Kiitos käynnistäsi Nature.com-sivustolla. Käyttämäsi selainversio tukee CSS:ää rajoitetusti. Parhaan käyttökokemuksen saavuttamiseksi suosittelemme käyttämään päivitettyä selainta (tai poistamaan yhteensopivuustilan käytöstä Internet Explorerissa). Sillä välin tuen jatkuvuuden varmistamiseksi renderöimme sivuston ilman tyylejä ja JavaScriptiä.
Uudet immunologiset ja massaspektrometriset menetelmät pysyvien oligosakkaridien kompleksiseen analyysiin AFEX:llä esikäsitellyssä maissitärkkelyksessä. Lignoselluloosabiomassa on kestävä vaihtoehto fossiilisille polttoaineille, ja sitä käytetään laajalti bioteknologioiden kehittämisessä esimerkiksi elintarvikkeiden, rehun, polttoaineiden ja kemikaalien tuotantoon. Näiden teknologioiden avain on kustannuskilpailukykyisten prosessien kehittäminen kasvisoluseinissä olevien monimutkaisten hiilihydraattien muuttamiseksi yksinkertaisiksi sokereiksi, kuten glukoosiksi, ksyloosiksi ja arabinoosiksi. Koska lignoselluloosabiomassa on erittäin sitkeää, se on altistattava termokemiallisille käsittelyille (esim. ammoniakkikuitujen kuorinta (AFEX), laimeat hapot (DA), ioniset nesteet (IL)) ja biologisille käsittelyille (esim. entsymaattinen hydrolyysi ja mikrobikäyminen) yhdessä halutun tuotteen saamiseksi. Kuitenkin, kun hydrolyysiprosessissa käytetään kaupallisia sienientsyymejä, vain 75–85 % muodostuneista liukoisista sokereista on monosakkarideja, ja loput 15–25 % ovat liukoisia, vaikeasti käsiteltäviä oligosakkarideja, jotka eivät aina ole mikro-organismien saatavilla. Aikaisemmin olemme onnistuneesti eristäneet ja puhdistaneet liukoisia, itsepäisiä oligosakkarideja käyttämällä hiili- ja piimaaerotuksen sekä kokoekskluusiokromatografian yhdistelmää ja tutkineet myös niiden entsyymejä estäviä ominaisuuksia. Olemme havainneet, että korkeamman polymeroitumisasteen (DP) metyloituja uronihapposubstituutioita sisältävät oligosakkaridit ovat vaikeampia käsitellä kaupallisilla entsyymiseoksilla kuin matalan DP:n omaavat ja neutraalit oligosakkaridit. Tässä raportissa esittelemme useiden lisämenetelmien käyttöä, mukaan lukien glykaanien profilointi käyttämällä kasvibiomassan glykaaneille spesifisiä monoklonaalisia vasta-aineita (mAb) glykaanisidosten karakterisoimiseksi kasvisoluseinissä ja entsymaattisissa hydrolysaateissa, matriisiavusteinen laserdesorptioionisaatio ja lentoaikamassaspektrometria. MALDI-TOF-MS käyttää rakenneinformatiivisia diagnostisia piikkejä, jotka on saatu spektroskopialla negatiivisten ionien sekundäärisen hajoamisen jälkeen, kaasukromatografiaa ja massaspektrometriaa (GC-MS) oligosakkaridisidosten karakterisointiin derivatisoinnin kanssa ja ilman. Oligosakkaridien pienen koon (DP 4–20) vuoksi näitä molekyylejä on vaikea käyttää mAb:iden sitoutumiseen ja karakterisointiin. Tämän ongelman ratkaisemiseksi käytimme uutta biotiinin konjugaatioon perustuvaa oligosakkaridien immobilisointimenetelmää, joka leimasi onnistuneesti suurimman osan matalan DP:n omaavista liukoisista oligosakkarideista mikrotiiterilevyn pinnalla. Menetelmää käytettiin sitten korkean läpimenon monoklonaalisessa vasta-ainejärjestelmässä spesifiseen ligaatioanalyysiin. Tämä uusi menetelmä helpottaa tulevaisuudessa kehittyneempien korkean läpimenon glykogeenimääritysten kehittämistä, joita voidaan käyttää biomarkkereissa olevien oligosakkaridien eristämiseen ja karakterisointiin diagnostisiin tarkoituksiin.
Lignoselluloosabiomassa, joka koostuu maatalous-, metsätalous-, ruoho- ja puumateriaaleista, on potentiaalinen raaka-aine biopohjaisten tuotteiden, kuten elintarvikkeiden, rehun, polttoaineiden ja kemikaalien lähtöaineiden, tuotannolle arvokkaampien tuotteiden tuottamiseksi1. Kasvisoluseinissä olevat hiilihydraatit (kuten selluloosa ja hemiselluloosa) depolymeroidaan monosakkarideiksi kemiallisen prosessoinnin ja biotransformaation (kuten entsymaattisen hydrolyysin ja mikrobikäymisen) avulla. Yleisiä esikäsittelyjä ovat ammoniakkikuitulaajennus (AFEX), laimea happo (DA), ioninen neste (IL) ja höyryräjähdys (SE), joissa käytetään kemikaalien ja lämmön yhdistelmää lignoselluloosan tuotannon vähentämiseksi avaamalla kasvisoluseiniä3,4. aineen sitkeyttä, 5. Entsymaattinen hydrolyysi suoritetaan suurella kiintoainepitoisuudella käyttämällä kaupallisia aktiivisia hiilihydraatteja sisältäviä entsyymejä (CAZymejä) ja mikrobikäymistä transgeenisten hiivojen tai bakteerien avulla biopohjaisten polttoaineiden ja kemikaalien tuottamiseksi6.
