از بازدید شما از Nature.com متشکریم. نسخه مرورگری که استفاده می‌کنید پشتیبانی محدودی از CSS دارد. برای بهترین تجربه، توصیه می‌کنیم از یک مرورگر به‌روز استفاده کنید (یا حالت سازگاری را در Internet Explorer غیرفعال کنید). در عین حال، برای اطمینان از ادامه پشتیبانی، سایت را بدون استایل‌ها و جاوا اسکریپت رندر خواهیم کرد.
روش‌های جدید ایمونولوژیکی و طیف‌سنجی جرمی برای تجزیه و تحلیل پیچیده الیگوساکاریدهای پایدار در کاه ذرت پیش تیمار شده با AFEX. زیست‌توده لیگنوسلولزی یک جایگزین پایدار برای سوخت‌های فسیلی است و به طور گسترده برای توسعه بیوتکنولوژی‌ها برای تولید محصولاتی مانند غذا، خوراک دام، سوخت و مواد شیمیایی استفاده می‌شود. کلید این فناوری‌ها، توسعه فرآیندهای رقابتی از نظر هزینه برای تبدیل کربوهیدرات‌های پیچیده موجود در دیواره‌های سلولی گیاه به قندهای ساده مانند گلوکز، زایلوز و آرابینوز است. از آنجا که زیست‌توده لیگنوسلولزی بسیار سرسخت است، باید تحت عملیات ترموشیمیایی (مانند لایه‌برداری فیبر آمونیاک (AFEX)، اسیدهای رقیق (DA)، مایعات یونی (IL)) و عملیات بیولوژیکی (مانند هیدرولیز آنزیمی و تخمیر میکروبی) به صورت ترکیبی قرار گیرد تا محصول مورد نظر به دست آید. با این حال، هنگامی که آنزیم‌های قارچی تجاری در فرآیند هیدرولیز استفاده می‌شوند، تنها 75 تا 85 درصد از قندهای محلول تشکیل شده مونوساکاریدها هستند و 15 تا 25 درصد باقی مانده، الیگوساکاریدهای محلول و مقاوم به هضم هستند که همیشه در دسترس میکروارگانیسم‌ها نیستند. پیش از این، ما با موفقیت الیگوساکاریدهای سرسخت محلول را با استفاده از ترکیبی از جداسازی کربن و خاک دیاتومه و کروماتوگرافی حذف اندازه، جداسازی و خالص‌سازی کرده‌ایم و همچنین خواص مهارکنندگی آنزیمی آنها را بررسی کرده‌ایم. ما دریافته‌ایم که الیگوساکاریدهای حاوی جایگزینی‌های اسید اورونیک متیله شده با درجه پلیمریزاسیون (DP) بالاتر، پردازش آنها با مخلوط‌های آنزیمی تجاری دشوارتر از الیگوساکاریدهای DP پایین و خنثی است. در اینجا ما استفاده از چندین روش اضافی، از جمله پروفایل گلیکان با استفاده از آنتی‌بادی‌های مونوکلونال (mAbs) مخصوص گلیکان‌های زیست‌توده گیاهی برای توصیف پیوندهای گلیکان در دیواره‌های سلولی گیاهی و هیدرولیزهای آنزیمی، یونیزاسیون دفع لیزری به کمک ماتریس، طیف‌سنجی جرمی زمان پرواز را گزارش می‌دهیم. MALDI-TOF-MS) از پیک‌های تشخیصی ساختار-آگاه به دست آمده توسط طیف‌سنجی پس از واپاشی ثانویه یون‌های منفی، کروماتوگرافی گازی و طیف‌سنجی جرمی (GC-MS) برای توصیف پیوندهای الیگوساکارید با و بدون مشتق‌سازی استفاده می‌کند. با توجه به اندازه کوچک الیگوساکاریدها (DP 4-20)، استفاده از این مولکول‌ها برای اتصال و توصیف mAb دشوار است. برای غلبه بر این مشکل، ما یک روش جدید تثبیت الیگوساکارید مبتنی بر کونژوگاسیون بیوتین را اعمال کردیم که با موفقیت اکثر الیگوساکاریدهای محلول با DP کم را روی سطح میکروپلیت نشاندار کرد، که سپس در یک سیستم mAb با توان عملیاتی بالا برای تجزیه و تحلیل اتصال خاص استفاده شد. این روش جدید، توسعه سنجش‌های پیشرفته‌تر گلیکوم با توان عملیاتی بالا را در آینده تسهیل می‌کند که می‌توانند برای جداسازی و توصیف الیگوساکاریدهای موجود در نشانگرهای زیستی برای اهداف تشخیصی استفاده شوند.
زیست‌توده لیگنوسلولزی، متشکل از مواد کشاورزی، جنگلی، علف و چوب، یک ماده اولیه بالقوه برای تولید محصولات زیستی، از جمله غذا، خوراک دام، سوخت و پیش‌سازهای شیمیایی برای تولید محصولات با ارزش بالاتر است.1 کربوهیدرات‌ها (مانند سلولز و همی‌سلولز) موجود در دیواره‌های سلولی گیاهان با پردازش شیمیایی و تبدیل زیستی (مانند هیدرولیز آنزیمی و تخمیر میکروبی) به مونوساکاریدها دپلیمریزه می‌شوند. پیش‌تیمارهای رایج شامل انبساط فیبر آمونیاک (AFEX)، اسید رقیق (DA)، مایع یونی (IL) و انفجار بخار (SE) هستند که از ترکیبی از مواد شیمیایی و گرما برای کاهش تولید لیگنوسلولز با باز کردن دیواره‌های سلولی گیاه استفاده می‌کنند.3،4. سرسختی ماده، 5. هیدرولیز آنزیمی با بار جامد بالا با استفاده از آنزیم‌های تجاری حاوی کربوهیدرات فعال (CAZymes) و تخمیر میکروبی با استفاده از مخمرها یا باکتری‌های تراریخته برای تولید سوخت‌ها و مواد شیمیایی زیستی انجام می‌شود.6
آنزیم‌های CAZyme موجود در آنزیم‌های تجاری از مخلوط پیچیده‌ای از آنزیم‌ها تشکیل شده‌اند که به صورت هم‌افزایی پیوندهای پیچیده کربوهیدرات-قند را می‌شکنند و مونوساکاریدها را تشکیل می‌دهند.2،7 همانطور که قبلاً گزارش دادیم، شبکه پیچیده پلیمرهای آروماتیک لیگنین با کربوهیدرات‌ها، آنها را بسیار مقاوم می‌کند که منجر به تبدیل ناقص قند می‌شود و 15 تا 25 درصد از الیگوساکاریدهای جنسی را که در طول هیدرولیز آنزیمی زیست‌توده پیش تصفیه شده تولید نمی‌شوند، تجمع می‌دهد. این یک مشکل رایج در روش‌های مختلف پیش تصفیه زیست‌توده است. برخی از دلایل این تنگنا شامل مهار آنزیم در طول هیدرولیز یا عدم وجود یا سطح پایین آنزیم‌های ضروری ضروری است که برای شکستن پیوندهای قندی در زیست‌توده گیاهی مورد نیاز هستند. درک ترکیب و ویژگی‌های ساختاری قندها، مانند پیوندهای قندی در الیگوساکاریدها، به ما کمک می‌کند تا تبدیل قند را در طول هیدرولیز بهبود بخشیم و فرآیندهای بیوتکنولوژیکی را از نظر هزینه با محصولات مشتق شده از نفت قابل رقابت کنیم.
