Ташаккур барои боздид аз Nature.com. Версияи браузере, ки шумо истифода мебаред, дастгирии маҳдуди CSS дорад. Барои беҳтарин таҷриба, мо тавсия медиҳем, ки шумо браузери навшударо истифода баред (ё режими мутобиқатро дар Internet Explorer ғайрифаъол кунед). Дар айни замон, барои таъмини дастгирии доимӣ, мо сайтро бе услубҳо ва JavaScript намоиш медиҳем.
Усулҳои нави иммунологӣ ва спектрометрии массавӣ барои таҳлили комплексии олигосахаридҳои доимӣ дар ҷуворимаккаи пухташуда, ки бо AFEX пешакӣ коркард шудаанд. Биомассаи лигноселлюлозӣ алтернативаи устувор ба сӯзишвории истихроҷшаванда мебошад ва барои таҳияи биотехнологияҳо барои истеҳсоли маҳсулот ба монанди хӯрокворӣ, хӯроки чорво, сӯзишворӣ ва маводи кимиёвӣ васеъ истифода мешавад. Калиди ин технологияҳо таҳияи равандҳои рақобатпазири арзишманд барои табдил додани карбогидратҳои мураккаби мавҷуд дар деворҳои ҳуҷайраҳои растанӣ ба қандҳои оддӣ, ба монанди глюкоза, ксилоза ва арабиноза мебошад. Азбаски биомассаи лигноселлюлозӣ хеле якрав аст, он бояд барои ба даст овардани маҳсулоти дилхоҳ ба коркарди термохимиявӣ (масалан, эксфолиатсияи нахи аммиак (AFEX), кислотаҳои моеъшуда (DA), моеъҳои ионӣ (IL)) ва коркарди биологӣ (масалан, гидролизи ферментативӣ ва ферментатсияи микробӣ) дар якҷоягӣ дучор карда шавад. Аммо, вақте ки ферментҳои тиҷоратии замбӯруғӣ дар раванди гидролиз истифода мешаванд, танҳо 75-85% қандҳои ҳалшавандаи ҳосилшуда моносахаридҳо мебошанд ва 15-25% боқимонда олигосахаридҳои ҳалшаванда ва душворгузар мебошанд, ки на ҳамеша барои микроорганизмҳо дастрасанд. Қаблан, мо олигосахаридҳои якрав ва ҳалшавандаро бомуваффақият бо истифода аз омезиши хроматографияи ҷудокунии карбон ва замини диатомӣ ва истисно кардани андоза ҷудо ва тоза кардем ва инчунин хосиятҳои боздорандаи ферментҳои онҳоро таҳқиқ кардем. Мо муайян кардем, ки олигосахаридҳое, ки дорои ивазкуниҳои кислотаи уронии метилшудаи дараҷаи баланди полимеризатсия (DP) мебошанд, нисбат ба олигосахаридҳои DP паст ва бетараф коркард бо омехтаҳои ферментҳои тиҷоратӣ душвортар аст. Дар ин ҷо мо истифодаи якчанд усулҳои иловагиро, аз ҷумла профилкунии гликан бо истифода аз антителоҳои моноклоналӣ (mAbs), ки ба гликанҳои биомассаи растанӣ хосанд, барои тавсифи пайвандҳои гликан дар деворҳои ҳуҷайраҳои растанӣ ва гидролизатҳои ферментӣ, ионизатсияи десорбсияи лазерӣ бо ёрии матритса, масса-спектрометрияи вақти парвоз, гузориш медиҳем. . MALDI-TOF-MS) қуллаҳои ташхисии сохторӣ-иттилоотиро, ки тавассути спектроскопия пас аз таҷзияи дуюмдараҷаи ионҳои манфӣ, хроматографияи газ ва спектрометрияи массавӣ (GC-MS) ба даст оварда шудаанд, барои тавсифи пайвандҳои олигосахарид бо ва бе ҳосилшавӣ истифода мебарад. Аз сабаби андозаи хурди олигосахаридҳо (DP 4-20), истифодаи ин молекулаҳо барои пайвастшавӣ ва тавсифи mAb душвор аст. Барои ҳалли ин мушкилот, мо усули нави иммобилизатсияи олигосахарид дар асоси конъюгатсияи биотинро истифода бурдем, ки аксарияти олигосахаридҳои ҳалшавандаи пасти DP-ро дар сатҳи микропластина бомуваффақият нишонгузорӣ кард, ки сипас дар системаи mAb-и баландсифат барои таҳлили мушаххаси лигатсия истифода шуд. Ин усули нав дар оянда таҳияи таҳлилҳои пешрафтаи гликоми баландсифатро осон мекунад, ки метавонанд барои ҷудо кардан ва тавсифи олигосахаридҳои мавҷуд дар биомаркерҳо барои мақсадҳои ташхис истифода шаванд.
Биомассаи лигноселлюлозӣ, ки аз маводи кишоварзӣ, ҷангалдорӣ, алаф ва чӯбӣ иборат аст, як ашёи хоми эҳтимолӣ барои истеҳсоли маҳсулоти биологӣ, аз ҷумла хӯрокворӣ, хӯроки чорво, сӯзишворӣ ва прекурсорҳои кимиёвӣ барои истеҳсоли маҳсулоти арзиши баландтар мебошад1. Карбогидратҳо (ба монанди селлюлоза ва гемиселлюлоза), ки дар деворҳои ҳуҷайраҳои растанӣ мавҷуданд, тавассути коркарди кимиёвӣ ва биотрансформация (ба монанди гидролизи ферментӣ ва ферментатсияи микробӣ) ба моносахаридҳо деполимеризатсия мешаванд. Коркарди маъмулии пешакӣ васеъшавии нахи аммиак (AFEX), кислотаи моеъшуда (DA), моеъи ионӣ (IL) ва таркиши буғ (SE)-ро дар бар мегирад, ки барои кам кардани истеҳсоли лигноселлюлоза тавассути кушодани деворҳои ҳуҷайраҳои растанӣ омезиши моддаҳои кимиёвӣ ва гармиро истифода мебаранд3,4. якрав будани модда, 5. Гидролизи ферментӣ бо бори баланди моддаҳои сахт бо истифода аз ферментҳои тиҷоратии дорои карбогидратҳои фаъол (CAZymes) ва ферментатсияи микробӣ бо истифода аз хамиртурушҳо ё бактерияҳои трансгенӣ барои истеҳсоли сӯзишворӣ ва маводи кимиёвии биологӣ 6 анҷом дода мешавад.
