Спасибо за посещение Nature.com. Версия браузера, которую вы используете, имеет ограниченную поддержку CSS. Для наилучшего опыта мы рекомендуем вам использовать обновленный браузер (или отключить режим совместимости в Internet Explorer). В то же время, чтобы обеспечить постоянную поддержку, мы будем отображать сайт без стилей и JavaScript.
Новые иммунологические и масс-спектрометрические методы комплексного анализа стойких олигосахаридов в кукурузной соломе, предварительно обработанной AFEX. Лигноцеллюлозная биомасса является устойчивой альтернативой ископаемому топливу и широко используется для разработки биотехнологий для производства таких продуктов, как продукты питания, корма, топливо и химикаты. Ключом к этим технологиям является разработка экономически конкурентоспособных процессов преобразования сложных углеводов, присутствующих в стенках растительных клеток, в простые сахара, такие как глюкоза, ксилоза и арабиноза. Поскольку лигноцеллюлозная биомасса очень упряма, ее необходимо подвергать термохимической обработке (например, аммиачному волокнистому шелушению (AFEX), разбавленным кислотам (DA), ионным жидкостям (IL)) и биологической обработке (например, ферментативному гидролизу и микробной ферментации) в сочетании для получения желаемого продукта. Однако при использовании коммерческих грибковых ферментов в процессе гидролиза только 75-85% образующихся растворимых сахаров являются моносахаридами, а оставшиеся 15-25% - растворимыми, труднообрабатываемыми олигосахаридами, которые не всегда доступны для микроорганизмов. Ранее мы успешно изолировали и очистили растворимые труднообрабатываемые олигосахариды, используя комбинацию разделения на углероде и диатомовой земле и эксклюзионной хроматографии, а также исследовали их ингибирующие ферменты свойства. Мы обнаружили, что олигосахариды, содержащие более высокую степень полимеризации (DP) метилированных замещений уроновой кислоты, сложнее обрабатывать коммерческими смесями ферментов, чем олигосахариды с низкой DP и нейтральные олигосахариды. Здесь мы сообщаем об использовании нескольких дополнительных методов, включая гликановое профилирование с использованием моноклональных антител (mAbs), специфичных для гликанов растительной биомассы, для характеристики гликановых связей в стенках растительных клеток и ферментативных гидролизатах, матрично-ассистированную лазерную десорбционную ионизацию, времяпролетную масс-спектрометрию. MALDI-TOF-MS) использует структурно-информативные диагностические пики, полученные с помощью спектроскопии после вторичного распада отрицательных ионов, газовой хроматографии и масс-спектрометрии (ГХ-МС) для характеристики олигосахаридных связей с дериватизацией и без нее. Из-за небольшого размера олигосахаридов (DP 4–20) эти молекулы трудно использовать для связывания и характеристики mAb. Чтобы преодолеть эту проблему, мы применили новый метод иммобилизации олигосахаридов на основе конъюгации биотина, который успешно пометил большинство растворимых олигосахаридов с низкой DP на поверхности микропланшета, который затем использовался в высокопроизводительной системе mAb для специфического анализа лигирования. Этот новый метод будет способствовать разработке более совершенных высокопроизводительных анализов гликома в будущем, которые можно будет использовать для выделения и характеристики олигосахаридов, присутствующих в биомаркерах, в диагностических целях.
Лигноцеллюлозная биомасса, состоящая из сельскохозяйственных, лесных, травяных и древесных материалов, является потенциальным сырьем для производства биопродуктов, включая продукты питания, корма, топливо и химические прекурсоры для производства более ценных продуктов1. Углеводы (такие как целлюлоза и гемицеллюлоза), присутствующие в стенках растительных клеток, деполимеризуются в моносахариды путем химической обработки и биотрансформации (например, ферментативный гидролиз и микробная ферментация). Обычные предварительные обработки включают расширение волокон аммиаком (AFEX), разбавленную кислоту (DA), ионную жидкость (IL) и паровой взрыв (SE), которые используют комбинацию химикатов и тепла для снижения производства лигноцеллюлозы путем открытия стенок растительных клеток3,4. упрямство вещества, 5. Ферментативный гидролиз проводится при высокой нагрузке твердых веществ с использованием коммерческих активных углеводсодержащих ферментов (CAZymes) и микробной ферментации с использованием трансгенных дрожжей или бактерий для производства биотоплива и химикатов6.