تعیین ساختار کربوهیدرات‌ها چالش‌برانگیز است و نیاز به ترکیبی از روش‌هایی مانند کروماتوگرافی مایع (LC)11،12، طیف‌سنجی رزونانس مغناطیسی هسته‌ای (NMR)13، الکتروفورز مویین (CE)14،15،16 و طیف‌سنجی جرمی (MS)17،18 دارد. روش‌های طیف‌سنجی جرمی مانند طیف‌سنجی جرمی زمان پرواز با واجذب لیزر و یونیزاسیون با استفاده از یک ماتریس (MALDI-TOF-MS) روشی همه‌کاره برای شناسایی ساختارهای کربوهیدرات هستند. اخیراً، طیف‌سنجی جرمی پشت سر هم تفکیک القایی برخورد (CID) از ترکیبات افزایشی یون سدیم به طور گسترده برای شناسایی اثر انگشت مربوط به موقعیت‌های اتصال الیگوساکارید، پیکربندی‌های آنومری، توالی‌ها و موقعیت‌های شاخه‌بندی استفاده شده است. 20، 21.
تجزیه و تحلیل گلیکان ابزاری عالی برای شناسایی عمیق پیوندهای کربوهیدراتی است22. این روش از آنتی‌بادی‌های مونوکلونال (mAbs) که به گلیکان دیواره سلولی گیاه هدایت می‌شوند، به عنوان کاوشگر برای درک پیوندهای پیچیده کربوهیدرات استفاده می‌کند. بیش از 250 mAbs در سراسر جهان در دسترس هستند که با استفاده از ساکاریدهای مختلف، علیه الیگوساکاریدهای خطی و شاخه‌دار مختلف طراحی شده‌اند24. چندین mAbs به طور گسترده برای توصیف ساختار، ترکیب و تغییرات دیواره سلولی گیاه استفاده شده‌اند، زیرا بسته به نوع سلول گیاهی، اندام، سن، مرحله رشد و محیط رشد، تفاوت‌های قابل توجهی وجود دارد25،26. اخیراً، این روش برای درک جمعیت‌های وزیکول در سیستم‌های گیاهی و حیوانی و نقش‌های مربوطه آنها در انتقال گلیکان که توسط نشانگرهای زیر سلولی، مراحل رشد یا محرک‌های محیطی تعیین می‌شوند، و برای تعیین فعالیت آنزیمی استفاده شده است. برخی از ساختارهای مختلف گلیکان‌ها و زایلان‌ها که شناسایی شده‌اند شامل پکتین (P)، زایلان (X)، مانان (M)، زایلوگلوکان‌ها (XylG)، گلوکان‌های پیوند مختلط (MLG)، آرابینوزایلان (ArbX)، گالاکتومانان (GalG)، اسید گلوکورونیک-آرابینوزایلان (GArbX) و آرابینو-گالاکتان (ArbG)29 هستند.
با این حال، علیرغم تمام این تلاش‌های تحقیقاتی، تنها تعداد کمی از مطالعات بر ماهیت تجمع الیگوساکارید در طول هیدرولیز با بار جامد بالا (HSL)، از جمله آزادسازی الیگوساکارید، تغییرات طول زنجیره الیگومری در طول هیدرولیز، پلیمرهای مختلف با DP پایین و منحنی‌های توزیع آنها تمرکز کرده‌اند. 30،31،32. در همین حال، اگرچه تجزیه و تحلیل گلیکان به عنوان ابزاری مفید برای تجزیه و تحلیل جامع ساختار گلیکان ثابت شده است، ارزیابی الیگوساکاریدهای با DP پایین محلول در آب با استفاده از روش‌های آنتی‌بادی دشوار است. الیگوساکاریدهای DP کوچکتر با وزن مولکولی کمتر از 5-10 کیلو دالتون به صفحات ELISA 33، 34 متصل نمی‌شوند و قبل از افزودن آنتی‌بادی شسته می‌شوند.
در اینجا، برای اولین بار، ما یک سنجش ELISA را روی صفحات پوشیده شده با آویدین با استفاده از آنتی‌بادی‌های مونوکلونال نشان می‌دهیم که ترکیبی از یک روش بیوتینیلاسیون یک مرحله‌ای برای الیگوساکاریدهای مقاوم محلول با آنالیز گلیکوم است. رویکرد ما برای آنالیز گلیکوم با آنالیز مبتنی بر MALDI-TOF-MS و GC-MS از پیوندهای الیگوساکارید مکمل با استفاده از مشتق‌سازی تری متیل سیلیل (TMS) از ترکیبات قند هیدرولیز شده، تأیید شد. این رویکرد نوآورانه می‌تواند در آینده به عنوان یک روش با توان عملیاتی بالا توسعه یابد و کاربرد گسترده‌تری در تحقیقات زیست پزشکی پیدا کند35.
تغییرات پس از ترجمه آنزیم‌ها و آنتی‌بادی‌ها، مانند گلیکوزیلاسیون،36 بر فعالیت بیولوژیکی آنها تأثیر می‌گذارد. به عنوان مثال، تغییرات در گلیکوزیلاسیون پروتئین‌های سرم نقش مهمی در آرتریت التهابی ایفا می‌کند و تغییرات در گلیکوزیلاسیون به عنوان نشانگرهای تشخیصی استفاده می‌شوند37. در مقالات گزارش شده است که گلیکان‌های مختلف به راحتی در انواع بیماری‌ها، از جمله بیماری‌های التهابی مزمن دستگاه گوارش و کبد، عفونت‌های ویروسی، سرطان‌های تخمدان، سینه و پروستات،38،39،40 ظاهر می‌شوند. درک ساختار گلیکان‌ها با استفاده از روش‌های الایزای گلیکان مبتنی بر آنتی‌بادی، اطمینان بیشتری در تشخیص بیماری بدون استفاده از روش‌های پیچیده MS ایجاد می‌کند.
