Tankewol foar jo besite oan Nature.com. De browserferzje dy't jo brûke hat beheinde CSS-stipe. Foar de bêste ûnderfining riede wy jo oan om in bywurke browser te brûken (of kompatibiliteitsmodus yn Internet Explorer út te skeakeljen). Yn 'e tuskentiid, om trochgeande stipe te garandearjen, sille wy de side sûnder stilen en JavaScript werjaan.
Nije immunologyske en massaspektrometryske metoaden foar komplekse analyze fan persistinte oligosachariden yn maisstâlen foarbehannele mei AFEX. Lignocellulose biomassa is in duorsum alternatyf foar fossile brânstoffen en wurdt breed brûkt om biotechnologyen te ûntwikkeljen foar de produksje fan produkten lykas iten, feed, brânstoffen en gemikaliën. De kaai ta dizze technologyen is de ûntwikkeling fan kosten-kompetitive prosessen foar it omsetten fan komplekse koalhydraten dy't oanwêzich binne yn plantselwanden yn ienfâldige sûkers lykas glukoaze, xylose en arabinose. Omdat lignocellulose biomassa tige koppich is, moat it ûnderwurpen wurde oan thermochemyske behannelingen (bygelyks, ammoniakfaser-eksfoliaasje (AFEX), ferdunde soeren (DA), ionyske floeistoffen (IL)) en biologyske behannelingen (bygelyks, enzymatyske hydrolyse en mikrobiële fermentaasje) yn kombinaasje om it winske produkt te krijen. As kommersjele skimmelenzymen lykwols brûkt wurde yn it hydrolyseproses, binne mar 75-85% fan 'e oplosbere sûkers dy't foarme wurde monosachariden, en de oerbleaune 15-25% binne oplosbere, ûnhanthavenbere oligosachariden, dy't net altyd beskikber binne foar mikroorganismen. Earder hawwe wy mei súkses oplosbere koppige oligosachariden isolearre en suvere mei in kombinaasje fan koalstof- en diatomeeënaarde-skieding en grutte-útslutingschromatografy, en ek har enzymremmende eigenskippen ûndersocht. Wy hawwe fûn dat oligosachariden mei in hegere graad fan polymerisaasje (DP) methylearre uronsoersubstituasjes dreger te ferwurkjen binne mei kommersjele enzymemingsels as lege DP en neutrale oligosachariden. Hjir rapportearje wy it gebrûk fan ferskate ekstra metoaden, ynklusyf glykaanprofilering mei monoklonale antistoffen (mAbs) spesifyk foar plantbiomassa-glykanen om glykaanbannen yn plantselwanden en enzymatyske hydrolysaten te karakterisearjen, matrix-assistearre laserdesorpsje-ionisaasje, time-of-flight massaspektrometry. . MALDI-TOF-MS) brûkt struktuer-ynformative diagnostyske pieken krigen troch spektroskopie nei sekundêr ferfal fan negative ioanen, gaschromatografy en massaspektrometry (GC-MS) om oligosacharidbannen mei en sûnder derivatisaasje te karakterisearjen. Fanwegen de lytse grutte fan oligosachariden (DP 4-20) binne dizze molekulen lestich te brûken foar mAb-binding en karakterisaasje. Om dit probleem te oerwinnen, hawwe wy in nije biotine-konjugaasje-basearre oligosaccharide-immobilisaasjemetoade tapast dy't mei súkses it grutste part fan 'e oplosbere oligosacchariden mei lege DP op it mikroplaatoerflak markearre, dy't doe brûkt waarden yn in hege-trochput mAb-systeem foar spesifike ligaasje-analyze. Dizze nije metoade sil de ûntwikkeling fan mear avansearre hege-trochput glycome-assays yn 'e takomst fasilitearje dy't brûkt wurde kinne om oligosacchariden oanwêzich yn biomarkers te isolearjen en te karakterisearjen foar diagnostyske doelen.
Lignocellulose biomassa, gearstald út lânbou, boskbou, gers en houtige materialen, is in potinsjele grûnstof foar de produksje fan biobasearre produkten, ynklusyf iten, feed, brânstof en gemyske foargongers om produkten mei hegere wearde te produsearjen1. Koalhydraten (lykas cellulose en hemicellulose) oanwêzich yn plantselwanden wurde depolymerisearre ta monosachariden troch gemyske ferwurking en biotransformaasje (lykas enzymatyske hydrolyse en mikrobiële fermentaasje). Faak foarkommende foarbehannelingen omfetsje ammoniakfaserútwreiding (AFEX), ferdund soer (DA), ionyske floeistof (IL), en stoomeksploazje (SE), dy't in kombinaasje fan gemikaliën en waarmte brûke om lignocelluloseproduksje te ferminderjen troch plantselwanden te iepenjen3,4. koppigens fan matearje, 5. Enzymatyske hydrolyse wurdt útfierd by in hege fêste stoflading mei kommersjele aktive koalhydraat-befette enzymen (CAZymes) en mikrobiële fermentaasje mei transgene gisten of baktearjes om biobasearre brânstoffen en gemikaliën te produsearjen6.
