Tak fordi du besøgte Nature.com.Den browserversion, du bruger, har begrænset CSS-understøttelse.For den bedste oplevelse anbefaler vi, at du bruger en opdateret browser (eller deaktiverer kompatibilitetstilstand i Internet Explorer).I mellemtiden, for at sikre fortsat support, vil vi gengive webstedet uden stilarter og JavaScript.
Nye immunologiske og massespektrometriske metoder til kompleks analyse af persistente oligosaccharider i majskomfur forbehandlet med AFEX.Lignocelluloseholdig biomasse er et bæredygtigt alternativ til fossile brændstoffer og bruges i vid udstrækning til at udvikle bioteknologier til produktion af produkter som fødevarer, foder, brændstoffer og kemikalier.Nøglen til disse teknologier er udviklingen af ​​omkostningskonkurrencedygtige processer til at omdanne komplekse kulhydrater, der findes i plantecellevægge, til simple sukkerarter såsom glucose, xylose og arabinose.Fordi lignocellulosebiomasse er meget genstridig, skal den underkastes termokemiske behandlinger (f.eks. ammoniakfibereksfoliering (AFEX), fortyndede syrer (DA), ioniske væsker (IL)) og biologiske behandlinger (f.eks. enzymatisk hydrolyse og mikrobiel fermentering) i kombination for at opnå det ønskede produkt..Men når kommercielle svampeenzymer anvendes i hydrolyseprocessen, er kun 75-85% af de dannede opløselige sukkerarter monosaccharider, og de resterende 15-25% er opløselige, vanskelige oligosaccharider, som ikke altid er tilgængelige for mikroorganismer.Tidligere har vi med succes isoleret og oprenset opløselige genstridige oligosaccharider ved hjælp af en kombination af carbon- og diatoméjordseparation og størrelsesudelukkelseskromatografi, og også undersøgt deres enzymhæmmende egenskaber.Vi har fundet ud af, at oligosaccharider indeholdende højere grad af polymerisation (DP) methylerede uronsyresubstitutioner er vanskeligere at bearbejde med kommercielle enzymblandinger end lav-DP og neutrale oligosaccharider.Her rapporterer vi brugen af ​​flere yderligere metoder, herunder glycanprofilering ved hjælp af monoklonale antistoffer (mAbs) specifikke for plantebiomasseglycaner for at karakterisere glycanbindinger i plantecellevægge og enzymatiske hydrolysater, matrix-assisteret laserdesorptionsionisering, time-of-flight massespektrometri..MALDI-TOF-MS) anvender strukturinformative diagnostiske toppe opnået ved spektroskopi efter sekundært henfald af negative ioner, gaskromatografi og massespektrometri (GC-MS) til at karakterisere oligosaccharidbindinger med og uden derivatisering.På grund af den lille størrelse af oligosaccharider (DP 4-20) er disse molekyler vanskelige at bruge til mAb-binding og karakterisering.For at overvinde dette problem anvendte vi en ny biotinkonjugationsbaseret oligosaccharid-immobiliseringsmetode, der med succes mærkede størstedelen af ​​lav-DP-opløselige oligosaccharider på mikropladeoverfladen, som derefter blev brugt i et højt gennemløbs-mAb-system til specifik ligeringsanalyse.Denne nye metode vil lette udviklingen af ​​mere avancerede high-throughput glykom-assays i fremtiden, som kan bruges til at isolere og karakterisere oligosaccharider til stede i biomarkører til diagnostiske formål.
Lignocelluloseholdig biomasse, sammensat af landbrugs-, skovbrugs-, græs- og træmaterialer, er et potentielt råmateriale til produktion af biobaserede produkter, herunder fødevarer, foder, brændstof og kemiske prækursorer for at producere produkter af højere værdi1.Kulhydrater (såsom cellulose og hemicellulose), der er til stede i plantecellevægge, depolymeriseres til monosaccharider ved kemisk bearbejdning og biotransformation (såsom enzymatisk hydrolyse og mikrobiel fermentering).Almindelige forbehandlinger omfatter ammoniakfiberekspansion (AFEX), fortyndet syre (DA), ionisk væske (IL) og dampeksplosion (SE), som bruger en kombination af kemikalier og varme til at reducere produktionen af ​​lignocellulose ved at åbne plantecellevægge3,4.stoffets stædighed, 5. Enzymatisk hydrolyse udføres ved en høj tørstofbelastning ved hjælp af kommercielle aktive kulhydratholdige enzymer (CAZymer) og mikrobiel fermentering ved hjælp af transgene gærarter eller bakterier til fremstilling af biobaserede brændstoffer og kemikalier 6 .