CAZim дар ферментҳои тиҷоратӣ аз омехтаи мураккаби ферментҳо иборатанд, ки пайвандҳои мураккаби карбогидрат-шакарро синергетикӣ ҷудо мекунанд ва моносахаридҳоро ташкил медиҳанд2,7. Тавре ки мо қаблан хабар дода будем, шабакаи мураккаби полимерҳои ароматии лигнин бо карбогидратҳо онҳоро хеле душвор мегардонад, ки боиси табдили нопурраи шакар мегардад ва 15-25% олигосахаридҳои ҷинсиро ҷамъ мекунад, ки ҳангоми гидролизи ферментативии биомассаи пешакӣ коркардшуда истеҳсол намешаванд. Ин як мушкили маъмул бо усулҳои гуногуни пеш аз коркарди биомасса мебошад. Баъзе аз сабабҳои ин монеа ингибисияи ферментҳо ҳангоми гидролиз ё набудани ё сатҳи пасти ферментҳои муҳими муҳим мебошанд, ки барои шикастани пайвандҳои шакар дар биомассаи растанӣ заруранд. Фаҳмидани таркиб ва хусусиятҳои сохтории шакарҳо, ба монанди пайвандҳои шакар дар олигосахаридҳо, ба мо кӯмак мекунад, ки табдили шакарро ҳангоми гидролиз беҳтар кунем ва равандҳои биотехнологиро бо маҳсулоти аз нафт ҳосилшуда рақобатпазир гардонем.
Муайян кардани сохтори карбогидратҳо душвор аст ва якҷоя кардани усулҳо ба монанди хроматографияи моеъ (LC)11,12, спектроскопияи резонанси магнитии ҳастаӣ (NMR)13, электрофорези капиллярӣ (CE)14,15,16 ва спектрометрияи массавӣ (MS)17-ро талаб мекунад. , ҳаждаҳ. Усулҳои MS ба монанди спектрометрияи массавии вақти парвоз бо десорбсияи лазерӣ ва ионизатсия бо истифода аз матритса (MALDI-TOF-MS) як усули бисёрҷониба барои муайян кардани сохторҳои карбогидрат мебошанд. Ба наздикӣ, MS-и тандемии диссотсиатсияи бархӯрд (CID)-и аддуктҳои ионҳои натрий барои муайян кардани изи ангушт, ки ба мавқеъҳои пайвастшавии олигосахарид, конфигуратсияҳои аномерӣ, пайдарпайӣ ва мавқеъҳои шохабандӣ мувофиқанд, ба таври васеъ истифода мешавад 20, 21.
Таҳлили гликан як воситаи аъло барои муайян кардани амиқи пайвандҳои карбогидратӣ мебошад22. Ин усул антителоҳои моноклоналӣ (mAbs)-ро, ки ба гликани девори ҳуҷайраҳои растанӣ ҳамчун зондҳо равона карда шудаанд, барои фаҳмидани пайвандҳои мураккаби карбогидратӣ истифода мебарад. Дар саросари ҷаҳон зиёда аз 250 mAbs мавҷуданд, ки бар зидди олигосахаридҳои гуногуни хаттӣ ва шохадор бо истифода аз сахаридҳои гуногун тарҳрезӣ шудаанд24. Якчанд mAbs барои тавсифи сохтор, таркиб ва тағиротҳои девори ҳуҷайраҳои растанӣ ба таври васеъ истифода шудаанд, зеро вобаста ба намуди ҳуҷайраҳои растанӣ, узв, синну сол, марҳилаи рушд ва муҳити афзоиш фарқиятҳои назаррас мавҷуданд25,26. Ба наздикӣ, ин усул барои фаҳмидани популятсияҳои везикулаҳо дар системаҳои растанӣ ва ҳайвонот ва нақши мувофиқи онҳо дар интиқоли гликан, ки аз ҷониби маркерҳои зерҳуҷайравӣ, марҳилаҳои рушд ё ангезаҳои муҳити зист муайян карда мешаванд ва барои муайян кардани фаъолияти ферментӣ истифода шудааст. Баъзе аз сохторҳои гуногуни гликанҳо ва ксиланҳо, ки муайян шудаанд, пектин (P), ксилан (X), маннан (M), ксилоглюканҳо (XylG), глюканҳои пайванди омехта (MLG), арабиноксилан (ArbX), галактоманнан (GalG), кислотаи глюкуронӣ-арабиноксилан (GArbX) ва арабино-галактан (ArbG)29-ро дар бар мегиранд.
Аммо, бо вуҷуди ҳамаи ин талошҳои тадқиқотӣ, танҳо чанд таҳқиқот ба хусусияти ҷамъшавии олигосахаридҳо ҳангоми гидролизи бо бори баланди ҷисмҳои сахт (HSL), аз ҷумла ҷудошавии олигосахаридҳо, тағйироти дарозии занҷири олигомерӣ ҳангоми гидролиз, полимерҳои гуногуни DP-и паст ва каҷҳои онҳо нигаронида шудаанд. тақсимот 30,31,32. Дар айни замон, гарчанде ки таҳлили гликан як воситаи муфид барои таҳлили ҳамаҷонибаи сохтори гликан исбот шудааст, арзёбии олигосахаридҳои DP-и пасти дар об ҳалшаванда бо истифода аз усулҳои антитело душвор аст. Олигосахаридҳои DP-и хурдтар бо вазни молекулавии камтар аз 5-10 кДа ба лавҳаҳои ELISA пайваст намешаванд 33, 34 ва пеш аз илова кардани антитело шуста мешаванд.
Дар ин ҷо, бори аввал, мо озмоиши ELISA-ро дар табақчаҳои бо авидин пӯшонидашуда бо истифода аз антителоҳои моноклоналӣ нишон медиҳем, ки тартиби биотинилизатсияи якқадамаро барои олигосахаридҳои рефрактории ҳалшаванда бо таҳлили гликом муттаҳид мекунад. Равиши мо ба таҳлили гликом тавассути таҳлили MALDI-TOF-MS ва GC-MS дар асоси таҳлили пайвандҳои олигосахаридҳои мукаммал бо истифода аз ҳосилаи триметилсилил (TMS)-и таркибҳои шакари гидролизшуда тасдиқ карда шуд. Ин равиши инноватсионӣ метавонад дар оянда ҳамчун усули баландсифат таҳия карда шавад ва дар тадқиқоти биотиббӣ татбиқи васеътар пайдо кунад35.
Тағйироти пас аз тарҷумаи ферментҳо ва антителоҳо, ба монанди гликозилизатсия,36 ба фаъолияти биологии онҳо таъсир мерасонанд. Масалан, тағйирот дар гликозилизатсияи сафедаҳои зардоб дар артрити илтиҳобӣ нақши муҳим мебозанд ва тағйирот дар гликозилизатсия ҳамчун аломатҳои ташхисӣ истифода мешаванд37. Дар адабиёт гузориш дода шудааст, ки гликанҳои гуногун дар як қатор бемориҳо, аз ҷумла бемориҳои музмини илтиҳобии рӯдаи меъда ва ҷигар, сироятҳои вирусӣ, саратони тухмдон, сина ва простата ба осонӣ пайдо мешаванд38,39,40. Фаҳмидани сохтори гликанҳо бо истифода аз усулҳои ELISA-и гликанӣ, ки ба антитело асос ёфтаанд, эътимоди иловагиро дар ташхиси беморӣ бидуни истифодаи усулҳои мураккаби MS таъмин мекунад.