CAZymen yn kommersjele enzymen binne gearstald út in kompleks mingsel fan enzymen dy't synergistysk komplekse koalhydraat-sûkerbiningen splitse om monosachariden te foarmjen2,7. Lykas wy earder rapportearre hawwe, makket it komplekse netwurk fan aromaatyske polymearen fan lignine mei koalhydraten se tige ûnbehannelber, wat liedt ta ûnfolsleine sûkerkonverzje, wêrby't 15-25% fan seks-oligosachariden ophoopt dy't net produsearre wurde tidens enzymatyske hydrolyse fan 'e foarbehannele biomassa. Dit is in faak probleem mei ferskate biomassa-foarbehannelingsmetoaden. Guon redenen foar dizze knelpunt omfetsje enzymremming tidens hydrolyse, of de ôfwêzigens of lege nivo's fan essensjele enzymen dy't nedich binne om sûkerbiningen yn plantbiomassa te brekken. Begrip fan 'e gearstalling en strukturele skaaimerken fan sûkers, lykas de sûkerbiningen yn oligosachariden, sil ús helpe om de sûkerkonverzje tidens hydrolyse te ferbetterjen, wêrtroch biotechnologyske prosessen kostenkonkurrearjend wurde mei produkten ôflaat fan petroleum.
It bepalen fan 'e struktuer fan koalhydraten is in útdaging en fereasket in kombinaasje fan metoaden lykas floeistofchromatografy (LC)11,12, kearnmagnetyske resonânsjespektroskopie (NMR)13, kapillêre elektroforese (CE)14,15,16 en massaspektrometry (MS)17. ,achttjin. MS-metoaden lykas time-of-flight-massaspektrometry mei laserdesorpsje en ionisaasje mei in matrix (MALDI-TOF-MS) binne in alsidige metoade foar it identifisearjen fan koalhydraatstrukturen. Koartlyn is Collision-Induced Dissosiation (CID) tandem MS fan natriumionaddukten it meast brûkt om fingerôfdrukken te identifisearjen dy't oerienkomme mei oligosaccharide-oanhechtingsposysjes, anomere konfiguraasjes, sekwinsjes en fertakkingsposysjes 20, 21.
Glykaananalyse is in poerbêst ark foar yngeande identifikaasje fan koalhydraatbiningen22. Dizze metoade brûkt monoklonale antistoffen (mAbs) rjochte op glykaan yn plantselwanden as probes om komplekse koalhydraatbiningen te begripen. Mear as 250 mAbs binne wrâldwiid beskikber, ûntworpen tsjin ferskate lineêre en fertakke oligosacchariden mei ferskate sacchariden24. Ferskate mAbs binne breed brûkt om de struktuer, gearstalling en modifikaasjes fan 'e plantselwand te karakterisearjen, om't d'r wichtige ferskillen binne ôfhinklik fan it type plantsel, oargel, leeftyd, ûntwikkelingsstadium en groeiomjouwing25,26. Mear resint is dizze metoade brûkt om fesikelpopulaasjes yn plant- en diersystemen te begripen en har respektive rollen yn glykaantransport lykas bepaald troch subsellulêre markers, ûntwikkelingsstadia of miljeustimuli, en om enzymatyske aktiviteit te bepalen. Guon fan 'e ferskillende struktueren fan glykanen en xylanen dy't identifisearre binne omfetsje pektine (P), xylan (X), mannan (M), xyloglukanen (XylG), mingde bânglukanen (MLG), arabinoxylan (ArbX), galaktomannan (GalG), glukuronzuur-arabinoxylan (GArbX) en arabino-galaktan (ArbG)29.
Nettsjinsteande al dizze ûndersyksynspanningen hawwe mar in pear stúdzjes har rjochte op 'e aard fan oligosaccharide-akkumulaasje tidens hydrolyse mei hege fêste stoffenbelesting (HSL), ynklusyf it frijkommen fan oligosaccharide, feroaringen yn oligomere ketenlingte tidens hydrolyse, ferskate polymearen mei lege DP, en har krommen. ferdielingen 30,31,32. Underwilens, hoewol glykaananalyse in nuttich ark bliken te wêzen foar in wiidweidige analyze fan 'e glykaanstruktuer, is it lestich om wetteroplosbere oligosacchariden mei lege DP te evaluearjen mei antistofmetoaden. Lytsere DP-oligosacchariden mei in molekulêr gewicht fan minder dan 5-10 kDa bine net oan ELISA-platen 33, 34 en wurde fuortwosken foardat antistof tafoege wurdt.
Hjir demonstrearje wy foar it earst in ELISA-assay op avidine-coated platen mei monoklonale antistoffen, wêrby't in ienstaps biotinylaasjeproseduere foar oplosbere refraktêre oligosacchariden kombinearre wurdt mei glycome-analyze. Us oanpak foar glycome-analyze waard validearre troch MALDI-TOF-MS en GC-MS basearre analyze fan komplementêre oligosaccharide-ferbiningen mei trimethylsilyl (TMS) derivatisaasje fan hydrolysearre sûkerkomposysjes. Dizze ynnovative oanpak kin yn 'e takomst ûntwikkele wurde as in hege-trochputmetoade en bredere tapassing fine yn biomedysk ûndersyk35.
Post-translasjonele modifikaasjes fan enzymen en antistoffen, lykas glycosylaasje,36 beynfloedzje har biologyske aktiviteit. Bygelyks, feroarings yn glycosylaasje fan serumproteinen spylje in wichtige rol by inflammatoire artritis, en feroarings yn glycosylaasje wurde brûkt as diagnostyske markers37. Ferskate glykanen binne yn 'e literatuer rapportearre om maklik te ferskinen yn in ferskaat oan sykten, ynklusyf groanyske inflammatoire sykten fan it gastrointestinale traktaat en lever, firale ynfeksjes, eierstok-, boarst- en prostaatkanker38,39,40. It begripen fan 'e struktuer fan glykanen mei help fan op antistoffen basearre glykan ELISA-metoaden sil ekstra fertrouwen jaan yn syktediagnoaze sûnder it gebrûk fan komplekse MS-metoaden.