Kaupallisten entsyymien CAZyymit koostuvat monimutkaisesta entsyymien seoksesta, joka synergistisesti katkaisee monimutkaisia ​​hiilihydraatti-sokerisidoksia muodostaen monosakkarideja2,7. Kuten aiemmin raportoimme, ligniinin ja hiilihydraattien aromaattisten polymeerien monimutkainen verkosto tekee niistä erittäin vaikeasti käsiteltäviä, mikä johtaa epätäydelliseen sokerin muuntumiseen. Sukupuolioligosakkarideja kertyy 15–25 %, eikä niitä tuoteta esikäsitellyn biomassan entsymaattisessa hydrolyysissä. Tämä on yleinen ongelma erilaisissa biomassan esikäsittelymenetelmissä. Joitakin syitä tähän pullonkaulaan ovat entsyymien esto hydrolyysin aikana tai sellaisten välttämättömien entsyymien puuttuminen tai alhainen määrä, joita tarvitaan kasvibiomassan sokerisidosten hajottamiseen. Sokerien koostumuksen ja rakenteellisten ominaisuuksien, kuten oligosakkaridien sokerisidosten, ymmärtäminen auttaa meitä parantamaan sokerin muuntumista hydrolyysin aikana, mikä tekee bioteknologisista prosesseista kustannuskilpailukykyisiä öljypohjaisiin tuotteisiin verrattuna.
Hiilihydraattien rakenteen määrittäminen on haastavaa ja vaatii useiden menetelmien yhdistelmän, kuten nestekromatografian (LC)11,12, ydinmagneettisen resonanssispektroskopian (NMR)13, kapillaarielektroforeesin (CE)14,15,16 ja massaspektrometrian (MS)17. ,kahdeksantoista. MS-menetelmät, kuten lentoaikamassaspektrometria laserdesorptiolla ja -ionisaatiolla matriisin avulla (MALDI-TOF-MS), ovat monipuolinen menetelmä hiilihydraattirakenteiden tunnistamiseen. Viime aikoina natriumioniadduktien törmäyksen aiheuttamaa dissosiaatiota (CID) hyödyntävää tandem-MS:ää on käytetty laajimmin oligosakkaridien kiinnityskohtia, anomeerisiä konfiguraatioita, sekvenssejä ja haarautumiskohtia vastaavien sormenjälkien tunnistamiseen 20, 21.
Glykaanianalyysi on erinomainen työkalu hiilihydraattisidosten syvälliseen tunnistamiseen22. Tässä menetelmässä käytetään kasvisoluseinän glykaaniin kohdistuvia monoklonaalisia vasta-aineita (mAb) koettimina monimutkaisten hiilihydraattisidosten ymmärtämiseksi. Maailmanlaajuisesti on saatavilla yli 250 mAb:tä, jotka on suunniteltu erilaisia ​​lineaarisia ja haarautuneita oligosakkarideja vastaan ​​käyttäen erilaisia ​​sakkarideja24. Useita mAb:ita on käytetty laajalti kasvisoluseinän rakenteen, koostumuksen ja modifikaatioiden karakterisointiin, koska niissä on merkittäviä eroja riippuen kasvisolutyypistä, elimestä, iästä, kehitysvaiheesta ja kasvuympäristöstä25,26. Viime aikoina tätä menetelmää on käytetty kasvi- ja eläinjärjestelmien vesikkelipopulaatioiden ja niiden roolien ymmärtämiseen glykaanin kuljetuksessa subsellulaaristen markkereiden, kehitysvaiheiden tai ympäristöärsykkeiden perusteella sekä entsymaattisen aktiivisuuden määrittämiseen. Joitakin tunnistettuja glykaanien ja ksylaanien erilaisia ​​rakenteita ovat pektiini (P), ksylaani (X), mannaani (M), ksyloglukaanit (XylG), sekasidosglukaanit (MLG), arabinoksylaani (ArbX), galaktomannaani (GalG), glukuronihappo-arabinoksylaani (GArbX) ja arabinogalaktaani (ArbG)29.
Kaikista näistä tutkimusponnisteluista huolimatta vain harvat tutkimukset ovat keskittyneet oligosakkaridien kertymisen luonteeseen suuren kiintoainemäärän (HSL) hydrolyysin aikana, mukaan lukien oligosakkaridien vapautuminen, oligomeeriketjun pituuden muutokset hydrolyysin aikana, erilaiset matalan DP:n polymeerit ja niiden käyrät, jakaumat 30,31,32. Samaan aikaan, vaikka glykaanianalyysi on osoittautunut hyödylliseksi työkaluksi glykaanin rakenteen kattavaan analyysiin, vesiliukoisten matalan DP:n oligosakkarideja on vaikea arvioida vasta-ainemenetelmillä. Pienemmät DP-oligosakkaridit, joiden molekyylipaino on alle 5–10 kDa, eivät sitoutu ELISA-levyihin 33, 34 ja ne huuhtoutuvat pois ennen vasta-aineiden lisäämistä.
Tässä tutkimuksessa demonstroimme ensimmäistä kertaa ELISA-määrityksen avidiinipäällystetyillä levyillä käyttäen monoklonaalisia vasta-aineita. Yhdistämme yksivaiheisen biotinylaatiomenetelmän liukoisille refraktaarisille oligosakkarideille glykokemian analyysiin. Lähestymistapamme glykokemian analyysiin validoitiin MALDI-TOF-MS- ja GC-MS-pohjaisella komplementaaristen oligosakkaridisidosten analyysillä käyttäen hydrolysoitujen sokerikoostumusten trimetyylisilyyli (TMS) -derivatisointia. Tätä innovatiivista lähestymistapaa voidaan kehittää tulevaisuudessa suuren läpimenon menetelmäksi ja sille voidaan löytää laajempia sovelluksia biolääketieteellisessä tutkimuksessa35.
Entsyymien ja vasta-aineiden translaationjälkeiset modifikaatiot, kuten glykosylaatio,36 vaikuttavat niiden biologiseen aktiivisuuteen. Esimerkiksi seerumin proteiinien glykosylaation muutoksilla on tärkeä rooli tulehduksellisessa niveltulehduksessa, ja glykosylaation muutoksia käytetään diagnostisina markkereina37. Kirjallisuudessa on raportoitu useiden glykaanien esiintyvän helposti useissa sairauksissa, mukaan lukien ruoansulatuskanavan ja maksan krooniset tulehdussairaudet, virusinfektiot, munasarja-, rinta- ja eturauhassyövät38,39,40. Glykaanien rakenteen ymmärtäminen vasta-ainepohjaisilla glykaani-ELISA-menetelmillä antaa lisävarmuutta tautien diagnosointiin ilman monimutkaisten MS-menetelmien käyttöä.
