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Novos métodos imunológicos e espectrométricos de massa para análise complexa de oligossacarídeos persistentes em palha de milho pré-tratada com AFEX. A biomassa lignocelulósica é uma alternativa sustentável aos combustíveis fósseis e é amplamente utilizada para desenvolver biotecnologias para a produção de produtos como alimentos, rações, combustíveis e produtos químicos. A chave para essas tecnologias é o desenvolvimento de processos com custo competitivo para converter carboidratos complexos presentes nas paredes celulares das plantas em açúcares simples, como glicose, xilose e arabinose. Como a biomassa lignocelulósica é muito teimosa, ela deve ser submetida a tratamentos termoquímicos (por exemplo, esfoliação de fibras de amônia (AFEX), ácidos diluídos (AD), líquidos iônicos (IL)) e tratamentos biológicos (por exemplo, hidrólise enzimática e fermentação microbiana) em combinação para obter o produto desejado. No entanto, quando enzimas fúngicas comerciais são usadas no processo de hidrólise, apenas 75-85% dos açúcares solúveis formados são monossacarídeos, e os 15-25% restantes são oligossacarídeos solúveis e intratáveis, que nem sempre estão disponíveis para os microrganismos. Anteriormente, isolamos e purificamos com sucesso oligossacarídeos solúveis teimosos usando uma combinação de separação de carbono e terra diatomácea e cromatografia de exclusão por tamanho, e também investigamos suas propriedades inibitórias enzimáticas. Descobrimos que oligossacarídeos contendo substituições de ácido urônico metilado com maior grau de polimerização (DP) são mais difíceis de processar com misturas de enzimas comerciais do que oligossacarídeos neutros e com baixo DP. Aqui, relatamos o uso de vários métodos adicionais, incluindo o perfil de glicano usando anticorpos monoclonais (mAbs) específicos para glicanos de biomassa vegetal para caracterizar ligações de glicano em paredes celulares de plantas e hidrolisados ​​enzimáticos, ionização por dessorção a laser assistida por matriz e espectrometria de massas por tempo de voo. MALDI-TOF-MS) utiliza picos diagnósticos informativos sobre a estrutura obtidos por espectroscopia após decaimento secundário de íons negativos, cromatografia gasosa e espectrometria de massas (GC-MS) para caracterizar ligações de oligossacarídeos com e sem derivatização. Devido ao pequeno tamanho dos oligossacarídeos (DP 4–20), essas moléculas são difíceis de usar para ligação e caracterização de mAbs. Para superar esse problema, aplicamos um novo método de imobilização de oligossacarídeos baseado em conjugação de biotina que marcou com sucesso a maioria dos oligossacarídeos solúveis de baixo DP na superfície da microplaca, que foi então usado em um sistema de mAbs de alto rendimento para análise de ligação específica. Este novo método facilitará o desenvolvimento de ensaios de glicoma de alto rendimento mais avançados no futuro, que podem ser usados ​​para isolar e caracterizar oligossacarídeos presentes em biomarcadores para fins diagnósticos.
A biomassa lignocelulósica, composta de materiais agrícolas, florestais, herbáceos e lenhosos, é uma matéria-prima potencial para a produção de produtos de base biológica, incluindo alimentos, rações, combustíveis e precursores químicos para produzir produtos de maior valor1. Carboidratos (como celulose e hemicelulose) presentes nas paredes celulares vegetais são despolimerizados em monossacarídeos por processamento químico e biotransformação (como hidrólise enzimática e fermentação microbiana). Pré-tratamentos comuns incluem expansão de fibra de amônia (AFEX), ácido diluído (DA), líquido iônico (IL) e explosão de vapor (SE), que usam uma combinação de produtos químicos e calor para reduzir a produção de lignocelulose pela abertura das paredes celulares vegetais3,4. teimosia da matéria, 5. A hidrólise enzimática é realizada em uma alta carga de sólidos usando enzimas comerciais ativas contendo carboidratos (CAZymes) e fermentação microbiana usando leveduras ou bactérias transgênicas para produzir combustíveis e produtos químicos de base biológica6.
CAZymes em enzimas comerciais são compostos de uma mistura complexa de enzimas que clivam sinergicamente ligações complexas de carboidratos-açúcares para formar monossacarídeos2,7. Como relatamos anteriormente, a rede complexa de polímeros aromáticos de lignina com carboidratos os torna altamente intratáveis, o que leva à conversão incompleta de açúcar, acumulando 15-25% de oligossacarídeos sexuais que não são produzidos durante a hidrólise enzimática da biomassa pré-tratada. Este é um problema comum com vários métodos de pré-tratamento de biomassa. Algumas razões para esse gargalo incluem a inibição enzimática durante a hidrólise ou a ausência ou baixos níveis de enzimas essenciais que são necessárias para quebrar ligações de açúcar na biomassa vegetal. Compreender a composição e as características estruturais dos açúcares, como as ligações de açúcar em oligossacarídeos, nos ajudará a melhorar a conversão de açúcar durante a hidrólise, tornando os processos biotecnológicos competitivos em termos de custo com produtos derivados do petróleo.
