Se ha desarrollado un nuevo y revolucionario mezclador estático en línea diseñado específicamente para cumplir con los estrictos requisitos de los sistemas de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y cromatografía líquida de ultra alta resolución (HPLC y UHPLC). Una mezcla deficiente de dos o más fases móviles puede resultar en una relación señal-ruido elevada, lo que reduce la sensibilidad. La mezcla estática homogénea de dos o más fluidos con un volumen interno mínimo y dimensiones físicas reducidas representa el estándar más alto para un mezclador estático ideal. El nuevo mezclador estático logra esto mediante el uso de una nueva tecnología de impresión 3D para crear una estructura 3D única que proporciona una mezcla estática hidrodinámica mejorada con la mayor reducción porcentual en la onda sinusoidal base por unidad de volumen interno de la mezcla. El uso de 1/3 del volumen interno de un mezclador convencional reduce la onda sinusoidal base en un 98 %. El mezclador consta de canales de flujo 3D interconectados con áreas de sección transversal y longitudes de trayectoria variables a medida que el fluido atraviesa geometrías 3D complejas. La mezcla a lo largo de múltiples trayectorias de flujo tortuosas, combinada con turbulencias y remolinos locales, da como resultado una mezcla a micro, meso y macroescala. Este mezclador único se diseñó mediante simulaciones de dinámica de fluidos computacional (CFD). Los datos de prueba presentados demuestran que se logra una excelente mezcla con un volumen interno mínimo.
Durante más de 30 años, la cromatografía líquida se ha utilizado en numerosas industrias, como la farmacéutica, la de pesticidas, la de protección ambiental, la forense y la de análisis químico. La capacidad de medir en partes por millón o menos es fundamental para el desarrollo tecnológico en cualquier industria. Una mezcla deficiente conlleva una mala relación señal-ruido, lo que resulta problemático para la comunidad cromatográfica en términos de límites de detección y sensibilidad. Al mezclar dos disolventes para HPLC, a veces es necesario forzar la mezcla mediante medios externos para homogeneizarlos, ya que algunos disolventes no se mezclan bien. Si los disolventes no se mezclan completamente, puede producirse una degradación del cromatograma de HPLC, que se manifiesta como un ruido de fondo excesivo o una forma de pico deficiente. Con una mezcla deficiente, el ruido de fondo aparecerá como una onda sinusoidal (ascendente y descendente) de la señal del detector a lo largo del tiempo. Asimismo, una mezcla deficiente puede provocar picos ensanchados y asimétricos, lo que reduce el rendimiento analítico, la forma de los picos y la resolución de los mismos. La industria ha reconocido que los mezcladores estáticos en línea y en T son un medio para mejorar estos límites y permitir a los usuarios alcanzar límites de detección (sensibilidades) más bajos. El mezclador estático ideal combina las ventajas de una alta eficiencia de mezcla, un bajo volumen muerto y una baja caída de presión con un volumen mínimo y un rendimiento máximo del sistema. Además, a medida que el análisis se vuelve más complejo, los analistas deben utilizar habitualmente disolventes más polares y difíciles de mezclar. Esto significa que una mejor mezcla es fundamental para las pruebas futuras, lo que incrementa aún más la necesidad de un diseño y un rendimiento superiores del mezclador.
Mott ha desarrollado recientemente una nueva gama de mezcladores estáticos en línea PerfectPeak™ patentados con tres volúmenes internos: 30 µl, 60 µl y 90 µl. Estos tamaños cubren el rango de volúmenes y características de mezcla necesarios para la mayoría de las pruebas de HPLC donde se requiere una mezcla mejorada y una baja dispersión. Los tres modelos tienen un diámetro de 0,5″ y ofrecen un rendimiento líder en la industria en un diseño compacto. Están fabricados en acero inoxidable 316L, pasivado para mayor inercia, pero también están disponibles en titanio y otras aleaciones metálicas resistentes a la corrosión y químicamente inertes. Estos mezcladores tienen una presión máxima de funcionamiento de hasta 20 000 psi. En la figura 1a se muestra una fotografía de un mezclador estático Mott de 60 µl diseñado para proporcionar la máxima eficiencia de mezcla utilizando un volumen interno menor que los mezcladores estándar de este tipo. Este nuevo diseño de mezclador estático utiliza una nueva tecnología de fabricación aditiva para crear una estructura 3D única que utiliza menos flujo interno que cualquier mezclador utilizado actualmente en la industria de la cromatografía para lograr la mezcla estática. Estos mezcladores constan de canales de flujo tridimensionales interconectados con diferentes áreas de sección transversal y diferentes longitudes de trayectoria a medida que el líquido atraviesa barreras geométricas complejas en su interior. En la figura 1b se muestra un diagrama esquemático del nuevo mezclador, que utiliza conexiones de compresión HPLC roscadas estándar de la industria 10-32 para la entrada y la salida, y tiene bordes azules sombreados del puerto interno del mezclador patentado. Las diferentes áreas de sección transversal de las trayectorias de flujo internas y los cambios en la dirección del flujo dentro del volumen de flujo interno crean regiones de flujo turbulento y laminar, lo que provoca la mezcla a escalas micro, meso y macro. El diseño de este mezclador único utilizó simulaciones de dinámica de fluidos computacional (CFD) para analizar los patrones de flujo y refinar el diseño antes de la creación de prototipos para pruebas analíticas internas y evaluación de campo por parte del cliente. La fabricación aditiva es el proceso de imprimir componentes geométricos 3D directamente a partir de dibujos CAD sin necesidad de mecanizado tradicional (fresadoras, tornos, etc.). Estos nuevos mezcladores estáticos están diseñados para fabricarse mediante este proceso, donde el cuerpo del mezclador se crea a partir de dibujos CAD y las piezas se fabrican (imprimen) capa a capa mediante fabricación aditiva. En este proceso, se deposita una capa de polvo metálico de aproximadamente 20 micras de espesor, y un láser controlado por computadora funde y fusiona selectivamente el polvo en una forma sólida. Se aplica otra capa sobre esta y se realiza la sinterización láser. Este proceso se repite hasta que la pieza esté completamente terminada. Luego, se retira el polvo de la parte no unida por láser, dejando una pieza impresa en 3D que coincide con el dibujo CAD original. El producto final es similar al proceso microfluídico, con la principal diferencia de que los componentes microfluídicos suelen ser bidimensionales (planos), mientras que con la fabricación aditiva se pueden crear patrones de flujo complejos en geometría tridimensional. Estos grifos están disponibles actualmente como piezas impresas en 3D en acero inoxidable 316L y titanio. La mayoría de las aleaciones metálicas, polímeros y algunas cerámicas se pueden utilizar para fabricar componentes mediante este método y se considerarán en futuros diseños/productos.