Aiempi tutkimuksemme osoitti, että sitkeät oligosakkaridit pysyivät hydrolysoitumattomina esikäsittelyn ja entsymaattisen hydrolyysin jälkeen (kuva 1). Aiemmin julkaistussa työssämme kehitimme aktiivihiileen perustuvan kiinteäfaasiuuttomenetelmän oligosakkaridien eristämiseksi AFEX-esikäsitellystä maissintähkän hydrolysaatista (ACSH)8. Alustavan uuton ja erottelun jälkeen oligosakkaridit fraktioitiin edelleen kokoekskluusiokromatografialla (SEC) ja kerättiin molekyylipainon mukaan. Eri esikäsittelyistä vapautuneet sokerimonomeerit ja oligomeerit analysoitiin sokerikoostumusanalyysillä. Kun verrataan eri esikäsittelymenetelmillä saatujen sokerioligomeerien pitoisuutta, sitkeiden oligosakkaridien läsnäolo on yleinen ongelma biomassan muuntamisessa monosakkarideiksi ja voi johtaa sokerisaannon vähenemiseen vähintään 10–15 % ja jopa 18 % US. Tätä menetelmää käytetään oligosakkaridifraktioiden laajamittaiseen jatkotuotantoon. Tuloksena olevaa ACH:ta ja sen seuraavia eri molekyylipainoisia fraktioita käytettiin kokeellisena materiaalina oligosakkaridien karakterisointiin tässä työssä.
Esikäsittelyn ja entsymaattisen hydrolyysin jälkeen pysyvät oligosakkaridit pysyivät hydrolysoimattomina. Tässä (A) on oligosakkaridien erotusmenetelmä, jossa oligosakkaridit eristetään AFEX-esikäsitellystä maissintähkän hydrolysaatista (ACSH) käyttämällä aktiivihiilen ja piimaan pakattua petiä; (B) Oligosakkaridien erotusmenetelmä. Oligosakkaridit eroteltiin edelleen kokoekskluusiokromatografialla (SEC); (C) Erilaisista esikäsittelyistä (laimennettu happo: DA, ioninen neste: IL ja AFEX) vapautuneet sakkaridimonomeerit ja -oligomeerit. Entsymaattiset hydrolyysiolosuhteet: korkea kiintoainepitoisuus 25 % (p/p) (noin 8 % glukaania), 96 tunnin hydrolyysi, 20 mg/g kaupallinen entsyymipitoisuus (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1-suhde) ja (D) AFEX-esikäsitellystä maissintähkästä (ACS) vapautuneet glukoosin, ksyloosin ja arabinoosin sokerimonomeerit ja -oligomeerit.
Glykaanianalyysi on osoittautunut hyödylliseksi työkaluksi kiinteän biomassan jäännöksistä eristettyjen uutteiden glykaanien kattavaan rakenneanalyysiin. Vesiliukoiset sakkaridit ovat kuitenkin aliedustettuina tällä perinteisellä menetelmällä,41 koska pienimolekyylipainoisia oligosakkarideja on vaikea immobilisoida ELISA-levyille ja ne huuhtoutuvat pois ennen vasta-aineiden lisäämistä. Siksi vasta-aineiden sitoutumista ja karakterisointia varten käytettiin yksivaiheista biotinylaatiomenetelmää liukoisten, ei-yhteensopivien oligosakkaridien päällystämiseksi avidiinilla päällystetyille ELISA-levyille. Tätä menetelmää testattiin käyttämällä aiemmin tuotettua ACSH:ta ja sen molekyylipainoon (tai polymeroitumisasteeseen, DP) perustuvaa fraktiota. Yksivaiheista biotinylaatiota käytettiin oligosakkaridin sitoutumisaffiniteetin lisäämiseksi lisäämällä biotiini-LC-hydratsidia hiilihydraatin pelkistävään päähän (kuva 2). Liuoksessa pelkistävän pään hemiasetaaliryhmä reagoi biotiini-LC-hydratsidin hydratsidiryhmän kanssa muodostaen hydratsonisidoksen. Pelkistävän aineen NaCNBH3 läsnä ollessa hydratsonisidos pelkistyy stabiiliksi biotinyloiduksi lopputuotteeksi. Sokereita pelkistävän pään modifikaation myötä matalan DP:n omaavien oligosakkaridien sitoutuminen ELISA-levyihin tuli mahdolliseksi, ja tutkimuksessamme tämä tehtiin avidiinipäällysteisillä levyillä käyttäen glykaaniin kohdennettuja monoklonaalisia vasta-aineita.
Biotinyloitujen oligosakkaridien seulonta ELISA-menetelmällä monoklonaalisten vasta-aineiden osalta. Tässä (A) on yhdistetty oligosakkaridien biotinylointi ja sitä seuraava ELISA-seulonta glykaaniin kohdennetuilla monoklonaalisilla vasta-aineilla NeutrAvidin-päällystetyillä levyillä ja (B) on esitetty yksivaiheinen menetelmä reaktiotuotteiden biotinyloimiseksi.
Avidiinilla päällystetyt levyt, joissa oli oligosakkaridikonjugoituja vasta-aineita, lisättiin sitten primaarisiin ja sekundaarisiin vasta-aineisiin ja pestiin valo- ja aikaherkässä väliaineessa. Kun vasta-aineiden sitoutuminen on valmis, levyyn lisättiin TMB-substraattia inkubointia varten. Reaktio pysäytettiin lopuksi rikkihapolla. Inkuboidut levyt analysoitiin ELISA-lukijalla kunkin vasta-aineen sitoutumisvoiman määrittämiseksi vasta-ainespesifisen ristisilloittumisen havaitsemiseksi. Kokeen yksityiskohdat ja parametrit on esitetty vastaavassa osiossa ”Materiaalit ja menetelmät”.
