацеленных на гликаны.
Скрининг моноклональных антител на основе ИФА для биотинилированных олигосахаридов. Здесь (А) сочетает биотинилирование олигосахаридов и последующий скрининг ИФА с использованием гликан-таргетированных моноклональных антител на планшетах, покрытых Нейтравидином, а (B) демонстрирует одноэтапную процедуру биотинилирования продуктов реакции.
Затем к первичным и вторичным антителам добавляли планшеты, покрытые авидином, с конъюгированными с олигосахаридом антителами, после чего планшет промывали в свето- и времячувствительной среде. После завершения связывания антител добавляли субстрат TMB для инкубации планшета. Реакцию в конечном итоге останавливали серной кислотой. Инкубированные планшеты анализировали с помощью ELISA-ридера для определения силы связывания каждого антитела и выявления специфического перекрестного связывания антител. Подробности и параметры эксперимента см. в соответствующем разделе «Материалы и методы».
Мы демонстрируем полезность этого недавно разработанного метода для конкретных применений, характеризуя растворимые олигосахариды, присутствующие в ACSH, а также в неочищенных и очищенных фракциях олигосахаридов, выделенных из лигноцеллюлозных гидролизатов. Как показано на рисунке 3, наиболее распространенными замещенными эпитопами ксиланами, идентифицированными в ACSH с использованием методов анализа биоацилированного гликома, обычно являются уроновые (U) или метилуроновые (MeU) и пектиновые арабиногалактаны. Большинство из них также были обнаружены в нашем предыдущем исследовании по анализу гликозидов негидролизованных твердых веществ (UHS)43.
Обнаружение трудновыводимых олигосахаридных эпитопов с использованием моноклонального антитела, направленного против гликана клеточной стенки. «Нейтральная» фракция — это фракция ацетонитрила (ACN), а «кислая» фракция — фракция фолиевой кислоты (FA). Более яркие красные цвета на тепловой карте указывают на более высокое содержание эпитопов, а более яркие синие — на пустой фон. Цветовые значения на шкале основаны на исходных значениях оптической плотности (OD) для составов N=2. Основные эпитопы, распознаваемые антителами, показаны справа.
Эти нецеллюлозные структуры не могли быть расщеплены наиболее распространенными целлюлазами и гемицеллюлазами из протестированной коммерческой ферментной смеси, которая включает в себя наиболее часто используемые коммерческие ферменты. Следовательно, для их гидролиза необходимы новые вспомогательные ферменты. Без необходимых вспомогательных ферментов для нецеллюлозных связей эти нецеллюлозные связи препятствуют полному превращению в моносахариды, даже если их исходные сахарные полимеры подвергаются обширному гидролизу на более короткие фрагменты и растворяются с использованием коммерческих ферментных смесей.
Дальнейшее изучение распределения сигнала и силы его связывания показало, что количество связывающих эпитопов было ниже во фракциях сахаров с высокой степенью полимеризации (A, B, C, DP до 20+), чем во фракциях с низкой степенью полимеризации (D, E, F, DP в димерах) (рис. 1). Кислотные фрагменты чаще встречаются в нецеллюлозных эпитопах, чем нейтральные фрагменты. Эти явления согласуются с закономерностью, наблюдаемой в нашем предыдущем исследовании, где высокополимерные и кислотные фрагменты были более устойчивы к ферментативному гидролизу. Следовательно, присутствие нецеллюлозных гликанных эпитопов и замещений U и MeU может значительно способствовать стабильности олигосахаридов. Следует отметить, что эффективность связывания и обнаружения может быть проблематичной для олигосахаридов с низкой степенью полимеризации, особенно если эпитоп представляет собой димерный или тримерный олигосахарид. Это можно проверить, используя коммерческие олигосахариды различной длины, каждый из которых содержит только один эпитоп, связывающийся со специфическим моноклональным антителом.
