Desenvolveuse un novo e revolucionario mesturador estático en liña, deseñado especificamente para cumprir os estritos requisitos dos sistemas de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) e cromatografía líquida de ultra alta resolución (HPLC e UHPLC). Unha mestura deficiente de dúas ou máis fases móbiles pode resultar nunha maior relación sinal-ruído, o que reduce a sensibilidade. A mestura estática homoxénea de dous ou máis fluídos cun volume interno mínimo e unhas dimensións físicas dun mesturador estático representa o estándar máis alto dun mesturador estático ideal. O novo mesturador estático consegue isto mediante o uso dunha nova tecnoloxía de impresión 3D para crear unha estrutura 3D única que proporciona unha mestura estática hidrodinámica mellorada coa maior porcentaxe de redución da onda sinusoidal base por unidade de volume interno da mestura. O uso de 1/3 do volume interno dun mesturador convencional reduce a onda sinusoidal básica nun 98 %. O mesturador consta de canles de fluxo 3D interconectadas con áreas de sección transversal e lonxitudes de percorrido variables a medida que o fluído atravesa xeometrías 3D complexas. A mestura ao longo de múltiples percorridos de fluxo tortuosos, combinada con turbulencias e remuíños locais, resulta nunha mestura a escalas micro, meso e macro. Este mesturador único está deseñado mediante simulacións de dinámica de fluídos computacional (CFD). Os datos de proba presentados mostran que se consegue unha mestura excelente cun volume interno mínimo.
Durante máis de 30 anos, a cromatografía líquida utilizouse en moitas industrias, incluíndo a farmacéutica, os pesticidas, a protección ambiental, a ciencia forense e a análise química. A capacidade de medir en partes por millón ou menos é fundamental para o desenvolvemento tecnolóxico en calquera industria. Unha mala eficiencia de mestura leva a unha mala relación sinal-ruído, o que supón unha molestia para a comunidade cromatográfica en termos de límites de detección e sensibilidade. Ao mesturar dous solventes HPLC, ás veces é necesario forzar a mestura por medios externos para homoxeneizar os dous solventes porque algúns solventes non se mesturan ben. Se os solventes non se mesturan completamente, pode producirse unha degradación do cromatograma HPLC, que se manifesta como un ruído de liña base excesivo e/ou unha forma de pico deficiente. Cunha mestura deficiente, o ruído de liña base aparecerá como unha onda sinusoidal (ascendente e descendente) do sinal do detector co paso do tempo. Ao mesmo tempo, unha mestura deficiente pode levar a picos ensanchados e asimétricos, o que reduce o rendemento analítico, a forma do pico e a resolución do pico. A industria recoñeceu que os mesturadores estáticos en liña e en T son un medio para mellorar estes límites e permitir que os usuarios alcancen límites de detección (sensibilidades) máis baixos. O mesturador estático ideal combina as vantaxes dunha alta eficiencia de mestura, un baixo volume morto e unha baixa caída de presión cun volume mínimo e un rendemento máximo do sistema. Ademais, a medida que a análise se fai máis complexa, os analistas deben usar de forma rutineira solventes máis polares e difíciles de mesturar. Isto significa que unha mellor mestura é imprescindible para as probas futuras, o que aumenta aínda máis a necesidade dun deseño e rendemento superiores do mesturador.