Determinar a estrutura de carboidratos é desafiador e requer uma combinação de métodos como cromatografia líquida (LC)11,12, espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN)13, eletroforese capilar (EC)14,15,16 e espectrometria de massas (MS)17. , dezoito. Métodos de MS como espectrometria de massas de tempo de voo com dessorção a laser e ionização usando uma matriz (MALDI-TOF-MS) são um método versátil para identificar estruturas de carboidratos. Recentemente, a MS em tandem por dissociação induzida por colisão (CID) de adutos de íons sódio tem sido amplamente utilizada para identificar impressões digitais correspondentes a posições de ligação de oligossacarídeos, configurações anoméricas, sequências e posições de ramificação20, 21.
A análise de glicanos é uma excelente ferramenta para a identificação aprofundada de ligações de carboidratos22. Este método utiliza anticorpos monoclonais (mAbs) direcionados ao glicano da parede celular vegetal como sondas para compreender ligações complexas de carboidratos. Mais de 250 mAbs estão disponíveis em todo o mundo, projetados contra vários oligossacarídeos lineares e ramificados usando vários sacarídeos24. Vários mAbs têm sido amplamente utilizados para caracterizar a estrutura, composição e modificações da parede celular vegetal, visto que existem diferenças significativas dependendo do tipo de célula vegetal, órgão, idade, estágio de desenvolvimento e ambiente de crescimento25,26. Mais recentemente, este método tem sido utilizado para compreender populações de vesículas em sistemas vegetais e animais e seus respectivos papéis no transporte de glicanos, conforme determinado por marcadores subcelulares, estágios de desenvolvimento ou estímulos ambientais, e para determinar a atividade enzimática. Algumas das diferentes estruturas de glicanos e xilanos que foram identificadas incluem pectina (P), xilano (X), manano (M), xiloglucanos (XylG), glucanos de ligação mista (MLG), arabinoxilano (ArbX), galactomanano (GalG), ácido glucurônico-arabinoxilano (GArbX) e arabino-galactano (ArbG)29.
No entanto, apesar de todos esses esforços de pesquisa, poucos estudos se concentraram na natureza do acúmulo de oligossacarídeos durante a hidrólise com alta carga de sólidos (HSL), incluindo liberação de oligossacarídeos, alterações no comprimento da cadeia oligomérica durante a hidrólise, diversos polímeros de baixa DP e suas curvas de distribuição 30,31,32. Enquanto isso, embora a análise de glicanos tenha se mostrado uma ferramenta útil para uma análise abrangente da estrutura do glicano, é difícil avaliar oligossacarídeos de baixa DP solúveis em água usando métodos de anticorpos. Oligossacarídeos de DP menores, com peso molecular inferior a 5-10 kDa, não se ligam às placas de ELISA 33, 34 e são removidos por lavagem antes da adição do anticorpo.
Aqui, pela primeira vez, demonstramos um ensaio ELISA em placas revestidas com avidina utilizando anticorpos monoclonais, combinando um procedimento de biotinilação em uma etapa para oligossacarídeos refratários solúveis com análise do glicoma. Nossa abordagem para análise do glicoma foi validada por análises de ligações complementares de oligossacarídeos baseadas em MALDI-TOF-MS e GC-MS, utilizando derivatização de trimetilsilil (TMS) de composições de açúcares hidrolisados. Essa abordagem inovadora pode ser desenvolvida como um método de alto rendimento no futuro e encontrar ampla aplicação em pesquisas biomédicas35.
Modificações pós-traducionais de enzimas e anticorpos, como a glicosilação,36 afetam sua atividade biológica. Por exemplo, alterações na glicosilação de proteínas séricas desempenham um papel importante na artrite inflamatória, e alterações na glicosilação são usadas como marcadores diagnósticos37. Diversos glicanos têm sido relatados na literatura como facilmente encontrados em uma variedade de doenças, incluindo doenças inflamatórias crônicas do trato gastrointestinal e do fígado, infecções virais e cânceres de ovário, mama e próstata38,39,40. A compreensão da estrutura dos glicanos usando métodos de ELISA de glicanos baseados em anticorpos proporcionará maior confiança no diagnóstico de doenças sem o uso de métodos complexos de esclerose múltipla.