Таҳқиқоти қаблии мо нишон дод, ки олигосахаридҳои якрав пас аз коркарди пешакӣ ва гидролизи ферментӣ бегидролиз монданд (Расми 1). Дар кори қаблан нашршудаи мо, мо усули истихроҷи ангишти фаъолшудаи сахтро барои ҷудо кардани олигосахаридҳо аз гидролизати ҷуворимаккаи печонидашуда бо AFEX (ACSH)8 таҳия кардем. Пас аз истихроҷ ва ҷудокунии аввалия, олигосахаридҳо бо роҳи хроматографияи истиснои андоза (SEC) минбаъд фраксия карда шуданд ва бо тартиби вазни молекулавӣ ҷамъоварӣ карда шуданд. Мономерҳои шакар ва олигомерҳое, ки аз коркарди пешакӣ ҷудо мешаванд, бо таҳлили таркиби шакар таҳлил карда шуданд. Ҳангоми муқоисаи миқдори олигомерҳои шакар, ки бо усулҳои гуногуни коркарди пешакӣ ба даст оварда шудаанд, мавҷудияти олигосахаридҳои якрав як мушкили маъмул дар табдили биомасса ба моносахаридҳо мебошад ва метавонад ба коҳиши ҳосили шакар ҳадди аққал 10-15% ва ҳатто то 18% дар ИМА оварда расонад. Ин усул барои истеҳсоли минбаъдаи миқдори зиёди фраксияҳои олигосахарид истифода мешавад. ACH-и ҳосилшуда ва фраксияҳои минбаъдаи он бо вазнҳои гуногуни молекулавӣ ҳамчун маводи таҷрибавӣ барои тавсифи олигосахаридҳо дар ин кор истифода шуданд.
Пас аз коркарди пешакӣ ва гидролизи ферментативӣ, олигосахаридҳои доимӣ бегидролиз монданд. Дар ин ҷо (А) усули ҷудокунии олигосахаридҳо оварда шудааст, ки дар он олигосахаридҳо аз гидролизати ҷуворимаккаи печонидашуда (ACSH), ки бо AFEX пешакӣ коркард шудааст, бо истифода аз кати бастабандишудаи карбони фаъол ва замини диатомӣ ҷудо карда мешаванд; (Б) Усули ҷудо кардани олигосахаридҳо. Олигосахаридҳо минбаъд бо хроматографияи истиснои андоза (SEC) ҷудо карда шуданд; (В) Мономерҳои сахарид ва олигомерҳое, ки аз коркарди пешакӣ гуногун озод карда мешаванд (кислотаи обшуда: DA, моеъи ионӣ: IL ва AFEX). Шароити гидролизи ферментӣ: боркунии баланди моддаҳои сахт бо 25% (w/w) (тақрибан 8% боркунии глюкан), гидролизи 96 соат, боркунии ферментии тиҷоратӣ бо 20 мг/г (таносуби Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) ва (D) Мономерҳои шакар ва олигомерҳои глюкоза, ксилоза ва арабиноза, ки аз ҷӯшонидашудаи ҷуворимаккаи пешакӣ коркардшудаи AFEX (ACS) ҷудо мешаванд.
Таҳлили гликан ҳамчун воситаи муфид барои таҳлили ҳамаҷонибаи сохтории гликанҳо дар экстрактҳо, ки аз боқимондаҳои сахти биомасса ҷудо карда шудаанд, исбот шудааст. Аммо, сахаридҳои дар об ҳалшаванда бо истифода аз ин усули анъанавӣ кам намояндагӣ мешаванд41, зеро олигосахаридҳои вазни каммолекулавӣ дар лавҳаҳои ELISA иммобилизатсия кардан душвор аст ва пеш аз илова кардани антитело шуста мешаванд. Аз ин рӯ, барои пайвастшавӣ ва тавсифи антитело, усули якқадами биотинилизатсия барои пӯшонидани олигосахаридҳои ҳалшаванда ва номувофиқ дар лавҳаҳои ELISA бо пӯшонидани авидин истифода шуд. Ин усул бо истифода аз ACSH-и қаблан истеҳсолшудаи мо ва як фраксияе, ки ба вазни молекулавии он (ё дараҷаи полимеризатсия, DP) асос ёфтааст, санҷида шуд. Биотинилизатсияи якқадама барои баланд бардоштани наздикии пайвастшавии олигосахарид бо илова кардани биотин-LC-гидразид ба охири коҳишдиҳандаи карбогидрат истифода шуд (Расми 2). Дар маҳлул, гурӯҳи гемиацеталӣ дар охири коҳишдиҳанда бо гурӯҳи гидразиди биотин-LC-гидразид реаксия карда, пайванди гидразонро ташкил медиҳад. Дар ҳузури агенти коҳишдиҳанда NaCNBH3, пайванди гидразон ба маҳсулоти ниҳоии устувори биотинилизатсияшуда коҳиш меёбад. Бо тағйир додани қисми коҳишдиҳандаи шакар, пайвастшавии олигосахаридҳои пасти DP ба лавҳаҳои ELISA имконпазир гардид ва дар таҳқиқоти мо ин дар лавҳаҳои бо авидин пӯшонидашуда бо истифода аз mAbs-ҳои ба гликан нигаронидашуда анҷом дода шуд.
Скрининги антителоҳои моноклоналӣ дар асоси ELISA барои олигосахаридҳои биотинилӣ. Дар ин ҷо (A) биотинилизатсияи якҷояи олигосахаридҳо ва скрининги минбаъдаи ELISA бо mAbs-ҳои ба гликан нигаронидашуда дар лавҳаҳои пӯшонидашудаи NeutrAvidin ва (B) тартиби якқадамаро барои биотинилизатсияи маҳсулоти реаксия нишон медиҳад.
Сипас, пластинаҳои бо авидин пӯшонидашуда бо антителоҳои бо олигосахарид пайвастшуда ба антителоҳои аввалия ва дуюмдараҷа илова карда шуданд ва дар муҳити ҳассос ба рӯшноӣ ва вақт шуста шуданд. Пас аз анҷоми пайвастшавии антитело, барои инкубатсия кардани пластина субстрати TMB илова кунед. Реаксия ниҳоят бо кислотаи сулфат қатъ карда шуд. Пластинаҳои инкубатсияшуда бо истифода аз хонандаи ELISA таҳлил карда шуданд, то қувваи пайвастшавии ҳар як антитело муайян карда шавад, то пайванди салибии мушаххаси антитело муайян карда шавад. Барои тафсилот ва параметрҳои таҷриба, ба бахши мувофиқи "Маводҳо ва усулҳо" нигаред.