Mott desenvolveu recentemente unha nova gama de mesturadores estáticos en liña PerfectPeak™ patentados con tres volumes internos: 30 µl, 60 µl e 90 µl. Estes tamaños cobren a gama de volumes e características de mestura necesarias para a maioría das probas de HPLC onde se require unha mestura mellorada e unha baixa dispersión. Os tres modelos teñen un diámetro de 0,5″ e ofrecen un rendemento líder na industria nun deseño compacto. Están feitos de aceiro inoxidable 316L, pasivado para maior inercia, pero tamén están dispoñibles titanio e outras aliaxes metálicas resistentes á corrosión e quimicamente inertes. Estes mesturadores teñen unha presión máxima de funcionamento de ata 20 000 psi. Na figura 1a móstrase unha fotografía dun mesturador estático Mott de 60 µl deseñado para proporcionar a máxima eficiencia de mestura mentres usa un volume interno menor que os mesturadores estándar deste tipo. Este novo deseño de mesturador estático usa unha nova tecnoloxía de fabricación aditiva para crear unha estrutura 3D única que usa menos fluxo interno que calquera mesturador usado actualmente na industria da cromatografía para lograr a mestura estática. Estes mesturadores constan de canles de fluxo tridimensionais interconectadas con diferentes áreas de sección transversal e diferentes lonxitudes de percorrido a medida que o líquido cruza complexas barreiras xeométricas no seu interior. Na figura 1b móstrase un diagrama esquemático do novo mesturador, que usa accesorios de compresión HPLC roscados 10-32 estándar da industria para a entrada e a saída, e ten bordos azuis sombreados do porto mesturador interno patentado. As diferentes áreas de sección transversal das traxectorias de fluxo internas e os cambios na dirección do fluxo dentro do volume de fluxo interno crean rexións de fluxo turbulento e laminar, provocando mesturas a escalas micro, meso e macro. O deseño deste mesturador único empregou simulacións de dinámica de fluídos computacional (CFD) para analizar os patróns de fluxo e refinar o deseño antes da creación de prototipos para probas analíticas internas e avaliación de campo por parte do cliente. A fabricación aditiva é o proceso de impresión de compoñentes xeométricos 3D directamente a partir de debuxos CAD sen necesidade de mecanizado tradicional (fresadoras, tornos, etc.). Estes novos mesturadores estáticos están deseñados para fabricarse mediante este proceso, onde o corpo do mesturador se crea a partir de debuxos CAD e as pezas se fabrican (imprimen) capa por capa mediante fabricación aditiva. Aquí, deposítase unha capa de po metálico duns 20 micras de grosor e un láser controlado por ordenador fúndeo selectivamente e fusiona o po nunha forma sólida. Aplique outra capa enriba desta capa e aplique a sinterización láser. Repita este proceso ata que a peza estea completamente rematada. O po elimínase entón da peza non unida por láser, deixando unha peza impresa en 3D que coincide co debuxo CAD orixinal. O produto final é algo similar ao proceso microfluídico, coa principal diferenza de que os compoñentes microfluídicos adoitan ser bidimensionais (planos), mentres que mediante a fabricación aditiva pódense crear patróns de fluxo complexos en xeometría tridimensional. Estas billas están dispoñibles actualmente como pezas impresas en 3D en aceiro inoxidable 316L e titanio. A maioría das aliaxes metálicas, polímeros e algunhas cerámicas pódense usar para fabricar compoñentes usando este método e serán considerados en futuros deseños/produtos.
Rice. 1. Fotografía (a) e diagrama (b) dun mesturador estático Mott de 90 μl que mostran unha sección transversal da traxectoria de fluxo de fluído do mesturador sombreada en azul.