Osoitamme tämän uuden menetelmän hyödyllisyyden erityissovelluksissa karakterisoimalla ACSH:ssa sekä lignoselluloosahydrolysaateista eristetyissä raaoissa ja puhdistetuissa oligosakkaridifraktioissa olevia liukoisia oligosakkarideja. Kuten kuvassa 3 on esitetty, yleisimmät bioasyloitujen glykomien määritysmenetelmillä ACSH:ssa tunnistetut epitooppisubstituoidut ksylaanit ovat yleensä uronihappo (U) tai metyyliuronihappo (MeU) ja pektiiniarabinogalaktaanit. Suurin osa niistä löydettiin myös aiemmassa tutkimuksessamme, jossa analysoitiin hydrolysoimattomien kiinteiden aineiden (UHS) glykaaneja43.
Rekalsiittoreiden oligosakkaridiepitooppien havaitseminen käyttämällä soluseinän glykaaniin kohdistuvaa monoklonaalista vasta-ainetta. "Neutraali" fraktio on ACN-fraktio ja "hapan" fraktio on FA-fraktio. Kirkkaammat punaiset värit lämpökartalla osoittavat korkeampaa epitooppipitoisuutta ja kirkkaammat siniset osoittavat tyhjää taustaa. Asteikon väriarvot perustuvat raaka-OD-arvoihin formulaatioille N=2. Vasta-aineiden tunnistamat pääepitoopit on esitetty oikealla.
Näitä ei-selluloosarakenteita ei voitu pilkkoa testatun kaupallisen entsyymiseoksen yleisimmillä sellulaaseilla ja hemisellulaaseilla, jotka sisältävät yleisimmin käytettyjä kaupallisia entsyymejä. Siksi niiden hydrolyysiin tarvitaan uusia apuentsyymejä. Ilman tarvittavia ei-selluloosa-apuentsyymejä nämä ei-selluloosasidokset estävät täydellisen muuntumisen monosakkarideiksi, vaikka niiden emosokeripolymeerit hydrolysoitaisiin perusteellisesti lyhyemmiksi fragmenteiksi ja liuotettaisiin kaupallisilla entsyymiseoksilla.
Signaalin jakautumisen ja sen sitoutumisvoimakkuuden jatkotutkimukset osoittivat, että sitoutumisepitooppeja oli vähemmän korkean DP:n omaavissa sokerifraktioissa (A, B, C, DP jopa 20+) kuin matalan DP:n omaavissa fraktioissa (D, E, F, DP) dimeereissä) (kuva 1). Happofragmentteja on yleisempää ei-selluloosaepitoopeissa kuin neutraaleissa fragmenteissa. Nämä ilmiöt ovat yhdenmukaisia ​​aiemmassa tutkimuksessamme havaitun kuvion kanssa, jossa korkean DP:n omaavat ja happofragmentit olivat vastustuskykyisempiä entsymaattiselle hydrolyysille. Siksi ei-selluloosaglykaaniepitooppien ja U- ja MeU-substituutioiden läsnäolo voi merkittävästi vaikuttaa oligosakkaridien stabiilisuuteen. On huomattava, että sitoutumis- ja havaitsemistehokkuus voi olla ongelmallista matalan DP:n omaaville oligosakkarideille, erityisesti jos epitooppi on dimeerinen tai trimeerinen oligosakkaridi. Tätä voidaan testata käyttämällä eri pituisia kaupallisia oligosakkarideja, joista jokainen sisältää vain yhden epitoopin, joka sitoutuu tiettyyn monoklonaaliseen vasta-aineeseen.
Rakennekohtaisten vasta-aineiden käyttö paljasti siis tietyntyyppisiä vaikeasti reagoivia sidoksia. Käytetyn vasta-aineen tyypistä, sopivasta ligaatiokuviosta ja sen tuottaman signaalin voimakkuudesta (runsain ja vähiten runsas) riippuen voidaan tunnistaa uusia entsyymejä ja lisätä niitä semikvantitatiivisesti entsyymiseokseen täydellisemmän glykokonversion saavuttamiseksi. Esimerkiksi ACSH-oligosakkaridien analyysin avulla voimme luoda glykaanisidosten tietokannan kullekin biomassamateriaalille. Tässä on huomattava, että vasta-aineiden erilainen affiniteetti on otettava huomioon, ja jos niiden affiniteetti on tuntematon, se aiheuttaa tiettyjä vaikeuksia eri vasta-aineiden signaalien vertailussa. Lisäksi glykaanisidosten vertailu voi toimia parhaiten saman vasta-aineen näytteiden välillä. Nämä vaikeasti reagoivat sidokset voidaan sitten linkittää CAZyme-tietokantaan, josta voimme tunnistaa entsyymejä, valita entsyymiehdokkaita ja testata sidoksia rikkovia entsyymejä tai kehittää mikrobijärjestelmiä näiden entsyymien ilmentämiseksi biojalostamoissa käytettäväksi44.
Jotta voisimme arvioida, miten immunologiset menetelmät täydentävät vaihtoehtoisia menetelmiä lignoselluloosahydrolysaateissa esiintyvien pienimolekyylipainoisten oligosakkaridien karakterisoinnissa, suoritimme MALDI-analyysin (kuva 4, S1-S8) ja TMS-johdettujen sakkaridien analyysin GC-MS:n avulla samalle paneelin (kuva 5) oligosakkaridiosalle. MALDI-analyysiä käytetään vertaamaan, vastaako oligosakkaridimolekyylien massajakauma aiottua rakennetta. Kuvassa 4 on esitetty neutraalien komponenttien ACN-A:n ja ACN-B:n MS-spektroskopia. ACN-A-analyysi vahvisti pentoosisokerien alueen DP-arvoilla 4–8 (kuva 4) DP-arvoihin 22 (kuva S1), joiden painot vastaavat MeU-ksylaanioligosakkarideja. ACN-B-analyysi vahvisti pentoosi- ja glukoksylaanisarjat DP-arvoilla 8–15. Lisämateriaalissa, kuten kuvassa S3, FA-C:n happamien osien massajakaumakartat osoittavat (Me)U-substituoitujen pentoosisokerien vaihteluvälin, jonka DP on 8–15. Tämä alue on yhdenmukainen ELISA-pohjaisessa monoklonaalisten vasta-aineiden seulonnassa havaittujen substituoitujen ksylaanien kanssa. Epitoopit ovat yhdenmukaisia.