Us eardere stúdzje liet sjen dat koppige oligosachariden net hydrolysearre bleaunen nei foarbehanneling en enzymatyske hydrolyse (figuer 1). Yn ús earder publisearre wurk hawwe wy in metoade foar ekstraksje fan fêste-faze mei aktivearre koalstof ûntwikkele om oligosachariden te isolearjen út AFEX-foarbehannele maisstoverhydrolysaat (ACSH)8. Nei de earste ekstraksje en skieding waarden de oligosachariden fierder fraksjonearre troch grutte-útslutingschromatografy (SEC) en sammele yn folchoarder fan molekulêr gewicht. Sûkermonomeren en oligomeren dy't frijkamen út ferskate foarbehannelingen waarden analysearre troch sûkerkomposysje-analyze. By it fergelykjen fan it gehalte oan sûkeroligomeren dy't krigen binne troch ferskate foarbehannelingsmetoaden, is de oanwêzigens fan koppige oligosachariden in faak probleem by de konverzje fan biomassa nei monosachariden en kin liede ta in fermindering fan sûkeropbringst fan teminsten 10-15% en sels oant 18%. Dizze metoade wurdt brûkt foar fierdere grutskalige produksje fan oligosacharidfraksjes. De resultearjende ACH en de folgjende fraksjes mei ferskillende molekulêre gewichten waarden brûkt as eksperiminteel materiaal foar de karakterisaasje fan oligosachariden yn dit wurk.
Nei foarbehanneling en enzymatyske hydrolyse bleaune oanhâldende oligosachariden net hydrolysearre. Hjir (A) is in oligosacharid-skiedingsmetoade wêrby't oligosachariden isolearre wurde út AFEX-foarbehannele maisstoverhydrolysaat (ACSH) mei in ynpakt bêd fan aktivearre koalstof en diatomeeënaarde; (B) Metoade foar skieding fan oligosachariden. De oligosachariden waarden fierder skieden troch grutte-útslutingschromatografy (SEC); (C) Saccharidemonomeren en oligomeren frijlitten út ferskate foarbehannelingen (ferdund soer: DA, ionyske floeistof: IL en AFEX). Enzymatyske hydrolysebetingsten: hege fêste stoflading fan 25% (w/w) (sawat 8% glukaanlading), 96 oeren hydrolyse, 20 mg/g kommersjele enzymlading (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 ferhâlding) en (D) Sûkermonomeren en oligomeren fan glukoaze, xylose en arabinose frijlitten út AFEX-foarbehannele maisstover (ACS).
Glykaananalyse hat bliken dien in nuttich ark te wêzen foar in wiidweidige strukturele analyze fan glykanen yn ekstrakten isolearre út fêste biomassaresiduen. Wetteroplosbere sacchariden wurde lykwols ûnderfertsjintwurdige mei dizze tradisjonele metoade41, om't oligosacchariden mei leech molekulêr gewicht lestich te immobilisearjen binne op ELISA-platen en útwosken wurde foar it tafoegjen fan antistoffen. Dêrom waard foar antistofbinding en karakterisaasje in ienstapsbiotinylaasjemetoade brûkt om oplosbere, net-konforme oligosacchariden te beklaaien op avidine-coated ELISA-platen. Dizze metoade waard test mei ús earder produsearre ACSH en in fraksje basearre op syn molekulêr gewicht (of polymerisaasjegraad, DP). Ienstapsbiotinylaasje waard brûkt om de oligosaccharide-biningsaffiniteit te ferheegjen troch biotine-LC-hydrazide ta te foegjen oan it redusearjende ein fan it koalhydraat (Fig. 2). Yn oplossing reagearret de hemiacetaalgroep oan it redusearjende ein mei de hydrazidegroep fan biotine-LC-hydrazide om in hydrazonebining te foarmjen. Yn oanwêzigens fan it redusearjende middel NaCNBH3 wurdt de hydrazonebining redusearre ta in stabyl biotinylearre einprodukt. Mei de modifikaasje fan it sûkerredusearjende ein waard it binen fan lege DP-oligosacchariden oan ELISA-platen mooglik, en yn ús stúdzje waard dit dien op avidine-coated platen mei gebrûk fan glykaan-rjochte mAbs.
Screening fan monoklonale antistoffen basearre op ELISA foar biotinylearre oligosachariden. Hjir (A) kombinearre biotinylaasje fan oligosachariden en folgjende ELISA-screening mei glykaan-rjochte mAbs op NeutrAvidin-coated platen en (B) toant in ienstapproseduere foar biotinylaasje fan reaksjeprodukten.
Avidine-bedekte platen mei oligosacharide-konjugearre antistoffen waarden doe tafoege oan primêre en sekundêre antistoffen en wosken yn in ljocht- en tiidgefoelich medium. Nei't de antistofbinding foltôge is, foegje TMB-substraat ta om de plaat te ynkubearjen. De reaksje waard úteinlik stoppe mei swevelsoer. De ynkubearre platen waarden analysearre mei in ELISA-lêzer om de bindingssterkte fan elk antistof te bepalen om antistofspesifike crosslinking te detektearjen. Foar details en parameters fan it eksperimint, sjoch de oerienkommende seksje "Materialen en Metoaden".