Nosso estudo anterior mostrou que oligossacarídeos teimosos permaneceram não hidrolisados ​​após pré-tratamento e hidrólise enzimática (Figura 1). Em nosso trabalho publicado anteriormente, desenvolvemos um método de extração em fase sólida com carvão ativado para isolar oligossacarídeos do hidrolisado de palha de milho pré-tratado com AFEX (ACSH)8. Após a extração e separação iniciais, os oligossacarídeos foram posteriormente fracionados por cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) e coletados em ordem de peso molecular. Monômeros e oligômeros de açúcar liberados de vários pré-tratamentos foram analisados ​​por análise de composição de açúcar. Ao comparar o conteúdo de oligômeros de açúcar obtidos por vários métodos de pré-tratamento, a presença de oligossacarídeos teimosos é um problema comum na conversão de biomassa em monossacarídeos e pode levar a uma redução no rendimento de açúcar de pelo menos 10-15% e até mesmo até 18%. EUA. Este método é usado para produção em larga escala de frações de oligossacarídeos. O ACH resultante e suas frações subsequentes com diferentes pesos moleculares foram usados ​​como material experimental para a caracterização de oligossacarídeos neste trabalho.
Após o pré-tratamento e a hidrólise enzimática, os oligossacarídeos persistentes permaneceram não hidrolisados. Aqui (A) é apresentado um método de separação de oligossacarídeos no qual oligossacarídeos são isolados de hidrolisado de palha de milho (ACSH) pré-tratado com AFEX usando um leito compactado de carvão ativado e terra diatomácea; (B) Método para separação de oligossacarídeos. Os oligossacarídeos foram posteriormente separados por cromatografia de exclusão por tamanho (SEC); (C) Monômeros e oligômeros de sacarídeos liberados de vários pré-tratamentos (ácido diluído: DA, líquido iônico: IL e AFEX). Condições de hidrólise enzimática: alta carga de sólidos de 25% (p/p) (aproximadamente 8% de carga de glucana), hidrólise de 96 horas, carga de enzima comercial de 20 mg/g (razão Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) e (D) Monômeros de açúcar e oligômeros de glicose, xilose e arabinose liberados da palha de milho pré-tratada com AFEX (ACS).
A análise de glicanos provou ser uma ferramenta útil para uma análise estrutural abrangente de glicanos em extratos isolados de resíduos de biomassa sólida. No entanto, sacarídeos solúveis em água são sub-representados usando este método tradicional41 porque oligossacarídeos de baixo peso molecular são difíceis de imobilizar em placas de ELISA e são removidos por lavagem antes da adição de anticorpos. Portanto, para a ligação e caracterização de anticorpos, um método de biotinilação em uma etapa foi usado para revestir oligossacarídeos solúveis e não complacentes em placas de ELISA revestidas com avidina. Este método foi testado usando nosso ACSH produzido anteriormente e uma fração baseada em seu peso molecular (ou grau de polimerização, DP). A biotinilação em uma etapa foi usada para aumentar a afinidade de ligação do oligossacarídeo adicionando biotina-LC-hidrazida à extremidade redutora do carboidrato (Fig. 2). Em solução, o grupo hemiacetal na extremidade redutora reage com o grupo hidrazida de biotina-LC-hidrazida para formar uma ligação hidrazona. Na presença do agente redutor NaCNBH3, a ligação hidrazona é reduzida a um produto final biotinilado estável. Com a modificação da extremidade redutora de açúcar, a ligação de oligossacarídeos de baixo DP a placas de ELISA tornou-se possível, e em nosso estudo isso foi feito em placas revestidas com avidina usando mAbs direcionados a glicanos.
Triagem de anticorpos monoclonais com base em ELISA para oligossacarídeos biotinilados. Aqui (A) a biotinilação combinada de oligossacarídeos e a subsequente triagem por ELISA com mAbs direcionados a glicanos em placas revestidas com NeutrAvidin e (B) mostra um procedimento de uma etapa para biotinilação de produtos de reação.
Placas revestidas com avidina contendo anticorpos conjugados a oligossacarídeos foram então adicionadas aos anticorpos primários e secundários e lavadas em meio sensível à luz e ao tempo. Após a ligação completa do anticorpo, o substrato TMB foi adicionado para incubar a placa. A reação foi finalmente interrompida com ácido sulfúrico. As placas incubadas foram analisadas em um leitor de ELISA para determinar a força de ligação de cada anticorpo e detectar a reticulação específica do anticorpo. Para detalhes e parâmetros do experimento, consulte a seção correspondente "Materiais e Métodos".
Demonstramos a utilidade deste método recém-desenvolvido para aplicações específicas, caracterizando os oligossacarídeos solúveis presentes no ACSH, bem como em frações de oligossacarídeos brutos e purificados isolados de hidrolisados ​​lignocelulósicos. Como mostrado na Figura 3, as xilanas substituídas por epítopos mais comuns identificadas no ACSH usando métodos de ensaio de glicoma bioacilado são geralmente arabinogalactanas urônicas (U) ou metilurônicas (MeU) e pécticas. A maioria delas também foi encontrada em nosso estudo anterior sobre a análise de glicanas de sólidos não hidrolisados ​​(SUS)43.