CAZymer i kommercielle enzymer er sammensat af en kompleks blanding af enzymer, der synergistisk spalter komplekse kulhydrat-sukkerbindinger for at danne monosaccharider2,7.Som vi rapporterede tidligere, gør det komplekse netværk af aromatiske polymerer af lignin med kulhydrater dem meget vanskelige at behandle, hvilket fører til ufuldstændig sukkeromdannelse, der akkumulerer 15-25% af kønsoligosaccharider, der ikke produceres under enzymatisk hydrolyse af den forbehandlede biomasse.Dette er et almindeligt problem med forskellige biomasseforbehandlingsmetoder.Nogle årsager til denne flaskehals omfatter enzymhæmning under hydrolyse eller fraværet eller lave niveauer af essentielle enzymer, der er nødvendige for at bryde sukkerbindinger i plantebiomasse.At forstå sammensætningen og strukturelle egenskaber af sukkerarter, såsom sukkerbindingerne i oligosaccharider, vil hjælpe os med at forbedre sukkeromdannelsen under hydrolyse, hvilket gør bioteknologiske processer omkostningskonkurrencedygtige med olieafledte produkter.
At bestemme strukturen af ​​kulhydrater er udfordrende og kræver en kombination af metoder såsom væskekromatografi (LC)11,12, kernemagnetisk resonansspektroskopi (NMR)13, kapillærelektroforese (CE)14,15,16 og massespektrometri (MS)17., atten.MS-metoder såsom time-of-flight massespektrometri med laserdesorption og ionisering ved hjælp af en matrix (MALDI-TOF-MS) er en alsidig metode til at identificere kulhydratstrukturer.For nylig har Collision-Induced Dissociation (CID) tandem MS af natriumionaddukter været mest udbredt til at identificere fingeraftryk svarende til oligosaccharid-vedhæftningspositioner, anomere konfigurationer, sekvenser og forgreningspositioner 20, 21 .
Glykananalyse er et fremragende værktøj til dybdegående identifikation af kulhydratbindinger22.Denne metode bruger monoklonale antistoffer (mAbs) rettet mod plantecellevægsglycan som prober til at forstå komplekse kulhydratbindinger.Mere end 250 mAbs er tilgængelige på verdensplan, designet mod forskellige lineære og forgrenede oligosaccharider ved hjælp af forskellige saccharider24.Adskillige mAbs er blevet brugt i vid udstrækning til at karakterisere strukturen, sammensætningen og modifikationerne af plantecellevæggen, da der er betydelige forskelle afhængigt af plantecelletype, organ, alder, udviklingsstadie og vækstmiljø25,26.For nylig er denne metode blevet brugt til at forstå vesikelpopulationer i plante- og dyresystemer og deres respektive roller i glycantransport som bestemt af subcellulære markører, udviklingsstadier eller miljøstimuli og til at bestemme enzymatisk aktivitet.Nogle af de forskellige strukturer af glycaner og xylaner, der er blevet identificeret, omfatter pektin (P), xylan (X), mannan (M), xyloglucaner (XylG), blandede bindingsglucaner (MLG), arabinoxylan (ArbX), galactomannan (GalG), glucuronsyre-arabinoxylan (GArbinoX) og 2Galanar.
På trods af alle disse forskningsbestræbelser har kun nogle få undersøgelser fokuseret på arten af ​​oligosaccharidakkumulering under hydrolyse med høj faststofbelastning (HSL), herunder oligosaccharidfrigivelse, oligomere kædelængdeændringer under hydrolyse, forskellige lav-DP-polymerer og deres kurver.fordelinger 30,31,32.I mellemtiden, selvom glycananalyse har vist sig at være et nyttigt værktøj til en omfattende analyse af glycanstruktur, er det vanskeligt at evaluere vandopløselige lav-DP oligosaccharider ved hjælp af antistofmetoder.Mindre DP-oligosaccharider med en molekylvægt på mindre end 5-10 kDa binder ikke til ELISA-pladerne 33, 34 og vaskes væk før antistoftilsætning.
Her demonstrerer vi for første gang et ELISA-assay på avidin-coatede plader ved hjælp af monoklonale antistoffer, der kombinerer en et-trins biotinyleringsprocedure for opløselige refraktære oligosaccharider med glykomanalyse.Vores tilgang til glykomanalyse blev valideret ved MALDI-TOF-MS og GC-MS baseret analyse af komplementære oligosaccharidbindinger ved hjælp af trimethylsilyl (TMS) derivatisering af hydrolyserede sukkersammensætninger.Denne innovative tilgang kan udvikles som en high-throughput metode i fremtiden og finde bredere anvendelse i biomedicinsk forskning35.
Post-translationelle modifikationer af enzymer og antistoffer, såsom glycosylering,36 påvirker deres biologiske aktivitet.For eksempel spiller ændringer i glykosylering af serumproteiner en vigtig rolle ved inflammatorisk arthritis, og ændringer i glykosylering bruges som diagnostiske markører37.Forskellige glycaner er blevet rapporteret i litteraturen for let at optræde i en række sygdomme, herunder kroniske inflammatoriske sygdomme i mave-tarmkanalen og leveren, virusinfektioner, ovarie-, bryst- og prostatacancer38,39,40.Forståelse af strukturen af ​​glycaner ved hjælp af antistof-baserede glycan ELISA-metoder vil give yderligere tillid til sygdomsdiagnose uden brug af komplekse MS-metoder.