Wy demonstrearje it nut fan dizze nij ûntwikkele metoade foar spesifike tapassingen troch it karakterisearjen fan 'e oplosbere oligosacchariden dy't oanwêzich binne yn ACSH, lykas yn rûge en suvere oligosaccharidefraksjes isolearre út lignocellulose hydrolysaten. Lykas te sjen is yn figuer 3, binne de meast foarkommende epitoop-substituearre xylanen dy't identifisearre binne yn ACSH mei bioasylearre glycome-assaymetoaden meastentiids uronyske (U) of metyluronyske (MeU) en pektine arabinogalaktanen. De measten fan harren waarden ek fûn yn ús eardere stúdzje oer de analyze fan glykanen fan net-hydrolysearre fêste stoffen (UHS)43.
Deteksje fan recalcitrante oligosaccharide-epitopen mei in monoklonaal antistof rjochte op 'e selwandglykaan. De "neutrale" fraksje is de ACN-fraksje en de "soere" fraksje is de FA-fraksje. Helderder read op 'e waarmtekaart jouwe in hegere epitopynhâld oan, en helderder blau jout in lege eftergrûn oan. Kleurwearden op 'e skaal binne basearre op rûge OD-wearden foar formulearringen N=2. De wichtichste epitopen dy't troch de antistoffen werkenne wurde oan 'e rjochterkant werjûn.
Dizze net-cellulosestrukturen koenen net spjalte wurde troch de meast foarkommende cellulasen en hemicellulasen yn it testte kommersjele enzymemingsel, dat de meast brûkte kommersjele enzymen omfettet. Dêrom binne nije helpenzymen nedich foar har hydrolyse. Sûnder de nedige net-cellulose helpenzymen foarkomme dizze net-cellulosebannen folsleine konverzje nei monosachariden, sels as har âlderlike sûkerpolymeren wiidweidich hydrolysearre wurde yn koartere fragminten en oplost wurde mei kommersjele enzymemingsels.
Fierder ûndersyk nei sinjaalferdieling en syn bindingssterkte liet sjen dat bindingsepitopen leger wiene yn sûkerfraksjes mei hege DP (A, B, C, DP oant 20+) as yn fraksjes mei lege DP (D, E, F, DP) yn dimeren) (Fig. 1). Soere fragminten komme faker foar yn net-cellulose-epitopen as yn neutrale fragminten. Dizze ferskynsels binne yn oerienstimming mei it patroan dat waarnommen is yn ús eardere stúdzje, wêrby't hege DP- en soere dielen mear resistint wiene foar enzymatyske hydrolyse. Dêrom kin de oanwêzigens fan net-cellulose-glykaanepitopen en U- en MeU-substituasjes sterk bydrage oan 'e stabiliteit fan' e oligosacchariden. It moat opmurken wurde dat bindings- en deteksje-effisjinsje problematysk kin wêze foar oligosacchariden mei lege DP, foaral as it epitoop in dimer of trimer oligosaccharide is. Dit kin wurde hifke mei kommersjele oligosacchariden fan ferskate lingten, elk mei mar ien epitoop dy't bindt oan in spesifyk mAb.
Sa die bliken út it gebrûk fan struktuerspesifike antistoffen bepaalde soarten recalcitrante biningen. Ofhinklik fan it type antistof dat brûkt wurdt, it passende ligaasjepatroan, en de sterkte fan it sinjaal dat it produseart (meast en minst oerfloedich), kinne nije enzymen identifisearre en semi-kwantitatyf tafoege wurde oan it enzymemingsel foar in folsleinere glykokonverzje. Mei de analyze fan ACSH-oligosacchariden as foarbyld kinne wy ​​in database fan glykaanbiningen oanmeitsje foar elk biomassamateriaal. Hjir moat opmurken wurde dat de ferskillende affiniteit fan antistoffen yn rekken brocht wurde moat, en as har affiniteit ûnbekend is, sil dit bepaalde swierrichheden feroarsaakje by it fergelykjen fan de sinjalen fan ferskate antistoffen. Derneist kin fergeliking fan glykaanbiningen it bêste wurkje tusken samples foar itselde antistof. Dizze koppige biningen kinne dan keppele wurde oan de CAZyme-database, wêrfan wy enzymen kinne identifisearje, kandidaat-enzymen selektearje en testen op bânbrekkende enzymen, of mikrobiële systemen ûntwikkelje om dizze enzymen út te drukken foar gebrûk yn bioraffinaazjes44.
Om te evaluearjen hoe't immunologyske metoaden alternative metoaden oanfolje foar it karakterisearjen fan oligosacchariden mei leech molekulêr gewicht oanwêzich yn lignocellulose hydrolysaten, hawwe wy MALDI (Fig. 4, S1-S8) en analyze fan TMS-ôflaatte sacchariden basearre op GC-MS útfierd op itselde paniel (Fig. 5) oligosaccharide-diel. MALDI wurdt brûkt om te fergelykjen oft de massaferdieling fan oligosaccharide-molekulen oerienkomt mei de bedoelde struktuer. Op fig. 4 wurdt MS fan 'e neutrale komponinten ACN-A en ACN-B toand. ACN-A-analyze befêstige in berik fan pentose-suikers fariearjend fan DP 4-8 (Fig. 4) oant DP 22 (Fig. S1), wêrfan de gewichten oerienkomme mei MeU-xylaan-oligosacchariden. ACN-B-analyze befêstige de pentose- en glukoxylaan-searje mei DP 8-15. Yn oanfoljend materiaal lykas figuer S3 litte FA-C-soere groepsmassaferdielingskaarten in berik fan (Me)U-substituearre pentose-suikers sjen mei in DP fan 8-15 dy't oerienkomme mei de substituearre xylanen dy't fûn binne yn ELISA-basearre mAb-screening. De epitopen binne konsekwint.