Таким образом, использование структурно-специфических антител позволило выявить определенные типы трудноразлагаемых связей. В зависимости от типа используемого антитела, соответствующей схемы лигирования и силы производимого им сигнала (наиболее и наименее распространенный), можно идентифицировать новые ферменты и полуколичественно добавлять их в ферментную смесь для более полного гликоконверсии. На примере анализа олигосахаридов ACSH можно создать базу данных гликозидных связей для каждого биоматериала. Следует отметить, что необходимо учитывать различную аффинность антител, и если их аффинность неизвестна, это создаст определенные трудности при сравнении сигналов разных антител. Кроме того, сравнение гликозидных связей может быть наиболее эффективным между образцами для одного и того же антитела. Затем эти трудноразлагаемые связи можно связать с базой данных CAZyme, из которой можно идентифицировать ферменты, выбрать ферменты-кандидаты и протестировать ферменты, разрывающие связи, или разработать микробные системы для экспрессии этих ферментов для использования в биоперерабатывающих предприятиях44.
Для оценки того, как иммунологические методы дополняют альтернативные методы характеристики низкомолекулярных олигосахаридов, присутствующих в лигноцеллюлозных гидролизатах, мы провели MALDI (рис. 4, S1-S8) и анализ сахаридов, полученных из TMS, на основе ГХ-МС на той же панели (рис. 5) олигосахаридной части. MALDI используется для сравнения соответствия распределения масс молекул олигосахаридов заданной структуре. На рис. 4 показана масс-спектрометрия нейтральных компонентов ACN-A и ACN-B. Анализ ACN-A подтвердил наличие ряда пентозных сахаров с DP от 4–8 (рис. 4) до DP 22 (рис. S1), массы которых соответствуют олигосахаридам MeU-ксилана. Анализ ACN-B подтвердил наличие пентозных и глюкококсилановых рядов с DP 8–15. В дополнительных материалах, таких как рисунок S3, карты распределения масс кислотного фрагмента FA-C показывают ряд пентозных сахаров, замещенных (Me)U, с DP от 8 до 15, которые соответствуют замещенным ксиланам, обнаруженным при скрининге моноклональных антител на основе ELISA. Эпитопы совпадают.
MALDI-MS спектр растворимых несовместимых олигосахаридов, присутствующих в ACS. Здесь: (A) низкомассовые фракции ACN-A, содержащие метилированные уроновые кислоты (DP 4-8), замещенные глюкуроксилановыми олигосахаридами, и (B) ксилан ACN-B и метилированные уроновые кислоты, замещенные глюкуроксиланом (DP 8-15).
Анализ состава гликозильных остатков труднорастворимых олигосахаридов. Здесь (A) Сахаридный состав ТМС различных фракций олигосахаридов, полученный с помощью ГХ-МС анализа. (B) Структуры различных сахаров, производных ТМС, присутствующих в олигосахаридах. ACN – фракция ацетонитрила, содержащая нейтральные олигосахариды, и FA – фракция феруловой кислоты, содержащая кислые олигосахариды.
Еще один интересный вывод был сделан на основании анализа олигосахаридной фракции методом ЖХ-МС, как показано на рисунке S9 (методы описаны в электронном дополнительном материале). Фрагменты гексозных и -OAc групп неоднократно наблюдались во время лигирования фракции ACN-B. Это открытие не только подтверждает фрагментацию, наблюдаемую в гликоме и анализе MALDI-TOF, но и предоставляет новую информацию о потенциальных производных углеводов в предварительно обработанной лигноцеллюлозной биомассе.
Мы также провели анализ гликозильного состава олигосахаридных фракций с использованием ТМС-дериватизации гликанов. С помощью ГХ-МС мы определили состав нейральных (непроизводных) и кислых сахаров (GluA и GalA) во фракции олигосахаридов (рис. 5). Глюкуроновая кислота обнаружена в кислых компонентах C и D, а галактуроновая кислота — в кислых компонентах A и B, оба из которых являются компонентами с высокой степенью полимеризации (DP) среди кислых сахаров. Эти результаты не только подтверждают наши данные ELISA и MALDI, но и согласуются с нашими предыдущими исследованиями накопления олигосахаридов. Поэтому мы считаем, что современные иммунологические методы с использованием биотинилирования олигосахаридов и последующего скрининга ELISA достаточны для обнаружения растворимых трудноразлагаемых олигосахаридов в различных биологических образцах.