Vores tidligere undersøgelse viste, at genstridige oligosaccharider forblev uhydrolyseret efter forbehandling og enzymatisk hydrolyse (figur 1).I vores tidligere publicerede arbejde udviklede vi en aktiv kul fastfase-ekstraktionsmetode til at isolere oligosaccharider fra AFEX-forbehandlet majsstoverhydrolysat (ACSH)8.Efter indledende ekstraktion og separation blev oligosacchariderne yderligere fraktioneret ved størrelsesudelukkelseskromatografi (SEC) og opsamlet i rækkefølge efter molekylvægt.Sukkermonomerer og -oligomerer frigivet fra forskellige forbehandlinger blev analyseret ved sukkersammensætningsanalyse.Når man sammenligner indholdet af sukkeroligomerer opnået ved forskellige forbehandlingsmetoder, er tilstedeværelsen af ​​genstridige oligosaccharider et almindeligt problem ved omdannelsen af ​​biomasse til monosaccharider og kan føre til en reduktion i sukkerudbyttet på mindst 10-15 % og endda op til 18 %.OS.Denne metode bruges til yderligere storskalaproduktion af oligosaccharidfraktioner.Den resulterende ACH og dens efterfølgende fraktioner med forskellige molekylvægte blev brugt som eksperimentelt materiale til karakterisering af oligosaccharider i dette arbejde.
Efter forbehandling og enzymatisk hydrolyse forblev persistente oligosaccharider uhydrolyseret.Her (A) er en oligosaccharidseparationsmetode, hvor oligosaccharider isoleres fra AFEX-forbehandlet majsstoverhydrolysat (ACSH) ved hjælp af et pakket leje af aktivt kul og diatoméjord;(B) Fremgangsmåde til separation af oligosaccharider.Oligosacchariderne blev yderligere adskilt ved størrelsesudelukkelseskromatografi (SEC);(C) Saccharidmonomerer og -oligomerer frigivet fra forskellige forbehandlinger (fortyndet syre: DA, ionisk væske: IL og AFEX).Enzymatiske hydrolysebetingelser: høj tørstofbelastning på 25 % (vægt/vægt) (ca. 8 % glucanbelastning), 96 timers hydrolyse, 20 mg/g kommerciel enzymbelastning (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1-forhold) og (D) Sukkermonomerer og oligomerer af glucose, preosexylose frigivet fra AFS-majs-frigivet fra AFS-majs-frigivet og EX).
Glykananalyse har vist sig at være et nyttigt værktøj til en omfattende strukturel analyse af glycaner i ekstrakter isoleret fra faste biomasserester.Imidlertid er vandopløselige saccharider underrepræsenteret ved brug af denne traditionelle metode41, fordi lavmolekylære oligosaccharider er vanskelige at immobilisere på ELISA-plader og vaskes ud før antistoftilsætning.Til antistofbinding og karakterisering blev der derfor brugt en et-trins biotinyleringsmetode til at coate opløselige, ikke-kompatible oligosaccharider på avidin-coatede ELISA-plader.Denne metode blev testet ved hjælp af vores tidligere fremstillede ACSH og en fraktion baseret på dens molekylvægt (eller polymerisationsgrad, DP).Et-trins biotinylering blev brugt til at øge oligosaccharidbindingsaffiniteten ved at tilføje biotin-LC-hydrazid til den reducerende ende af kulhydratet (fig. 2).I opløsning reagerer hemiacetalgruppen i den reducerende ende med hydrazidgruppen af ​​biotin-LC-hydrazid for at danne en hydrazonbinding.I nærvær af reduktionsmidlet NaCNBH3 reduceres hydrazonbindingen til et stabilt biotinyleret slutprodukt.Med modifikationen af ​​den sukkerreducerende ende blev binding af oligosaccharider med lav DP til ELISA-plader mulig, og i vores undersøgelse blev dette gjort på avidin-coatede plader under anvendelse af glycan-målrettede mAbs.
Screening af monoklonale antistoffer baseret på ELISA for biotinylerede oligosaccharider.Her viser (A) kombineret biotinylering af oligosaccharider og efterfølgende ELISA-screening med glycan-målrettede mAbs på NeutrAvidin-coatede plader og (B) viser en et-trins procedure til biotinylering af reaktionsprodukter.
Avidin-coatede plader med oligosaccharid-konjugerede antistoffer blev derefter tilsat til primære og sekundære antistoffer og vasket i et lys- og tidsfølsomt medium.Når antistofbindingen er fuldført, tilsættes TMB-substrat for at inkubere pladen.Reaktionen blev til sidst standset med svovlsyre.De inkuberede plader blev analyseret under anvendelse af en ELISA-læser for at bestemme bindingsstyrken af ​​hvert antistof for at påvise antistof-specifik tværbinding.For detaljer og parametre for eksperimentet, se det tilsvarende afsnit "Materialer og metoder".