MALDI-MS-spektrum fan oplosbere net-konforme oligosacchariden oanwêzich yn ACS. Hjir, (A) ACN-A leechgewichtsfraksjes mei methylearre uronsoer (DP 4-8) substituearre glucuroxylaan-oligosacchariden en (B) ACN-B xylaan en methylearre uronsoer-oligosacchariden substituearre mei glucuroxylaan (DP 8-15).
Analyse fan 'e gearstalling fan it glykaanresidu fan refraktêre oligosachariden. Hjir (A) TMS-sacharidgearstalling fan ferskate oligosacharidfraksjes krigen mei GC-MS-analyze. (B) Strukturen fan ferskate TMS-ôflaatte sûkers oanwêzich yn oligosachariden. ACN - acetonitrilfraksje mei neutrale oligosachariden en FA - ferulinezuurfraksje mei soere oligosachariden.
In oare nijsgjirrige konklúzje waard lutsen út 'e LC-MS-analyze fan 'e oligosacharidefraksje, lykas te sjen is yn figuer S9 (metoaden binne te sjen yn it elektroanyske oanfoljende materiaal). Fragminten fan hexose- en -OAc-groepen waarden ferskate kearen waarnommen tidens ligaasje fan 'e ACN-B-fraksje. Dizze fynst befêstiget net allinich de fragmintaasje dy't waarnommen is yn glycome- en MALDI-TOF-analyze, mar leveret ek nije ynformaasje oer potinsjele koalhydraatderivaten yn foarbehannele lignocellulose-biomassa.
Wy hawwe ek in glykaan-gearstallingsanalyse útfierd fan oligosacharidfraksjes mei TMS-glykaanderivatisaasje. Mei GC-MS hawwe wy de gearstalling fan neurale (net-derivative) en soere sûkers (GluA en GalA) yn 'e oligosacharidfraksje bepaald (Fig. 5). Glucuronzuur wurdt fûn yn soere komponinten C en D, wylst galakturonzuur wurdt fûn yn soere komponinten A en B, dy't beide hege DP-komponinten fan soere sûkers binne. Dizze resultaten befêstigje net allinich ús ELISA- en MALDI-gegevens, mar binne ek yn oerienstimming mei ús eardere stúdzjes fan oligosacharid-akkumulaasje. Dêrom leauwe wy dat moderne immunologyske metoaden mei biotinylaasje fan oligosachariden en neifolgjende ELISA-screening genôch binne om oplosbere recalcitrante oligosachariden yn ferskate biologyske samples te detektearjen.
Omdat ELISA-basearre mAb-screeningmetoaden troch ferskate metoaden validearre binne, woenen wy it potinsjeel fan dizze nije kwantitative metoade fierder ûndersykje. Twa kommersjele oligosacchariden, xylohexasaccharide-oligosaccharide (XHE) en 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX), waarden oankocht en testen mei in nije mAb-oanpak rjochte op it selwandglykaan. Figuer 6 lit in lineêre korrelaasje sjen tusken it biotinylearre biningssignaal en de logaritmyske konsintraasje fan oligosaccharide-konsintraasje, wat suggerearret dat it in mooglik Langmuir-adsorpsjemodel is. Under de mAbs korrelearren CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148, en CCRC-M151 mei XHE, en CCRC-M108, CCRC-M109, en LM11 mei A2XX oer in berik fan 1 nm oant 100 nano. Fanwegen de beheinde beskikberens fan antistoffen tidens it eksperimint, waarden beheinde eksperiminten útfierd mei elke oligosaccharide-konsintraasje. It moat hjir opmurken wurde dat guon antistoffen hiel oars reagearje op itselde oligosacharide as substraat, wierskynlik om't se bine oan wat ferskillende epitopen en hiel ferskillende bindingsaffiniteiten hawwe kinne. De meganismen en ymplikaasjes fan krekte epitopidentifikaasje sille folle komplekser wêze as de nije mAb-oanpak tapast wurdt op echte samples.
Twa kommersjele oligosachariden waarden brûkt om it deteksjeberik fan ferskate glykaan-rjochte mAbs te bepalen. Hjir jouwe lineêre korrelaasjes mei log-konsintraasje fan oligosacharidkonsintraasje Langmuir-adsorpsjepatroanen oan foar (A) XHE mei mAb en (B) A2XX mei mAb. De oerienkommende epitopen jouwe de struktueren oan fan 'e kommersjele oligosachariden dy't as substraten yn 'e assay brûkt wurde.