مطالعه قبلی ما نشان داد که الیگوساکاریدها سرسخت پس از پیش‌فرآوری و هیدرولیز آنزیمی، هیدرولیز نشده باقی می‌مانند (شکل 1). در کار منتشر شده قبلی ما، ما یک روش استخراج فاز جامد با زغال فعال برای جداسازی الیگوساکاریدها از هیدرولیز کاه ذرت پیش‌فرآوری شده با AFEX (ACSH)8 توسعه دادیم. پس از استخراج و جداسازی اولیه، الیگوساکاریدها با استفاده از کروماتوگرافی اندازه‌سنجی (SEC) بیشتر تفکیک و به ترتیب وزن مولکولی جمع‌آوری شدند. مونومرها و الیگومرهای قندی آزاد شده از پیش‌فرآوری‌های مختلف با استفاده از آنالیز ترکیب قند مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. هنگام مقایسه محتوای الیگومرهای قندی به‌دست‌آمده از روش‌های مختلف پیش‌فرآوری، وجود الیگوساکاریدها سرسخت یک مشکل رایج در تبدیل زیست‌توده به مونوساکاریدها است و می‌تواند منجر به کاهش حداقل 10 تا 15 درصد و حتی تا 18 درصد در بازده قند شود. این روش برای تولید بیشتر بخش‌های الیگوساکاریدی در مقیاس بزرگ استفاده می‌شود. ACH حاصل و بخش‌های بعدی آن با وزن‌های مولکولی مختلف به عنوان ماده آزمایشی برای توصیف الیگوساکاریدها در این کار مورد استفاده قرار گرفتند.
پس از پیش‌فرآوری و هیدرولیز آنزیمی، الیگوساکاریدها پایدار هیدرولیز نشده باقی ماندند. در اینجا (الف) یک روش جداسازی الیگوساکاریدها وجود دارد که در آن الیگوساکاریدها از هیدرولیزات کاه ذرت پیش‌فرآوری شده با AFEX (ACSH) با استفاده از یک بستر فشرده از کربن فعال و خاک دیاتومه جدا می‌شوند. (ب) روشی برای جداسازی الیگوساکاریدها. الیگوساکاریدها بیشتر با کروماتوگرافی حذف اندازه (SEC) از هم جدا شدند. (ج) مونومرهای ساکارید و الیگومرهای آزاد شده از پیش‌فرآوری‌های مختلف (اسید رقیق شده: DA، مایع یونی: IL و AFEX). شرایط هیدرولیز آنزیمی: بارگذاری مواد جامد بالا به میزان ۲۵٪ (وزنی/وزنی) (تقریباً ۸٪ بارگذاری گلوکان)، ۹۶ ساعت هیدرولیز، بارگذاری ۲۰ میلی‌گرم بر گرم آنزیم تجاری (نسبت Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) و (د) مونومرهای قندی و الیگومرهای گلوکز، زایلوز و آرابینوز آزاد شده از ساقه ذرت پیش تیمار شده با AFEX (ACS).
تجزیه و تحلیل گلیکان به عنوان ابزاری مفید برای تجزیه و تحلیل ساختاری جامع گلیکان‌ها در عصاره‌های جدا شده از بقایای زیست توده جامد ثابت شده است. با این حال، ساکاریدهای محلول در آب با استفاده از این روش سنتی کمتر نشان داده می‌شوند41 زیرا الیگوساکاریدهای با وزن مولکولی کم به سختی در صفحات ELISA بی‌حرکت می‌شوند و قبل از افزودن آنتی‌بادی شسته می‌شوند. بنابراین، برای اتصال و توصیف آنتی‌بادی، از یک روش بیوتینیلاسیون یک مرحله‌ای برای پوشش دادن الیگوساکاریدهای محلول و غیر سازگار روی صفحات ELISA با پوشش آویدین استفاده شد. این روش با استفاده از ACSH تولید شده قبلی ما و کسری بر اساس وزن مولکولی آن (یا درجه پلیمریزاسیون، DP) آزمایش شد. بیوتینیلاسیون یک مرحله‌ای برای افزایش میل ترکیبی اتصال الیگوساکارید با افزودن بیوتین-LC-هیدرازید به انتهای کاهنده کربوهیدرات استفاده شد (شکل 2). در محلول، گروه همی‌استال در انتهای کاهنده با گروه هیدرازید بیوتین-LC-هیدرازید واکنش می‌دهد تا یک پیوند هیدرازون تشکیل دهد. در حضور عامل کاهنده NaCNBH3، پیوند هیدرازون به یک محصول نهایی پایدار بیوتینیله شده کاهش می‌یابد. با اصلاح انتهای کاهنده قند، اتصال الیگوساکاریدهای با DP پایین به صفحات الایزا امکان‌پذیر شد و در مطالعه ما این کار بر روی صفحات پوشیده شده با آویدین با استفاده از آنتی‌بادی‌های مونوکلونال هدفمند گلیکان انجام شد.
غربالگری آنتی‌بادی‌های مونوکلونال بر اساس ELISA برای الیگوساکاریدهای بیوتینیله شده. در اینجا (الف) بیوتینیله کردن ترکیبی الیگوساکاریدها و غربالگری ELISA متعاقب آن با mAb های هدفمند گلیکان روی صفحات پوشیده شده با NeutrAvidin و (ب) یک روش یک مرحله‌ای برای بیوتینیله کردن محصولات واکنش را نشان می‌دهد.
سپس صفحات پوشیده شده با آویدین با آنتی‌بادی‌های کونژوگه شده با الیگوساکارید به آنتی‌بادی‌های اولیه و ثانویه اضافه شده و در یک محیط حساس به نور و زمان شسته شدند. پس از تکمیل اتصال آنتی‌بادی، سوبسترای TMB را برای انکوبه کردن پلیت اضافه کنید. واکنش در نهایت با اسید سولفوریک متوقف شد. صفحات انکوبه شده با استفاده از دستگاه ELISA reader برای تعیین قدرت اتصال هر آنتی‌بادی جهت تشخیص اتصال متقاطع اختصاصی آنتی‌بادی مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. برای جزئیات و پارامترهای آزمایش، به بخش مربوطه "مواد و روش‌ها" مراجعه کنید.
ما با مشخص کردن الیگوساکاریدهای محلول موجود در ACSH و همچنین در بخش‌های الیگوساکارید خام و خالص‌شده جدا شده از هیدرولیزات‌های لیگنوسلولزی، کاربرد این روش تازه توسعه‌یافته را برای کاربردهای خاص نشان می‌دهیم. همانطور که در شکل 3 نشان داده شده است، رایج‌ترین زایلان‌های جایگزین‌شده با اپی‌توپ که در ACSH با استفاده از روش‌های سنجش گلیکوم بیوآسیله شناسایی شده‌اند، معمولاً اورونیک (U) یا متیلورونیک (MeU) و پکتیک آرابینوگالاکتان‌ها هستند. اکثر آنها در مطالعه قبلی ما در مورد تجزیه و تحلیل گلیکان‌های جامدات غیر هیدرولیز شده (UHS)43 نیز یافت شدند.
