Um novo e revolucionário misturador estático em linha foi desenvolvido especificamente para atender aos rigorosos requisitos de sistemas de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e cromatografia líquida de ultra-alta eficiência (UHPLC). A mistura inadequada de duas ou mais fases móveis pode resultar em uma relação sinal-ruído mais alta, o que reduz a sensibilidade. A mistura estática homogênea de dois ou mais fluidos, com volume interno e dimensões físicas mínimas, representa o padrão ideal para um misturador estático. O novo misturador estático atinge esse objetivo utilizando uma nova tecnologia de impressão 3D para criar uma estrutura 3D exclusiva que proporciona uma mistura estática hidrodinâmica aprimorada, com a maior redução percentual na onda senoidal básica por unidade de volume interno da mistura. Utilizando 1/3 do volume interno de um misturador convencional, a onda senoidal básica é reduzida em 98%. O misturador consiste em canais de fluxo 3D interconectados com áreas de seção transversal e comprimentos de percurso variáveis, à medida que o fluido atravessa geometrias 3D complexas. A mistura ao longo de múltiplos caminhos de fluxo tortuosos, combinada com turbulência e vórtices locais, resulta em mistura nas escalas micro, meso e macro. Este misturador exclusivo foi projetado utilizando simulações de dinâmica de fluidos computacional (CFD). Os dados dos testes apresentados mostram que uma excelente mistura é alcançada com um volume interno mínimo.
Há mais de 30 anos, a cromatografia líquida é utilizada em diversos setores, incluindo o farmacêutico, o de pesticidas, o de proteção ambiental, o forense e o de análises químicas. A capacidade de medir concentrações em partes por milhão ou menos é crucial para o desenvolvimento tecnológico em qualquer indústria. Uma mistura deficiente resulta em uma baixa relação sinal-ruído, o que representa um problema para a comunidade cromatográfica em termos de limites de detecção e sensibilidade. Ao misturar dois solventes de HPLC, às vezes é necessário forçar a mistura por meios externos para homogeneizá-los, pois alguns solventes não se misturam bem. Se os solventes não forem misturados completamente, pode ocorrer degradação do cromatograma de HPLC, manifestando-se como ruído de linha de base excessivo e/ou formato de pico inadequado. Com uma mistura deficiente, o ruído de linha de base aparecerá como uma onda senoidal (ascendente e descendente) do sinal do detector ao longo do tempo. Ao mesmo tempo, uma mistura deficiente pode levar ao alargamento e à assimetria dos picos, reduzindo o desempenho analítico, o formato e a resolução dos picos. A indústria reconheceu que os misturadores estáticos em linha e em T são uma forma de melhorar esses limites e permitir que os usuários alcancem limites de detecção (sensibilidades) mais baixos. O misturador estático ideal combina os benefícios de alta eficiência de mistura, baixo volume morto e baixa queda de pressão com volume mínimo e máxima produtividade do sistema. Além disso, à medida que as análises se tornam mais complexas, os analistas precisam usar rotineiramente solventes mais polares e de difícil mistura. Isso significa que uma melhor mistura é essencial para os testes futuros, aumentando ainda mais a necessidade de um projeto e desempenho superiores dos misturadores.