ACS:ssä esiintyvien liukoisten, ei-yhteensopivien oligosakkaridien MALDI-MS-spektri. Tässä (A) ACN-A:n matalan painoalueen fraktiot, jotka sisältävät metyloituja uronihappo- (DP 4-8) substituoituja glukuroksylaanioligosakkarideja, ja (B) ACN-B:n ksylaani- ja metyloituja uronihappo-oligosakkarideja, jotka on substituoitu glukuroksylaanilla (DP 8-15).
Refraktaaristen oligosakkaridien glykaanijäännöksen koostumuksen analyysi. Tässä (A) GC-MS-analyysillä saatujen eri oligosakkaridifraktioiden TMS-sakkaridikoostumus. (B) Oligosakkarideissa esiintyvien erilaisten TMS-johdannaisten sokereiden rakenteet. ACN – asetonitriilifraktio, joka sisältää neutraaleja oligosakkarideja, ja FA – happo-oligosakkarideja sisältävä ferulihappofraktio.
Toinen mielenkiintoinen johtopäätös tehtiin oligosakkaridifraktion LC-MS-analyysistä, kuten kuvassa S9 on esitetty (menetelmät löytyvät sähköisestä lisämateriaalista). Heksoosi- ja -OAc-ryhmien fragmentteja havaittiin toistuvasti ACN-B-fraktion ligaation aikana. Tämä havainto ei ainoastaan ​​vahvista glykomeeri- ja MALDI-TOF-analyysissä havaittua fragmentoitumista, vaan tarjoaa myös uutta tietoa mahdollisista hiilihydraattijohdannaisista esikäsitellyssä lignoselluloosabiomassassa.
Suoritimme myös oligosakkaridifraktioiden glykaanikoostumusanalyysin käyttämällä TMS-glykaanin derivatisointia. GC-MS:ää käyttäen määritimme hermosolujen (ei-derivaattaisten) ja happamien sokereiden (GluA ja GalA) koostumuksen oligosakkaridifraktiossa (kuva 5). Glukuronihappoa löytyy happamista komponenteista C ja D, kun taas galakturonihappoa löytyy happamista komponenteista A ja B, jotka molemmat ovat happamien sokereiden korkean DP:n komponentteja. Nämä tulokset eivät ainoastaan ​​vahvista ELISA- ja MALDI-tietojamme, vaan ovat myös yhdenmukaisia ​​aiempien oligosakkaridien kertymistä koskevien tutkimustemme kanssa. Siksi uskomme, että nykyaikaiset immunologiset menetelmät, joissa käytetään oligosakkaridien biotinylointia ja sitä seuraavaa ELISA-seulontaa, ovat riittäviä liukoisten vaikeasti hajoavien oligosakkaridien havaitsemiseksi erilaisissa biologisissa näytteissä.
Koska ELISA-pohjaisia ​​monoklonaalisten vasta-aineiden seulontamenetelmiä on validoitu useilla eri menetelmillä, halusimme tutkia tämän uuden kvantitatiivisen menetelmän potentiaalia tarkemmin. Hankimme kaksi kaupallista oligosakkaridia, ksyloheksasakkaridioligosakkaridi (XHE) ja 23-α-L-arabinofuranosyyli-ksylotrioosi (A2XX), ja testasimme niitä uudella monoklonaalisten vasta-aineiden lähestymistavalla, joka kohdistuu soluseinän glykaaniin. Kuva 6 esittää lineaarisen korrelaation biotinyloidun sitoutumissignaalin ja oligosakkaridipitoisuuden logaritmisen pitoisuuden välillä, mikä viittaa mahdolliseen Langmuir-adsorptiomalliin. Monoklonaalisista vasta-aineista CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 ja CCRC-M151 korreloivat XHE:n kanssa, ja CCRC-M108, CCRC-M109 ja LM11 korreloivat A2XX:n kanssa 1 nm:n - 100 nanometrin välillä. Koska vasta-aineita oli saatavilla rajoitetusti kokeen aikana, kullakin oligosakkaridipitoisuudella tehtiin rajoitetusti kokeita. Tässä on huomattava, että jotkut vasta-aineet reagoivat hyvin eri tavalla samaan oligosakkaridiin substraattina, oletettavasti siksi, että ne sitoutuvat hieman erilaisiin epitooppeihin ja niillä voi olla hyvin erilaiset sitoutumisaffiniteetit. Tarkan epitoopin tunnistamisen mekanismit ja vaikutukset ovat paljon monimutkaisempia, kun uutta monoklonaalista vasta-ainetta koskevaa lähestymistapaa sovelletaan todellisiin näytteisiin.
Kahta kaupallista oligosakkaridia käytettiin erilaisten glykaaniin kohdistuvien monoklonaalisten vasta-aineiden havaitsemisalueen määrittämiseen. Tässä lineaariset korrelaatiot oligosakkaridipitoisuuden logaritmisen pitoisuuden kanssa osoittavat Langmuir-adsorptiokuvioita (A) XHE:lle monoklonaalisen vasta-aineen kanssa ja (B) A2XX:lle monoklonaalisen vasta-aineen kanssa. Vastaavat epitoopit osoittavat määrityksessä substraatteina käytettyjen kaupallisten oligosakkaridien rakenteet.