تشخیص اپی‌توپ‌های الیگوساکارید مقاوم با استفاده از یک آنتی‌بادی مونوکلونال که به سمت گلیکان دیواره سلولی هدایت می‌شود. بخش «خنثی» بخش ACN و بخش «اسیدی» بخش FA است. قرمزهای روشن‌تر در نقشه حرارتی نشان‌دهنده محتوای اپی‌توپ بالاتر و آبی‌های روشن‌تر نشان‌دهنده پس‌زمینه خالی هستند. مقادیر رنگی در مقیاس بر اساس مقادیر خام OD برای فرمولاسیون‌های N=2 هستند. اپی‌توپ‌های اصلی شناسایی‌شده توسط آنتی‌بادی‌ها در سمت راست نشان داده شده‌اند.
این ساختارهای غیر سلولزی نمی‌توانند توسط رایج‌ترین سلولازها و همی‌سلولازها در مخلوط آنزیمی تجاری مورد آزمایش، که شامل رایج‌ترین آنزیم‌های تجاری مورد استفاده است، شکسته شوند. بنابراین، آنزیم‌های کمکی جدیدی برای هیدرولیز آنها مورد نیاز است. بدون آنزیم‌های جانبی غیر سلولزی لازم، این پیوندهای غیر سلولزی از تبدیل کامل به مونوساکاریدها جلوگیری می‌کنند، حتی اگر پلیمرهای قندی اصلی آنها به طور گسترده به قطعات کوتاه‌تر هیدرولیز شده و با استفاده از مخلوط‌های آنزیمی تجاری حل شوند.
مطالعه بیشتر توزیع سیگنال و قدرت اتصال آن نشان داد که اپی‌توپ‌های اتصال در بخش‌های قندی با DP بالا (A، B، C، DP تا 20+) کمتر از بخش‌های با DP پایین (D، E، F، DP) در دایمرها هستند (شکل 1). قطعات اسیدی در اپی‌توپ‌های غیرسلولی بیشتر از قطعات خنثی هستند. این پدیده‌ها با الگوی مشاهده شده در مطالعه قبلی ما سازگار است، جایی که بخش‌های DP بالا و اسیدی در برابر هیدرولیز آنزیمی مقاوم‌تر بودند. بنابراین، وجود اپی‌توپ‌های گلیکان غیرسلولی و جایگزینی‌های U و MeU می‌تواند تا حد زیادی به پایداری الیگوساکارید‌ها کمک کند. لازم به ذکر است که کارایی اتصال و تشخیص می‌تواند برای الیگوساکاریدهای با DP پایین مشکل‌ساز باشد، به خصوص اگر اپی‌توپ یک الیگوساکارید دیمری یا تریمری باشد. این موضوع را می‌توان با استفاده از الیگوساکاریدهای تجاری با طول‌های مختلف، که هر کدام فقط حاوی یک اپی‌توپ هستند که به یک آنتی‌بادی مونوکلونال خاص متصل می‌شود، آزمایش کرد.
بنابراین، استفاده از آنتی‌بادی‌های مختص ساختار، انواع خاصی از پیوندهای مقاوم را آشکار کرد. بسته به نوع آنتی‌بادی مورد استفاده، الگوی اتصال مناسب و قدرت سیگنالی که تولید می‌کند (فراوان‌ترین و کم‌فراوان‌ترین)، می‌توان آنزیم‌های جدید را شناسایی و به صورت نیمه‌کمّی به مخلوط آنزیم اضافه کرد تا گلیکوکانورژن کامل‌تری حاصل شود. با در نظر گرفتن تجزیه و تحلیل الیگوساکاریدهای ACSH به عنوان مثال، می‌توانیم یک پایگاه داده از پیوندهای گلیکان برای هر ماده زیست‌توده ایجاد کنیم. در اینجا باید توجه داشت که میل ترکیبی متفاوت آنتی‌بادی‌ها باید در نظر گرفته شود و اگر میل ترکیبی آنها ناشناخته باشد، این امر هنگام مقایسه سیگنال‌های آنتی‌بادی‌های مختلف، مشکلات خاصی ایجاد می‌کند. علاوه بر این، مقایسه پیوندهای گلیکان ممکن است بین نمونه‌های مربوط به یک آنتی‌بادی یکسان، بهترین نتیجه را داشته باشد. سپس می‌توان این پیوندهای سرسخت را به پایگاه داده CAZyme متصل کرد، که از طریق آن می‌توانیم آنزیم‌ها را شناسایی کنیم، آنزیم‌های کاندید را انتخاب کنیم و آنزیم‌های شکستن پیوند را آزمایش کنیم، یا سیستم‌های میکروبی را برای بیان این آنزیم‌ها برای استفاده در پالایشگاه‌های زیستی توسعه دهیم44.
برای ارزیابی اینکه چگونه روش‌های ایمونولوژیکی مکمل روش‌های جایگزین برای توصیف الیگوساکاریدهای با وزن مولکولی پایین موجود در هیدرولیزات‌های لیگنوسلولزی هستند، ما MALDI (شکل 4، S1-S8) و تجزیه و تحلیل ساکاریدهای مشتق شده از TMS را بر اساس GC-MS در همان پنل (شکل 5) بخش الیگوساکارید انجام دادیم. MALDI برای مقایسه اینکه آیا توزیع جرم مولکول‌های الیگوساکارید با ساختار مورد نظر مطابقت دارد یا خیر، استفاده می‌شود. در شکل 4، MS اجزای خنثی ACN-A و ACN-B را نشان می‌دهد. تجزیه و تحلیل ACN-A طیف وسیعی از قندهای پنتوز را از DP 4-8 (شکل 4) تا DP 22 (شکل S1) تأیید کرد که وزن آنها مربوط به الیگوساکاریدهای MeU-xylan است. تجزیه و تحلیل ACN-B سری پنتوز و گلوکوکسیلان را با DP 8-15 تأیید کرد. در مطالب تکمیلی مانند شکل S3، نقشه‌های توزیع جرم بخش اسیدی FA-C طیفی از قندهای پنتوز جایگزین شده (Me)U با DP 8-15 را نشان می‌دهند که با زایلان‌های جایگزین شده یافت شده در غربالگری mAb مبتنی بر ELISA سازگار هستند. اپی‌توپ‌ها سازگار هستند.