Мо фоиданокии ин усули нав таҳияшударо барои барномаҳои мушаххас бо тавсифи олигосахаридҳои ҳалшаванда дар ACSH, инчунин дар фраксияҳои олигосахариди хом ва тозашуда, ки аз гидролизатҳои лигноселлюлоза ҷудо карда шудаанд, нишон медиҳем. Тавре ки дар расми 3 нишон дода шудааст, маъмултарин ксиланҳои ивазкунандаи эпитопҳо, ки дар ACSH бо истифода аз усулҳои таҳлили гликоми биоацилӣ муайян карда шудаанд, одатан уронӣ (U) ё метилуронӣ (MeU) ва арабиногалактанҳои пектикӣ мебошанд. Аксари онҳо инчунин дар таҳқиқоти қаблии мо оид ба таҳлили гликанҳои ҷисмҳои сахти ғайригидролизшуда (UHS)43 пайдо шуданд.
Муайян кардани эпитопҳои олигосахариди беэътино бо истифода аз антителои моноклоналӣ, ки ба гликани девори ҳуҷайра равона карда шудааст. Фраксияи "нейтралӣ" фраксияи ACN ва фраксияи "туршӣ" фраксияи FA мебошад. Сурхҳои равшантар дар харитаи гармӣ миқдори баланди эпитопро нишон медиҳанд ва кабуди равшантар заминаи холӣ нишон медиҳанд. Арзишҳои ранг дар миқёс ба арзишҳои хоми OD барои формулаҳои N=2 асос ёфтаанд. Эпитопҳои асосии шинохташаванда аз ҷониби антителоҳо дар тарафи рост нишон дода шудаанд.
Ин сохторҳои ғайриселлюлозаро аз ҷониби маъмултарин селлюлозаҳо ва гемиселлюлазаҳо дар омехтаи ферментҳои тиҷоратии санҷидашуда, ки ферментҳои тиҷоратии маъмултаринро дар бар мегирад, шикастан мумкин набуд. Аз ин рӯ, барои гидролизи онҳо ферментҳои нави ёрирасон лозиманд. Бе ферментҳои иловагии зарурии ғайриселлюлоза, ин пайвандҳои ғайриселлюлоза табдили пурраро ба моносахаридҳо пешгирӣ мекунанд, ҳатто агар полимерҳои шакарии аслии онҳо ба таври васеъ ба пораҳои кӯтоҳтар гидролиз карда шаванд ва бо истифода аз омехтаҳои ферментҳои тиҷоратӣ ҳал карда шаванд.
Таҳқиқоти минбаъдаи тақсимоти сигнал ва қувваи пайвастшавии он нишон дод, ки эпитопҳои пайвастшавӣ дар фраксияҳои баланди шакарии DP (A, B, C, DP то 20+) нисбат ба фраксияҳои пасти DP (D, E, F, DP) дар димерҳо камтар буданд (Расми 1). Пораҳои кислота дар эпитопҳои ғайриселлюлоза нисбат ба пораҳои бетараф бештар маъмуланд. Ин падидаҳо бо намунае, ки дар таҳқиқоти қаблии мо мушоҳида шудааст, мувофиқанд, ки дар он қисмҳои баланди DP ва кислота ба гидролизи ферментативӣ тобовартар буданд. Аз ин рӯ, мавҷудияти эпитопҳои гликани ғайриселлюлоза ва ивазкуниҳои U ва MeU метавонанд ба устувории олигосахаридҳо саҳми калон гузоранд. Бояд қайд кард, ки пайвастшавӣ ва самаранокии ошкоркунӣ метавонад барои олигосахаридҳои пасти DP мушкилот эҷод кунад, хусусан агар эпитоп олигосахариди димерӣ ё тримерӣ бошад. Инро бо истифода аз олигосахаридҳои тиҷоратии дарозии гуногун, ки ҳар кадоми онҳо танҳо як эпитоп доранд, ки ба mAb мушаххас пайваст мешавад, санҷидан мумкин аст.
Ҳамин тариқ, истифодаи антителоҳои сохторӣ-мушаххас намудҳои муайяни пайвандҳои беэътиноӣ (бо бандии мувофиқ)-ро ошкор кард. Вобаста ба намуди антителои истифодашуда, намунаи мувофиқи лигатсия ва қувваи сигнале, ки он истеҳсол мекунад (бештар ва камтар фаровон), ферментҳои навро метавон муайян кард ва барои гликоконверсияи пурратар ба омехтаи ферментҳо ниммиқдор илова кард. Бо назардошти таҳлили олигосахаридҳои ACSH ҳамчун мисол, мо метавонем пойгоҳи додаҳои пайвандҳои гликанро барои ҳар як маводи биомасса эҷод кунем. Дар ин ҷо бояд қайд кард, ки наздикии гуногуни антителоҳо бояд ба назар гирифта шавад ва агар наздикии онҳо номаълум бошад, ин ҳангоми муқоисаи сигналҳои антителоҳои гуногун мушкилоти муайяне ба вуҷуд меорад. Илова бар ин, муқоисаи пайвандҳои гликан метавонад байни намунаҳо барои ҳамон як антитело беҳтарин кор кунад. Сипас ин пайвандҳои якрав метавонанд ба пойгоҳи додаҳои CAZyme пайваст карда шаванд, ки аз он мо метавонем ферментҳоро муайян кунем, ферментҳои номзадро интихоб кунем ва ферментҳои шикастани пайвандҳоро санҷем ё системаҳои микробҳоро барои ифодаи ин ферментҳо барои истифода дар биокоркардҳо таҳия кунем44.
Барои арзёбии он, ки чӣ гуна усулҳои иммунологӣ усулҳои алтернативиро барои тавсифи олигосахаридҳои вазни каммолекулавӣ, ки дар гидролизатҳои лигноселлюлоза мавҷуданд, пурра мекунанд, мо MALDI (Расми 4, S1-S8) ва таҳлили сахаридҳои ҳосилшудаи TMS-ро дар асоси GC-MS дар ҳамон панел (Расми 5) дар қисми олигосахарид анҷом додем. MALDI барои муқоисаи он, ки оё тақсимоти массаи молекулаҳои олигосахарид бо сохтори пешбинишуда мувофиқат мекунад, истифода мешавад. Дар расми 4 MS-и ҷузъҳои бетараф ACN-A ва ACN-B нишон дода шудааст. Таҳлили ACN-A як қатор шакарҳои пентозаро, ки аз DP 4-8 (Расми 4) то DP 22 (Расми S1) фарқ мекунанд, тасдиқ кард, ки вазнҳои онҳо ба олигосахаридҳои MeU-ксилан мувофиқат мекунанд. Таҳлили ACN-B силсилаи пентоза ва глюкоксиланро бо DP 8-15 тасдиқ кард. Дар маводи иловагӣ, ба монанди расми S3, харитаҳои тақсимоти массаи қисми туршии FA-C як қатор шакарҳои пентозаи ивазшудаи (Me)U-ро бо DP 8-15 нишон медиҳанд, ки бо ксиланҳои ивазшуда, ки дар скрининги mAb дар асоси ELISA ёфт шудаанд, мувофиқанд. Эпитопҳо мувофиқанд.