CAZymes в коммерческих ферментах состоят из сложной смеси ферментов, которые синергически расщепляют сложные связи углевод-сахар с образованием моносахаридов2,7. Как мы сообщали ранее, сложная сеть ароматических полимеров лигнина с углеводами делает их крайне неподатливыми, что приводит к неполному преобразованию сахара, накапливая 15-25% половых олигосахаридов, которые не производятся во время ферментативного гидролиза предварительно обработанной биомассы. Это распространенная проблема с различными методами предварительной обработки биомассы. Некоторые причины этого узкого места включают ингибирование ферментов во время гидролиза или отсутствие или низкие уровни основных основных ферментов, которые требуются для разрыва связей сахара в растительной биомассе. Понимание состава и структурных характеристик сахаров, таких как связи сахара в олигосахаридах, поможет нам улучшить преобразование сахара во время гидролиза, делая биотехнологические процессы экономически конкурентоспособными с продуктами, полученными из нефти.
Определение структуры углеводов является сложной задачей и требует сочетания таких методов, как жидкостная хроматография (ЖХ)11,12, ядерно-магнитно-резонансная спектроскопия (ЯМР)13, капиллярный электрофорез (КЭ)14,15,16 и масс-спектрометрия (МС)17. ,восемнадцать. Методы МС, такие как времяпролетная масс-спектрометрия с лазерной десорбцией и ионизацией с использованием матрицы (MALDI-TOF-MS), являются универсальным методом идентификации углеводных структур. В последнее время тандемная МС с диссоциацией, вызванной столкновениями (CID), аддуктов ионов натрия наиболее широко используется для идентификации отпечатков пальцев, соответствующих положениям присоединения олигосахаридов, аномерным конфигурациям, последовательностям и положениям разветвления20,21.
Анализ гликанов является прекрасным инструментом для углубленной идентификации углеводных связей22. Этот метод использует моноклональные антитела (mAbs), направленные на гликан клеточной стенки растений в качестве зондов для понимания сложных углеводных связей. Во всем мире доступно более 250 mAbs, разработанных против различных линейных и разветвленных олигосахаридов с использованием различных сахаридов24. Несколько mAbs широко использовались для характеристики структуры, состава и модификаций клеточной стенки растений, поскольку существуют значительные различия в зависимости от типа растительной клетки, органа, возраста, стадии развития и среды роста25,26. Совсем недавно этот метод использовался для понимания популяций везикул в растительных и животных системах и их соответствующих ролей в транспорте гликанов, определяемых субклеточными маркерами, стадиями развития или стимулами окружающей среды, а также для определения ферментативной активности. Некоторые из различных структур гликанов и ксиланов, которые были идентифицированы, включают пектин (P), ксилан (X), маннан (M), ксилоглюканы (XylG), глюканы со смешанными связями (MLG), арабиноксилан (ArbX), галактоманнан (GalG), глюкуроновую кислоту-арабиноксилан (GArbX) и арабино-галактан (ArbG)29.
Однако, несмотря на все эти исследовательские усилия, только несколько исследований были сосредоточены на природе накопления олигосахаридов во время гидролиза с высокой нагрузкой твердых веществ (HSL), включая высвобождение олигосахаридов, изменения длины олигомерной цепи во время гидролиза, различные полимеры с низкой DP и их кривые. распределения 30,31,32. Между тем, хотя анализ гликанов оказался полезным инструментом для всестороннего анализа структуры гликанов, трудно оценить водорастворимые олигосахариды с низкой DP с помощью методов антител. Более мелкие олигосахариды DP с молекулярной массой менее 5-10 кДа не связываются с планшетами ELISA 33, 34 и смываются перед добавлением антител.
Здесь мы впервые демонстрируем анализ ELISA на покрытых авидином пластинах с использованием моноклональных антител, объединяющий одношаговую процедуру биотинилирования растворимых рефрактерных олигосахаридов с анализом гликома. Наш подход к анализу гликома был подтвержден с помощью анализа комплементарных олигосахаридных связей на основе MALDI-TOF-MS и GC-MS с использованием триметилсилиловой (TMS) дериватизации гидролизованных сахарных композиций. Этот инновационный подход может быть разработан как высокопроизводительный метод в будущем и найти более широкое применение в биомедицинских исследованиях35.
Посттрансляционные модификации ферментов и антител, такие как гликозилирование,36 влияют на их биологическую активность. Например, изменения в гликозилировании сывороточных белков играют важную роль при воспалительном артрите, а изменения в гликозилировании используются в качестве диагностических маркеров37. В литературе сообщалось о том, что различные гликаны легко появляются при различных заболеваниях, включая хронические воспалительные заболевания желудочно-кишечного тракта и печени, вирусные инфекции, рак яичников, молочной железы и простаты38,39,40. Понимание структуры гликанов с использованием методов ИФА на основе антител гликанов обеспечит дополнительную уверенность в диагностике заболеваний без использования сложных методов МС.