Detecção de epítopos de oligossacarídeos recalcitrantes utilizando um anticorpo monoclonal direcionado ao glicano da parede celular. A fração "neutra" é a fração ACN e a fração "ácida" é a fração FA. Vermelhos mais brilhantes no mapa de calor indicam maior conteúdo de epítopos, e azuis mais brilhantes indicam um fundo branco. Os valores de cor na escala são baseados em valores de DO brutos para formulações N = 2. Os principais epítopos reconhecidos pelos anticorpos são mostrados à direita.
Essas estruturas não celulósicas não puderam ser clivadas pelas celulases e hemicelulases mais comuns na mistura enzimática comercial testada, que inclui as enzimas comerciais mais utilizadas. Portanto, novas enzimas auxiliares são necessárias para sua hidrólise. Sem as enzimas acessórias não celulósicas necessárias, essas ligações não celulósicas impedem a conversão completa em monossacarídeos, mesmo que seus polímeros de açúcar originais sejam extensivamente hidrolisados ​​em fragmentos mais curtos e dissolvidos com misturas enzimáticas comerciais.
Estudos adicionais da distribuição do sinal e sua força de ligação mostraram que os epítopos de ligação eram menores em frações de açúcar com alto DP (A, B, C, DP até 20+) do que em frações com baixo DP (D, E, F, DP) em dímeros (Fig. 1). Fragmentos ácidos são mais comuns em epítopos não celulósicos do que em fragmentos neutros. Esses fenômenos são consistentes com o padrão observado em nosso estudo anterior, onde frações com alto DP e ácidos eram mais resistentes à hidrólise enzimática. Portanto, a presença de epítopos de glicanos não celulósicos e substituições de U e MeU podem contribuir significativamente para a estabilidade dos oligossacarídeos. Deve-se notar que a eficiência de ligação e detecção pode ser problemática para oligossacarídeos com baixo DP, especialmente se o epítopo for um oligossacarídeo dimérico ou trimérico. Isso pode ser testado usando oligossacarídeos comerciais de diferentes comprimentos, cada um contendo apenas um epítopo que se liga a um mAb específico.
Assim, o uso de anticorpos específicos para cada estrutura revelou certos tipos de ligações recalcitrantes. Dependendo do tipo de anticorpo utilizado, do padrão de ligação apropriado e da intensidade do sinal que ele produz (mais e menos abundante), novas enzimas podem ser identificadas e adicionadas semiquantitativamente à mistura enzimática para uma glicoconversão mais completa. Tomando a análise de oligossacarídeos ACSH como exemplo, podemos criar um banco de dados de ligações de glicano para cada material de biomassa. Deve-se notar aqui que as diferentes afinidades dos anticorpos devem ser levadas em consideração e, se sua afinidade for desconhecida, isso criará certas dificuldades ao comparar os sinais de diferentes anticorpos. Além disso, a comparação de ligações de glicano pode funcionar melhor entre amostras para o mesmo anticorpo. Essas ligações persistentes podem então ser vinculadas ao banco de dados CAZyme, a partir do qual podemos identificar enzimas, selecionar enzimas candidatas e testar enzimas de quebra de ligações, ou desenvolver sistemas microbianos para expressar essas enzimas para uso em biorrefinarias44.
Para avaliar como métodos imunológicos complementam métodos alternativos para caracterizar oligossacarídeos de baixo peso molecular presentes em hidrolisados ​​lignocelulósicos, realizamos MALDI (Fig. 4, S1-S8) e análise de sacarídeos derivados de TMS com base em GC-MS no mesmo painel (Fig. 5) da parte do oligossacarídeo. MALDI é usado para comparar se a distribuição de massa das moléculas de oligossacarídeo corresponde à estrutura pretendida. A Fig. 4 mostra MS dos componentes neutros ACN-A e ACN-B. A análise de ACN-A confirmou uma gama de açúcares pentoses variando de DP 4-8 (Fig. 4) a DP 22 (Fig. S1), cujos pesos correspondem aos oligossacarídeos MeU-xilana. A análise de ACN-B confirmou as séries de pentoses e glucoxilanas com DP 8-15. Em material suplementar, como a Figura S3, os mapas de distribuição de massa da fração ácida FA-C mostram uma gama de açúcares pentose substituídos por (Me)U com um DP de 8-15, consistentes com os xilanos substituídos encontrados na triagem de mAb baseada em ELISA. Os epítopos são consistentes.