A Mott desenvolveu recentemente uma nova linha de misturadores estáticos em linha PerfectPeak™ patenteados, com três volumes internos: 30 µl, 60 µl e 90 µl. Esses tamanhos abrangem a gama de volumes e características de mistura necessárias para a maioria dos testes de HPLC, onde são exigidas melhor mistura e baixa dispersão. Todos os três modelos têm 0,5 polegadas de diâmetro e oferecem desempenho líder do setor em um design compacto. São fabricados em aço inoxidável 316L, passivado para inércia, mas também estão disponíveis em titânio e outras ligas metálicas resistentes à corrosão e quimicamente inertes. Esses misturadores têm uma pressão máxima de operação de até 20.000 psi. A figura 1a mostra uma fotografia de um misturador estático Mott de 60 µl, projetado para fornecer máxima eficiência de mistura, utilizando um volume interno menor do que os misturadores padrão desse tipo. Este novo design de misturador estático utiliza uma nova tecnologia de fabricação aditiva para criar uma estrutura 3D exclusiva que utiliza menos fluxo interno do que qualquer misturador atualmente usado na indústria de cromatografia para obter mistura estática. Esses misturadores consistem em canais de fluxo tridimensionais interconectados com diferentes áreas de seção transversal e comprimentos de percurso, à medida que o líquido atravessa barreiras geométricas complexas em seu interior. A Figura 1b mostra um diagrama esquemático do novo misturador, que utiliza conexões de compressão HPLC rosqueadas 10-32 padrão da indústria para entrada e saída, e possui bordas sombreadas em azul da porta interna patenteada do misturador. Diferentes áreas de seção transversal dos caminhos de fluxo internos e mudanças na direção do fluxo dentro do volume interno criam regiões de fluxo turbulento e laminar, causando mistura em escalas micro, meso e macro. O projeto deste misturador exclusivo utilizou simulações de dinâmica de fluidos computacional (CFD) para analisar os padrões de fluxo e refinar o projeto antes da prototipagem para testes analíticos internos e avaliação em campo pelo cliente. A manufatura aditiva é o processo de impressão de componentes geométricos 3D diretamente a partir de desenhos CAD, sem a necessidade de usinagem tradicional (fresadoras, tornos, etc.). Esses novos misturadores estáticos são projetados para serem fabricados utilizando esse processo, no qual o corpo do misturador é criado a partir de desenhos CAD e as peças são fabricadas (impressas) camada por camada por meio de manufatura aditiva. Nesse processo, uma camada de pó metálico com cerca de 20 mícrons de espessura é depositada, e um laser controlado por computador funde e sinteriza seletivamente o pó, transformando-o em uma forma sólida. Outra camada é aplicada sobre essa camada e submetida à sinterização a laser. Esse processo é repetido até que a peça esteja completamente finalizada. O pó é então removido da parte não unida a laser, resultando em uma peça impressa em 3D que corresponde ao desenho CAD original. O produto final é semelhante ao processo microfluídico, com a principal diferença sendo que os componentes microfluídicos são geralmente bidimensionais (planos), enquanto, utilizando a manufatura aditiva, padrões de fluxo complexos podem ser criados em geometria tridimensional. Essas torneiras estão atualmente disponíveis como peças impressas em 3D em aço inoxidável 316L e titânio. A maioria das ligas metálicas, polímeros e algumas cerâmicas podem ser utilizadas para fabricar componentes utilizando esse método e serão consideradas em projetos/produtos futuros.
Arroz. 1. Fotografia (a) e diagrama (b) de um misturador estático Mott de 90 μl mostrando uma seção transversal do caminho do fluxo de fluido do misturador sombreado em azul.
Realizar simulações de dinâmica de fluidos computacional (CFD) do desempenho de misturadores estáticos durante a fase de projeto auxilia no desenvolvimento de projetos eficientes e reduz experimentos de tentativa e erro, que consomem muito tempo e recursos. A simulação CFD de misturadores estáticos e tubulações padrão (simulação sem misturador) foi realizada utilizando o software COMSOL Multiphysics. A modelagem foi feita utilizando mecânica de fluidos laminares impulsionada por pressão para compreender a velocidade e a pressão do fluido dentro de uma peça. Essa dinâmica de fluidos, combinada com o transporte químico de compostos da fase móvel, auxilia na compreensão da mistura de dois líquidos concentrados diferentes. O modelo foi estudado em função do tempo, igual a 10 segundos, para facilitar o cálculo na busca por soluções comparáveis. Os dados teóricos foram obtidos em um estudo com correlação temporal utilizando a ferramenta de projeção de sonda pontual, onde um ponto no meio da saída foi escolhido para a coleta de dados. O modelo CFD e os testes experimentais utilizaram dois solventes diferentes através de uma válvula de amostragem proporcional e um sistema de bombeamento, resultando em um plugue de substituição para cada solvente na linha de amostragem. Esses solventes foram então misturados em um misturador estático. As Figuras 2 e 3 mostram simulações de fluxo através de um tubo padrão (sem misturador) e através de um misturador estático Mott, respectivamente. A simulação foi executada em um tubo reto de 5 cm de comprimento e 0,25 mm de diâmetro interno para demonstrar o conceito de alternância de fluxos de água e acetonitrila pura no tubo na ausência de um misturador estático, conforme mostrado na Figura 2. A simulação utilizou as dimensões exatas do tubo e do misturador e uma vazão de 0,3 ml/min.
Arroz. 2. Simulação de fluxo CFD em um tubo de 5 cm com diâmetro interno de 0,25 mm para representar o que acontece em um tubo de HPLC, ou seja, na ausência de um misturador. A cor vermelha representa a fração mássica de água. A cor azul representa a ausência de água, ou seja, acetonitrila pura. Regiões de difusão podem ser observadas entre os tampões alternados dos dois líquidos diferentes.