Наше предыдущее исследование показало, что стойкие олигосахариды остались негидролизованными после предварительной обработки и ферментативного гидролиза (рисунок 1). В нашей ранее опубликованной работе мы разработали метод твердофазной экстракции активированным углем для выделения олигосахаридов из гидролизата кукурузной соломы, предварительно обработанного AFEX (ACSH)8. После первоначальной экстракции и разделения олигосахариды были дополнительно фракционированы с помощью эксклюзионной хроматографии (SEC) и собраны в порядке молекулярной массы. Мономеры и олигомеры сахаров, высвобождаемые в результате различных предварительных обработок, были проанализированы с помощью анализа состава сахара. При сравнении содержания олигомеров сахаров, полученных различными методами предварительной обработки, наличие стойких олигосахаридов является распространенной проблемой при преобразовании биомассы в моносахариды и может привести к снижению выхода сахара не менее чем на 10-15% и даже до 18%. США. Этот метод используется для дальнейшего крупномасштабного производства фракций олигосахаридов. Полученный АЦХ и его последующие фракции с различной молекулярной массой были использованы в качестве экспериментального материала для характеристики олигосахаридов в данной работе.
После предварительной обработки и ферментативного гидролиза стойкие олигосахариды остались негидролизованными. Здесь (A) — метод разделения олигосахаридов, при котором олигосахариды выделяются из гидролизата кукурузной соломы, предварительно обработанного AFEX (ACSH), с использованием уплотненного слоя активированного угля и диатомовой земли; (B) Метод разделения олигосахаридов. Олигосахариды далее разделялись с помощью эксклюзионной хроматографии (SEC); (C) Мономеры и олигомеры сахарида, высвобождаемые из различных предварительных обработок (разбавленная кислота: DA, ионная жидкость: IL и AFEX). Условия ферментативного гидролиза: высокая загрузка твердых веществ 25% (по массе) (приблизительно 8% загрузки глюкана), 96 часов гидролиза, 20 мг/г коммерческой загрузки фермента (соотношение Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) и (D) мономеры сахаров и олигомеры глюкозы, ксилозы и арабинозы, выделенные из предварительно обработанной AFEX кукурузной соломы (ACS).
Анализ гликанов оказался полезным инструментом для комплексного структурного анализа гликанов в экстрактах, выделенных из твердых остатков биомассы. Однако водорастворимые сахариды недостаточно представлены при использовании этого традиционного метода41, поскольку низкомолекулярные олигосахариды трудно иммобилизовать на планшетах ELISA и вымываются перед добавлением антител. Поэтому для связывания антител и характеристики использовался одношаговый метод биотинилирования для покрытия растворимых, несовместимых олигосахаридов на покрытых авидином планшетах ELISA. Этот метод был протестирован с использованием нашего ранее полученного ACSH и фракции, основанной на его молекулярной массе (или степени полимеризации, DP). Одношаговое биотинилирование использовалось для увеличения сродства связывания олигосахаридов путем добавления биотин-LC-гидразида к восстанавливающему концу углевода (рис. 2). В растворе полуацетальная группа на восстанавливающем конце реагирует с гидразидной группой биотин-LC-гидразида с образованием гидразоновой связи. В присутствии восстановителя NaCNBH3 гидразоновая связь восстанавливается до стабильного биотинилированного конечного продукта. С модификацией восстанавливающего конца сахара стало возможным связывание олигосахаридов с низкой DP на планшетах ELISA, и в нашем исследовании это было сделано на покрытых авидином планшетах с использованием гликан-таргетных mAbs.
Скрининг моноклональных антител на основе ИФА для биотинилированных олигосахаридов. Здесь (A) комбинированное биотинилирование олигосахаридов и последующий скрининг ИФА с гликан-таргетными моноклональными антителами на покрытых нейтравидином планшетах, а (B) демонстрирует одноэтапную процедуру биотинилирования продуктов реакции.
Затем к первичным и вторичным антителам добавляли покрытые авидином планшеты с конъюгированными с олигосахаридом антителами и промывали в свето- и времячувствительной среде. После завершения связывания антител добавляли субстрат ТМБ для инкубации планшета. Реакцию окончательно останавливали серной кислотой. Инкубированные планшеты анализировали с помощью ридера ELISA для определения силы связывания каждого антитела с целью обнаружения специфического для антител перекрестного связывания. Подробности и параметры эксперимента см. в соответствующем разделе «Материалы и методы».