Espectro de MALDI-MS de oligossacarídeos solúveis não conformes presentes em ACS. Aqui, (A) frações de baixo peso de ACN-A contendo oligossacarídeos de glucuroxilana substituídos por ácido urônico metilado (DP 4-8) e (B) oligossacarídeos de xilana e ácido urônico metilado de ACN-B substituídos por glucuroxilana (DP 8-15).
Análise da composição do resíduo de glicano de oligossacarídeos refratários. Aqui (A) Composição de sacarídeos de TMS de várias frações de oligossacarídeos obtidas por análise GC-MS. (B) Estruturas de vários açúcares derivados de TMS presentes em oligossacarídeos. ACN – fração de acetonitrila contendo oligossacarídeos neutros e FA – fração de ácido ferúlico contendo oligossacarídeos ácidos.
Outra conclusão interessante foi extraída da análise por LC-MS da fração de oligossacarídeos, como mostrado na Figura S9 (os métodos podem ser vistos no material eletrônico suplementar). Fragmentos de grupos hexose e -OAc foram observados repetidamente durante a ligação da fração ACN-B. Essa descoberta não apenas confirma a fragmentação observada na análise de glicoma e MALDI-TOF, mas também fornece novas informações sobre potenciais derivados de carboidratos em biomassa lignocelulósica pré-tratada.
Também realizamos análises da composição de glicanos de frações de oligossacarídeos usando derivatização de glicanos por TMS. Usando GC-MS, determinamos a composição de açúcares neurais (não derivados) e ácidos (GluA e GalA) na fração de oligossacarídeos (Fig. 5). O ácido glicurônico é encontrado nos componentes ácidos C e D, enquanto o ácido galacturônico é encontrado nos componentes ácidos A e B, ambos componentes de alto DP de açúcares ácidos. Esses resultados não apenas confirmam nossos dados de ELISA e MALDI, mas também são consistentes com nossos estudos anteriores de acúmulo de oligossacarídeos. Portanto, acreditamos que métodos imunológicos modernos usando biotinilação de oligossacarídeos e subsequente triagem por ELISA são suficientes para detectar oligossacarídeos recalcitrantes solúveis em várias amostras biológicas.
Como os métodos de triagem de mAbs baseados em ELISA foram validados por diversos métodos diferentes, queríamos explorar ainda mais o potencial desse novo método quantitativo. Dois oligossacarídeos comerciais, o oligossacarídeo xilohexassacarídeo (XHE) e a 23-α-L-arabinofuranosil-xilotriose (A2XX), foram adquiridos e testados usando uma nova abordagem de mAbs visando o glicano da parede celular. A Figura 6 mostra uma correlação linear entre o sinal de ligação biotinilado e a concentração logarítmica da concentração de oligossacarídeo, sugerindo um possível modelo de adsorção de Langmuir. Entre os mAbs, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 e CCRC-M151 correlacionaram-se com XHE, e CCRC-M108, CCRC-M109 e LM11 correlacionaram-se com A2XX em uma faixa de 1 nm a 100 nano. Devido à disponibilidade limitada de anticorpos durante o experimento, foram realizados experimentos limitados com cada concentração de oligossacarídeo. Deve-se notar aqui que alguns anticorpos reagem de forma muito diferente ao mesmo oligossacarídeo como substrato, presumivelmente porque se ligam a epítopos ligeiramente diferentes e podem ter afinidades de ligação muito distintas. Os mecanismos e implicações da identificação precisa de epítopos serão muito mais complexos quando a nova abordagem com mAb for aplicada a amostras reais.
Dois oligossacarídeos comerciais foram utilizados para determinar a faixa de detecção de vários mAbs direcionados a glicanos. Aqui, correlações lineares com a concentração logarítmica da concentração de oligossacarídeos indicam padrões de adsorção de Langmuir para (A) XHE com mAb e (B) A2XX com mAb. Os epítopos correspondentes indicam as estruturas dos oligossacarídeos comerciais utilizados como substratos no ensaio.
O uso de anticorpos monoclonais direcionados a glicanos (análise glicocômica ou triagem de mAb baseada em ELISA) é uma ferramenta poderosa para a caracterização aprofundada da maioria dos principais glicanos da parede celular que compõem a biomassa vegetal. No entanto, a análise clássica de glicanos caracteriza apenas glicanos maiores da parede celular, visto que a maioria dos oligossacarídeos não é imobilizada eficientemente em placas de ELISA. Neste estudo, a palha de milho pré-tratada com AFEX foi hidrolisada enzimaticamente com alto teor de sólidos. A análise de açúcares foi utilizada para determinar a composição de carboidratos recalcitrantes da parede celular no hidrolisado. No entanto, a análise de mAb de oligossacarídeos menores em hidrolisados ​​é subestimada, sendo necessárias ferramentas adicionais para imobilizar oligossacarídeos efetivamente em placas de ELISA.