Поскольку методы скрининга моноклональных антител на основе ИФА были подтверждены несколькими различными методами, мы хотели дополнительно изучить потенциал этого нового количественного метода. Были приобретены и протестированы два коммерческих олигосахарида: ксилогексасахарид (XHE) и 23-α-L-арабинофуранозил-ксилотриоза (A2XX), с использованием нового подхода с применением моноклональных антител, нацеленных на гликозильные остатки клеточной стенки. На рисунке 6 показана линейная корреляция между сигналом связывания биотинилированного олигосахарида и логарифмом концентрации олигосахарида, что предполагает возможную модель адсорбции Лангмюра. Среди моноклональных антител CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 и CCRC-M151 коррелировали с XHE, а CCRC-M108, CCRC-M109 и LM11 коррелировали с A2XX в диапазоне от 1 нм до 100 нано. Из-за ограниченного количества антител, доступных во время эксперимента, для каждой концентрации олигосахарида было проведено ограниченное количество экспериментов. Следует отметить, что некоторые антитела реагируют совершенно по-разному на один и тот же олигосахарид в качестве субстрата, предположительно потому, что они связываются с несколько разными эпитопами и могут иметь очень разную аффинность связывания. Механизмы и последствия точной идентификации эпитопов станут гораздо сложнее, когда новый подход с использованием моноклональных антител будет применен к реальным образцам.
Для определения диапазона обнаружения различных моноклональных антител, нацеленных на гликан, были использованы два коммерческих олигосахарида. Здесь линейные корреляции с логарифмом концентрации олигосахарида указывают на картины адсорбции Лангмюра для (A) XHE с моноклональным антителом и (B) A2XX с моноклональным антителом. Соответствующие эпитопы указывают на структуры коммерческих олигосахаридов, используемых в качестве субстратов в анализе.
Использование моноклональных антител, нацеленных на гликозиды (гликокомический анализ или скрининг моноклональных антител на основе ИФА), является мощным инструментом для углубленной характеристики большинства основных гликозидов клеточной стенки, составляющих растительную биомассу. Однако классический анализ гликозидов характеризует только более крупные гликозиды клеточной стенки, поскольку большинство олигосахаридов неэффективно иммобилизуются на планшетах для ИФА. В этом исследовании кукурузная солома, предварительно обработанная AFEX, была подвергнута ферментативному гидролизу при высоком содержании сухих веществ. Анализ сахаров использовался для определения состава трудноразлагаемых углеводов клеточной стенки в гидролизате. Однако анализ моноклональных антител более мелких олигосахаридов в гидролизатах недооценен, и необходимы дополнительные инструменты для эффективной иммобилизации олигосахаридов на планшетах для ИФА.
В данной работе мы описываем новый и эффективный метод иммобилизации олигосахаридов для скрининга моноклональных антител, сочетающий биотинилирование олигосахаридов с последующим ИФА-скринингом на планшетах, покрытых NeutrAvidin™. Иммобилизованные биотинилированные олигосахариды продемонстрировали достаточное сродство к антителу, что позволило быстро и эффективно обнаруживать трудноудаляемые олигосахариды. Анализ состава этих трудноудаляемых олигосахаридов с помощью масс-спектрометрии подтвердил результаты этого нового подхода к иммуноскринингу. Таким образом, эти исследования показывают, что сочетание биотинилирования олигосахаридов и ИФА-скрининга с использованием гликан-направленных моноклональных антител может быть использовано для обнаружения поперечных связей в олигосахаридах и может широко применяться в других биохимических исследованиях, характеризующих структуру олигосахаридов.
Этот метод гликозилирования на основе биотина является первым, позволяющим исследовать трудноразлагаемые углеводные связи растворимых олигосахаридов в растительной биомассе. Это помогает понять, почему некоторые части биомассы так плохо поддаются биопроизводству. Этот метод заполняет важный пробел в методах анализа гликома и расширяет сферу его применения на более широкий круг субстратов, помимо растительных олигосахаридов. В будущем мы можем использовать робототехнику для биотинилирования и применять разработанный нами метод для высокопроизводительного анализа образцов с помощью ИФА.