طیف MALDI-MS از الیگوساکاریدهای محلول غیر سازگار موجود در ACS. در اینجا، (الف) بخش‌های ACN-A با محدوده وزنی کم حاوی الیگوساکاریدهای گلوکوروکسیلان جایگزین شده با اسید اورونیک متیله شده (DP 4-8) و (ب) زایلان ACN-B و الیگوساکاریدهای اسید اورونیک متیله شده جایگزین شده با گلوکوروکسیلان (DP 8-15).
تجزیه و تحلیل ترکیب باقیمانده گلیکان الیگوساکاریدهای مقاوم. در اینجا (الف) ترکیب ساکارید TMS از بخش‌های مختلف الیگوساکارید که با استفاده از تجزیه و تحلیل GC-MS به دست آمده است. (ب) ساختارهای قندهای مختلف مشتق شده از TMS موجود در الیگوساکاریدها. ACN - بخش استونیتریل حاوی الیگوساکاریدهای خنثی و FA - بخش اسید فرولیک حاوی الیگوساکاریدهای اسیدی.
نتیجه جالب دیگری از تجزیه و تحلیل LC-MS بخش الیگوساکارید، همانطور که در شکل S9 نشان داده شده است (روش‌ها را می‌توان در مطالب تکمیلی الکترونیکی مشاهده کرد)، گرفته شد. قطعاتی از گروه‌های هگزوز و -OAc به طور مکرر در طول اتصال بخش ACN-B مشاهده شدند. این یافته نه تنها قطعه قطعه شدن مشاهده شده در تجزیه و تحلیل گلیکوم و MALDI-TOF را تأیید می‌کند، بلکه اطلاعات جدیدی در مورد مشتقات کربوهیدرات بالقوه در زیست توده لیگنوسلولزی پیش تصفیه شده نیز ارائه می‌دهد.
ما همچنین تجزیه و تحلیل ترکیب گلیکان بخش‌های الیگوساکارید را با استفاده از مشتق‌سازی گلیکان TMS انجام دادیم. با استفاده از GC-MS، ترکیب قندهای عصبی (غیرمشتق) و اسیدی (GluA و GalA) را در بخش الیگوساکارید تعیین کردیم (شکل 5). اسید گلوکورونیک در اجزای اسیدی C و D یافت می‌شود، در حالی که اسید گالاکتورونیک در اجزای اسیدی A و B یافت می‌شود که هر دو از اجزای DP بالای قندهای اسیدی هستند. این نتایج نه تنها داده‌های ELISA و MALDI ما را تأیید می‌کنند، بلکه با مطالعات قبلی ما در مورد تجمع الیگوساکارید نیز سازگار هستند. بنابراین، ما معتقدیم که روش‌های ایمونولوژیکی مدرن با استفاده از بیوتینیلاسیون الیگوساکاریدها و غربالگری بعدی ELISA برای تشخیص الیگوساکاریدهای مقاوم محلول در نمونه‌های بیولوژیکی مختلف کافی هستند.
از آنجایی که روش‌های غربالگری آنتی‌بادی مونوکلونال مبتنی بر ELISA با چندین روش مختلف تأیید شده‌اند، ما می‌خواستیم پتانسیل این روش کمی جدید را بیشتر بررسی کنیم. دو الیگوساکارید تجاری، الیگوساکارید زایلوهگزاساکارید (XHE) و 23-α-L-آرابینوفورانوزیل-زایلوتریوز (A2XX)، خریداری و با استفاده از یک رویکرد جدید آنتی‌بادی مونوکلونال که گلیکان دیواره سلولی را هدف قرار می‌دهد، آزمایش شدند. شکل 6 یک همبستگی خطی بین سیگنال اتصال بیوتینیله شده و غلظت لگاریتمی غلظت الیگوساکارید را نشان می‌دهد که نشان‌دهنده یک مدل جذب لانگمویر احتمالی است. در میان آنتی‌بادی‌های مونوکلونال، CCRC-M137، CCRC-M138، CCRC-M147، CCRC-M148 و CCRC-M151 با XHE همبستگی داشتند و CCRC-M108، CCRC-M109 و LM11 با A2XX در محدوده 1 نانومتر تا 100 نانومولار همبستگی داشتند. با توجه به محدودیت دسترسی به آنتی‌بادی‌ها در طول آزمایش، آزمایش‌های محدودی با هر غلظت الیگوساکارید انجام شد. در اینجا باید توجه داشت که برخی از آنتی‌بادی‌ها واکنش بسیار متفاوتی به الیگوساکارید مشابه به عنوان یک سوبسترا نشان می‌دهند، احتمالاً به این دلیل که آنها به اپی‌توپ‌های کمی متفاوت متصل می‌شوند و می‌توانند میل ترکیبی بسیار متفاوتی داشته باشند. مکانیسم‌ها و پیامدهای شناسایی دقیق اپی‌توپ زمانی که رویکرد جدید mAb بر روی نمونه‌های واقعی اعمال شود، بسیار پیچیده‌تر خواهد بود.
دو الیگوساکارید تجاری برای تعیین محدوده تشخیص آنتی‌بادی‌های مونوکلونال هدف‌گیرنده گلیکان مختلف استفاده شدند. در اینجا، همبستگی‌های خطی با غلظت لگاریتمی غلظت الیگوساکارید، الگوهای جذب لانگمویر را برای (الف) XHE با آنتی‌بادی مونوکلونال و (ب) A2XX با آنتی‌بادی مونوکلونال نشان می‌دهند. اپی‌توپ‌های مربوطه، ساختارهای الیگوساکاریدهای تجاری مورد استفاده به عنوان سوبسترا در سنجش را نشان می‌دهند.
استفاده از آنتی‌بادی‌های مونوکلونال هدفمند گلیکان (آنالیز گلیکوکومیک یا غربالگری آنتی‌بادی مونوکلونال مبتنی بر ELISA) ابزاری قدرتمند برای توصیف عمیق اکثر گلیکان‌های دیواره سلولی اصلی است که زیست‌توده گیاهی را تشکیل می‌دهند. با این حال، آنالیز کلاسیک گلیکان فقط گلیکان‌های دیواره سلولی بزرگتر را توصیف می‌کند، زیرا اکثر الیگوساکاریدها به طور موثر در صفحات ELISA بی‌حرکت نمی‌شوند. در این مطالعه، کاه ذرت پیش تیمار شده با AFEX با محتوای جامد بالا به صورت آنزیمی هیدرولیز شد. از آنالیز قند برای تعیین ترکیب کربوهیدرات‌های دیواره سلولی مقاوم در هیدرولیز استفاده شد. با این حال، آنالیز آنتی‌بادی مونوکلونال الیگوساکاریدها کوچکتر در هیدرولیزات‌ها دست کم گرفته شده است و برای بی‌حرکت کردن موثر الیگوساکاریدها در صفحات ELISA به ابزارهای اضافی نیاز است.