Vi demonstrerer anvendeligheden af ​​denne nyudviklede metode til specifikke anvendelser ved at karakterisere de opløselige oligosaccharider til stede i ACSH såvel som i rå og oprensede oligosaccharidfraktioner isoleret fra lignocellulosehydrolysater.Som vist i figur 3 er de mest almindelige epitop-substituerede xylaner identificeret i ACSH ved anvendelse af bioacylerede glykomassaymetoder sædvanligvis uroniske (U) eller methyluroniske (MeU) og pektiske arabinogalactaner.De fleste af dem blev også fundet i vores tidligere undersøgelse om analyse af glycaner af ikke-hydrolyserede faste stoffer (UHS)43.
Påvisning af genstridige oligosaccharidepitoper ved anvendelse af et monoklonalt antistof rettet mod cellevægsglycanen.Den "neutrale" fraktion er ACN-fraktionen, og den "sure" fraktion er FA-fraktionen.Lysere røde på varmekortet indikerer højere epitopindhold, og lysere blå farver indikerer en tom baggrund.Farveværdier på skalaen er baseret på rå OD-værdier for formuleringer N=2.De vigtigste epitoper, der genkendes af antistofferne, er vist til højre.
Disse ikke-cellulosestrukturer kunne ikke spaltes af de mest almindelige cellulaser og hemicellulaser i den testede kommercielle enzymblanding, som omfatter de mest almindeligt anvendte kommercielle enzymer.Derfor kræves der nye hjælpeenzymer til deres hydrolyse.Uden de nødvendige ikke-cellulose-accessoriske enzymer forhindrer disse ikke-cellulosebindinger fuldstændig omdannelse til monosaccharider, selvom deres modersukkerpolymerer i vid udstrækning hydrolyseres til kortere fragmenter og opløses ved hjælp af kommercielle enzymblandinger.
Yderligere undersøgelse af signalfordeling og dens bindingsstyrke viste, at bindingsepitoper var lavere i sukkerfraktioner med høj DP (A, B, C, DP op til 20+) end i fraktioner med lav DP (D, E, F, DP) i dimerer) (fig. 1).Syrefragmenter er mere almindelige i ikke-celluloseepitoper end neutrale fragmenter.Disse fænomener er i overensstemmelse med mønsteret observeret i vores tidligere undersøgelse, hvor høj DP og syredele var mere modstandsdygtige over for enzymatisk hydrolyse.Derfor kan tilstedeværelsen af ​​ikke-celluloseglycan-epitoper og U- og MeU-substitutioner i høj grad bidrage til stabiliteten af ​​oligosacchariderne.Det skal bemærkes, at bindings- og detektionseffektivitet kan være problematisk for oligosaccharider med lav DP, især hvis epitopen er et dimert eller trimert oligosaccharid.Dette kan testes under anvendelse af kommercielle oligosaccharider af forskellig længde, der hver kun indeholder én epitop, der binder til et specifikt mAb.
Således afslørede brugen af ​​strukturspecifikke antistoffer visse typer genstridige bindinger.Afhængigt af den anvendte type antistof, det passende ligeringsmønster og styrken af ​​det signal, det producerer (mest og mindst udbredt), kan nye enzymer identificeres og tilføjes semikvantitativt til enzymblandingen for mere fuldstændig glykokonvertering.Tager vi analysen af ​​ACSH oligosaccharider som et eksempel, kan vi oprette en database med glykanbindinger for hvert biomassemateriale.Det skal her bemærkes, at antistoffernes forskellige affinitet bør tages i betragtning, og hvis deres affinitet er ukendt, vil dette skabe visse vanskeligheder, når man sammenligner signalerne fra forskellige antistoffer.Derudover kan sammenligning af glycanbindinger fungere bedst mellem prøver for det samme antistof.Disse genstridige bindinger kan derefter kobles til CAZyme-databasen, hvorfra vi kan identificere enzymer, udvælge kandidatenzymer og teste for bindingsbrydende enzymer eller udvikle mikrobielle systemer til at udtrykke disse enzymer til brug i bioraffinaderier44.
For at evaluere, hvordan immunologiske metoder komplementerer alternative metoder til karakterisering af lavmolekylære oligosaccharider til stede i lignocellulosehydrolysater, udførte vi MALDI (fig. 4, S1-S8) og analyse af TMS-afledte saccharider baseret på GC-MS på samme panel (fig. 5) oligosacchariddel.MALDI bruges til at sammenligne, om massefordelingen af ​​oligosaccharidmolekyler matcher den tilsigtede struktur.På fig.4 viser MS af de neutrale komponenter ACN-A og ACN-B.ACN-A-analyse bekræftede en række pentosesukkere i området fra DP 4-8 (fig. 4) til DP 22 (fig. S1), hvis vægte svarer til MeU-xylanoligosaccharider.ACN-B-analyse bekræftede pentose- og glucoxylan-serien med DP 8-15.I supplerende materiale, såsom figur S3, viser FA-C-syregruppemassefordelingskort en række (Me)U-substituerede pentosesukkere med en DP på ​​8-15, der er i overensstemmelse med de substituerede xylaner fundet i ELISA-baseret mAb-screening.Epitoperne er konsistente.