Glykaaniin kohdennettujen monoklonaalisten vasta-aineiden käyttö (glykokoominen analyysi tai ELISA-pohjainen monoklonaalisten vasta-aineiden seulonta) on tehokas työkalu useimpien kasvibiomassan muodostavien tärkeimpien soluseinän glykaanien syvälliseen karakterisointiin. Klassinen glykaanianalyysi karakterisoi kuitenkin vain suurempia soluseinän glykaaneja, koska useimmat oligosakkaridit eivät immobilisoidu tehokkaasti ELISA-levyille. Tässä tutkimuksessa AFEX-esikäsitellyt maissintähkät hydrolysoitiin entsymaattisesti korkealla kiintoainepitoisuudella. Sokerianalyysiä käytettiin hydrolysaatin vaikeasti hajoavien soluseinän hiilihydraattien koostumuksen määrittämiseen. Pienempien oligosakkaridien monoklonaalisten vasta-aineiden analyysi hydrolysaateissa on kuitenkin aliarvioitu, ja oligosakkaridien tehokkaaseen immobilisointiin ELISA-levyille tarvitaan lisätyökaluja.
Raportoimme tässä uuden ja tehokkaan oligosakkaridien immobilisointimenetelmän monoklonaalisten vasta-aineiden seulontaan yhdistämällä oligosakkaridien biotinyloinnin ja sen jälkeen ELISA-seulonnan NeutrAvidin™-päällystetyillä levyillä. Immobilisoiduilla biotinyloiduilla oligosakkarideilla oli riittävä affiniteetti vasta-aineeseen, mikä mahdollisti vaikeasti havaittavien oligosakkaridien nopean ja tehokkaan havaitsemisen. Näiden itsepäisten oligosakkaridien koostumuksen analyysi massaspektrometrialla vahvisti tämän uuden immunoseulontamenetelmän tulokset. Nämä tutkimukset osoittavat siis, että oligosakkaridien biotinyloinnin ja ELISA-seulonnan yhdistelmää glykaaneihin kohdennetuilla monoklonaalisilla vasta-aineilla voidaan käyttää ristisidosten havaitsemiseen oligosakkarideissa ja sitä voidaan soveltaa laajasti muissa biokemiallisissa tutkimuksissa, joissa karakterisoidaan oligosakkaridien rakennetta.
Tämä biotiinipohjainen glykaanien profilointimenetelmä on ensimmäinen raportti, joka pystyy tutkimaan liukoisten oligosakkaridien vaikeasti sitoutuvia hiilihydraattisidoksia kasvibiomassassa. Tämä auttaa ymmärtämään, miksi jotkut biomassan osat ovat niin sitkeitä biopolttoaineiden tuotannon kannalta. Tämä menetelmä täyttää tärkeän aukon glykominektimenetelmissä ja laajentaa sen soveltamista laajempaan valikoimaan substraatteja kasvioligosakkaridien lisäksi. Tulevaisuudessa voimme käyttää robotiikkaa biotinylointiin ja käyttää kehittämäämme menetelmää näytteiden suuren läpimenon analysointiin ELISA:lla.
Pioneer 33A14 -hybridin siemenistä kasvatettu maissin olki (CS) korjattiin vuonna 2010 Kramer Farmsilta Raysta, Coloradosta. Maanomistajan luvalla tätä biomassaa voidaan käyttää tutkimustarkoituksiin. Näytteet säilytettiin kuivissa, alle 6 %:n kosteudessa, vetoketjullisissa pusseissa huoneenlämmössä. Näytteet säilytettiin kuivissa, alle 6 %:n kosteudessa, vetoketjullisissa pusseissa huoneenlämmössä. Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре. Näytteet säilytettiin kuivissa, alle 6 %:n kosteudessa, vetoketjullisissa pusseissa huoneenlämmössä.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中.样品在室温下以干燥< 6 % Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < 6%. Näytteet säilytetään vetoketjullisissa pusseissa huoneenlämmössä, jossa ilmankosteus on alle 6 %.Tutkimus noudatti paikallisia ja kansallisia ohjeita. Koostumusanalyysi suoritettiin NREL-protokollaa käyttäen. Koostumuksen havaittiin sisältävän 31,4 % glukaania, 18,7 % ksylaania, 3,3 % arabinania, 1,2 % galaktaania, 2,2 % asetyyliä, 14,3 % ligniiniä, 1,7 % proteiinia ja 13,4 % tuhkaa.
Cellic® CTec2 (138 mg proteiinia/ml, erä VCNI 0001) on monimutkainen seos sellulaasia, β-glukosidaasia ja Cellic® HTec2:ta (157 mg proteiinia/ml, erä VHN00001) Novozymesiltä (Franklinton, NC, USA)). Multifect Pectinase® (72 mg proteiinia/ml), monimutkainen seos pektiiniä hajottavia entsyymejä, lahjoitti DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, USA). Entsyymiproteiinipitoisuudet määritettiin arvioimalla proteiinipitoisuus (ja vähentämällä muun kuin proteiinitypen osuus) käyttämällä Kjeldahl-typpianalyysiä (AOAC-menetelmä 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA). Piiamaa 545 ostettiin EMD Milliporelta (Billerica, MA). Aktiivihiili (DARCO, 100 mesh -rakeet), Avicel (PH-101), pyökin ksylaani ja kaikki muut kemikaalit ostettiin Sigma-Aldrichilta (St. Louis, MO).
AFEX-esikäsittely suoritettiin GLBRC:ssä (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, USA). Esikäsittely suoritettiin 140 °C:ssa 15 minuutin ajan. Viipymäaika vedettömän ammoniakin ja biomassan suhteessa 1:1, 60 %:n (w/w) täyttöasteella, ruostumattomasta teräksestä valmistetussa pöytämallisessa panosreaktorissa (Parr Instruments Company). Se kesti 30 minuuttia. Reaktori lämmitettiin 140 °C:seen ja ammoniakki vapautui nopeasti, jolloin biomassa palautui nopeasti huoneenlämpöön. AFEX-esikäsitellyn maissinjyvän (ACS) koostumus oli samanlainen kuin käsittelemättömän maissinjyvän (UT-CS).