Executar simulacións de dinámica de fluídos computacional (CFD) do rendemento de mesturadores estáticos durante a fase de deseño para axudar a desenvolver deseños eficientes e reducir os experimentos de proba e erro, que requiren moito tempo e son custosos. Simulación CFD de mesturadores estáticos e tubaxes estándar (simulación sen mesturador) usando o paquete de software COMSOL Multiphysics. Modelado usando mecánica de fluídos laminares impulsada pola presión para comprender a velocidade e a presión do fluído dentro dunha peza. Esta dinámica de fluídos, combinada co transporte químico de compostos de fase móbil, axuda a comprender a mestura de dous líquidos concentrados diferentes. O modelo estúdase como unha función do tempo, igual a 10 segundos, para facilitar o cálculo mentres se buscan solucións comparables. Os datos teóricos obtivéronse nun estudo correlacionado no tempo usando a ferramenta de proxección de sonda de puntos, onde se escolleu un punto no medio da saída para a recollida de datos. O modelo CFD e as probas experimentais usaron dous solventes diferentes a través dunha válvula de mostraxe proporcional e un sistema de bombeo, o que resultou nun tapón de substitución para cada solvente na liña de mostraxe. Estes solventes mestúranse entón nun mesturador estático. As figuras 2 e 3 mostran simulacións de fluxo a través dunha tubaxe estándar (sen mesturador) e a través dun mesturador estático Mott, respectivamente. A simulación executouse nun tubo recto de 5 cm de longo e 0,25 mm de diámetro interno para demostrar o concepto de tapóns alternados de auga e acetonitrilo puro no tubo en ausencia dun mesturador estático, como se mostra na Figura 2. A simulación empregou as dimensións exactas do tubo e do mesturador e un caudal de 0,3 ml/min.
Rice. 2. Simulación do fluxo CFD nun tubo de 5 cm cun diámetro interno de 0,25 mm para representar o que ocorre nun tubo HPLC, é dicir, en ausencia dun mesturador. O vermello cheo representa a fracción másica de auga. O azul representa a falta de auga, é dicir, acetonitrilo puro. Pódense ver rexións de difusión entre tapóns alternos de dous líquidos diferentes.
Arroz. 3. Mesturador estático cun volume de 30 ml, modelado no paquete de software COMSOL CFD. A lenda representa a fracción másica da auga no mesturador. A auga pura móstrase en vermello e o acetonitrilo puro en azul. O cambio na fracción másica da auga simulada represéntase por un cambio na cor da mestura de dous líquidos.
Na figura 4 móstrase un estudo de validación do modelo de correlación entre a eficiencia de mestura e o volume de mestura. A medida que aumenta o volume de mestura, aumentará a eficiencia de mestura. Segundo o coñecemento dos autores, outras forzas físicas complexas que actúan dentro do mesturador non se poden ter en conta neste modelo CFD, o que resulta nunha maior eficiencia de mestura nas probas experimentais. A eficiencia de mestura experimental mediuse como a porcentaxe de redución na sinusoide da base. Ademais, o aumento da contrapresión adoita resultar en niveis de mestura máis altos, que non se teñen en conta na simulación.
As seguintes condicións e configuración de proba de HPLC empregáronse para medir ondas sinusoidais brutas para comparar o rendemento relativo de diferentes mesturadores estáticos. O diagrama da Figura 5 mostra un deseño típico do sistema HPLC/UHPLC. O mesturador estático probouse colocándoo directamente despois da bomba e antes do inxector e da columna de separación. A maioría das medicións sinusoidais de fondo realízanse evitando o inxector e a columna capilar entre o mesturador estático e o detector UV. Ao avaliar a relación sinal-ruído e/ou analizar a forma do pico, a configuración do sistema móstrase na Figura 5.
Figura 4. Gráfico da eficiencia de mestura fronte ao volume de mestura para unha gama de mesturadores estáticos. A impureza teórica segue a mesma tendencia que os datos de impurezas experimentais, o que confirma a validez das simulacións CFD.
O sistema HPLC empregado para esta proba foi un HPLC da serie 1100 de Agilent cun detector UV controlado por un PC con software Chemstation. A táboa 1 mostra as condicións de axuste típicas para medir a eficiencia do mesturador mediante a monitorización de sinusoides básicas en dous estudos de caso. As probas experimentais realizáronse en dous exemplos diferentes de solventes. Os dous solventes mesturados no caso 1 foron o solvente A (acetato de amonio 20 mM en auga desionizada) e o solvente B (acetonitrilo (ACN) ao 80 %/auga desionizada ao 20 %). No caso 2, o solvente A era unha solución de acetona ao 0,05 % (etiqueta) en auga desionizada. O solvente B é unha mestura de metanol e auga ao 80/20 %. No caso 1, a bomba axustouse a un caudal de 0,25 ml/min a 1,0 ml/min e, no caso 2, a bomba axustouse a un caudal constante de 1 ml/min. En ambos os casos, a proporción da mestura de solventes A e B foi de 20 % de A/80 % de B. O detector axustouse a 220 nm no caso 1 e a absorción máxima de acetona no caso 2 axustouse a unha lonxitude de onda de 265 nm.