It brûken fan glykaan-rjochte monoklonale antistoffen (glykokomyske analyze of ELISA-basearre mAb-screening) is in krêftich ark foar yngeande karakterisaasje fan 'e measte wichtige selwandglykanen dy't plantbiomassa foarmje. Klassike glykaananalyze karakterisearret lykwols allinich gruttere selwandglykanen, om't de measte oligosachariden net effisjint immobilisearre wurde op ELISA-platen. Yn dizze stúdzje waard AFEX-foarbehannele maisstôk enzymatysk hydrolysearre by in heech fêste stoffengehalte. Sûkeranalyze waard brûkt om de gearstalling fan recalcitrante selwandkoalhydraten yn it hydrolysaat te bepalen. mAb-analyze fan lytsere oligosachariden yn hydrolysaten wurdt lykwols ûnderskat, en ekstra ark binne nedich om oligosachariden effektyf te immobilisearjen op ELISA-platen.
Wy rapportearje hjir in nije en effisjinte oligosaccharide-immobilisaasjemetoade foar mAb-screening troch it kombinearjen fan oligosaccharide-biotinylaasje folge troch ELISA-screening op NeutrAvidin™-coated platen. De immobilisearre biotinylearre oligosacchariden lieten foldwaande affiniteit foar it antistof sjen om rappe en effisjinte deteksje fan recalcitrante oligosacchariden mooglik te meitsjen. Analyse fan 'e gearstalling fan dizze koppige oligosacchariden basearre op massaspektrometry befêstige de resultaten fan dizze nije oanpak foar immunoscreening. Sa litte dizze stúdzjes sjen dat de kombinaasje fan oligosaccharide-biotinylaasje en ELISA-screening mei glykaan-rjochte monoklonale antistoffen brûkt wurde kin om crosslinks yn oligosacchariden te detektearjen en breed tapast wurde kin yn oare biogemyske stúdzjes dy't de struktuer fan oligosacchariden karakterisearje.
Dizze op biotine basearre glykaanprofylmetoade is it earste rapport dat de recalcitrante koalhydraatbiningen fan oplosbere oligosachariden yn plantbiomassa kin ûndersykje. Dit helpt te begripen wêrom't guon dielen fan biomassa sa koppich binne as it giet om de produksje fan biobrânstof. Dizze metoade follet in wichtige gat yn glykomanalysemetoaden en wreidet de tapassing út nei in breder skala oan substraten bûten plantoligosachariden. Yn 'e takomst kinne wy ​​robotika brûke foar biotinylaasje en de metoade brûke dy't wy ûntwikkele hawwe foar hege-trochputanalyse fan samples mei ELISA.
Maisstrie (CS) groeid út Pioneer 33A14 hybride siedden waard yn 2010 rispe fan Kramer Farms yn Ray, Kolorado. Mei tastimming fan 'e lâneigner kin dizze biomassa brûkt wurde foar ûndersyk. De samples waarden droech < 6% focht opslein yn ziplock-tassen by keamertemperatuer. De samples waarden droech < 6% focht opslein yn ziplock-tassen by keamertemperatuer. Ûntwikkelje sûchjes mei belestingen < 6% yn belestingen mei sûch-molnyske gearkomsten. Monsters waarden droech opslein by <6% fochtigens yn sekken mei ritssluiting by keamertemperatuer.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Ôfhinklik fan 'e belestingen mei in fermogen fan < 6%. Monsters wurde opslein yn ritssekjes by keamertemperatuer mei in fochtigens fan < 6%.De stúdzje foldie oan lokale en nasjonale rjochtlinen. Gearstallingsanalyse waard útfierd mei it NREL-protokol. De gearstalling befette 31,4% glukaan, 18,7% xylaan, 3,3% arabinan, 1,2% galaktan, 2,2% acetyl, 14,3% lignine, 1,7% proteïne en 13,4% jiske.
Cellic® CTec2 (138 mg proteïne/ml, lot VCNI 0001) is in kompleks mingsel fan cellulase, β-glukosidase en Cellic® HTec2 (157 mg proteïne/ml, lot VHN00001) fan Novozymes (Franklinton, NC, Feriene Steaten)). Multifect Pectinase® (72 mg proteïne/mL), in kompleks mingsel fan pektine-ôfbrekkende enzymen, waard skonken troch DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, Feriene Steaten). Enzymproteïne-konsintraasjes waarden bepaald troch it skatten fan it proteïnegehalte (en it ôflûken fan de bydrage fan net-proteïnestikstof) mei help fan Kjeldahl-stikstofanalyse (AOAC-metoade 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, Feriene Steaten). Diatomeeënaarde 545 waard kocht fan EMD Millipore (Billerica, MA). Aktivearre koalstof (DARCO, 100 mesh korrels), Avicel (PH-101), beukenxylaan, en alle oare gemikaliën waarden kocht fan Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
AFEX-foarbehanneling waard útfierd by GLBRC (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, Feriene Steaten). De foarbehanneling waard útfierd by 140 °C foar 15 minuten. 46 ferbliuwstiid by in 1:1 ferhâlding fan wetterfrije ammoniak ta biomassa mei 60% (w/w) lading yn in roestfrij stielen benchtop batchreaktor (Parr Instruments Company). It duorre 30 minuten. De reaktor waard op 140 °C brocht en de ammoniak waard rap frijlitten, wêrtroch't de biomassa fluch werom koe nei keamertemperatuer. De gearstalling fan AFEX-foarbehannele maisstrov (ACS) wie fergelykber mei dy fan ûnbehannele maisstrov (UT-CS).