Relatamos aqui um novo e eficiente método de imobilização de oligossacarídeos para triagem de anticorpos monoclonais (mAb), combinando biotinilação de oligossacarídeos seguida de triagem por ELISA em placas revestidas com NeutrAvidin™. Os oligossacarídeos biotinilados imobilizados demonstraram afinidade suficiente pelo anticorpo para permitir a detecção rápida e eficiente de oligossacarídeos recalcitrantes. A análise da composição desses oligossacarídeos teimosos com base em espectrometria de massas confirmou os resultados dessa nova abordagem para imunotriagem. Assim, esses estudos demonstram que a combinação de biotinilação de oligossacarídeos e triagem por ELISA com anticorpos monoclonais direcionados a glicanos pode ser usada para detectar ligações cruzadas em oligossacarídeos e pode ser amplamente aplicada em outros estudos bioquímicos que caracterizam a estrutura de oligossacarídeos.
Este método de perfil de glicano baseado em biotina é o primeiro relatório capaz de investigar as ligações recalcitrantes de carboidratos de oligossacarídeos solúveis na biomassa vegetal. Isso ajuda a entender por que algumas partes da biomassa são tão resistentes quando se trata da produção de biocombustíveis. Este método preenche uma lacuna importante nos métodos de análise de glicano e estende sua aplicação a uma gama mais ampla de substratos além dos oligossacarídeos vegetais. No futuro, poderemos usar robótica para biotinilação e usar o método que desenvolvemos para análises de alto rendimento de amostras usando ELISA.
A palha de milho (CS) cultivada a partir de sementes híbridas Pioneer 33A14 foi colhida em 2010 na Kramer Farms em Ray, Colorado. Com a permissão do proprietário, essa biomassa pode ser usada para pesquisas. As amostras foram armazenadas secas < 6% de umidade em sacos zip-lock em temperatura ambiente. As amostras foram armazenadas secas < 6% de umidade em sacos zip-lock em temperatura ambiente. A privacidade deve ser mantida com uma taxa de retorno < 6% no pacote com temperatura de temperatura máxima. As amostras foram armazenadas secas com umidade <6% em sacos com zíper em temperatura ambiente.样品在室温下以干燥<6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥<6% Certifique-se de que o pacote esteja com temperatura máxima de entrada < 6%. As amostras são armazenadas em sacos com zíper em temperatura ambiente e umidade < 6%.O estudo atendeu às diretrizes locais e nacionais. A análise composicional foi realizada utilizando o protocolo NREL. A composição continha 31,4% de glucana, 18,7% de xilana, 3,3% de arabinana, 1,2% de galactana, 2,2% de acetila, 14,3% de lignina, 1,7% de proteína e 13,4% de cinzas.
Cellic® CTec2 (138 mg de proteína/ml, lote VCNI 0001) é uma mistura complexa de celulase, β-glicosidase e Cellic® HTec2 (157 mg de proteína/ml, lote VHN00001) da Novozymes (Franklinton, NC, EUA). A Multifect Pectinase® (72 mg de proteína/mL), uma mistura complexa de enzimas degradadoras de pectina, foi doada pela DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, EUA). As concentrações de proteína enzimática foram determinadas pela estimativa do teor de proteína (e subtraindo a contribuição de nitrogênio não proteico) utilizando a análise de nitrogênio Kjeldahl (método AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, EUA). A terra diatomácea 545 foi adquirida da EMD Millipore (Billerica, MA). Carvão ativado (DARCO, grânulos de 100 mesh), Avicel (PH-101), xilana de faia e todos os outros produtos químicos foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
O pré-tratamento com AFEX foi realizado no GLBRC (Laboratório de Pesquisa de Conversão de Biomassa, MSU, Lansing, MI, EUA). O pré-tratamento foi realizado a 140 °C por 15 minutos. 46 minutos de tempo de residência na proporção de 1:1 de amônia anidra para biomassa, com carga de 60% (p/p), em um reator de bancada em batelada de aço inoxidável (Parr Instruments Company). O tempo de residência foi de 30 minutos. O reator foi levado a 140 °C e a amônia foi rapidamente liberada, permitindo que a biomassa retornasse rapidamente à temperatura ambiente. A composição da palha de milho pré-tratada com AFEX (ACS) foi semelhante à da palha de milho não tratada (UT-CS).