Мы демонстрируем полезность этого недавно разработанного метода для конкретных приложений, характеризуя растворимые олигосахариды, присутствующие в ACSH, а также в сырых и очищенных фракциях олигосахаридов, выделенных из лигноцеллюлозных гидролизатов. Как показано на рисунке 3, наиболее распространенными эпитоп-замещенными ксиланами, идентифицированными в ACSH с использованием методов анализа биоацилированного гликома, обычно являются уроновые (U) или метилуроновые (MeU) и пектиновые арабиногалактаны. Большинство из них также были обнаружены в нашем предыдущем исследовании по анализу гликанов негидролизованных твердых веществ (UHS)43.
Обнаружение неподатливых олигосахаридных эпитопов с использованием моноклонального антитела, направленного на гликан клеточной стенки. «Нейтральная» фракция — это фракция ACN, а «кислая» фракция — это фракция FA. Более яркие красные цвета на тепловой карте указывают на более высокое содержание эпитопа, а более яркие синие цвета указывают на пустой фон. Цветовые значения на шкале основаны на необработанных значениях OD для составов N=2. Основные эпитопы, распознаваемые антителами, показаны справа.
Эти нецеллюлозные структуры не могли быть расщеплены наиболее распространенными целлюлазами и гемицеллюлазами в протестированной коммерческой смеси ферментов, которая включает наиболее часто используемые коммерческие ферменты. Поэтому для их гидролиза требуются новые вспомогательные ферменты. Без необходимых нецеллюлозных вспомогательных ферментов эти нецеллюлозные связи препятствуют полному превращению в моносахариды, даже если их исходные полимеры сахаров широко гидролизуются на более короткие фрагменты и растворяются с использованием коммерческих смесей ферментов.
Дальнейшее изучение распределения сигнала и его силы связывания показало, что связывающие эпитопы были ниже во фракциях сахара с высокой DP (A, B, C, DP до 20+), чем во фракциях с низкой DP (D, E, F, DP) в димерах (рис. 1). Кислотные фрагменты чаще встречаются в нецеллюлозных эпитопах, чем в нейтральных. Эти явления согласуются с картиной, наблюдавшейся в нашем предыдущем исследовании, где высокие DP и кислотные фрагменты были более устойчивы к ферментативному гидролизу. Следовательно, наличие нецеллюлозных гликановых эпитопов и замен U и MeU может в значительной степени способствовать стабильности олигосахаридов. Следует отметить, что эффективность связывания и обнаружения может быть проблематичной для олигосахаридов с низкой DP, особенно если эпитоп представляет собой димерный или тримерный олигосахарид. Это можно проверить с использованием коммерческих олигосахаридов разной длины, каждый из которых содержит только один эпитоп, который связывается с определенным mAb.
Таким образом, использование структурно-специфических антител выявило определенные типы неподатливых связей. В зависимости от типа используемого антитела, соответствующей схемы лигирования и силы сигнала, который он производит (наиболее и наименее распространенный), новые ферменты могут быть идентифицированы и добавлены полуколичественно к смеси ферментов для более полной гликоконверсии. Взяв в качестве примера анализ олигосахаридов ACSH, мы можем создать базу данных гликановых связей для каждого материала биомассы. Здесь следует отметить, что следует учитывать различную аффинность антител, и если их аффинность неизвестна, это создаст определенные трудности при сравнении сигналов разных антител. Кроме того, сравнение гликановых связей может работать лучше всего между образцами для одного и того же антитела. Затем эти неподатливые связи можно связать с базой данных CAZyme, из которой мы можем идентифицировать ферменты, выбирать кандидатные ферменты и тестировать ферменты, разрывающие связи, или разрабатывать микробные системы для экспрессии этих ферментов для использования на биоперерабатывающих заводах44.
Чтобы оценить, как иммунологические методы дополняют альтернативные методы для характеристики низкомолекулярных олигосахаридов, присутствующих в лигноцеллюлозных гидролизатах, мы провели MALDI (рис. 4, S1-S8) и анализ сахаридов, полученных из TMS, на основе ГХ-МС на той же панели (рис. 5) олигосахаридной части. MALDI используется для сравнения того, соответствует ли распределение масс молекул олигосахаридов предполагаемой структуре. На рис. 4 показана MS нейтральных компонентов ACN-A и ACN-B. Анализ ACN-A подтвердил диапазон пентозных сахаров от DP 4–8 (рис. 4) до DP 22 (рис. S1), веса которых соответствуют олигосахаридам MeU-ксилана. Анализ ACN-B подтвердил ряд пентозы и глюкоксилана с DP 8-15. В дополнительных материалах, таких как Рисунок S3, карты распределения массы кислотных фрагментов FA-C показывают ряд замещенных пентозных сахаров (Me)U с DP 8-15, которые согласуются с замещенными ксиланами, обнаруженными при скрининге mAb на основе ELISA. Эпитопы согласуются.