ما در اینجا یک روش جدید و کارآمد برای تثبیت الیگوساکارید برای غربالگری آنتی‌بادی مونوکلونال با ترکیب بیوتینیلاسیون الیگوساکارید و به دنبال آن غربالگری ELISA روی صفحات پوشش داده شده با NeutrAvidin™ گزارش می‌دهیم. الیگوساکاریدهای بیوتینیله تثبیت‌شده، میل ترکیبی کافی برای آنتی‌بادی نشان دادند تا امکان تشخیص سریع و کارآمد الیگوساکاریدهای مقاوم را فراهم کنند. تجزیه و تحلیل ترکیب این الیگوساکاریدهای سرسخت بر اساس طیف‌سنجی جرمی، نتایج این رویکرد جدید برای ایمونواسکرینینگ را تأیید کرد. بنابراین، این مطالعات نشان می‌دهند که ترکیب بیوتینیلاسیون الیگوساکارید و غربالگری ELISA با آنتی‌بادی‌های مونوکلونال هدفمند گلیکان می‌تواند برای تشخیص پیوندهای عرضی در الیگوساکاریدها استفاده شود و می‌تواند به طور گسترده در سایر مطالعات بیوشیمیایی که ساختار الیگوساکاریدها را مشخص می‌کنند، به کار رود.
این روش پروفایل گلیکان مبتنی بر بیوتین، اولین گزارشی است که قادر به بررسی پیوندهای کربوهیدراتی مقاوم الیگوساکاریدهای محلول در زیست‌توده گیاهی است. این امر به درک این موضوع کمک می‌کند که چرا برخی از بخش‌های زیست‌توده در تولید سوخت زیستی بسیار سرسخت هستند. این روش، شکاف مهمی را در روش‌های تجزیه و تحلیل گلیکوم پر می‌کند و کاربرد آن را به طیف وسیع‌تری از سوبستراها فراتر از الیگوساکاریدهای گیاهی گسترش می‌دهد. در آینده، ممکن است از رباتیک برای بیوتینیلاسیون استفاده کنیم و از روشی که برای تجزیه و تحلیل با توان عملیاتی بالا نمونه‌ها با استفاده از ELISA توسعه داده‌ایم، استفاده کنیم.
کاه ذرت (CS) که از بذرهای هیبرید Pioneer 33A14 رشد کرده است، در سال ۲۰۱۰ از مزارع کرامر در ری، کلرادو برداشت شد. با اجازه صاحب زمین، این زیست توده می‌تواند برای تحقیقات مورد استفاده قرار گیرد. نمونه‌ها در کیسه‌های زیپ‌دار و در دمای اتاق و با رطوبت کمتر از ۶٪ نگهداری شدند. نمونه‌ها در کیسه‌های زیپ‌دار و در دمای اتاق و با رطوبت کمتر از ۶٪ نگهداری شدند. 6% در پکیج با برایستژкой-молнией при комнатной температуре. نمونه‌ها در کیسه‌های زیپ‌دار و در دمای اتاق و با رطوبت کمتر از ۶٪ نگهداری شدند.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% ذخیره سازی در بسته ها با برایستژкой-молнией при комнатной температуре со влажностью < 6%. نمونه‌ها در کیسه‌های زیپ‌دار در دمای اتاق با رطوبت کمتر از ۶٪ نگهداری می‌شوند.این مطالعه با دستورالعمل‌های محلی و ملی مطابقت داشت. تجزیه و تحلیل ترکیبات با استفاده از پروتکل NREL انجام شد. مشخص شد که این ترکیب حاوی ۳۱.۴٪ گلوکان، ۱۸.۷٪ زایلان، ۳.۳٪ آرابینان، ۱.۲٪ گالاکتان، ۲.۲٪ استیل، ۱۴.۳٪ لیگنین، ۱.۷٪ پروتئین و ۱۳.۴٪ خاکستر است.
Cellic® CTec2 (138 میلی‌گرم پروتئین در میلی‌لیتر، سری VCNI 0001) ترکیبی پیچیده از سلولاز، بتا-گلوکوزیداز و Cellic® HTec2 (157 میلی‌گرم پروتئین در میلی‌لیتر، سری VHN00001) از Novozymes (فرانکلینتون، کارولینای شمالی، ایالات متحده آمریکا) است. Multifect Pectinase® (72 میلی‌گرم پروتئین در میلی‌لیتر)، ترکیبی پیچیده از آنزیم‌های تجزیه‌کننده پکتین، توسط DuPont Industrial Biosciences (پالو آلتو، کالیفرنیا، ایالات متحده آمریکا) اهدا شد. غلظت پروتئین آنزیم با تخمین محتوای پروتئین (و کم کردن سهم نیتروژن غیرپروتئینی) با استفاده از آنالیز نیتروژن Kjeldahl (روش AOAC 2001.11، Dairy One Cooperative Inc.، ایتاکا، نیویورک، ایالات متحده آمریکا) تعیین شد. خاک دیاتومه 545 از EMD Millipore (بیلریکا، ماساچوست) خریداری شد. کربن فعال (DARCO، گرانول‌های مش ۱۰۰)، آویسل (PH-101)، زایلان راش و سایر مواد شیمیایی از شرکت سیگما-آلدریچ (سنت لوئیس، میسوری) خریداری شدند.
پیش تصفیه AFEX در GLBRC (آزمایشگاه تحقیقات تبدیل زیست توده، MSU، لنسینگ، میشیگان، ایالات متحده آمریکا) انجام شد. پیش تصفیه در دمای 140 درجه سانتیگراد به مدت 15 دقیقه انجام شد. 46 زمان ماند با نسبت 1:1 آمونیاک بی آب به زیست توده با بارگذاری 60٪ (وزنی/وزنی) در یک راکتور ناپیوسته رومیزی از جنس استیل ضد زنگ (شرکت Parr Instruments). این کار 30 دقیقه طول کشید. راکتور به دمای 140 درجه سانتیگراد رسانده شد و آمونیاک به سرعت آزاد شد و به زیست توده اجازه داد تا به سرعت به دمای اتاق بازگردد. ترکیب ساقه ذرت پیش تصفیه شده AFEX (ACS) مشابه ساقه ذرت تصفیه نشده (UT-CS) بود.