Спектри MALDI-MS аз олигосахаридҳои ҳалшавандаи номувофиқ, ки дар ACS мавҷуданд. Дар ин ҷо, (A) фраксияҳои диапазони камвазни ACN-A, ки дорои олигосахаридҳои глюкуроксилан ивазшудаи кислотаи метилшудаи уронӣ (DP 4-8) мебошанд ва (B) олигосахаридҳои ксилан ва кислотаи метилшудаи уронӣ ACN-B, ки бо глюкуроксилан иваз шудаанд (DP 8-15).
Таҳлили таркиби боқимондаи гликани олигосахаридҳои рефракторӣ. Дар ин ҷо (A) Таркиби сахариди TMS аз фраксияҳои гуногуни олигосахаридҳо, ки бо истифода аз таҳлили GC-MS ба даст оварда шудаанд. (B) Сохторҳои қандҳои гуногуни ҳосилшуда аз TMS, ки дар олигосахаридҳо мавҷуданд. ACN – фраксияи ацетонитрил, ки дорои олигосахаридҳои нейтралӣ мебошад ва FA – фраксияи кислотаи ферулӣ, ки дорои олигосахаридҳои кислотаӣ мебошад.
Хулосаи дигари ҷолиб аз таҳлили LC-MS-и фраксияи олигосахарид ба даст омад, ки дар расми S9 нишон дода шудааст (усулҳоро дар маводи иловагии электронӣ дидан мумкин аст). Ҳангоми пайваст кардани фраксияи ACN-B пораҳои гурӯҳҳои гексоза ва -OAc борҳо мушоҳида карда шуданд. Ин бозёфт на танҳо фрагментатсияи мушоҳидашударо дар таҳлили гликом ва MALDI-TOF тасдиқ мекунад, балки инчунин маълумоти навро дар бораи ҳосилаҳои эҳтимолии карбогидратҳо дар биомассаи лигноселлюлозаи пешакӣ коркардшуда пешниҳод мекунад.
Мо инчунин таҳлили таркиби гликани фраксияҳои олигосахаридро бо истифода аз ҳосилшавии гликани TMS анҷом додем. Бо истифода аз GC-MS, мо таркиби қандҳои асабӣ (ғайриҳосилшаванда) ва туршӣ (GluA ва GalA)-ро дар фраксияи олигосахарид муайян кардем (Расми 5). Кислотаи глюкуронӣ дар ҷузъҳои туршии C ва D мавҷуд аст, дар ҳоле ки кислотаи галактуронӣ дар ҷузъҳои туршии A ва B мавҷуд аст, ки ҳардуи онҳо ҷузъҳои баланди DP-и қандҳои туршӣ мебошанд. Ин натиҷаҳо на танҳо маълумоти ELISA ва MALDI-и моро тасдиқ мекунанд, балки бо таҳқиқоти қаблии мо дар бораи ҷамъшавии олигосахаридҳо низ мувофиқанд. Аз ин рӯ, мо боварӣ дорем, ки усулҳои муосири иммунологӣ бо истифода аз биотинилизатсияи олигосахаридҳо ва скрининги минбаъдаи ELISA барои муайян кардани олигосахаридҳои ҳалшавандаи рекалцитрантӣ дар намунаҳои гуногуни биологӣ кофӣ мебошанд.
Азбаски усулҳои скрининги mAb дар асоси ELISA бо якчанд усулҳои гуногун тасдиқ шудаанд, мо мехостем имконоти ин усули нави миқдориро минбаъд омӯзем. Ду олигосахариди тиҷоратӣ, олигосахариди ксилогексахарид (XHE) ва 23-α-L-арабинофуранозил-ксилотриоз (A2XX), бо истифода аз усули нави mAb, ки гликани девори ҳуҷайраро ҳадаф қарор медиҳад, харидорӣ ва санҷида шуданд. Расми 6 коррелятсияи хаттиро байни сигнали пайвастшавии биотинилӣ ва консентратсияи log-и консентратсияи олигосахарид нишон медиҳад, ки модели эҳтимолии адсорбсияи Ленгмюрро нишон медиҳад. Дар байни mAbs, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 ва CCRC-M151 бо XHE коррелятсия карданд ва CCRC-M108, CCRC-M109 ва LM11 бо A2XX дар диапазони аз 1 нм то 100 нано коррелятсия карданд. Аз сабаби маҳдуд будани дастрасии антителоҳо дар давоми таҷриба, бо ҳар як консентратсияи олигосахарид таҷрибаҳои маҳдуд гузаронида шуданд. Дар ин ҷо бояд қайд кард, ки баъзе антителоҳо ба ҳамон олигосахарид ҳамчун субстрат хеле гуногун вокуниш нишон медиҳанд, эҳтимолан аз он сабаб, ки онҳо ба эпитопҳои каме гуногун пайваст мешаванд ва метавонанд пайвандҳои хеле гуногун дошта бошанд. Механизмҳо ва оқибатҳои муайянкунии дақиқи эпитопҳо ҳангоми татбиқи равиши нави mAb ба намунаҳои воқеӣ хеле мураккабтар хоҳанд буд.
Ду олигосахариди тиҷоратӣ барои муайян кардани диапазони ошкоркунии mAb-ҳои гуногуни гликан, ки ҳадаф қарор доранд, истифода шуданд. Дар ин ҷо, коррелятсияҳои хаттӣ бо консентратсияи логарифмии консентратсияи олигосахарид намунаҳои адсорбсияи Ленгмюрро барои (A) XHE бо mAb ва (B) A2XX бо mAb нишон медиҳанд. Эпитопҳои мувофиқ сохторҳои олигосахаридҳои тиҷоратиро, ки ҳамчун субстратҳо дар таҳлил истифода мешаванд, нишон медиҳанд.