Спектр MALDI-MS растворимых несоответствующих олигосахаридов, присутствующих в ACS. Здесь (A) фракции ACN-A с низким диапазоном веса, содержащие метилированную уроновую кислоту (DP 4-8), замещенные глюкуроксиланом олигосахариды и (B) ACN-B ксилан и метилированные олигосахариды уроновой кислоты, замещенные глюкуроксиланом (DP 8-15).
Анализ состава гликанового остатка рефрактерных олигосахаридов. Здесь (A) сахаридный состав TMS различных фракций олигосахаридов, полученный с помощью анализа ГХ-МС. (B) Структуры различных сахаров, полученных из TMS, присутствующих в олигосахаридах. ACN — ацетонитрильная фракция, содержащая нейтральные олигосахариды, а FA — фракция феруловой кислоты, содержащая кислые олигосахариды.
Еще один интересный вывод был сделан из анализа LC-MS фракции олигосахаридов, как показано на рисунке S9 (методы можно увидеть в электронном дополнительном материале). Фрагменты гексозных и -OAc групп неоднократно наблюдались во время лигирования фракции ACN-B. Это открытие не только подтверждает фрагментацию, наблюдаемую в анализе гликома и MALDI-TOF, но и предоставляет новую информацию о потенциальных производных углеводов в предварительно обработанной лигноцеллюлозной биомассе.
Мы также провели анализ состава гликанов фракций олигосахаридов с использованием дериватизации гликанов TMS. Используя ГХ-МС, мы определили состав нейральных (непроизводных) и кислых сахаров (GluA и GalA) во фракции олигосахаридов (рис. 5). Глюкуроновая кислота обнаружена в кислых компонентах C и D, тогда как галактуроновая кислота обнаружена в кислых компонентах A и B, оба из которых являются компонентами с высокой DP кислых сахаров. Эти результаты не только подтверждают наши данные ELISA и MALDI, но также согласуются с нашими предыдущими исследованиями накопления олигосахаридов. Поэтому мы считаем, что современные иммунологические методы с использованием биотинилирования олигосахаридов и последующего скрининга ELISA достаточны для обнаружения растворимых неподатливых олигосахаридов в различных биологических образцах.
Поскольку методы скрининга mAb на основе ELISA были проверены несколькими различными методами, мы хотели дополнительно изучить потенциал этого нового количественного метода. Два коммерческих олигосахарида, олигосахарид ксилогексасахарида (XHE) и 23-α-L-арабинофуранозил-ксилотриоза (A2XX), были приобретены и протестированы с использованием нового подхода mAb, нацеленного на гликан клеточной стенки. На рисунке 6 показана линейная корреляция между сигналом биотинилированного связывания и логарифмом концентрации олигосахарида, что предполагает возможную модель адсорбции Ленгмюра. Среди mAb CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 и CCRC-M151 коррелировали с XHE, а CCRC-M108, CCRC-M109 и LM11 коррелировали с A2XX в диапазоне от 1 нм до 100 нано. Из-за ограниченной доступности антител во время эксперимента были проведены ограниченные эксперименты с каждой концентрацией олигосахарида. Здесь следует отметить, что некоторые антитела реагируют очень по-разному на один и тот же олигосахарид в качестве субстрата, предположительно потому, что они связываются с немного разными эпитопами и могут иметь очень разную аффинность связывания. Механизмы и последствия точной идентификации эпитопов будут намного сложнее, когда новый подход mAb будет применен к реальным образцам.
Два коммерческих олигосахарида были использованы для определения диапазона обнаружения различных гликан-таргетных mAbs. Здесь линейные корреляции с логарифмической концентрацией концентрации олигосахарида указывают на паттерны адсорбции Ленгмюра для (A) XHE с mAb и (B) A2XX с mAb. Соответствующие эпитопы указывают на структуры коммерческих олигосахаридов, используемых в качестве субстратов в анализе.
Использование моноклональных антител, нацеленных на гликаны (гликокомный анализ или скрининг mAb на основе ELISA) является мощным инструментом для углубленной характеристики большинства основных гликанов клеточной стенки, составляющих растительную биомассу. Однако классический анализ гликанов характеризует только более крупные гликаны клеточной стенки, поскольку большинство олигосахаридов неэффективно иммобилизуются на планшетах ELISA. В этом исследовании кукурузная солома, предварительно обработанная AFEX, была ферментативно гидролизована при высоком содержании твердых веществ. Анализ сахара использовался для определения состава неподатливых углеводов клеточной стенки в гидролизате. Однако анализ mAb более мелких олигосахаридов в гидролизатах недооценен, и для эффективной иммобилизации олигосахаридов на планшетах ELISA необходимы дополнительные инструменты.