Táboa 1. Configuracións de HPLC para os casos 1 e 2 Caso 1 Caso 2 Velocidade da bomba De 0,25 ml/min a 1,0 ml/min 1,0 ml/min Disolvente A Acetato de amonio 20 mM en auga desionizada Acetona 0,05 % en auga desionizada Disolvente B Acetonitrilo (ACN) ao 80 % / auga desionizada ao 80 % / auga desionizada ao 20 % Proporción de disolventes A ao 20 % / B ao 80 % A ao 20 % / B ao 80 % Detector 220 nm 265 nm
Rice. 6. Gráficos de ondas sinusoidais mixtas medidas antes e despois de aplicar un filtro de paso baixo para eliminar os compoñentes de deriva da liña base do sinal.
A figura 6 é un exemplo típico de ruído de liña base mixto no caso 1, mostrado como un patrón sinusoidal repetitivo superposto á deriva da liña base. A deriva da liña base é un aumento ou diminución lentos no sinal de fondo. Se non se permite que o sistema se equilibre o tempo suficiente, normalmente caerá, pero derivará de forma errática mesmo cando o sistema sexa completamente estable. Esta deriva da liña base tende a aumentar cando o sistema funciona en condicións de gradiente pronunciado ou alta contrapresión. Cando está presente esta deriva da liña base, pode ser difícil comparar os resultados dunha mostra a outra, o que se pode superar aplicando un filtro de paso baixo aos datos brutos para filtrar estas variacións de baixa frecuencia, proporcionando así unha gráfica de oscilación cunha liña base plana. Na figura 6, a figura 6 tamén mostra unha gráfica do ruído de liña base do mesturador despois de aplicar un filtro de paso baixo.
Despois de completar as simulacións CFD e as probas experimentais iniciais, desenvolvéronse posteriormente tres mesturadores estáticos separados empregando os compoñentes internos descritos anteriormente con tres volumes internos: 30 µl, 60 µl e 90 µl. Este rango abrangue o rango de volumes e o rendemento de mestura necesarios para aplicacións de HPLC con baixo contido de analitos onde se require unha mestura mellorada e unha baixa dispersión para producir liñas de base de baixa amplitude. Na figura 7 móstranse as medicións básicas de onda sinusoidal obtidas no sistema de proba do Exemplo 1 (acetonitrilo e acetato de amonio como trazadores) con tres volumes de mesturadores estáticos e sen mesturadores instalados. As condicións de proba experimentais para os resultados mostrados na Figura 7 mantivéronse constantes durante as 4 probas segundo o procedemento descrito na Táboa 1 a un caudal de disolvente de 0,5 ml/min. Aplique un valor de desprazamento aos conxuntos de datos para que se poidan mostrar xuntos sen solapamento de sinais. O desprazamento non afecta á amplitude do sinal utilizado para xulgar o nivel de rendemento do mesturador. A amplitude sinusoidal media sen o mesturador foi de 0,221 mAi, mentres que as amplitudes dos mesturadores Mott estáticos a 30 µl, 60 µl e 90 µl caeron a 0,077, 0,017 e 0,004 mAi, respectivamente.
Figura 7. Desprazamento do sinal do detector UV de HPLC fronte ao tempo para o caso 1 (acetonitrilo con indicador de acetato de amonio) que mostra a mestura de solventes sen mesturador, mesturadores Mott de 30 µl, 60 µl e 90 µl que mostran unha mestura mellorada (menor amplitude do sinal) a medida que aumenta o volume do mesturador estático. (desprazamentos de datos reais: 0,13 (sen mesturador), 0,32, 0,4, 0,45 mA para unha mellor visualización).