Arroz. 3. Misturador estático com volume de 30 ml, modelado no software COMSOL CFD. A legenda representa a fração mássica de água no misturador. Água pura é mostrada em vermelho e acetonitrila pura em azul. A variação na fração mássica da água simulada é representada por uma mudança na cor da mistura dos dois líquidos.
A Figura 4 mostra um estudo de validação do modelo de correlação entre a eficiência de mistura e o volume de mistura. À medida que o volume de mistura aumenta, a eficiência de mistura também aumenta. Até onde os autores sabem, outras forças físicas complexas que atuam dentro do misturador não podem ser consideradas neste modelo de CFD, resultando em uma maior eficiência de mistura nos testes experimentais. A eficiência de mistura experimental foi medida como a redução percentual na senoide base. Além disso, o aumento da contrapressão geralmente resulta em níveis de mistura mais elevados, os quais não são considerados na simulação.
As seguintes condições de HPLC e configuração de teste foram utilizadas para medir ondas senoidais brutas e comparar o desempenho relativo de diferentes misturadores estáticos. O diagrama na Figura 5 mostra um esquema típico de um sistema HPLC/UHPLC. O misturador estático foi testado posicionando-o imediatamente após a bomba e antes do injetor e da coluna de separação. A maioria das medições de ondas senoidais de fundo são realizadas desviando o injetor e a coluna capilar entre o misturador estático e o detector UV. Ao avaliar a relação sinal-ruído e/ou analisar o formato do pico, a configuração do sistema é mostrada na Figura 5.
Figura 4. Gráfico da eficiência de mistura versus volume de mistura para uma gama de misturadores estáticos. A impureza teórica segue a mesma tendência dos dados experimentais de impureza, confirmando a validade das simulações de CFD.
O sistema HPLC utilizado neste teste foi um Agilent Série 1100 com detector UV, controlado por um computador com o software Chemstation. A Tabela 1 mostra as condições típicas de ajuste para medir a eficiência do misturador monitorando sinusoides básicas em dois estudos de caso. Os testes experimentais foram realizados com dois exemplos diferentes de solventes. No caso 1, os dois solventes misturados foram o solvente A (acetato de amônio 20 mM em água deionizada) e o solvente B (80% de acetonitrila (ACN)/20% de água deionizada). No caso 2, o solvente A era uma solução de 0,05% de acetona (marcada) em água deionizada. O solvente B era uma mistura de 80% de metanol e 20% de água. No caso 1, a bomba foi ajustada para uma vazão de 0,25 ml/min a 1,0 ml/min e, no caso 2, a bomba foi ajustada para uma vazão constante de 1 ml/min. Em ambos os casos, a proporção da mistura dos solventes A e B foi de 20% A/80% B. O detector foi ajustado para 220 nm no caso 1 e, no caso 2, a absorção máxima da acetona foi ajustada para um comprimento de onda de 265 nm.
Tabela 1. Configurações de HPLC para os Casos 1 e 2 Caso 1 Caso 2 Velocidade da Bomba 0,25 ml/min a 1,0 ml/min 1,0 ml/min Solvente A Acetato de amônio 20 mM em água deionizada Acetona 0,05% em água deionizada Solvente B Acetonitrila (ACN) 80% / água deionizada 20% metanol / água deionizada 80% Proporção de solventes 20% A / 80% B 20% A / 80% B Detector 220 nm 265 nm
Arroz. 6. Gráficos de ondas senoidais mistas medidas antes e depois da aplicação de um filtro passa-baixa para remover os componentes de deriva da linha de base do sinal.
A Figura 6 mostra um exemplo típico de ruído de linha de base misto no Caso 1, apresentado como um padrão sinusoidal repetitivo sobreposto à deriva da linha de base. A deriva da linha de base é um aumento ou diminuição lenta do sinal de fundo. Se o sistema não tiver tempo suficiente para se equilibrar, geralmente ocorrerá uma queda, mas a deriva da linha de base será errática mesmo quando o sistema estiver completamente estável. Essa deriva da linha de base tende a aumentar quando o sistema opera em condições de gradiente acentuado ou alta contrapressão. Quando essa deriva da linha de base está presente, pode ser difícil comparar os resultados entre amostras, o que pode ser contornado aplicando-se um filtro passa-baixa aos dados brutos para filtrar essas variações de baixa frequência, fornecendo assim um gráfico de oscilação com uma linha de base plana. A Figura 6 também mostra um gráfico do ruído de linha de base do misturador após a aplicação de um filtro passa-baixa.