ACSH با مواد جامد بالا 25% (وزنی/وزنی) (تقریباً 8% دکستران) به عنوان ماده اولیه برای تولید انبوه الیگوساکاریدها تهیه شد. هیدرولیز آنزیمی ACS با استفاده از مخلوط آنزیمی تجاری شامل Cellic® Ctec2 10 میلی‌گرم پروتئین/گرم گلوکان (در زیست‌توده پیش تیمار شده)، Htec2 (Novozymes، Franklinton، NC)، 5 میلی‌گرم پروتئین/گرم گلوکان و Multifect Pectinase (Genencor Inc، USA) انجام شد. هیدرولیز آنزیمی در یک بیوراکتور 5 لیتری با حجم کاری 3 لیتر، pH 4.8، دمای 50 درجه سانتیگراد و 250 دور در دقیقه انجام شد. پس از هیدرولیز به مدت 96 ساعت، هیدرولیزات با سانتریفیوژ در 6000 دور در دقیقه به مدت 30 دقیقه و سپس در 14000 دور در دقیقه به مدت 30 دقیقه برای حذف مواد جامد هیدرولیز نشده جمع‌آوری شد. سپس هیدرولیزات از طریق یک بشر فیلتردار 0.22 میلی‌متری تحت فیلتراسیون استریل قرار گرفت. هیدرولیزات فیلتر شده در بطری‌های استریل در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری و سپس روی کربن تجزیه شد.
تجزیه و تحلیل ترکیب نمونه‌های زیست‌توده مبتنی بر عصاره طبق رویه‌های تجزیه و تحلیل آزمایشگاهی NREL: آماده‌سازی نمونه‌ها برای تجزیه و تحلیل ترکیب (NREL/TP-510-42620) و تعیین کربوهیدرات‌های ساختاری و لیگنین در زیست‌توده (NREL/TP-510 – 42618)47.
آنالیز الیگوساکاریدها از جریان هیدرولیز شده در مقیاس 2 میلی‌لیتر با استفاده از روش هیدرولیز اسیدی مبتنی بر اتوکلاو انجام شد. نمونه هیدرولیز شده را با 69.7 میکرولیتر اسید سولفوریک 72٪ در یک لوله کشت 10 میلی‌لیتری با درب پیچی مخلوط کرده و به مدت 1 ساعت روی میز کار در دمای 121 درجه سانتیگراد انکوبه کنید، روی یخ خنک کنید و در یک ویال کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) فیلتر کنید. غلظت الیگوساکاریدها با کم کردن غلظت مونوساکاریدها در نمونه هیدرولیز نشده از غلظت کل قند در نمونه هیدرولیز شده با اسید تعیین شد.
غلظت گلوکز، زایلوز و آرابینوز در زیست‌توده هیدرولیز شده اسیدی با استفاده از یک سیستم HPLC شیمادزو مجهز به نمونه‌گیر خودکار، گرم‌کن ستون، پمپ ایزوکراتیک و آشکارساز ضریب شکست روی ستون Bio-Rad Aminex HPX-87H تجزیه و تحلیل شد. ستون در دمای 50 درجه سانتیگراد نگهداری و با 0.6 میلی‌لیتر در دقیقه 5 میلی‌مولار H2SO4 در آب شسته شد.
مایع رویی هیدرولیز رقیق شده و از نظر محتوای مونومر و الیگوساکارید مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. قندهای مونومری به دست آمده پس از هیدرولیز آنزیمی با استفاده از HPLC مجهز به ستون Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P و ستون محافظ خاکستر مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. دمای ستون در دمای 80 درجه سانتیگراد حفظ شد و از آب به عنوان فاز متحرک با سرعت جریان 0.6 میلی لیتر در دقیقه استفاده شد. الیگوساکارید ها با هیدرولیز در اسید رقیق در دمای 121 درجه سانتیگراد طبق روش های شرح داده شده در مراجع 41، 48، 49 تعیین شدند.
آنالیز ساکارید بر روی بقایای زیست‌توده خام، پیش تیمار شده با AFEX و تمام بقایای زیست‌توده هیدرولیز نشده (شامل تولید عصاره‌های سریالی دیواره سلولی و غربالگری آنتی‌بادی مونوکلونال آنها) با استفاده از روش‌های قبلاً شرح داده شده 27، 43، 50، 51 انجام شد. برای آنالیز گلیکوم، بقایای نامحلول در الکل از مواد دیواره سلولی گیاهی از بقایای زیست‌توده تهیه شده و تحت استخراج سریالی با معرف‌های تهاجمی فزاینده مانند اگزالات آمونیوم (50 میلی‌مولار)، کربنات سدیم (50 میلی‌مولار و 0.5٪ وزنی/حجمی)، CON. (1M و 4M، هر دو با 1٪ وزنی/حجمی بوروهیدرید سدیم) و کلریت اسید همانطور که قبلاً شرح داده شد52،53 قرار گرفتند. سپس عصاره‌ها در برابر یک پنل پیچیده از آنتی‌بادی‌های مونوکلونال 50 که به سمت گلیکان دیواره سلولی هدایت می‌شدند، تحت آزمایش ELISA قرار گرفتند و واکنش‌های اتصال آنتی‌بادی مونوکلونال به صورت نقشه حرارتی ارائه شدند. آنتی‌بادی‌های مونوکلونال هدف قرار دهنده گلیکان دیواره سلولی گیاهی از ذخایر آزمایشگاهی (سری‌های CCRC، JIM و MAC) خریداری شدند.
بیوتینیلاسیون یک مرحله‌ای الیگوساکارید‌ها. کونژوگاسیون کربوهیدرات‌ها با بیوتین-LC-هیدرازید با استفاده از روش زیر انجام شد. بیوتین-LC-هیدرازید (4.6 میلی‌گرم/12 میکرومول) با هم زدن شدید و حرارت دادن در دمای 65 درجه سانتیگراد به مدت 1 دقیقه در دی متیل سولفوکسید (DMSO، 70 میکرولیتر) حل شد. اسید استیک گلاسیال (30 میکرولیتر) اضافه شد و مخلوط روی سیانوبوروهیدرید سدیم (6.4 میلی‌گرم/100 میکرومول) ریخته شد و پس از حرارت دادن در دمای 65 درجه سانتیگراد به مدت حدود 1 دقیقه کاملاً حل شد. سپس، 5 تا 8 میکرولیتر از مخلوط واکنش به الیگوساکارید خشک شده (1-100 نانومول) اضافه شد تا مولار اضافی 10 برابر یا بیشتر از برچسب روی انتهای احیاکننده به دست آید. واکنش به مدت 2 ساعت در دمای 65 درجه سانتیگراد انجام شد و پس از آن نمونه‌ها بلافاصله خالص‌سازی شدند. در آزمایش‌های برچسب‌گذاری، از سیانوبوروهیدرید سدیم بدون کاهش استفاده نشد و نمونه‌ها به مدت ۲.۵ ساعت در دمای ۶۵ درجه سانتیگراد واکنش داده شدند.