Истифодаи антителоҳои моноклоналии ба гликан нигаронидашуда (таҳлили гликомикӣ ё скрининги mAb дар асоси ELISA) як воситаи пуриқтидор барои тавсифи амиқи аксари гликанҳои асосии девори ҳуҷайра, ки биомассаи растаниро ташкил медиҳанд, мебошад. Аммо, таҳлили классикии гликан танҳо гликанҳои калонтари девори ҳуҷайраро тавсиф мекунад, зеро аксари олигосахаридҳо дар лавҳаҳои ELISA самаранок иммобилизатсия карда намешаванд. Дар ин таҳқиқот, ҷӯвори печонидашудаи AFEX бо миқдори зиёди моддаҳои сахт ба таври ферментативӣ гидролиз карда шуд. Таҳлили шакар барои муайян кардани таркиби карбогидратҳои девори ҳуҷайраҳои беқувват дар гидролизат истифода шуд. Аммо, таҳлили mAb-и олигосахаридҳои хурдтар дар гидролизатҳо нодида гирифта мешавад ва барои иммобилизатсияи самараноки олигосахаридҳо дар лавҳаҳои ELISA асбобҳои иловагӣ лозиманд.
Мо дар ин ҷо усули нави ва самараноки иммобилизатсияи олигосахаридҳоро барои скрининги mAb бо роҳи якҷоя кардани биотинилизатсияи олигосахарид ва баъдан скрининги ELISA дар лавҳаҳои пӯшонидашудаи NeutrAvidin™ пешниҳод мекунем. Олигосахаридҳои иммобилизатсияшудаи биотинилизатсияшуда нисбати антитело майли кофӣ нишон доданд, ки имкон медиҳад олигосахаридҳои беқувват зуд ва самаранок муайян карда шаванд. Таҳлили таркиби ин олигосахаридҳои якрав дар асоси спектрометрияи массавӣ натиҷаҳои ин равиши нави иммуноскриниро тасдиқ кард. Ҳамин тариқ, ин таҳқиқот нишон медиҳанд, ки якҷоя кардани биотинилизатсияи олигосахарид ва скрининги ELISA бо антителоҳои моноклоналии ба гликан нигаронидашуда метавонад барои муайян кардани пайвандҳои салибӣ дар олигосахаридҳо истифода шавад ва метавонад дар дигар таҳқиқоти биохимиявӣ, ки сохтори олигосахаридҳоро тавсиф мекунанд, васеъ истифода шавад.
Ин усули профилсозии гликан дар асоси биотин аввалин гузоришест, ки қодир аст пайвандҳои карбогидратии беқуввати олигосахаридҳои ҳалшавандаро дар биомассаи растанӣ таҳқиқ кунад. Ин барои фаҳмидани он ки чаро баъзе қисмҳои биомасса ҳангоми истеҳсоли сӯзишвории биологӣ ин қадар якраванд, кӯмак мекунад. Ин усул холигии муҳимро дар усулҳои таҳлили гликом пур мекунад ва татбиқи онро ба доираи васеътари субстратҳо берун аз олигосахаридҳои растанӣ васеъ мекунад. Дар оянда, мо метавонем робототехникаро барои биотинилизатсия истифода барем ва усулеро, ки мо таҳия кардаем, барои таҳлили баланди намунаҳо бо истифода аз ELISA истифода барем.
Коҳи ҷуворимакка (КҶ), ки аз тухмиҳои гибридии Pioneer 33A14 парвариш карда шудааст, соли 2010 аз хоҷагиҳои Kramer дар Рей, Колорадо ҷамъоварӣ карда шудааст. Бо иҷозати соҳиби замин, ин биомассаро барои тадқиқот истифода бурдан мумкин аст. Намунаҳо дар халтаҳои хушк бо намӣ <6% дар ҳарорати хонагӣ дар халтаҳои зип-қулф нигоҳ дошта шуданд. Намунаҳо дар халтаҳои хушк бо намӣ <6% дар ҳарорати хонагӣ дар халтаҳои зип-қулф нигоҳ дошта шуданд. Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температурае. Намунаҳо дар халтаҳои бастабандишуда дар ҳарорати хонагӣ дар ҳолати хушк ва намӣ <6% нигоҳ дошта шуданд.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией барои комнатной ҳароратие бо влажностью < 6%. Намунаҳо дар халтаҳои зипперӣ дар ҳарорати хонагӣ бо намӣ <6% нигоҳ дошта мешаванд.Таҳқиқот ба дастурҳои маҳаллӣ ва миллӣ мувофиқат мекард. Таҳлили таркибӣ бо истифода аз протоколи NREL гузаронида шуд. Муайян карда шуд, ки таркиб дорои 31,4% глюкан, 18,7% ксилан, 3,3% арабинан, 1,2% галактан, 2,2% ацетил, 14,3% лигнин, 1,7% сафеда ва 13,4% хокистар мебошад.
Cellic® CTec2 (138 мг протеин/мл, партия VCNI 0001) омехтаи мураккаби селлюлаза, β-глюкозидаза ва Cellic® HTec2 (157 мг протеин/мл, партия VHN00001) аз Novozymes (Франклинтон, NC, ИМА) мебошад. Multifect Pectinase® (72 мг протеин/мл), омехтаи мураккаби ферментҳои вайронкунандаи пектин, аз ҷониби DuPont Industrial Biosciences (Пало Алто, CA, ИМА) хайрия карда шуд. Консентратсияи протеини фермент бо роҳи баҳодиҳии миқдори протеин (ва тарҳ кардани саҳми нитрогени ғайрипротеин) бо истифода аз таҳлили нитрогени Kjeldahl (усули AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Итака, NY, ИМА) муайян карда шуд. Диатомияи замин 545 аз EMD Millipore (Billerica, MA) харидорӣ шудааст. Карбони фаъолшуда (DARCO, гранулаҳои 100-торӣ), Avicel (PH-101), ксилани бук ва ҳамаи дигар моддаҳои кимиёвӣ аз Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури) харидорӣ карда шуданд.
Коркарди пешакӣ бо AFEX дар GLBRC (Лабораторияи тадқиқоти табдили биомасса, MSU, Лансинг, MI, ИМА) анҷом дода шуд. Коркарди пешакӣ дар ҳарорати 140°C ба муддати 15 дақиқа, дар таносуби 1:1 аммиаки беоб ба биомасса бо боркунии 60% (w/w) дар реактори партиявии пӯлоди зангногир (Parr Instruments Company) анҷом дода шуд. Ин 30 дақиқа вақт гирифт. Реактор ба 140°C расонида шуд ва аммиак зуд озод карда шуд, ки имкон дод биомасса зуд ба ҳарорати хонагӣ баргардад. Таркиби ҷӯворимаккаи ҷуворимаккаи AFEX (ACS)-и пешакӣ коркардшуда ба таркиби ҷӯворимаккаи коркарднашуда (UT-CS) монанд буд.