MALDI-MS spektrum af opløselige, ikke-kompatible oligosaccharider til stede i ACS.Her (A) ACN-A lavvægtsfraktioner indeholdende methyleret uronsyre (DP 4-8) substituerede glucuroxylanoligosaccharider og (B) ACN-B xylan og methylerede uronsyreoligosaccharider substitueret med glucuroxylan (DP 8-15).
Analyse af sammensætningen af ​​glycanresten af ​​ildfaste oligosaccharider.Her (A) TMS-saccharidsammensætning af forskellige oligosaccharidfraktioner opnået ved hjælp af GC-MS-analyse.(B) Strukturer af forskellige TMS-afledte sukkerarter til stede i oligosaccharider.ACN – acetonitrilfraktion indeholdende neutrale oligosaccharider og FA - ferulinsyrefraktion indeholdende sure oligosaccharider.
En anden interessant konklusion blev draget fra LC-MS-analysen af ​​oligosaccharidfraktionen, som vist i figur S9 (metoder kan ses i det elektroniske supplerende materiale).Fragmenter af hexose- og -OAc-grupper blev gentagne gange observeret under ligering af ACN-B-fraktionen.Dette fund bekræfter ikke kun fragmenteringen observeret i glykom- og MALDI-TOF-analyse, men giver også ny information om potentielle kulhydratderivater i forbehandlet lignocellulosebiomasse.
Vi udførte også glycansammensætningsanalyse af oligosaccharidfraktioner ved hjælp af TMS-glycanderivatisering.Ved hjælp af GC-MS bestemte vi sammensætningen af ​​neurale (ikke-derivative) og sure sukkerarter (GluA og GalA) i oligosaccharidfraktionen (fig. 5).Glucuronsyre findes i sure komponenter C og D, mens galacturonsyre findes i sure komponenter A og B, som begge er høj DP-komponenter af sure sukkerarter.Disse resultater bekræfter ikke kun vores ELISA- og MALDI-data, men er også i overensstemmelse med vores tidligere undersøgelser af oligosaccharid-akkumulering.Derfor mener vi, at moderne immunologiske metoder, der anvender biotinylering af oligosaccharider og efterfølgende ELISA-screening, er tilstrækkelige til at påvise opløselige genstridige oligosaccharider i forskellige biologiske prøver.
Da ELISA-baserede mAb-screeningsmetoder er blevet valideret af flere forskellige metoder, ønskede vi at udforske potentialet af denne nye kvantitative metode yderligere.To kommercielle oligosaccharider, xylohexasaccharide-oligosaccharid (XHE) og 23-a-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX), blev købt og testet ved hjælp af en ny mAb-tilgang rettet mod cellevægsglycanen.Figur 6 viser en lineær korrelation mellem det biotinylerede bindingssignal og log-koncentrationen af ​​oligosaccharidkoncentration, hvilket tyder på en mulig Langmuir-adsorptionsmodel.Blandt mAb'erne korrelerede CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 og CCRC-M151 med XHE, og CCRC-M108, CCRC-M109 og LM11 korrelerede med A2XX over et interval på 100n namno.På grund af den begrænsede tilgængelighed af antistoffer under eksperimentet, blev der udført begrænsede eksperimenter med hver oligosaccharidkoncentration.Det skal her bemærkes, at nogle antistoffer reagerer meget forskelligt på det samme oligosaccharid som et substrat, formentlig fordi de binder til lidt forskellige epitoper og kan have meget forskellige bindingsaffiniteter.Mekanismerne og implikationerne af nøjagtig epitopidentifikation vil være meget mere komplekse, når den nye mAb-tilgang anvendes på rigtige prøver.
To kommercielle oligosaccharider blev anvendt til at bestemme detektionsområdet for forskellige glycan-målrettede mAb'er.Her indikerer lineære korrelationer med log-koncentration af oligosaccharidkoncentration Langmuir-adsorptionsmønstre for (A) XHE med mAb og (B) A2XX med mAb.De tilsvarende epitoper angiver strukturerne af de kommercielle oligosaccharider, der anvendes som substrater i assayet.
Brugen af ​​glycan-målrettede monoklonale antistoffer (glykokomisk analyse eller ELISA-baseret mAb-screening) er et kraftfuldt værktøj til dybdegående karakterisering af de fleste af de vigtigste cellevægsglycaner, der udgør plantebiomasse.Klassisk glycananalyse karakteriserer dog kun glycaner med større cellevæg, da de fleste oligosaccharider ikke er effektivt immobiliseret på ELISA-plader.I denne undersøgelse blev AFEX-forbehandlet majskomfur enzymatisk hydrolyseret ved et højt tørstofindhold.Sukkeranalyse blev brugt til at bestemme sammensætningen af ​​genstridige cellevægskulhydrater i hydrolysatet.Imidlertid er mAb-analyse af mindre oligosaccharider i hydrolysater undervurderet, og yderligere værktøjer er nødvendige for effektivt at immobilisere oligosaccharider på ELISA-plader.