پوشش ELISA و شستشوی نمونه‌های الیگوساکاریدهای بیوتینیله شده. 25 میکرولیتر از نمونه‌های بیوتینیله شده (100 میکرولیتر از هر نمونه غلیظ رقیق شده در 5 میلی‌لیتر محلول بافر تریس 0.1 مولار (TBS)) به هر چاهک پلیت پوشش داده شده با آویدین اضافه شد. چاهک‌های کنترل با 50 میکرولیتر بیوتین با غلظت 10 میکروگرم در میلی‌لیتر در 0.1 مولار TBS پوشش داده شدند. از آب دیونیزه به عنوان پوشش برای اندازه‌گیری‌های شاهد استفاده شد. قرص به مدت 2 ساعت در دمای اتاق و در تاریکی انکوبه شد. پلیت را 3 بار با شیر بدون چربی 0.1٪ در 0.1 مولار TBS با استفاده از برنامه شماره 11 برای Grenier flat 3A بشویید.
افزودن و شستشوی آنتی‌بادی‌های اولیه. 40 میکرولیتر آنتی‌بادی اولیه به هر چاهک اضافه کنید. میکروپلیت را به مدت 1 ساعت در دمای اتاق و تاریکی انکوبه کنید. سپس پلیت‌ها 3 بار با شیر 0.1٪ در محلول 0.1M TBS با استفاده از برنامه شستشوی شماره 11 برای Grenier Flat 3A شسته شدند.
آنتی‌بادی ثانویه را اضافه کرده و بشویید. 50 میکرولیتر آنتی‌بادی ثانویه موش/موش صحرایی (رقیق شده با نسبت 1:5000 در شیر 0.1% در محلول 0.1 مولار TBS) به هر چاهک اضافه کنید. میکروپلیت را به مدت 1 ساعت در دمای اتاق و تاریکی انکوبه کنید. سپس میکروپلیت‌ها 5 بار با شیر 0.1% در محلول 0.1 مولار TBS با استفاده از برنامه شستشوی پلیت Grenier Flat 5A شماره 12 شسته شدند.
اضافه کردن سوبسترا. 50 میکرولیتر 3،3'،5،5'-تترامتیل بنزیدین (TMB) را به سوبسترای پایه اضافه کنید (با اضافه کردن 2 قطره بافر، 3 قطره TMB، 2 قطره پراکسید هیدروژن به 15 میلی لیتر آب دیونیزه). سوبسترای TMB را آماده کنید و قبل از استفاده ورتکس کنید. میکروپلیت را به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق و در تاریکی انکوبه کنید.
مرحله را کامل کنید و قرص را بخوانید. 50 میکرولیتر اسید سولفوریک 1 نرمال به هر چاهک اضافه کنید و جذب را از 450 تا 655 نانومتر با استفاده از دستگاه الایزا ریدر ثبت کنید.
محلول‌های ۱ میلی‌گرم بر میلی‌لیتر از این آنالیت‌ها را در آب دیونیزه تهیه کنید: آرابینوز، رامنوز، فوکوز، زایلوز، اسید گالاکتورونیک (GalA)، اسید گلوکورونیک (GlcA)، مانوز، گلوکز، گالاکتوز، لاکتوز، N-استیل مانوزامین (manNAc)، N-استیل گلوکزامین (glcNAc)، N-استیل گالاکتوزامین (galNAc)، اینوزیتول (استاندارد داخلی). دو استاندارد با اضافه کردن محلول‌های قندی ۱ میلی‌گرم بر میلی‌لیتر نشان داده شده در جدول ۱ تهیه شدند. نمونه‌ها منجمد شده و در دمای ۸۰- درجه سانتیگراد لیوفیلیزه می‌شوند تا زمانی که تمام آب آنها حذف شود (معمولاً حدود ۱۲ تا ۱۸ ساعت).
۱۰۰ تا ۵۰۰ میکروگرم نمونه را به لوله‌های درپیچ‌دار روی ترازوی تحلیلی اضافه کنید. مقدار اضافه شده را ثبت کنید. بهتر است نمونه را در غلظت مشخصی از حلال حل کنید و آن را به صورت یک مایع به لوله اضافه کنید. برای هر لوله نمونه، از ۲۰ میکرولیتر اینوزیتول ۱ میلی‌گرم در میلی‌لیتر به عنوان استاندارد داخلی استفاده کنید. مقدار استاندارد داخلی اضافه شده به نمونه باید برابر با مقدار استاندارد داخلی اضافه شده به لوله استاندارد باشد.
۸ میلی‌لیتر متانول بی‌آب را به یک ویال با درب پیچی اضافه کنید. سپس ۴ میلی‌لیتر محلول ۳ نرمال متانولی HCl اضافه کنید، درب آن را بگذارید و تکان دهید. این فرآیند از آب استفاده نمی‌کند.
۵۰۰ میکرولیتر محلول متانول HCl 1 مولار را به نمونه‌های الیگوساکارید و لوله‌های استاندارد TMS اضافه کنید. نمونه‌ها به مدت یک شب (۱۶۸ ساعت) در دمای ۸۰ درجه سانتیگراد در یک بلوک حرارتی انکوبه شدند. محصول متانولیز را در دمای اتاق با استفاده از منیفولد خشک‌کن خشک کنید. ۲۰۰ میکرولیتر MeOH اضافه کنید و دوباره خشک کنید. این فرآیند دو بار تکرار می‌شود. ۲۰۰ میکرولیتر متانول، ۱۰۰ میکرولیتر پیریدین و ۱۰۰ میکرولیتر استیک انیدرید به نمونه اضافه کنید و خوب مخلوط کنید. نمونه‌ها را به مدت ۳۰ دقیقه در دمای اتاق انکوبه کنید و خشک کنید. ۲۰۰ میکرولیتر متانول اضافه کنید و دوباره خشک کنید.
۲۰۰ میکرولیتر Tri-Sil اضافه کنید و لوله دربسته را به مدت ۲۰ دقیقه تا دمای ۸۰ درجه سانتیگراد حرارت دهید، سپس تا دمای اتاق خنک کنید. از یک منیفولد خشک‌کن برای خشک کردن بیشتر نمونه تا حجم تقریبی ۵۰ میکرولیتر استفاده کنید. لازم به ذکر است که اجازه ندادیم نمونه‌ها کاملاً خشک شوند.
2 میلی‌لیتر هگزان اضافه کنید و با ورتکس کردن خوب مخلوط کنید. نوک پیپت‌های پاستور (5-8 میلی‌متر) را با یک تکه پشم شیشه پر کنید، پشم شیشه را روی یک پیپت با قطر 5-3/4 اینچ قرار دهید. نمونه‌ها به مدت 2 دقیقه با سرعت 3000 گرم سانتریفیوژ شدند. هرگونه باقیمانده نامحلول رسوب داده می‌شود. نمونه را تا 100-150 میکرولیتر خشک کنید. حجم تقریبی 1 میکرولیتر در دمای اولیه 80 درجه سانتیگراد و زمان اولیه 2.0 دقیقه به GC-MS تزریق شد (جدول 2).