Lähtöaineeksi oligosakkaridien laajamittaiseen tuotantoon valmistettiin 25 % (w/w) korkean kiintoainepitoisuuden omaavaa ACSH:ta (noin 8 % dekstraanipitoisuus). ACS:n entsymaattinen hydrolyysi suoritettiin käyttämällä kaupallista entsyymiseosta, joka sisälsi Cellic® Ctec2 10 mg proteiinia/g glukaania (esikäsitellyssä biomassassa), Htec2:ta (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg proteiinia/g glukaania ja Multifect Pectinasea (Genencor Inc, USA). ). , 5 mg proteiinia/g dekstraania. Entsymaattinen hydrolyysi suoritettiin 5 litran bioreaktorissa, jonka työtilavuus oli 3 litraa, pH 4,8, lämpötila 50 °C ja nopeus 250 rpm. 96 tunnin hydrolyysin jälkeen hydrolysaatti kerättiin sentrifugoimalla nopeudella 6000 rpm 30 minuutin ajan ja sitten nopeudella 14000 rpm 30 minuutin ajan hydrolysoitumattomien kiintoaineiden poistamiseksi. Hydrolysaatti steriilisuodatettiin sitten 0,22 mm:n suodatinlasin läpi. Suodatettu hydrolysaatti säilytettiin steriileissä pulloissa 4 °C:ssa ja fraktioitiin sitten hiilellä.
Uutepohjaisten biomassanäytteiden koostumuksen analysointi NREL-laboratorioanalyysimenetelmien mukaisesti: näytteiden valmistelu koostumusanalyysiä varten (NREL/TP-510-42620) ja rakennehiilihydraattien ja ligniinin määritys biomassasta (NREL/TP-510–42618)47.
Hydrolysaattivirran oligosakkaridianalyysi suoritettiin 2 ml:n mittakaavassa käyttäen autoklaavipohjaista happohydrolyysimenetelmää. Sekoita hydrolysaattinäyte 69,7 µl:n kanssa 72-prosenttista rikkihappoa 10 ml:n kierrekorkisessa viljelyputkessa ja inkuboi 1 tunti työpöydällä 121 °C:ssa, jäähdytä jäillä ja suodata korkean suorituskyvyn nestekromatografiaan (HPLC). Oligosakkaridien pitoisuus määritettiin vähentämällä hydrolysoimattoman näytteen monosakkaridien pitoisuus happohydrolysoidun näytteen kokonaissokeripitoisuudesta.
Happohydrolysoidun biomassan glukoosi-, ksyloosi- ja arabinoosipitoisuudet analysoitiin Shimadzu HPLC -järjestelmällä, joka oli varustettu automaattisella näytteenottimella, kolonninlämmittimellä, isokraattisella pumpulla ja taitekerroindetektorilla Bio-Rad Aminex HPX-87H -kolonnilla. Kolonnia pidettiin 50 °C:ssa ja eluoitiin 0,6 ml/min 5 mM H2SO4:lla vesivirtauksessa.
Hydrolysaatin supernatantti laimennettiin ja analysoitiin monomeeri- ja oligosakkaridipitoisuuden suhteen. Entsymaattisen hydrolyysin jälkeen saadut monomeerisokerit analysoitiin HPLC:llä, joka oli varustettu Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P -kolonnilla ja tuhkasuojakolonnilla. Kolonnin lämpötila pidettiin 80 °C:ssa, vettä käytettiin liikkuvana faasina virtausnopeudella 0,6 ml/min. Oligosakkaridit määritettiin hydrolyysillä laimeassa hapossa 121 °C:ssa viitteissä 41, 48, 49 kuvattujen menetelmien mukaisesti.
Sakkaridianalyysi suoritettiin raa'ille, AFEX-esikäsitellyille ja kaikille hydrolysoimattomille biomassajäännöksille (mukaan lukien sarjamuotoisten soluseinäuutteiden tuotanto ja niiden monoklonaalisten vasta-aineiden seulonta) aiemmin kuvatuilla menetelmillä 27, 43, 50, 51. Glykomeerianalyysiä varten kasvisoluseinämateriaalin alkoholiin liukenemattomat jäännökset valmistetaan biomassajäännöksistä ja ne uutetaan sarjamenetelmällä yhä aggressiivisemmilla reagensseilla, kuten ammoniumoksalaatilla (50 mM), natriumkarbonaatilla (50 mM ja 0,5 % w/v), CON:lla (1 M ja 4 M, molemmat 1 % w/v natriumboorihydridiä) ja happokloriitilla, kuten aiemmin on kuvattu 52,53. Uutteet analysoitiin sitten ELISA-menetelmällä soluseinäglykaaniin kohdistuvien monoklonaalisten vasta-aineiden kompleksista paneelia vastaan, ja monoklonaalisten vasta-aineiden sitoutumisreaktiot esitettiin lämpökarttana. Kasvisoluseinäglykaaniin kohdistuvat monoklonaaliset vasta-aineet hankittiin laboratoriovarastoista (CCRC, JIM ja MAC-sarjat).
Oligosakkaridien yksivaiheinen biotinylointi. Hiilihydraattien konjugointi biotiini-LC-hydratsidin kanssa suoritettiin seuraavalla menetelmällä. Biotiini-LC-hydratsidi (4,6 mg/12 μmol) liuotettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO, 70 μl) voimakkaasti sekoittaen ja kuumentamalla 65 °C:ssa 1 minuutin ajan. Lisättiin jääetikkaa (30 µl) ja seos kaadettiin natriumsyanoboorihydridiin (6,4 mg/100 µmol) ja liuotettiin kokonaan kuumentamalla 65 °C:ssa noin 1 minuutin ajan. Sitten kuivattuun oligosakkaridiin (1–100 nmol) lisättiin 5–8 μl reaktioseosta, jotta leima-aineen moolimäärä pelkistävään päähän nähden oli 10-kertainen tai suurempi. Reaktio suoritettiin 65 °C:ssa 2 tunnin ajan, minkä jälkeen näytteet puhdistettiin välittömästi. Leimauskokeissa ei käytetty natriumsyanoboorihydridiä ilman pelkistystä, ja näytteiden annettiin reagoida 65 °C:ssa 2,5 tunnin ajan.