Os datos que se mostran na figura 8 son os mesmos que na figura 7, pero esta vez inclúen os resultados de tres mesturadores estáticos de HPLC de uso común con volumes internos de 50 µl, 150 µl e 250 µl. Rice. Figura 8. Gráfico de desprazamento do sinal do detector UV de HPLC fronte ao tempo para o caso 1 (acetonitrilo e acetato de amonio como indicadores) que mostra a mestura de solvente sen mesturador estático, a nova serie de mesturadores estáticos Mott e tres mesturadores convencionais (o desprazamento de datos real é de 0,1 (sen mesturador), 0,32, 0,48, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 mA respectivamente para un mellor efecto de visualización). A porcentaxe de redución da onda sinusoidal base calcúlase mediante a relación entre a amplitude da onda sinusoidal e a amplitude sen o mesturador instalado. As porcentaxes de atenuación da onda sinusoidal medidas para os casos 1 e 2 indícanse na táboa 2, xunto cos volumes internos dun novo mesturador estático e sete mesturadores estándar de uso común na industria. Os datos das figuras 8 e 9, así como os cálculos presentados na táboa 2, mostran que o mesturador estático Mott pode proporcionar ata unha atenuación de onda sinusoidal do 98,1 %, superando con creces o rendemento dun mesturador HPLC convencional nestas condicións de proba. Figura 9. Gráfico de desprazamento do sinal do detector UV de HPLC fronte ao tempo para o caso 2 (metanol e acetona como trazadores) que non mostra mesturador estático (combinado), unha nova serie de mesturadores estáticos Mott e dous mesturadores convencionais (os desprazamentos de datos reais son 0, 11 (sen mesturador), 0,22, 0,3, 0,35 mA e para unha mellor visualización). Tamén se avaliaron sete mesturadores de uso común na industria. Estes inclúen mesturadores con tres volumes internos diferentes da empresa A (designados mesturador A1, A2 e A3) e da empresa B (designados mesturador B1, B2 e B3). A empresa C só clasificou un tamaño.
Táboa 2. Características de axitación do mesturador estático e volume interno Mesturador estático Caso 1 Recuperación sinusoidal: Proba de acetonitrilo (eficiencia) Caso 2 Recuperación sinusoidal: Proba de auga con metanol (eficiencia) Volume interno (µl) Sen mesturador – - 0 Mott 30 65 % 67,2 % 30 Mott 60 92,2 % 91,3 % 60 Mott 90 98,1 % 97,5 % 90 Mesturador A1 66,4 % 73,7 % 50 Mesturador A2 89,8 % 91,6 % 150 Mesturador A3 92,2 % 94,5 % 250 Mesturador B1 44,8 % 45,7 % 9 35 Mesturador B2 845 % 96,2 % 370 Mesturador C 97,2 % 97,4 % 250
A análise dos resultados da Figura 8 e da Táboa 2 mostra que o mesturador estático Mott de 30 µl ten a mesma eficiencia de mestura que o mesturador A1, é dicir, 50 µl; non obstante, o Mott de 30 µl ten un 30 % menos de volume interno. Ao comparar o mesturador Mott de 60 µl co mesturador A2 de 150 µl de volume interno, houbo unha lixeira mellora na eficiencia de mestura do 92 % fronte ao 89 %, pero o máis importante é que este maior nivel de mestura conseguiuse a 1/3 do volume do mesturador. Mesturador similar A2. O rendemento do mesturador Mott de 90 µl seguiu a mesma tendencia que o mesturador A3 cun volume interno de 250 µl. Tamén se observaron melloras no rendemento de mestura do 98 % e o 92 % cunha redución do volume interno do triplo. Obtivéronse resultados e comparacións similares para os mesturadores B e C. Como resultado, a nova serie de mesturadores estáticos Mott PerfectPeak™ proporciona unha maior eficiencia de mestura que os mesturadores da competencia comparables, pero cun menor volume interno, proporcionando un mellor ruído de fondo e unha mellor relación sinal-ruído, mellor