Мы сообщаем здесь о новом и эффективном методе иммобилизации олигосахаридов для скрининга mAb путем объединения биотинилирования олигосахаридов с последующим скринингом ELISA на покрытых NeutrAvidin™ планшетах. Иммобилизованные биотинилированные олигосахариды показали достаточную аффинность к антителу, что позволило быстро и эффективно обнаружить неподатливые олигосахариды. Анализ состава этих неподатливых олигосахаридов на основе масс-спектрометрии подтвердил результаты этого нового подхода к иммуноскринированию. Таким образом, эти исследования демонстрируют, что сочетание биотинилирования олигосахаридов и скрининга ELISA с моноклональными антителами, нацеленными на гликан, может использоваться для обнаружения сшивок в олигосахаридах и может широко применяться в других биохимических исследованиях, характеризующих структуру олигосахаридов.
Этот метод профилирования гликанов на основе биотина является первым отчетом, способным исследовать неподатливые углеводные связи растворимых олигосахаридов в растительной биомассе. Это помогает понять, почему некоторые части биомассы настолько упрямы, когда дело доходит до производства биотоплива. Этот метод заполняет важный пробел в методах анализа гликома и расширяет его применение на более широкий спектр субстратов за пределами растительных олигосахаридов. В будущем мы можем использовать робототехнику для биотинилирования и использовать разработанный нами метод для высокопроизводительного анализа образцов с использованием ИФА.
Кукурузная солома (CS), выращенная из гибридных семян Pioneer 33A14, была собрана в 2010 году на ферме Kramer Farms в Рэе, штат Колорадо. С разрешения землевладельца эта биомасса может быть использована для исследований. Образцы хранились в сухом виде (<6%) в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре. Образцы хранились в сухом виде (<6%) в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре. Образцы хранятся в прохладном месте при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре. Образцы хранились в сухом виде при влажности <6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре и влажности < 6%. Образцы хранятся в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре и влажности < 6%.Исследование соответствовало местным и национальным рекомендациям. Анализ состава проводился с использованием протокола NREL. Было обнаружено, что состав содержит 31,4% глюкана, 18,7% ксилана, 3,3% арабинана, 1,2% галактана, 2,2% ацетила, 14,3% лигнина, 1,7% белка и 13,4% золы.
Cellic® CTec2 (138 мг белка/мл, партия VCNI 0001) представляет собой сложную смесь целлюлазы, β-глюкозидазы и Cellic® HTec2 (157 мг белка/мл, партия VHN00001) от Novozymes (Франклинтон, Северная Каролина, США)). Multifect Pectinase® (72 мг белка/мл), сложная смесь ферментов, разрушающих пектин, была предоставлена ​​компанией DuPont Industrial Biosciences (Пало-Альто, Калифорния, США). Концентрации ферментного белка определялись путем оценки содержания белка (и вычитания вклада небелкового азота) с использованием анализа азота по Кьельдалю (метод AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Итака, Нью-Йорк, США). Диатомовая земля 545 была приобретена у EMD Millipore (Биллерика, Массачусетс). Активированный уголь (DARCO, гранулы 100 меш), Avicel (PH-101), буковый ксилан и все остальные химикаты были приобретены у Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури).
Предварительная обработка AFEX проводилась в GLBRC (Исследовательская лаборатория по конверсии биомассы, MSU, Лансинг, Мичиган, США). Предварительная обработка проводилась при температуре 140 °C в течение 15 минут. Время пребывания 46 при соотношении безводного аммиака к биомассе 1:1 при загрузке 60% (по весу) в настольном реакторе периодического действия из нержавеющей стали (Parr Instruments Company). Это заняло 30 минут. Реактор доводили до 140 °C, и аммиак быстро высвобождался, позволяя биомассе быстро вернуться к комнатной температуре. Состав предварительно обработанной AFEX кукурузной соломы (ACS) был аналогичен составу необработанной кукурузной соломы (UT-CS).