ACSH mei hege fêste stoffen 25% (w/w) (sawat 8% dekstraanlading) waard taret as útgongsmateriaal foar grutskalige produksje fan oligosachariden. Enzymatyske hydrolyse fan ACS waard útfierd mei in kommersjeel enzymemingsel ynklusyf Cellic® Ctec2 10 mg proteïne/g glukaan (yn foarbehannele biomassa), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg proteïne/g glukaan, en Multifect Pectinase (Genencor Inc, Feriene Steaten). ), 5 mg proteïne/g dekstraan. Enzymatyske hydrolyse waard útfierd yn in 5-liter bioreaktor mei in wurkfolume fan 3 liter, pH 4,8, 50 °C en 250 rpm. Nei hydrolyse foar 96 oeren waard it hydrolysaat sammele troch sintrifugaasje by 6000 rpm foar 30 minuten en dan by 14000 rpm foar 30 minuten om net-hydrolysearre fêste stoffen te ferwiderjen. It hydrolysaat waard doe sterile filtraasje ûnderwurpen troch in filterbeker fan 0,22 mm. It filtere hydrolysaat waard opslein yn sterile flessen by 4 °C en doe fraksjonearre op koalstof.
Analyse fan 'e gearstalling fan biomassamonsters op basis fan ekstrakt neffens NREL-laboratoariumanalyseprosedueres: tarieding fan monsters foar gearstallingsanalyse (NREL/TP-510-42620) en bepaling fan strukturele koalhydraten en lignine yn biomassa (NREL/TP-510 – 42618)47.
Oligosacharidanalyse fan 'e hydrolysaatstream waard útfierd op in skaal fan 2 ml mei in autoklaaf-basearre soere hydrolysemetoade. Ming it hydrolysaatmonster mei 69,7 µl 72% swevelsoer yn in kultuerbuis mei in skroefdop fan 10 ml en ynkubearje 1 oere op in wurktafel by 121 °C, koelje op iis en filterje yn in fleske mei hege prestaasjes floeistofchromatografy (HPLC). De konsintraasje fan oligosachariden waard bepaald troch de konsintraasje fan monosachariden yn it net-hydrolysearre monster ôf te lûken fan 'e totale sûkerkonsintraasje yn it soere-hydrolysearre monster.
Glukoaze-, xylose- en arabinose-konsintraasjes yn 'e soere hydrolysearre biomassa waarden analysearre mei in Shimadzu HPLC-systeem foarsjoen fan in autosampler, kolomferwaarmer, isokratyske pomp en brekingsyndeksdetektor op in Bio-Rad Aminex HPX-87H-kolom. De kolom waard op 50 °C hâlden en eluearre mei 0,6 ml/min 5 mM H2SO4 yn wetterstream.
De hydrolysaatsupernatant waard ferdund en analysearre op monomeer- en oligosacharidynhâld. Monomere sûkers dy't krigen waarden nei enzymatyske hydrolyse waarden analysearre troch HPLC foarsjoen fan in Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P-kolom en in jiskebeskermingskolom. De kolomtemperatuer waard op 80 °C hâlden, wetter waard brûkt as de mobile faze mei in streamsnelheid fan 0,6 ml/min. Oligosachariden waarden bepaald troch hydrolyse yn ferdund soer by 121 °C neffens de metoaden beskreaun yn refs. 41, 48, 49.
Saccharide-analyze waard útfierd op rau, AFEX-foarbehannele en alle net-hydrolysearre biomassaresiduen (ynklusyf produksje fan seriële selwandekstrakten en har mAb-screening) mei help fan earder beskreaune prosedueres 27, 43, 50, 51. Foar glycome-analyze wurde alkohol-ûnoplosbere residuen fan plantselwandmateriaal taret út biomassaresiduen en ûnderwurpen oan seriële ekstraksje mei hieltyd agressiver reagentia lykas ammoniumoksalaat (50 mM), natriumkarbonaat (50 mM en 0,5% w/v), CON. (1M en 4M, beide mei 1% w/v natriumborohydride) en soerchlorit lykas earder beskreaun 52,53. De ekstrakten waarden doe ûnderwurpen oan ELISA tsjin in kompleks paniel fan mAb50's rjochte op 'e selwandglykaan, en de mAb-binende reaksjes waarden presintearre as in waarmtekaart. mAbs dy't rjochte wiene op plantselwandglykaan waarden kocht fan laboratoariumfoarrieden (CCRC-, JIM- en MAC-searjes).
Ien-stap biotinylaasje fan oligosachariden. De konjugaasje fan koalhydraten mei biotine-LC-hydrazide waard útfierd mei de folgjende proseduere. Biotine-LC-hydrazide (4,6 mg/12 μmol) waard oplost yn dimethylsulfoksyde (DMSO, 70 μl) troch krêftich roeren en ferwaarmjen by 65 °C foar 1 minút. Glaciale jittik (30 μl) waard tafoege en it mingsel waard getten op natriumcyanoborohydride (6,4 mg/100 µmol) en folslein oplost nei ferwaarmjen by 65 °C foar sawat 1 minút. Dêrnei waard 5 oant 8 μl fan it reaksjemingsel tafoege oan it droege oligosacharid (1-100 nmol) om in 10-fâldige of mear molêre oerskot fan it label te krijen oer it redusearjende ein. De reaksje waard útfierd by 65 °C foar 2 oeren, wêrnei't de samples fuortendaliks suvere waarden. Gjin natriumcyanoborohydride waard brûkt yn 'e labelingseksperiminten sûnder reduksje, en de samples waarden 2,5 oeren by 65 °C reagearre.