Кукурузная солома (КС), выращенная из семян гибрида Pioneer 33A14, была собрана в 2010 году на ферме Kramer Farms в городе Рэй, штат Колорадо. С разрешения землевладельца эта биомасса может быть использована для исследований. Образцы хранились в сухих пакетах с застежкой-молнией (< 6% влажности) при комнатной температуре. Образцы хранились в сухих пакетах с застежкой-молнией (< 6% влажности) при комнатной температуре. Образцы хранятся в прохладном месте при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре. Образцы хранились в сухом месте при влажности менее 6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре и влажности < 6%. Образцы хранятся в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре и влажности < 6%.Исследование проводилось в соответствии с местными и национальными рекомендациями. Анализ состава выполнялся с использованием протокола NREL. Было установлено, что состав содержит 31,4% глюкана, 18,7% ксилана, 3,3% арабинана, 1,2% галактана, 2,2% ацетила, 14,3% лигнина, 1,7% белка и 13,4% золы.
Cellic® CTec2 (138 мг белка/мл, партия VCNI 0001) представляет собой сложную смесь целлюлазы, β-глюкозидазы и Cellic® HTec2 (157 мг белка/мл, партия VHN00001) от компании Novozymes (Франклингтон, Северная Каролина, США). Multifect Pectinase® (72 мг белка/мл), сложная смесь ферментов, расщепляющих пектин, была предоставлена ​​компанией DuPont Industrial Biosciences (Пало-Альто, Калифорния, США). Концентрации белка в ферментах определяли путем оценки содержания белка (и вычитания вклада небелкового азота) с использованием анализа азота по Кьельдалю (метод AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Итака, Нью-Йорк, США). Диатомитовая земля 545 была приобретена у компании EMD Millipore (Биллерика, Массачусетс). Активированный уголь (DARCO, гранулы 100 меш), Avicel (PH-101), ксилан бука и все остальные химические реактивы были приобретены у компании Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури).
Предварительная обработка AFEX проводилась в GLBRC (Лаборатория исследований по преобразованию биомассы, Университет штата Мичиган, Лансинг, Мичиган, США). Предварительная обработка осуществлялась при температуре 140°C в течение 15 минут. Время пребывания составляло 46 минут при соотношении безводного аммиака к биомассе 1:1 и загрузке 60% (масс./масс.) в настольном реакторе периодического действия из нержавеющей стали (Parr Instruments Company). Процесс длился 30 минут. Реактор нагревали до 140°C, и аммиак быстро высвобождался, позволяя биомассе быстро вернуться к комнатной температуре. Состав предварительно обработанной AFEX кукурузной соломы (ACS) был аналогичен составу необработанной кукурузной соломы (UT-CS).
Высококонцентрированный ACSH 25% (масс./масс.) (приблизительно 8% декстрана) был приготовлен в качестве исходного материала для крупномасштабного производства олигосахаридов. Ферментативный гидролиз ACS проводили с использованием коммерческой ферментной смеси, включающей Cellic® Ctec2 10 мг белка/г глюкана (в предварительно обработанной биомассе), Htec2 (Novozymes, Франклинтон, Северная Каролина), 5 мг белка/г глюкана и Multifect Pectinase (Genencor Inc, США). Ферментативный гидролиз проводили в 5-литровом биореакторе с рабочим объемом 3 литра, pH 4,8, 50°C и 250 об/мин. После 96 часов гидролиза гидролизат собирали центрифугированием при 6000 об/мин в течение 30 минут, а затем при 14000 об/мин в течение 30 минут для удаления негидролизованных твердых веществ. Затем гидролизат подвергли стерильной фильтрации через фильтровальный стакан с порами 0,22 мм. Отфильтрованный гидролизат хранили в стерильных бутылках при 4°C, а затем фракционировали на активированном угле.
Анализ состава образцов биомассы на основе экстрактов в соответствии с лабораторными процедурами анализа NREL: подготовка образцов для анализа состава (NREL/TP-510-42620) и определение структурных углеводов и лигнина в биомассе (NREL/TP-510 – 42618)47.
Анализ олигосахаридов в потоке гидролизата проводили в масштабе 2 мл с использованием метода кислотного гидролиза в автоклаве. Образец гидролизата смешивали с 69,7 мкл 72% серной кислоты в 10-мл пробирке с завинчивающейся крышкой и инкубировали в течение 1 часа на лабораторном столе при 121 °C, охлаждали на льду и фильтровали в пробирку для высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Концентрацию олигосахаридов определяли путем вычитания концентрации моносахаридов в негидролизованном образце из общей концентрации сахаров в образце, подвергнутом кислотному гидролизу.