Após a conclusão das simulações de CFD e dos testes experimentais iniciais, três misturadores estáticos distintos foram desenvolvidos utilizando os componentes internos descritos acima, com três volumes internos: 30 µl, 60 µl e 90 µl. Essa faixa abrange o intervalo de volumes e desempenho de mistura necessários para aplicações de HPLC com baixa concentração de analito, onde uma melhor mistura e baixa dispersão são requeridas para produzir linhas de base de baixa amplitude. A Figura 7 mostra medições básicas de onda senoidal obtidas no sistema de teste do Exemplo 1 (acetonitrila e acetato de amônio como traçadores) com três volumes de misturadores estáticos e sem misturadores instalados. As condições experimentais para os resultados mostrados na Figura 7 foram mantidas constantes ao longo dos 4 testes, de acordo com o procedimento descrito na Tabela 1, com uma vazão de solvente de 0,5 ml/min. Aplique um valor de deslocamento aos conjuntos de dados para que possam ser exibidos lado a lado sem sobreposição de sinal. O deslocamento não afeta a amplitude do sinal usado para avaliar o nível de desempenho do misturador. A amplitude sinusoidal média sem o misturador foi de 0,221 mAi, enquanto as amplitudes dos misturadores estáticos de Mott em 30 µl, 60 µl e 90 µl caíram para 0,077, 0,017 e 0,004 mAi, respectivamente.
Figura 7. Deslocamento do sinal do detector UV de HPLC em função do tempo para o Caso 1 (acetonitrila com indicador de acetato de amônio), mostrando a mistura do solvente sem misturador e com misturadores Mott de 30 µl, 60 µl e 90 µl, demonstrando uma melhor mistura (menor amplitude do sinal) à medida que o volume do misturador estático aumenta. (Deslocamentos reais dos dados: 0,13 (sem misturador), 0,32, 0,4, 0,45 mA para melhor visualização).
Os dados mostrados na figura 8 são os mesmos da figura 7, mas desta vez incluem os resultados de três misturadores estáticos de HPLC comumente usados, com volumes internos de 50 µl, 150 µl e 250 µl. Rice. Figura 8. Gráfico do deslocamento do sinal do detector UV de HPLC versus tempo para o Caso 1 (acetonitrila e acetato de amônio como indicadores), mostrando a mistura do solvente sem misturador estático, a nova série de misturadores estáticos Mott e três misturadores convencionais (o deslocamento real dos dados é de 0,1 (sem misturador), 0,32, 0,48, 0,6, 0,7, 0,8 e 0,9 mA, respectivamente, para melhor visualização). A redução percentual da onda senoidal base é calculada pela razão entre a amplitude da onda senoidal e a amplitude sem o misturador instalado. As porcentagens de atenuação da onda senoidal medidas para os Casos 1 e 2 estão listadas na Tabela 2, juntamente com os volumes internos de um novo misturador estático e sete misturadores padrão comumente usados ​​na indústria. Os dados nas Figuras 8 e 9, bem como os cálculos apresentados na Tabela 2, mostram que o Misturador Estático Mott pode fornecer até 98,1% de atenuação da onda senoidal, superando em muito o desempenho de um misturador HPLC convencional nessas condições de teste. Figura 9. Gráfico do deslocamento do sinal do detector UV HPLC versus tempo para o caso 2 (metanol e acetona como traçadores) mostrando sem misturador estático (combinado), uma nova série de misturadores estáticos Mott e dois misturadores convencionais (os deslocamentos reais dos dados são 0, 11 (sem misturador), 0,22, 0,3, 0,35 mA e para melhor visualização). Sete misturadores comumente usados ​​na indústria também foram avaliados. Isso inclui misturadores com três volumes internos diferentes da empresa A (designados Misturador A1, A2 e A3) e da empresa B (designados Misturador B1, B2 e B3). A empresa C classificou apenas um tamanho.