Ҷисмҳои сахти баландсифати ACSH 25% (w/w) (тақрибан 8% боркунии декстран) ҳамчун маводи ибтидоӣ барои истеҳсоли миқёси калони олигосахаридҳо омода карда шуд. Гидролизи ферментативии ACS бо истифода аз омехтаи ферментҳои тиҷоратӣ, аз ҷумла Cellic® Ctec2 10 мг сафеда/г глюкан (дар биомассаи пешакӣ коркардшуда), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 мг сафеда/г глюкан ва Multifect Pectinase (Genencor Inc, ИМА). ), 5 мг сафеда/г декстран анҷом дода шуд. Гидролизи ферментативӣ дар биореактори 5-литрӣ бо ҳаҷми кории 3 литр, рН 4.8, 50°C ва 250 чархзанӣ дар як дақиқа гузаронида шуд. Пас аз гидролиз барои 96 соат, гидролизат бо роҳи сентрифугакунӣ дар 6000 чархзанӣ дар як дақиқа барои 30 дақиқа ва сипас дар 14000 чархзанӣ дар як дақиқа барои 30 дақиқа ҷамъоварӣ карда шуд, то ҷисмҳои сахти бегидролизшударо тоза кунад. Сипас гидролизат тавассути стакани филтрии 0,22 мм ба филтратсияи стерилӣ дучор карда шуд. Гидролизати филтршуда дар шишаҳои стерилӣ дар ҳарорати 4°C нигоҳ дошта шуд ва сипас дар карбон фраксия карда шуд.
Таҳлили таркиби намунаҳои биомассаи экстрактӣ мувофиқи тартиби таҳлили лабораторияи NREL: омода кардани намунаҳо барои таҳлили таркиб (NREL/TP-510-42620) ва муайян кардани карбогидратҳои сохторӣ ва лигнин дар биомасса (NREL/TP-510 – 42618)47.
Таҳлили олигосахаридҳои ҷараёни гидролизат дар миқёси 2 мл бо истифода аз усули гидролизи кислота дар асоси автоклав анҷом дода шуд. Намунаи гидролизатро бо 69,7 мкл кислотаи 72% сулфат дар найчаи парвариши сарпӯши винтӣ бо 10 мл омехта кунед ва барои 1 соат дар рӯи миз дар ҳарорати 121 °C инкубатсия кунед, дар ях хунук кунед ва ба шишаи хроматографияи моеъи баландсифат (HPLC) филтр кунед. Консентратсияи олигосахаридҳо бо тарҳ кардани консентратсияи моносахаридҳо дар намунаи ғайригидролизшуда аз консентратсияи умумии шакар дар намунаи бо кислота гидролизшуда муайян карда шуд.
Консентратсияи глюкоза, ксилоза ва арабиноза дар биомассаи гидролизи кислотавӣ бо истифода аз системаи Shimadzu HPLC, ки бо автосамплер, гармкунаки сутун, насоси изократӣ ва детектори нишондиҳандаи шикаст дар сутуни Bio-Rad Aminex HPX-87H муҷаҳҳаз шудааст, таҳлил карда шуд. Сутун дар ҳарорати 50°C нигоҳ дошта шуд ва бо ҷараёни об 0,6 мл/дақ 5 мМ H2SO4 элюсия карда шуд.
Қисми болоии гидролизат об карда шуда, барои миқдори мономер ва олигосахарид таҳлил карда шуд. Қандҳои мономерӣ, ки пас аз гидролизи ферментӣ ба даст оварда шудаанд, бо истифода аз HPLC, ки бо сутуни Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P ва сутуни муҳофизаткунандаи хокистар муҷаҳҳаз шудааст, таҳлил карда шуданд. Ҳарорати сутун дар 80°C нигоҳ дошта шуд, об ҳамчун фазаи мобилӣ бо суръати ҷараёни 0,6 мл/дақ истифода шуд. Олигосахаридҳо бо роҳи гидролиз дар кислотаи обшуда дар 121°C мувофиқи усулҳои тавсифшуда дар истинодҳои 41, 48, 49 муайян карда шуданд.
Таҳлили сахарид дар болои боқимондаҳои биомассаи хом, ки пешакӣ коркардшудаи AFEX ва ҳамаи боқимондаҳои ғайригидролизшудаи биомасса (аз ҷумла истеҳсоли экстрактҳои силсилавии девори ҳуҷайра ва скрининги mAb-и онҳо) бо истифода аз расмиёти қаблан тавсифшуда 27, 43, 50, 51 анҷом дода шуд. Барои таҳлили гликом, боқимондаҳои ҳалнашавандаи спиртии маводи девори ҳуҷайраҳои растанӣ аз боқимондаҳои биомасса омода карда мешаванд ва бо реагентҳои торафт хашмгинтар ба монанди оксалати аммоний (50 мМ), карбонати натрий (50 мМ ва 0.5% w/v), CON (1M ва 4M, ҳарду бо борогидриди натрий 1% w/v) ва хлорити кислота, тавре ки қаблан тавсиф шуда буд, истихроҷи силсилавӣ карда мешаванд52,53. Сипас экстрактҳо дар муқобили панели мураккаби mAb50s, ки ба гликани девори ҳуҷайра равона карда шудаанд, ба ELISA дучор карда шуданд ва реаксияҳои пайвастшавии mAb ҳамчун харитаи гармӣ пешниҳод карда шуданд. mAb-ҳое, ки ба гликани девори ҳуҷайраҳои растанӣ нигаронида шудаанд, аз захираҳои лабораторӣ (силсилаи CCRC, JIM ва MAC) харидорӣ карда шуданд.
Биотинизатсияи якмарҳилаии олигосахаридҳо. Конъюгасияи карбогидратҳо бо биотин-LC-гидразид бо истифода аз тартиби зерин анҷом дода шуд. Биотин-LC-гидразид (4,6 мг/12 мкмол) дар диметилсулфоксид (DMSO, 70 мкл) бо роҳи омехтакунии шадид ва гармкунӣ дар ҳарорати 65°C барои 1 дақиқа ҳал карда шуд. Кислотаи сиркои яхӣ (30 мкл) илова карда шуд ва омехта ба сианоборогидриди натрий (6,4 мг/100 мкмол) рехта шуд ва пас аз гармкунӣ дар ҳарорати 65°C барои тақрибан 1 дақиқа пурра ҳал карда шуд. Сипас, аз 5 то 8 мкл омехтаи реаксия ба олигосахариди хушк (1-100 нмоль) илова карда шуд, то 10 маротиба ё бештар аз молии нишона аз охири барқароркунанда ба даст оварда шавад. Реаксия дар ҳарорати 65°C барои 2 соат гузаронида шуд, ки пас аз он намунаҳо фавран тоза карда шуданд. Дар таҷрибаҳои нишонгузорӣ сианоборогидриди натрий бе барқарорсозӣ истифода нашуд ва намунаҳо дар ҳарорати 65°C ба муддати 2,5 соат реаксия карда шуданд.