Концентрации глюкозы, ксилозы и арабинозы в биомассе, подвергнутой кислотному гидролизу, анализировали с помощью системы ВЭЖХ Shimadzu, оснащенной автосамплером, нагревателем колонки, изократическим насосом и детектором показателя преломления, на колонке Bio-Rad Aminex HPX-87H. Колонку поддерживали при температуре 50°C, элюирование проводили со скоростью 0,6 мл/мин 5 мМ H2SO4 в воде.
Надосадочную жидкость гидролизата разбавляли и анализировали на содержание мономеров и олигосахаридов. Мономерные сахара, полученные после ферментативного гидролиза, анализировали методом ВЭЖХ с использованием колонки Bio-Rad (Геркулес, Калифорния) Aminex HPX-87P и защитной колонки с золой. Температуру колонки поддерживали на уровне 80°C, в качестве подвижной фазы использовали воду со скоростью потока 0,6 мл/мин. Олигосахариды определяли путем гидролиза в разбавленной кислоте при 121°C согласно методам, описанным в ссылках 41, 48, 49.
Анализ сахаридов проводили на необработанных, предварительно обработанных AFEX и всех негидролизованных остатках биомассы (включая получение серийных экстрактов клеточной стенки и их скрининг моноклональных антител) с использованием ранее описанных процедур 27, 43, 50, 51. Для анализа гликома спиртонерастворимые остатки материала клеточной стенки растений получали из остатков биомассы и подвергали последовательной экстракции с использованием все более агрессивных реагентов, таких как оксалат аммония (50 мМ), карбонат натрия (50 мМ и 0,5% мас./об.), CON (1М и 4М, оба с 1% мас./об. борогидрида натрия) и хлорит кислоты, как описано ранее 52, 53. Затем экстракты подвергали ИФА с использованием сложной панели моноклональных антител 50-го порядка, направленных на гликан клеточной стенки, а реакции связывания моноклональных антител представляли в виде тепловой карты. Моноклональные антитела, нацеленные на гликан клеточной стенки растений, были приобретены из лабораторных запасов (серии CCRC, JIM и MAC).
Одностадийное биотинилирование олигосахаридов. Конъюгацию углеводов с биотинил-ЖК-гидразидом проводили по следующей процедуре. Биотинил-ЖК-гидразид (4,6 мг/12 мкмоль) растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО, 70 мкл) при интенсивном перемешивании и нагревании при 65°C в течение 1 мин. Добавляли ледяную уксусную кислоту (30 мкл), и смесь выливали на цианоборогидрид натрия (6,4 мг/100 мкмоль), который полностью растворялся после нагревания при 65°C в течение примерно 1 мин. Затем от 5 до 8 мкл реакционной смеси добавляли к высушенному олигосахариду (1-100 нмоль) для получения 10-кратного или более высокого молярного избытка метки по отношению к восстанавливающему концу. Реакцию проводили при 65°C в течение 2 ч, после чего образцы немедленно очищали. В экспериментах по мечению без восстановления не использовался цианоборогидрид натрия, а образцы подвергались реакции при 65°C в течение 2,5 часов.
Покрытие и промывка образцов биотинилированных олигосахаридов для ИФА. В каждую лунку планшета с покрытием из авидина добавляли 25 мкл биотинилированных образцов (100 мкл каждого концентрированного образца, разбавленного в 5 мл 0,1 М Трис-буферного раствора (TBS)). Контрольные лунки покрывали 50 мкл биотина в концентрации 10 мкг/мл в 0,1 М TBS. В качестве покрытия для контрольных измерений использовали деионизированную воду. Планшет инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре в темноте. Планшет промывали 3 раза 0,1% обезжиренным молоком в 0,1 М TBS, используя программу № 11 для Grenier flat 3A.
Добавление и промывка первичных антител. Добавьте 40 мкл первичных антител в каждую лунку. Инкубируйте микропланшет в течение 1 часа при комнатной температуре в темноте. Затем планшеты промывали 3 раза 0,1%-ным молоком в 0,1М TBS, используя программу промывки № 11 для Grenier Flat 3A.