ACSH с высоким содержанием твердых веществ 25% (w/w) (приблизительно 8% загрузки декстрана) был подготовлен в качестве исходного материала для крупномасштабного производства олигосахаридов. Ферментативный гидролиз ACS был выполнен с использованием коммерческой смеси ферментов, включающей Cellic® Ctec2 10 мг белка/г глюкана (в предварительно обработанной биомассе), Htec2 (Novozymes, Франклинтон, Северная Каролина), 5 мг белка/г глюкана и Multifect Pectinase (Genencor Inc, США). ). ), 5 мг белка/г декстрана. Ферментативный гидролиз был выполнен в 5-литровом биореакторе с рабочим объемом 3 литра, pH 4,8, 50°C и 250 об/мин. После гидролиза в течение 96 часов гидролизат собирали центрифугированием при 6000 об/мин в течение 30 минут, а затем при 14000 об/мин в течение 30 минут для удаления негидролизованных твердых веществ. Затем гидролизат подвергали стерильной фильтрации через 0,22 мм фильтрующий стакан. Отфильтрованный гидролизат хранили в стерильных бутылках при 4°C, а затем фракционировали на угле.
Анализ состава образцов биомассы на основе экстракта в соответствии с процедурами лабораторного анализа NREL: подготовка образцов для анализа состава (NREL/TP-510-42620) и определение структурных углеводов и лигнина в биомассе (NREL/TP-510 – 42618)47.
Анализ олигосахаридов потока гидролизата проводили в масштабе 2 мл с использованием метода кислотного гидролиза на основе автоклава. Смешайте образец гидролизата с 69,7 мкл 72% серной кислоты в 10 мл культуральной пробирке с завинчивающейся крышкой и инкубируйте в течение 1 ч на настольном компьютере при 121 °C, охладите на льду и профильтруйте в пробирку для высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Концентрацию олигосахаридов определяли путем вычитания концентрации моносахаридов в негидролизованном образце из общей концентрации сахара в кислотно-гидролизованном образце.
Концентрации глюкозы, ксилозы и арабинозы в кислотно-гидролизованной биомассе анализировали с помощью системы ВЭЖХ Shimadzu, оснащенной автосемплером, нагревателем колонки, изократическим насосом и детектором рефрактометрического показателя на колонке Bio-Rad Aminex HPX-87H. Колонку поддерживали при 50°C и элюировали потоком 0,6 мл/мин 5 мМ H2SO4 в воде.
Супернатант гидролизата разбавляли и анализировали на содержание мономеров и олигосахаридов. Мономерные сахара, полученные после ферментативного гидролиза, анализировали с помощью ВЭЖХ, оснащенной колонкой Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P и колонкой ash guard. Температура колонки поддерживалась на уровне 80°C, в качестве подвижной фазы использовалась вода со скоростью потока 0,6 мл/мин. Олигосахариды определяли гидролизом в разбавленной кислоте при 121°C в соответствии с методами, описанными в ссылках 41, 48, 49.
Анализ сахарида проводился на сырых, предварительно обработанных AFEX и всех негидролизованных остатках биомассы (включая получение серийных экстрактов клеточной стенки и их скрининг mAb) с использованием ранее описанных процедур 27, 43, 50, 51 . Для анализа гликома нерастворимые в спирте остатки материала растительной клеточной стенки готовятся из остатков биомассы и подвергаются серийной экстракции с использованием все более агрессивных реагентов, таких как оксалат аммония (50 мМ), карбонат натрия (50 мМ и 0,5% м/о), CON. (1M и 4M, оба с 1% м/о боргидрида натрия) и кислого хлорита, как ранее описано52,53. Затем экстракты подвергались ИФА против сложной панели mAb50, направленных на гликан клеточной стенки, и реакции связывания mAb были представлены в виде тепловой карты. Моноклональные антитела, нацеленные на гликан клеточной стенки растений, были приобретены из лабораторных запасов (серии CCRC, JIM и MAC).
Одностадийное биотинилирование олигосахаридов. Конъюгацию углеводов с биотин-LC-гидразидом проводили с использованием следующей процедуры. Биотин-LC-гидразид (4,6 мг/12 мкмоль) растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО, 70 мкл) путем интенсивного перемешивания и нагревания при 65°С в течение 1 мин. Добавляли ледяную уксусную кислоту (30 мкл) и выливали смесь на цианоборогидрид натрия (6,4 мг/100 мкмоль) и полностью растворяли после нагревания при 65°С в течение примерно 1 мин. Затем от 5 до 8 мкл реакционной смеси добавляли к высушенному олигосахариду (1-100 нмоль) для получения 10-кратного или более молярного избытка метки над восстанавливающим концом. Реакцию проводили при 65°С в течение 2 ч, после чего образцы немедленно очищали. В экспериментах по маркировке без восстановления цианоборогидрид натрия не использовался, а образцы реагировали при температуре 65°С в течение 2,5 часов.