ELISA-coating en waskjen fan samples fan biotinylearre oligosachariden. 25 μl biotinylearre samples (100 μl fan elk konsintrearre sample ferdund yn 5 ml fan 0,1 M Tris-bufferoplossing (TBS)) waarden tafoege oan elk putsje fan 'e avidine-coated plaat. Kontrôleputjes waarden coated mei 50 μl biotine yn in konsintraasje fan 10 μg/ml yn 0,1 M TBS. Deionisearre wetter waard brûkt as in coating foar blanco-mjittingen. De tablet waard 2 oeren by keamertemperatuer yn it tsjuster ynkubearre. Waskje de plaat 3 kear mei 0,1% skimme molke yn 0,1 M TBS mei programma nr. 11 foar Grenier flat 3A.
Tafoegjen en waskjen fan primêre antistoffen. Foegje 40 µl primêre antistof ta oan elke putsje. Ynkubearje de mikroplaat 1 oere by keamertemperatuer yn it tsjuster. De platen waarden doe 3 kear wosken mei 0,1% molke yn 0,1M TBS mei waskprogramma #11 foar Grenier Flat 3A.
Foegje sekundêr antistof ta en waskje. Foegje 50 µl mûs/rat sekundêr antistof (ferdun 1:5000 yn 0,1% molke yn 0,1 M TBS) ta oan elke putsje. Ynkubearje de mikroplaat 1 oere by keamertemperatuer yn it tsjuster. De mikroplaten waarden doe 5 kear wosken mei 0,1% molke yn 0,1 M TBS mei Grenier Flat 5A plaatwasprogramma #12.
In substraat tafoegje. Foegje 50 µl 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) ta oan it basissubstraat (troch 2 drippen buffer, 3 drippen TMB, 2 drippen wetterstofperokside ta te foegjen oan 15 ml deionisearre wetter). Tariede it TMB-substraat en vortex foar gebrûk). Ynkubearje de mikroplaat by keamertemperatuer foar 30 minuten. Yn it tsjuster.
Foltôgje de stap en lês de tablet ôf. Foegje 50 µl fan 1 N swevelsoer ta oan elke putsje en registrearje de absorbânsje fan 450 oant 655 nm mei in ELISA-lêzer.
Meitsje 1 mg/ml oplossingen fan dizze analyten yn deionisearre wetter: arabinose, rhamnose, fucose, xylose, galakturonzuur (GalA), glucuronzuur (GlcA), mannose, glukose, galaktose, laktose, N-acetylmannosamine (manNAc), N-acetylglucosamine (glcNAc), N-acetylgalactosamine (galNAc), inositol (ynterne standert). Twa standerts waarden taret troch it tafoegjen fan de 1 mg/ml sûkeroplossingen dy't werjûn binne yn tabel 1. De samples wurde beferzen en lyofilisearre by -80°C oant al it wetter fuorthelle is (meastal sawat 12-18 oeren).
Foegje 100–500 µg fan it stekproef ta oan skroefdopbuizen op in analytyske weegskaal. Registrearje de tafoege hoemannichte. It is it bêste om it stekproef op te lossen yn in spesifike konsintraasje oplosmiddel en it as in floeibere aliquot oan 'e buis ta te foegjen. Brûk 20 µl fan 1 mg/ml inositol as in ynterne standert foar elke stekproefbuis. De hoemannichte ynterne standert dy't oan it stekproef tafoege wurdt, moat itselde wêze as de hoemannichte ynterne standert dy't oan 'e standertbuis tafoege is.
Foegje 8 ml wetterfrije methanol ta oan in fleske mei skroefdop. Dan 4 ml fan in 3 N methanolyske HCl-oplossing, slute de dop ôf en skodzje. Dit proses brûkt gjin wetter.
Foegje 500 µl fan in 1 M HCl-metanoloplossing ta oan de oligosacharide-monsters en standert TMS-buizen. De monsters waarden oernachtich (168 oeren) by 80 °C ynkubearre yn in termysk blok. Droegje it metanolyzeprodukt by keamertemperatuer mei in droechmanifold. Foegje 200 µl MeOH ta en droegje opnij. Dit proses wurdt twa kear werhelle. Foegje 200 µl metanol, 100 µl pyridine en 100 µl azijnzuuranhydride ta oan it monster en ming goed. Ynkubearje de monsters 30 minuten by keamertemperatuer en droegje se. Foegje 200 µl metanol ta en droegje opnij.
Foegje 200 µl Tri-Sil ta en ferwaarmje de ôfsluten buis 20 minuten. 80 °C, en koelje dan ôf nei keamertemperatuer. Brûk in droechmanifold om it stekproef fierder te droegjen oant in folume fan sawat 50 µl. It is wichtich om te notearjen dat wy de stekproeven net folslein droegje litten hawwe.
Foegje 2 ml heksaan ta en mingje goed troch te vortexen. Folje de punten fan Pasteur-pipetten (5-8 mm) mei in stik glêswol troch de glêswol boppe op in pipette mei in diameter fan 5-3/4 inch te setten. De samples waarden 2 minuten sintrifugearre by 3000 g. Alle ûnoplosbere resten wurde delslach. Droege it sample oant 100-150 µl. In folume fan sawat 1 μl waard yn 'e GC-MS ynjektearre by in begjintemperatuer fan 80 °C en in begjintiid fan 2,0 minuten (Tabel 2).