Добавьте вторичные антитела и промойте. Добавьте в каждую лунку 50 мкл вторичных антител мыши/крысы (разведенных в соотношении 1:5000 в 0,1% молоке в 0,1 М TBS). Инкубируйте микропланшет в течение 1 часа при комнатной температуре в темноте. Затем микропланшеты промывали 5 раз 0,1% молоком в 0,1 М TBS, используя программу промывки планшетов Grenier Flat 5A № 12.
Добавление субстрата. Добавьте 50 мкл 3,3′,5,5′-тетраметилбензидина (ТМБ) к основному субстрату (добавив 2 капли буфера, 3 капли ТМБ, 2 капли перекиси водорода в 15 мл деионизированной воды). Подготовьте субстрат ТМБ и перемешайте на вортексе перед использованием. Инкубируйте микропланшет при комнатной температуре в течение 30 минут в темноте.
Выполните этот шаг и считайте показания таблетки. Добавьте 50 мкл 1 N серной кислоты в каждую лунку и запишите значение абсорбции в диапазоне от 450 до 655 нм с помощью ELISA-ридера.
Приготовьте растворы следующих аналитов с концентрацией 1 мг/мл в деионизированной воде: арабиноза, рамноза, фукоза, ксилоза, галактуроновая кислота (GalA), глюкуроновая кислота (GlcA), манноза, глюкоза, галактоза, лактоза, N-ацетилманнозамин (manNAc), N-ацетилглюкозамин (glcNAc), N-ацетилгалактозамин (galNAc), инозитол (внутренний стандарт). Два стандарта были приготовлены путем добавления растворов сахаров с концентрацией 1 мг/мл, указанных в таблице 1. Образцы замораживают и лиофилизируют при -80°C до полного удаления воды (обычно около 12-18 часов).
Добавьте 100–500 мкг образца в пробирки с завинчивающимися крышками на аналитических весах. Запишите добавленное количество. Лучше всего растворить образец в растворителе определенной концентрации и добавить его в пробирку в виде жидкой аликвоты. Используйте 20 мкл инозитола концентрацией 1 мг/мл в качестве внутреннего стандарта для каждой пробирки с образцом. Количество внутреннего стандарта, добавленного к образцу, должно быть таким же, как и количество внутреннего стандарта, добавленного в стандартную пробирку.
В пробирку с завинчивающейся крышкой налейте 8 мл безводного метанола. Затем добавьте 4 мл 3 N метанольного раствора HCl, пробирку закройте крышкой и встряхните. В этом процессе вода не используется.
Добавьте 500 мкл 1 М раствора HCl в метаноле к образцам олигосахаридов и стандартным пробиркам с ТМС. Образцы инкубировали в течение ночи (168 часов) при 80°C в термоблоке. Высушите продукт метанолиза при комнатной температуре с помощью сушильного коллектора. Добавьте 200 мкл метанола и снова высушите. Этот процесс повторяют дважды. Добавьте 200 мкл метанола, 100 мкл пиридина и 100 мкл уксусного ангидрида к образцу и тщательно перемешайте. Инкубируйте образцы при комнатной температуре в течение 30 минут и высушите. Добавьте 200 мкл метанола и снова высушите.
Добавьте 200 мкл Tri-Sil и закройте пробирку крышкой, нагрев до 80°C в течение 20 минут, затем охладите до комнатной температуры. Используйте сушильный коллектор для дальнейшего высушивания образца до объема приблизительно 50 мкл. Важно отметить, что мы не давали образцам полностью высохнуть.
Добавьте 2 мл гексана и тщательно перемешайте с помощью вихревого перемешивания. Наполните кончики пипеток Пастера (5-8 мм) кусочком стеклянной ваты, поместив ее на пипетку диаметром 5-3/4 дюйма. Образцы центрифугировали при 3000 g в течение 2 минут. Все нерастворимые остатки выпадают в осадок. Высушите образец до 100-150 мкл. Примерно 1 мкл образца вводили в ГХ-МС при начальной температуре 80 °C и начальном времени 2,0 минуты (таблица 2).