Пӯшонидани ELISA ва шустани намунаҳои олигосахаридҳои биотинилӣ. 25 мкл намунаҳои биотинилӣ (100 мкл аз ҳар як намунаи консентратсияшуда дар 5 мл маҳлули буферии 0.1 М Трис (TBS) ҳал карда шудааст) ба ҳар як чоҳи табақчаи бо авидин пӯшонидашуда илова карда шуданд. Чоҳҳои назоратӣ бо 50 мкл биотин бо консентратсияи 10 мкг/мл дар 0.1 М ТBS пӯшонида шуданд. Оби деионизатсияшуда ҳамчун пӯшиш барои андозагирии холӣ истифода шуд. Лавҳа барои 2 соат дар ҳарорати хонагӣ дар торикӣ инкубатсия карда шуд. Лавҳачаро 3 маротиба бо шири 0.1% равғанӣ дар 0.1 М ТBS бо истифода аз барномаи № 11 барои Grenier flat 3A бишӯед.
Илова ва шустани антителоҳои аввалия. Ба ҳар як чоҳ 40 мкл антителои аввалия илова кунед. Микропластинаро барои 1 соат дар ҳарорати хонагӣ дар торикӣ инкубатсия кунед. Сипас, плитаҳо 3 маротиба бо шири 0,1% дар 0,1 М TBS бо истифода аз барномаи шустушӯи №11 барои Grenier Flat 3A шуста шуданд.
Антителои дуюмдараҷаро илова кунед ва бишӯед. Ба ҳар як чоҳ 50 мкл антителои дуюмдараҷаи муш/калам (1:5000 дар шири 0,1% дар 0,1 M TBS омехта карда шудааст) илова кунед. Микропластинаро барои 1 соат дар ҳарорати хонагӣ дар торикӣ инкубатсия кунед. Сипас микропластинаҳо 5 маротиба бо шири 0,1% дар 0,1 M TBS бо истифода аз барномаи шустани табақчаҳои Grenier Flat 5A #12 шуста шуданд.
Илова кардани субстрат. 50 мкл 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (TMB)-ро ба субстрати асосӣ илова кунед (бо илова кардани 2 қатра буфер, 3 қатра TMB, 2 қатра пероксиди гидроген ба 15 мл оби деионизатсияшуда). Субстрати TMB-ро омода кунед. ва пеш аз истифода вортекс кунед). Микропластинаро дар ҳарорати хонагӣ барои 30 дақиқа инкубатсия кунед. Дар торикӣ.
Ин қадамро анҷом диҳед ва лавҳаро хонед. Ба ҳар як чоҳ 50 мкл 1 Н кислотаи сулфат илова кунед ва бо истифода аз хонандаи ELISA ҷаббидашавиро аз 450 то 655 нм сабт кунед.
Маҳлулҳои 1 мг/мл-и ин аналитҳоро дар оби деионизатсияшуда омода кунед: арабиноза, рамноза, фукоза, ксилоза, кислотаи галактуронӣ (GalA), кислотаи глюкуронӣ (GlcA), манноза, глюкоза, галактоза, лактоза, N-ацетилманнозамин (manNAc), N-ацетилглюкозамин. (glcNAc), N-ацетилгалактозамин (galNAc), инозитол (стандарти дохилӣ). Ду стандарт бо илова кардани маҳлулҳои шакари 1 мг/мл, ки дар Ҷадвали 1 нишон дода шудаанд, омода карда шуданд. Намунаҳо дар -80°C ях карда ва лиофилизатсия карда мешаванд, то он даме ки тамоми об тоза карда шавад (одатан тақрибан 12-18 соат).
100-500 мкг намунаро ба найчаҳои сарпӯшдор дар тарозуи таҳлилӣ илова кунед. Миқдори иловашударо сабт кунед. Беҳтар аст, ки намунаро дар консентратсияи муайяни ҳалкунанда ҳал кунед ва онро ба найча ҳамчун аликвоти моеъ илова кунед. Барои ҳар як найчаи намуна 20 мкл 1 мг/мл инозитолро ҳамчун стандарти дохилӣ истифода баред. Миқдори стандарти дохилӣ, ки ба намуна илова карда мешавад, бояд ба миқдори стандарти дохилӣ, ки ба найчаи стандартӣ илова карда шудааст, баробар бошад.
Ба шишаи бо сарпӯши винтӣ 8 мл метаноли беоб илова кунед. Сипас, 4 мл маҳлули 3 Н. метанолӣ HCl-ро бо сарпӯш пӯшонед ва такон диҳед. Ин раванд обро истифода намебарад.
Ба намунаҳои олигосахарид ва найчаҳои стандартии TMS 500 мкл маҳлули метанолизи 1 М HCl илова кунед. Намунаҳо шабонарӯз (168 соат) дар ҳарорати 80°C дар блоки термикӣ инкубатсия карда шуданд. Маҳсулоти метанолизро дар ҳарорати хонагӣ бо истифода аз коллектори хушккунӣ хушк кунед. 200 мкл MeOH илова кунед ва дубора хушк кунед. Ин раванд ду маротиба такрор карда мешавад. Ба намуна 200 мкл метанол, 100 мкл пиридин ва 100 мкл ангидриди сирко илова кунед ва хуб омехта кунед. Намунаҳоро дар ҳарорати хонагӣ барои 30 дақиқа инкубатсия кунед ва хушк кунед. 200 мкл метанол илова кунед ва дубора хушк кунед.
200 мкл Tri-Sil илова кунед ва найчаи бо сарпӯшро барои 20 дақиқа гарм кунед. 80°C, сипас то ҳарорати хонагӣ хунук кунед. Барои хушк кардани минбаъдаи намуна то ҳаҷми тақрибан 50 мкл аз коллектор истифода баред. Қайд кардан муҳим аст, ки мо ба намунаҳо иҷозат надодем, ки пурра хушк шаванд.
2 мл гексан илова кунед ва бо вортекс хуб омехта кунед. Нӯги пипеткаҳои Пастер (5-8 мм)-ро бо порае аз пашми шишагӣ пур кунед, ки онро ба болои пипеткаи диаметри 5-3/4 дюймӣ гузоред. Намунаҳо дар 3000 г барои 2 дақиқа сентрифуга карда шуданд. Ҳама гуна боқимондаҳои ҳалнашаванда таҳшин мешаванд. Намунаро то 100-150 мкл хушк кунед. Ҳаҷми тақрибан 1 мкл ба GC-MS дар ҳарорати ибтидоии 80 °C ва вақти ибтидоии 2,0 дақиқа ворид карда шуд (Ҷадвали 2).