sensibilidade ao analito, forma do pico e resolución do pico. Observáronse tendencias similares na eficiencia de mestura tanto nos estudos do Caso 1 como do Caso 2. Para o Caso 2, realizáronse probas utilizando (metanol e acetona como indicadores) para comparar a eficiencia de mestura de 60 ml de Mott, un mesturador comparable A1 (volume interno 50 µl) e un mesturador comparable B1 (volume interno 35 µl). , o rendemento foi deficiente sen un mesturador instalado, pero utilizouse para a análise de referencia. O mesturador Mott de 60 ml demostrou ser o mellor mesturador do grupo de proba, proporcionando un aumento do 90 % na eficiencia de mestura. Un mesturador comparable A1 experimentou unha mellora do 75 % na eficiencia de mestura seguida dunha mellora do 45 % nun mesturador comparable B1. Realizouse unha proba básica de redución de onda sinusoidal con caudal nunha serie de mesturadores nas mesmas condicións que a proba da curva sinusoidal no Caso 1, cambiando só o caudal. Os datos mostraron que no rango de caudais de 0,25 a 1 ml/min, a diminución inicial da onda sinusoidal mantívose relativamente constante para os tres volumes do mesturador. Para os dous mesturadores de menor volume, hai un lixeiro aumento na contracción sinusoidal a medida que diminúe o caudal, o que se espera debido ao maior tempo de residencia do disolvente no mesturador, o que permite unha maior mestura por difusión. Espérase que a subtracción da onda sinusoidal aumente a medida que o caudal diminúe aínda máis. Non obstante, para o maior volume do mesturador coa maior atenuación da base da onda sinusoidal, a atenuación da base da onda sinusoidal mantívose practicamente sen cambios (dentro do rango de incerteza experimental), con valores que oscilan entre o 95 % e o 98 %. 10. Atenuación básica dunha onda sinusoidal en función do caudal no caso 1. A proba realizouse en condicións similares á proba sinusoidal con caudal variable, inxectando o 80 % dunha mestura 80/20 de acetonitrilo e auga e o 20 % de acetato de amonio 20 mM.
A gama recentemente desenvolvida de mesturadores estáticos en liña patentados PerfectPeak™ con tres volumes internos: 30 µl, 60 µl e 90 µl cobre o rango de rendemento de volume e mestura necesario para a maioría das análises de HPLC que requiren unha mestura mellorada e chans de baixa dispersión. O novo mesturador estático consegue isto mediante o uso dunha nova tecnoloxía de impresión 3D para crear unha estrutura 3D única que proporciona unha mestura estática hidrodinámica mellorada coa maior porcentaxe de redución do ruído base por unidade de volume de mestura interna. O uso de 1/3 do volume interno dun mesturador convencional reduce o ruído base nun 98 %. Estes mesturadores constan de canles de fluxo tridimensionais interconectadas con diferentes áreas de sección transversal e diferentes lonxitudes de percorrido a medida que o líquido cruza barreiras xeométricas complexas no seu interior. A nova familia de mesturadores estáticos proporciona un rendemento mellorado en comparación cos mesturadores da competencia, pero cun menor volume interno, o que resulta nunha mellor relación sinal-ruído e límites de cuantificación máis baixos, así como unha forma de pico, eficiencia e resolución melloradas para unha maior sensibilidade.
Neste número Cromatografía: RP-HPLC respectuosa co medio ambiente: uso da cromatografía núcleo-cuncha para substituír o acetonitrilo por isopropanol na análise e purificación: novo cromatógrafo de gases para...
Centro de negocios International Labmate Limited Oak Court Sandridge Park, Porters Wood St Albans Hertfordshire AL3 6PH Reino Unido