Vi rapporterer her en ny og effektiv oligosaccharid-immobiliseringsmetode til mAb-screening ved at kombinere oligosaccharidbiotinylering efterfulgt af ELISA-screening på NeutrAvidin™-coatede plader.De immobiliserede biotinylerede oligosaccharider viste tilstrækkelig affinitet for antistoffet til at muliggøre hurtig og effektiv påvisning af genstridige oligosaccharider.Analyse af sammensætningen af ​​disse genstridige oligosaccharider baseret på massespektrometri bekræftede resultaterne af denne nye tilgang til immunoscreening.Disse undersøgelser viser således, at kombinationen af ​​oligosaccharidbiotinylering og ELISA-screening med glycan-målrettede monoklonale antistoffer kan bruges til at påvise tværbindinger i oligosaccharider og kan anvendes bredt i andre biokemiske undersøgelser, der karakteriserer strukturen af ​​oligosaccharider.
Denne biotinbaserede glycanprofileringsmetode er den første rapport, der er i stand til at undersøge de genstridige kulhydratbindinger af opløselige oligosaccharider i plantebiomasse.Dette hjælper med at forstå, hvorfor nogle dele af biomassen er så stædige, når det kommer til produktion af biobrændstof.Denne metode udfylder et vigtigt hul i glykomanalysemetoder og udvider dens anvendelse til en bredere vifte af substrater ud over planteoligosaccharider.I fremtiden vil vi muligvis bruge robotteknologi til biotinylering og bruge den metode, vi har udviklet til high-throughput analyse af prøver ved hjælp af ELISA.
Majshalm (CS) dyrket fra Pioneer 33A14 hybridfrø blev høstet i 2010 fra Kramer Farms i Ray, Colorado.Med lodsejerens tilladelse kan denne biomasse anvendes til forskning. Prøverne blev opbevaret tørt < 6 % fugt i zip-lock poser i stuetemperatur. Prøverne blev opbevaret tørt < 6 % fugt i zip-lock poser i stuetemperatur. Besparelser på systemer til dækning < 6 % i dækning af elektricitetsteknologi. Prøver blev opbevaret tørt ved <6% fugtighed i lynlåsposer ved stuetemperatur.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6 % Optimal drift i forbindelse med sikringsanlæg med < 6 %. Prøver opbevares i lynlåsposer ved stuetemperatur med luftfugtighed < 6 %.Undersøgelsen fulgte lokale og nationale retningslinjer.Sammensætningsanalyse blev udført under anvendelse af NREL-protokollen.Sammensætningen viste sig at indeholde 31,4 % glucan, 18,7 % xylan, 3,3 % arabinan, 1,2 % galactan, 2,2 % acetyl, 14,3 % lignin, 1,7 % protein og 13,4 % aske.
Cellic® CTec2 (138 mg protein/ml, lot VCNI 0001) er en kompleks blanding af cellulase, β-glucosidase og Cellic® HTec2 (157 mg protein/ml, lot VHN00001) fra Novozymes (Franklinton, NC, USA)).Multifect Pectinase® (72 mg protein/ml), en kompleks blanding af pektinnedbrydende enzymer, blev doneret af DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, USA).Enzymproteinkoncentrationer blev bestemt ved at estimere proteinindholdet (og fratrække bidraget af ikke-proteinnitrogen) under anvendelse af Kjeldahl-nitrogenanalyse (AOAC-metode 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA).Diatoméjord 545 blev købt fra EMD Millipore (Billerica, MA).Aktivt kul (DARCO, 100 mesh granulat), Avicel (PH-101), bøgexylan og alle andre kemikalier blev købt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
AFEX-forbehandling blev udført på GLBRC (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, USA).Forbehandling blev udført ved 140°C i 15 minutter.46 opholdstid ved 1:1 forhold mellem vandfri ammoniak og biomasse ved 60 % (vægt/vægt) belastning i en batchreaktor af rustfrit stål (Parr Instruments Company).Det tog 30 minutter.Reaktoren blev bragt til 140°C, og ammoniakken blev hurtigt frigivet, hvilket tillod biomassen hurtigt at vende tilbage til stuetemperatur.Sammensætningen af ​​AFEX pre-treated corn stover (ACS) svarede til den for ubehandlet corn stover (UT-CS).