ACSH com alto teor de sólidos 25% (p/p) (aproximadamente 8% de carga de dextrana) foi preparado como material de partida para a produção em larga escala de oligossacarídeos. A hidrólise enzimática do ACS foi realizada usando uma mistura enzimática comercial incluindo Cellic® Ctec2 10 mg proteína/g glucana (em biomassa pré-tratada), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg proteína/g glucana e Multifect Pectinase (Genencor Inc, EUA). ). ), 5 mg proteína/g de dextrana. A hidrólise enzimática foi realizada em um biorreator de 5 litros com um volume de trabalho de 3 litros, pH 4,8, 50 °C e 250 rpm. Após hidrólise por 96 horas, o hidrolisado foi coletado por centrifugação a 6000 rpm por 30 minutos e depois a 14000 rpm por 30 minutos para remover sólidos não hidrolisados. O hidrolisado foi então submetido à filtração estéril através de um béquer filtrante de 0,22 mm. O hidrolisado filtrado foi armazenado em frascos estéreis a 4°C e, em seguida, fracionado em carbono.
Análise da composição de amostras de biomassa à base de extrato de acordo com os procedimentos de análise de laboratório do NREL: preparação de amostras para análise de composição (NREL/TP-510-42620) e determinação de carboidratos estruturais e lignina na biomassa (NREL/TP-510 – 42618)47.
A análise de oligossacarídeos da corrente hidrolisada foi realizada em uma escala de 2 ml usando um método de hidrólise ácida em autoclave. Misture a amostra hidrolisada com 69,7 µl de ácido sulfúrico a 72% em um tubo de cultura de 10 ml com tampa de rosca e incube por 1 h em uma bancada a 121 °C, resfrie em gelo e filtre em um frasco de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). A concentração de oligossacarídeos foi determinada subtraindo a concentração de monossacarídeos na amostra não hidrolisada da concentração total de açúcares na amostra hidrolisada com ácido.
As concentrações de glicose, xilose e arabinose na biomassa hidrolisada com ácido foram analisadas usando um sistema de HPLC Shimadzu equipado com amostrador automático, aquecedor de coluna, bomba isocrática e detector de índice de refração em uma coluna Bio-Rad Aminex HPX-87H. A coluna foi mantida a 50 °C e eluída com fluxo de 0,6 ml/min de H₂SO₂ 5 mM em água.
O sobrenadante do hidrolisado foi diluído e analisado quanto ao teor de monômeros e oligossacarídeos. Os açúcares monoméricos obtidos após a hidrólise enzimática foram analisados ​​por HPLC equipada com uma coluna Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P e uma coluna de proteção de cinzas. A temperatura da coluna foi mantida a 80 °C, utilizando-se água como fase móvel com vazão de 0,6 ml/min. Os oligossacarídeos foram determinados por hidrólise em ácido diluído a 121 °C, de acordo com os métodos descritos nas referências 41, 48 e 49.
A análise de sacarídeos foi realizada em resíduos de biomassa brutos, pré-tratados com AFEX e todos os resíduos de biomassa não hidrolisados ​​(incluindo a produção de extratos seriais de parede celular e sua triagem de mAb) usando procedimentos descritos anteriormente 27, 43, 50, 51. Para análise de glicoma, resíduos insolúveis em álcool de material de parede celular vegetal são preparados a partir de resíduos de biomassa e submetidos à extração serial com reagentes cada vez mais agressivos, como oxalato de amônio (50 mM), carbonato de sódio (50 mM e 0,5% p/v), CON. (1M e 4M, ambos com borohidreto de sódio a 1% p/v) e clorito ácido, conforme descrito anteriormente 52,53. Os extratos foram então submetidos a ELISA contra um painel complexo de mAb50s direcionados ao glicano da parede celular, e as reações de ligação do mAb foram apresentadas como um mapa de calor. Os mAbs direcionados ao glicano da parede celular vegetal foram adquiridos de estoques de laboratório (séries CCRC, JIM e MAC).
Biotinilação de oligossacarídeos em uma etapa. A conjugação de carboidratos com biotina-LC-hidrazida foi realizada utilizando o seguinte procedimento. Biotina-LC-hidrazida (4,6 mg/12 μmol) foi dissolvida em dimetilsulfóxido (DMSO, 70 μl) por agitação vigorosa e aquecimento a 65 °C por 1 min. Ácido acético glacial (30 μl) foi adicionado e a mistura foi vertida sobre cianoborohidreto de sódio (6,4 mg/100 μmol) e completamente dissolvida após aquecimento a 65 °C por cerca de 1 minuto. Em seguida, de 5 a 8 μl da mistura de reação foram adicionados ao oligossacarídeo seco (1-100 nmol) para obter um excesso molar de 10 vezes ou mais do marcador sobre a extremidade redutora. A reação foi realizada a 65 °C por 2 h, após o que as amostras foram imediatamente purificadas. Nenhum cianoborohidreto de sódio foi usado nos experimentos de marcação sem redução, e as amostras reagiram a 65° C por 2,5 horas.