Покрытие ELISA и промывка образцов биотинилированных олигосахаридов. 25 мкл биотинилированных образцов (100 мкл каждого концентрированного образца, разведенного в 5 мл 0,1 М раствора буфера Трис (TBS)) добавляли в каждую лунку планшета, покрытого авидином. Контрольные лунки покрывали 50 мкл биотина в концентрации 10 мкг/мл в 0,1 М TBS. Деионизированную воду использовали в качестве покрытия для холостых измерений. Планшет инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре в темноте. Промывайте планшет 3 раза 0,1% обезжиренным молоком в 0,1 М TBS, используя программу № 11 для Grenier flat 3A.
Добавление и промывка первичных антител. Добавьте 40 мкл первичных антител в каждую лунку. Инкубируйте микропланшет в течение 1 часа при комнатной температуре в темноте. Затем планшеты промывали 3 раза 0,1% молоком в 0,1M TBS, используя программу промывки № 11 для Grenier Flat 3A.
Добавьте вторичное антитело и промойте. Добавьте 50 мкл вторичного антитела мыши/крысы (разведенного 1:5000 в 0,1% молоке в 0,1 М TBS) в каждую лунку. Инкубируйте микропланшет в течение 1 часа при комнатной температуре в темноте. Затем микропланшеты промывали 5 раз 0,1% молоком в 0,1 М TBS с использованием программы промывки пластин Grenier Flat 5A № 12.
Добавление субстрата. Добавьте 50 мкл 3,3′,5,5′-тетраметилбензидина (ТМБ) к базовому субстрату (добавив 2 капли буфера, 3 капли ТМБ, 2 капли перекиси водорода на 15 мл деионизированной воды). Подготовьте субстрат ТМБ. и вортексируйте перед использованием). Инкубируйте микропланшет при комнатной температуре в течение 30 минут. В темноте.
Завершите шаг и прочитайте планшет. Добавьте 50 мкл 1 N серной кислоты в каждую лунку и запишите поглощение от 450 до 655 нм с помощью ридера ELISA.
Подготовьте 1 мг/мл растворы этих аналитов в деионизированной воде: арабиноза, рамноза, фукоза, ксилоза, галактуроновая кислота (GalA), глюкуроновая кислота (GlcA), манноза, глюкоза, галактоза, лактоза, N-ацетилманнозамин (manNAc), N-ацетилглюкозамин . (glcNAc), N-ацетилгалактозамин (galNAc), инозитол (внутренний стандарт). Два стандарта были приготовлены путем добавления 1 мг/мл растворов сахара, показанных в Таблице 1. Образцы замораживают и лиофилизируют при -80 °C до тех пор, пока не будет удалена вся вода (обычно около 12-18 часов).
Добавьте 100–500 мкг образца в пробирки с завинчивающейся крышкой на аналитических весах. Запишите добавленное количество. Лучше всего растворить образец в растворителе определенной концентрации и добавить его в пробирку в виде жидкой аликвоты. Используйте 20 мкл 1 мг/мл инозитола в качестве внутреннего стандарта для каждой пробирки с образцом. Количество внутреннего стандарта, добавленного в образец, должно быть таким же, как и количество внутреннего стандарта, добавленного в стандартную пробирку.
Добавьте 8 мл безводного метанола в пробирку с завинчивающейся крышкой. Затем добавьте 4 мл 3 N. метанольного раствора HCl, закройте и встряхните. В этом процессе не используется вода.
Добавьте 500 мкл 1 М раствора метанола HCl к образцам олигосахаридов и стандартным пробиркам TMS. Образцы инкубировали в течение ночи (168 часов) при 80 °C в термоблоке. Высушите продукт метанолиза при комнатной температуре с помощью сушильного коллектора. Добавьте 200 мкл MeOH и снова высушите. Этот процесс повторяют дважды. Добавьте 200 мкл метанола, 100 мкл пиридина и 100 мкл уксусного ангидрида к образцу и хорошо перемешайте. Инкубируйте образцы при комнатной температуре в течение 30 минут. и высушите. Добавьте 200 мкл метанола и снова высушите.
Добавьте 200 мкл Tri-Sil и нагревайте закрытую пробирку в течение 20 минут. 80°C, затем охладите до комнатной температуры. Используйте сушильный коллектор для дальнейшего высушивания образца до объема приблизительно 50 мкл. Важно отметить, что мы не давали образцам полностью высохнуть.
Добавьте 2 мл гексана и хорошо перемешайте встряхиванием. Заполните кончики пипеток Пастера (5-8 мм) кусочком стекловаты, вставив стекловату поверх пипетки диаметром 5-3/4 дюйма. Образцы центрифугировали при 3000 g в течение 2 минут. Любые нерастворимые остатки осаждаются. Высушите образец до 100-150 мкл. Объем приблизительно 1 мкл вводили в ГХ-МС при начальной температуре 80 °C и начальном времени 2,0 минуты (таблица 2).