Tabela 2. Características de agitação do misturador estático e volume interno Misturador estático Caso 1 Recuperação sinusoidal: Teste com acetonitrila (Eficiência) Caso 2 Recuperação sinusoidal: Teste com metanol e água (Eficiência) Volume interno (µl) Sem misturador – - 0 Mott 30 65% 67,2% 30 Mott 60 92,2% 91,3% 60 Mott 90 98,1% 97,5% 90 Misturador A1 66,4% 73,7% 50 Misturador A2 89,8% 91,6% 150 Misturador A3 92,2% 94,5% 250 Misturador B1 44,8% 45,7% 9 35 Misturador B2 845% 96,2% 370 Misturador C 97,2% 97,4% 250
A análise dos resultados na Figura 8 e na Tabela 2 mostra que o misturador estático Mott de 30 µl tem a mesma eficiência de mistura que o misturador A1, ou seja, 50 µl; no entanto, o Mott de 30 µl tem 30% menos volume interno. Ao comparar o misturador Mott de 60 µl com o misturador A2, de volume interno de 150 µl, houve uma ligeira melhoria na eficiência de mistura, de 89% para 92%, mas, mais importante, esse nível mais alto de mistura foi alcançado com 1/3 do volume do misturador A2. O desempenho do misturador Mott de 90 µl seguiu a mesma tendência do misturador A3, com volume interno de 250 µl. Melhorias no desempenho de mistura de 98% e 92% também foram observadas com uma redução de 3 vezes no volume interno. Resultados e comparações semelhantes foram obtidos para os misturadores B e C. Consequentemente, a nova série de misturadores estáticos Mott PerfectPeak™ oferece maior eficiência de mistura do que misturadores concorrentes comparáveis, porém com menor volume interno, proporcionando melhor ruído de fundo e melhor relação sinal-ruído, melhor sensibilidade ao analito, formato do pico e resolução do pico. Tendências semelhantes na eficiência de mistura foram observadas nos estudos do Caso 1 e do Caso 2. No Caso 2, os testes foram realizados utilizando metanol e acetona como indicadores para comparar a eficiência de mistura do misturador Mott de 60 ml, um misturador A1 comparável (volume interno de 50 µl) e um misturador B1 comparável (volume interno de 35 µl). O desempenho foi ruim sem um misturador instalado, mas foi utilizado para a análise de referência. O misturador Mott de 60 ml provou ser o melhor do grupo de teste, proporcionando um aumento de 90% na eficiência de mistura. Um misturador A1 comparável apresentou uma melhoria de 75% na eficiência de mistura, seguido por uma melhoria de 45% em um misturador B1 comparável. Um teste básico de redução da onda senoidal com variação da vazão foi realizado em uma série de misturadores sob as mesmas condições do teste da curva senoidal do Caso 1, alterando-se apenas a vazão. Os dados mostraram que, na faixa de vazões de 0,25 a 1 ml/min, a diminuição inicial da onda senoidal permaneceu relativamente constante para os três volumes de misturadores. Para os dois misturadores de menor volume, observou-se um leve aumento na contração sinusoidal com a diminuição da vazão, o que era esperado devido ao aumento do tempo de residência do solvente no misturador, permitindo uma maior mistura por difusão. Esperava-se que a atenuação da onda senoidal aumentasse com a redução adicional da vazão. No entanto, para o misturador de maior volume, com a maior atenuação da base da onda senoidal, a atenuação da base da onda senoidal permaneceu praticamente inalterada (dentro da faixa de incerteza experimental), com valores variando de 95% a 98%. 10. Atenuação básica de uma onda senoidal em função da vazão no caso 1. O teste foi realizado em condições semelhantes ao teste da onda senoidal com vazão variável, injetando 80% de uma mistura 80/20 de acetonitrila e água e 20% de acetato de amônio 20 mM.
A nova linha de misturadores estáticos em linha PerfectPeak™, com patente registrada e três volumes internos (30 µl, 60 µl e 90 µl), abrange a faixa de volume e desempenho de mistura necessária para a maioria das análises de HPLC que exigem mistura aprimorada e baixos níveis de dispersão. O novo misturador estático alcança esse resultado utilizando uma nova tecnologia de impressão 3D para criar uma estrutura 3D exclusiva que proporciona mistura estática hidrodinâmica aprimorada, com a maior redução percentual de ruído de base por unidade de volume de mistura interna. Utilizando 1/3 do volume interno de um misturador convencional, o ruído de base é reduzido em 98%. Esses misturadores consistem em canais de fluxo tridimensionais interconectados com diferentes áreas de seção transversal e diferentes comprimentos de percurso, à medida que o líquido atravessa barreiras geométricas complexas em seu interior. A nova família de misturadores estáticos oferece desempenho superior aos misturadores da concorrência, porém com menor volume interno, resultando em melhor relação sinal-ruído e limites de quantificação mais baixos, além de melhor formato de pico, eficiência e resolução para maior sensibilidade.
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