Biotinyloitujen oligosakkaridien ELISA-päällystys ja pesu. Avidiinilla päällystetyn levyn jokaiseen kuoppaan lisättiin 25 μl biotinyloituja näytteitä (100 μl jokaista väkevöityä näytettä laimennettuna 5 ml:aan 0,1 M Tris-puskuriliuosta (TBS)). Kontrollikuopat päällystettiin 50 μl:lla biotiinia pitoisuudella 10 μg/ml 0,1 M TBS:ssä. Deionisoitua vettä käytettiin päällysteenä sokeakokeissa. Tablettia inkuboitiin 2 tuntia huoneenlämmössä pimeässä. Pese levy 3 kertaa 0,1 % rasvattomalla maidolla 0,1 M TBS:ssä käyttäen ohjelmaa nro 11 Grenier-levylle 3A.
Primaaristen vasta-aineiden lisäys ja pesu. Lisää 40 µl primaarista vasta-ainetta jokaiseen kuoppaan. Inkuboi mikrolevyä 1 tunti huoneenlämmössä pimeässä. Sitten levyt pestiin kolme kertaa 0,1 % maidolla 0,1 M TBS:ssä käyttäen pesuohjelmaa nro 11 Grenier Flat 3A:lle.
Lisää sekundaarinen vasta-aine ja pese. Lisää 50 µl hiiren/rotan sekundaarista vasta-ainetta (laimennettuna suhteessa 1:5000 0,1 % maitoon 0,1 M TBS:ssä) jokaiseen kuoppaan. Inkuboi mikrolevyä 1 tunti huoneenlämmössä pimeässä. Sitten mikrolevyt pestiin viisi kertaa 0,1 % maidolla 0,1 M TBS:ssä käyttäen Grenier Flat 5A -levynpesuohjelmaa nro 12.
Substraatin lisääminen. Lisää 50 µl 3,3′,5,5′-tetrametyylibentsidiiniä (TMB) perussubstraattiin (lisäämällä 2 tippaa puskuria, 3 tippaa TMB:tä ja 2 tippaa vetyperoksidia 15 ml:aan deionisoitua vettä). Valmistele TMB-substraatti ja vortexaa ennen käyttöä. Inkuboi mikrolevyä huoneenlämmössä 30 minuuttia pimeässä.
Suorita vaihe loppuun ja lue tabletti. Lisää 50 µl 1 N rikkihappoa jokaiseen kuoppaan ja mittaa absorbanssi 450–655 nm:ssä ELISA-lukijalla.
Valmistele näistä analyyteistä 1 mg/ml liuoksia deionisoituun veteen: arabinoosi, ramnoosi, fukoosi, ksyloosi, galakturonihappo (GalA), glukuronihappo (GlcA), mannoosi, glukoosi, galaktoosi, laktoosi, N-asetyylimannosamiini (manNAc), N-asetyyliglukosamiini (glcNAc), N-asetyyligalaktosamiini (galNAc), inositoli (sisäinen standardi). Kaksi standardia valmistettiin lisäämällä taulukossa 1 esitetyt 1 mg/ml sokeriliuokset. Näytteet pakastetaan ja kylmäkuivataan -80 °C:ssa, kunnes kaikki vesi on poistettu (yleensä noin 12–18 tuntia).
Lisää 100–500 µg näytettä analyysivaa'an kierrekorkkiputkiin. Kirjaa lisätty määrä muistiin. On parasta liuottaa näyte tiettyyn liuotinpitoisuuteen ja lisätä se putkeen nestemäisenä eränä. Käytä 20 µl 1 mg/ml inositolia sisäisenä standardina jokaista näyteputkea kohden. Näytteeseen lisättävän sisäisen standardin määrän on oltava sama kuin standardiputkeen lisättävän sisäisen standardin määrän.
Lisää 8 ml vedetöntä metanolia kierrekorkilla varustettuun pulloon. Sitten 4 ml 3 N metanolista HCl-liuosta, sulje korkki ja ravista. Tässä prosessissa ei käytetä vettä.
Lisää 500 µl 1 M HCl-metanoliliuosta oligosakkaridinäytteisiin ja standardi-TMS-putkiin. Näytteitä inkuboitiin yön yli (168 tuntia) 80 °C:ssa lämpöblokissa. Kuivaa metanolyysituote huoneenlämmössä kuivausjakotukin avulla. Lisää 200 µl MeOH:ta ja kuivaa uudelleen. Tämä prosessi toistetaan kahdesti. Lisää näytteeseen 200 µl metanolia, 100 µl pyridiiniä ja 100 µl etikkahappoanhydridiä ja sekoita hyvin. Inkuboi näytteitä huoneenlämmössä 30 minuuttia ja kuivaa. Lisää 200 µl metanolia ja kuivaa uudelleen.
Lisää 200 µl Tri-Siliä ja kuumenna korkilla suljettua putkea 20 minuuttia. Kuumenna 80 °C:seen ja jäähdytä sitten huoneenlämpöiseksi. Kuivaa näyte kuivausjakotukilla noin 50 µl:n tilavuuteen. On tärkeää huomata, ettemme antaneet näytteiden kuivua kokonaan.
Lisää 2 ml heksaania ja sekoita hyvin vorteksoimalla. Täytä Pasteur-pipettien (5–8 mm) kärjet lasivillapalalla asettamalla lasivilla 5-3/4 tuuman halkaisijaltaan olevan pipetin päälle. Näytteet sentrifugoitiin 3000 g:n voimalla 2 minuuttia. Liukenemattomat jäämät saostuivat. Kuivaa näyte 100–150 µl:aan. Noin 1 μl:n tilavuus injektoitiin GC-MS-laitteeseen 80 °C:n alkulämpötilassa ja 2,0 minuutin alkuajalla (taulukko 2).