Revestimento e lavagem de amostras de oligossacarídeos biotinilados por ELISA. 25 μl de amostras biotiniladas (100 μl de cada amostra concentrada diluída em 5 ml de solução tampão Tris 0,1 M (TBS)) foram adicionados a cada poço da placa revestida com avidina. Os poços controle foram revestidos com 50 μl de biotina na concentração de 10 μg/ml em TBS 0,1 M. Água deionizada foi utilizada como revestimento para as medições em branco. O comprimido foi incubado por 2 horas à temperatura ambiente no escuro. A placa foi lavada 3 vezes com leite desnatado a 0,1% em TBS 0,1 M, utilizando o programa nº 11 para Grenier Flat 3A.
Adição e lavagem dos anticorpos primários. Adicione 40 µl de anticorpo primário a cada poço. Incube a microplaca por 1 hora à temperatura ambiente no escuro. As placas foram então lavadas 3 vezes com leite a 0,1% em 0,1 M de TBS, utilizando o programa de lavagem nº 11 para Grenier Flat 3A.
Adicione o anticorpo secundário e lave. Adicione 50 µl de anticorpo secundário de camundongo/rato (diluído 1:5000 em leite a 0,1% em TBS 0,1 M) a cada poço. Incubar a microplaca por 1 hora em temperatura ambiente no escuro. As microplacas foram então lavadas 5 vezes com leite a 0,1% em TBS 0,1 M usando o programa de lavagem de placas Grenier Flat 5A nº 12.
Adição de substrato. Adicione 50 µl de 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) ao substrato base (adicionando 2 gotas de tampão, 3 gotas de TMB e 2 gotas de peróxido de hidrogênio a 15 ml de água deionizada). Prepare o substrato de TMB e agite em vórtex antes do uso. Incube a microplaca em temperatura ambiente por 30 minutos. No escuro.
Conclua a etapa e leia o comprimido. Adicione 50 µl de ácido sulfúrico 1 N a cada poço e registre a absorbância de 450 a 655 nm usando um leitor de ELISA.
Preparar soluções de 1 mg/ml dos seguintes analitos em água deionizada: arabinose, ramnose, fucose, xilose, ácido galacturônico (GalA), ácido glicurônico (GlcA), manose, glicose, galactose, lactose, N-acetilmanosamina (manNAc), N-acetilglicosamina (glcNAc), N-acetilgalactosamina (galNAc), inositol (padrão interno). Dois padrões foram preparados adicionando as soluções de açúcar de 1 mg/mL mostradas na Tabela 1. As amostras são congeladas e liofilizadas a -80 °C até que toda a água seja removida (geralmente cerca de 12 a 18 horas).
Adicione 100–500 µg de amostra a tubos com tampa de rosca em uma balança analítica. Registre a quantidade adicionada. É melhor dissolver a amostra em uma concentração específica de solvente e adicioná-la ao tubo como uma alíquota líquida. Use 20 µl de inositol a 1 mg/ml como padrão interno para cada tubo de amostra. A quantidade de padrão interno adicionada à amostra deve ser igual à quantidade de padrão interno adicionada ao tubo de amostra.
Adicione 8 ml de metanol anidro a um frasco com tampa de rosca. Em seguida, adicione 4 ml de solução de HCl metanólico 3 N, tampe e agite. Este processo não utiliza água.
Adicionar 500 µl de solução de HCl metanólico 1 M às amostras de oligossacarídeos e aos tubos TMS padrão. As amostras foram incubadas durante a noite (168 horas) a 80 °C em um bloco térmico. Secar o produto de metanólise à temperatura ambiente usando um coletor de secagem. Adicionar 200 µl de MeOH e secar novamente. Este processo é repetido duas vezes. Adicionar 200 µl de metanol, 100 µl de piridina e 100 µl de anidrido acético à amostra e misturar bem. Incubar as amostras à temperatura ambiente por 30 minutos e secar. Adicionar 200 µl de metanol e secar novamente.
Adicione 200 µl de Tri-Sil e aqueça o tubo tampado por 20 minutos a 80 °C e, em seguida, deixe esfriar à temperatura ambiente. Use um coletor de secagem para secar ainda mais a amostra até um volume de aproximadamente 50 µl. É importante observar que não deixamos as amostras secarem completamente.
Adicione 2 ml de hexano e misture bem em vórtex. Preencha as pontas das pipetas Pasteur (5-8 mm) com um pedaço de lã de vidro, inserindo-o sobre uma pipeta de 5-3/4 polegadas de diâmetro. As amostras foram centrifugadas a 3000 g por 2 minutos. Quaisquer resíduos insolúveis são precipitados. Seque a amostra até 100-150 µl. Um volume de aproximadamente 1 µl foi injetado no GC-MS a uma temperatura inicial de 80 °C e um tempo inicial de 2,0 minutos (Tabela 2).