ACSH 25 % (vægt/vægt) med højt tørstofindhold (ca. 8 % dextranbelastning) blev fremstillet som et udgangsmateriale til produktion af oligosaccharider i stor skala.Enzymatisk hydrolyse af ACS blev udført under anvendelse af en kommerciel enzymblanding inklusive Cellic® Ctec2 10 mg protein/g glucan (i forbehandlet biomasse), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg protein/g glucan og Multifect Pectinase (Genencor Inc, USA).).), 5 mg protein/g dextran.Enzymatisk hydrolyse blev udført i en 5-liters bioreaktor med et arbejdsvolumen på 3 liter, pH 4,8, 50°C og 250 rpm.Efter hydrolyse i 96 timer blev hydrolysatet opsamlet ved centrifugering ved 6000 rpm i 30 minutter og derefter ved 14000 rpm i 30 minutter for at fjerne uhydrolyserede faste stoffer.Hydrolysatet blev derefter udsat for sterilfiltrering gennem et 0,22 mm filterbæger.Det filtrerede hydrolysat blev opbevaret i sterile flasker ved 4°C og derefter fraktioneret på kul.
Analyse af sammensætningen af ​​ekstraktbaserede biomasseprøver i henhold til NREL laboratorieanalyseprocedurer: forberedelse af prøver til sammensætningsanalyse (NREL/TP-510-42620) og bestemmelse af strukturelle kulhydrater og lignin i biomasse (NREL/TP-510 – 42618)47.
Oligosaccharidanalyse af hydrolysatstrømmen blev udført i en 2 ml skala under anvendelse af en autoklavebaseret syrehydrolysemetode.Bland hydrolysatprøven med 69,7 µl 72 % svovlsyre i et 10 ml dyrkningsrør med skruelåg og inkuber i 1 time på en bordplade ved 121 °C, afkøl på is og filtrer ind i et hætteglas med højtydende væskekromatografi (HPLC).Koncentrationen af ​​oligosaccharider blev bestemt ved at trække koncentrationen af ​​monosaccharider i den ikke-hydrolyserede prøve fra den totale sukkerkoncentration i den syrehydrolyserede prøve.
Glucose-, xylose- og arabinosekoncentrationer i den syrehydrolyserede biomasse blev analyseret under anvendelse af et Shimadzu HPLC-system udstyret med en autosampler, søjlevarmer, isokratisk pumpe og brydningsindeksdetektor på en Bio-Rad Aminex HPX-87H søjle.Søjlen blev holdt ved 50°C og elueret med 0,6 ml/min 5 mM H2S04 i vand.flyde.
Hydrolysat-supernatanten blev fortyndet og analyseret for indhold af monomer og oligosaccharid.Monomere sukkerarter opnået efter enzymatisk hydrolyse blev analyseret ved HPLC udstyret med en Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P søjle og en askebeskyttelsessøjle.Søjletemperaturen blev holdt på 80°C, vand blev anvendt som den mobile fase med en strømningshastighed på 0,6 ml/min.Oligosaccharider blev bestemt ved hydrolyse i fortyndet syre ved 121°C ifølge metoderne beskrevet i ref.41, 48, 49.
Saccharidanalyse blev udført på rå, AFEX-forbehandlede og alle ikke-hydrolyserede biomasserester (inklusive produktion af seriecellevægsekstrakter og deres mAb-screening) under anvendelse af tidligere beskrevne procedurer 27, 43, 50, 51.Til glykomanalyse fremstilles alkohol-uopløselige rester af plantecellevægsmateriale ud fra biomasserester og udsættes for serieekstraktion med stadig mere aggressive reagenser såsom ammoniumoxalat (50 mM), natriumcarbonat (50 mM og 0,5 % w/v), CON.(1M og 4M, begge med 1% vægt/volumen natriumborhydrid) og syrechlorit som tidligere beskrevet52,53.Ekstrakterne blev derefter underkastet ELISA mod et komplekst panel af mAb50'er rettet mod cellevægsglycanen, og mAb-bindingsreaktionerne blev præsenteret som et varmekort.mAbs rettet mod plantecellevæg-glycan blev købt fra laboratorieaktier (CCRC-, JIM- og MAC-serier).
Et-trins biotinylering af oligosaccharider.Konjugationen af ​​kulhydrater med biotin-LC-hydrazid blev udført under anvendelse af følgende procedure.Biotin-LC-hydrazid (4,6 mg/12 μmol) blev opløst i dimethylsulfoxid (DMSO, 70 μl) ved kraftig omrøring og opvarmning ved 65°C i 1 min.Iseddikesyre (30 µl) blev tilsat, og blandingen blev hældt på natriumcyanoborhydrid (6,4 mg/100 µmol) og fuldstændigt opløst efter opvarmning til 65°C i ca. 1 minut.Derefter blev fra 5 til 8 μl af reaktionsblandingen tilsat til det tørrede oligosaccharid (1-100 nmol) for at opnå et 10 gange eller mere molært overskud af mærket over den reducerende ende.Reaktionen blev udført ved 65°C i 2 timer, hvorefter prøverne straks blev oprenset.Intet natriumcyanoborhydrid blev anvendt i mærkningsforsøgene uden reduktion, og prøverne blev omsat ved 65°C i 2,5 timer.
ELISA coating og vask af prøver af biotinylerede oligosaccharider.25 μl biotinylerede prøver (100 μl af hver koncentreret prøve fortyndet i 5 ml 0,1 M Tris-bufferopløsning (TBS)) blev tilsat til hver brønd på den avidin-coatede plade.Kontrolbrønde blev coatet med 50 μl biotin i en koncentration på 10 μg/ml i 0,1 M TBS.Deioniseret vand blev brugt som belægning til blindprøvemålinger.Tabletten blev inkuberet i 2 timer ved stuetemperatur i mørke.Vask pladen 3 gange med 0,1 % skummetmælk i 0,1 M TBS vha. programnr.11 til Grenier lejlighed 3A.
Tilsætning og vask af primære antistoffer.Tilsæt 40 ​​µl primært antistof til hver brønd.Inkuber mikropladen i 1 time ved stuetemperatur i mørke.Pladerne blev derefter vasket 3 gange med 0,1 % mælk i 0,1 M TBS under anvendelse af vaskeprogram #11 for Grenier Flat 3A.
Tilsæt sekundært antistof og vask.Tilsæt 50 µl sekundært muse-/rotteantistof (fortyndet 1:5000 i 0,1 % mælk i 0,1 M TBS) til hver brønd.Inkuber mikropladen i 1 time ved stuetemperatur i mørke.Mikropladerne blev derefter vasket 5 gange med 0,1 % mælk i 0,1 M TBS under anvendelse af Grenier Flat 5A pladevaskeprogram #12.
Tilføjelse af et substrat.Tilsæt 50 µl 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidin (TMB) til basissubstratet (ved at tilsætte 2 dråber buffer, 3 dråber TMB, 2 dråber hydrogenperoxid til 15 ml deioniseret vand).Forbered TMB-substratet.og vortex før brug).Inkuber mikropladen ved stuetemperatur i 30 minutter.I mørket.
Gennemfør trinnet og læs tabletten.Tilsæt 50 µl 1 N svovlsyre til hver brønd, og optag absorbansen fra 450 til 655 nm ved hjælp af en ELISA-læser.
Forbered 1 mg/ml opløsninger af disse analytter i deioniseret vand: arabinose, rhamnose, fucose, xylose, galacturonsyre (GalA), glucuronsyre (GlcA), mannose, glucose, galactose, lactose, N-acetylmannosamin (manNAc), N-acetylglucosamin.(glcNAc), N-acetylgalactosamin (galNAc), inositol (intern standard).To standarder blev fremstillet ved at tilsætte 1 mg/ml sukkeropløsninger vist i tabel 1. Prøver fryses og frysetørres ved -80°C, indtil alt vand er fjernet (sædvanligvis ca. 12-18 timer).
Tilsæt 100–500 µg prøve til rør med skruelåg på en analytisk vægt.Registrer det tilføjede beløb.Det er bedst at opløse prøven i en specifik koncentration af opløsningsmiddel og tilsætte den til røret som en flydende alikvot.Brug 20 µl 1 mg/ml inositol som intern standard for hvert prøverør.Mængden af ​​intern standard tilsat til prøven skal være den samme som mængden af ​​intern standard tilsat standardrøret.
Tilsæt 8 ml vandfri methanol til et hætteglas med skruelåg.Derefter 4 ml 3 N. methanolisk HCl-opløsning, lukket og rystet.Denne proces bruger ikke vand.
Tilsæt 500 µl 1 M HCl-methanolopløsning til oligosaccharidprøverne og standard TMS-rør.Prøver blev inkuberet natten over (168 timer) ved 80°C i en termisk blok.Tør metanolyseproduktet ved stuetemperatur ved hjælp af en tørremanifold.Tilsæt 200 µl MeOH og tør igen.Denne proces gentages to gange.Tilsæt 200 µl methanol, 100 µl pyridin og 100 µl eddikesyreanhydrid til prøven og bland godt.Inkuber prøver ved stuetemperatur i 30 minutter.og tørret.Tilsæt 200 µl methanol og tør igen.
Tilsæt 200 µl Tri-Sil og opvarm røret med låg i 20 minutter.80°C, derefter afkølet til stuetemperatur.Brug en tørremanifold til yderligere at tørre prøven til et volumen på ca. 50 µl.Det er vigtigt at bemærke, at vi ikke tillod prøverne at tørre helt.
Tilsæt 2 ml hexan og bland godt ved vortexing.Fyld spidserne af Pasteur-pipetter (5-8 mm) med et stykke glasuld ved at indsætte glasulden oven på en pipette med en diameter på 5-3/4 tommer.Prøver blev centrifugeret ved 3000 g i 2 minutter.Eventuelle uopløselige rester udfældes.Tør prøven til 100-150 µl.Et volumen på ca. 1 μl blev injiceret i GC-MS ved en starttemperatur på 80 °C og en starttid på 2,0 minutter (tabel 2).