Arroz. 1. Fotografía (a) y diagrama (b) de un mezclador estático Mott de 90 μl que muestra una sección transversal de la trayectoria del flujo de fluido del mezclador sombreada en azul.
Ejecutar simulaciones de dinámica de fluidos computacional (CFD) del rendimiento de mezcladores estáticos durante la fase de diseño para ayudar a desarrollar diseños eficientes y reducir experimentos de prueba y error costosos y que consumen mucho tiempo. Simulación CFD de mezcladores estáticos y tuberías estándar (simulación sin mezclador) utilizando el paquete de software COMSOL Multiphysics. Modelado utilizando mecánica de fluidos laminar impulsada por presión para comprender la velocidad y la presión del fluido dentro de una pieza. Esta dinámica de fluidos, combinada con el transporte químico de compuestos de la fase móvil, ayuda a comprender la mezcla de dos líquidos concentrados diferentes. El modelo se estudia en función del tiempo, igual a 10 segundos, para facilitar el cálculo mientras se buscan soluciones comparables. Los datos teóricos se obtuvieron en un estudio correlacionado en el tiempo utilizando la herramienta de proyección de sonda puntual, donde se eligió un punto en el medio de la salida para la recolección de datos. El modelo CFD y las pruebas experimentales utilizaron dos solventes diferentes a través de una válvula de muestreo proporcional y un sistema de bombeo, lo que resultó en un tapón de reemplazo para cada solvente en la línea de muestreo. Estos solventes luego se mezclan en un mezclador estático. Las figuras 2 y 3 muestran simulaciones de flujo a través de una tubería estándar (sin mezclador) y a través de un mezclador estático Mott, respectivamente. La simulación se realizó en un tubo recto de 5 cm de longitud y 0,25 mm de diámetro interno para demostrar el concepto de alternancia de tapones de agua y acetonitrilo puro en el tubo en ausencia de un mezclador estático, como se muestra en la figura 2. La simulación utilizó las dimensiones exactas del tubo y el mezclador, y un caudal de 0,3 ml/min.
Arroz. 2. Simulación de flujo CFD en un tubo de 5 cm con un diámetro interno de 0,25 mm para representar lo que sucede en un tubo de HPLC, es decir, en ausencia de un mezclador. El rojo intenso representa la fracción másica de agua. El azul representa la ausencia de agua, es decir, acetonitrilo puro. Se pueden observar regiones de difusión entre tapones alternos de dos líquidos diferentes.
Arroz. 3. Mezclador estático con un volumen de 30 ml, modelado en el paquete de software COMSOL CFD. La leyenda representa la fracción másica de agua en el mezclador. El agua pura se muestra en rojo y el acetonitrilo puro en azul. El cambio en la fracción másica del agua simulada se representa mediante un cambio en el color de la mezcla de los dos líquidos.
La figura 4 muestra un estudio de validación del modelo de correlación entre la eficiencia de mezclado y el volumen de mezclado. A medida que aumenta el volumen de mezclado, aumenta la eficiencia de mezclado. Según el conocimiento de los autores, otras fuerzas físicas complejas que actúan dentro del mezclador no pueden considerarse en este modelo CFD, lo que resulta en una mayor eficiencia de mezclado en las pruebas experimentales. La eficiencia de mezclado experimental se midió como la reducción porcentual en la sinusoide base. Además, el aumento de la contrapresión generalmente resulta en mayores niveles de mezclado, lo cual no se considera en la simulación.
Se utilizaron las siguientes condiciones de HPLC y configuración de prueba para medir ondas sinusoidales brutas y comparar el rendimiento relativo de diferentes mezcladores estáticos. El diagrama de la Figura 5 muestra la configuración típica de un sistema HPLC/UHPLC. El mezclador estático se probó colocándolo directamente después de la bomba y antes del inyector y la columna de separación. La mayoría de las mediciones sinusoidales de fondo se realizaron sin pasar por el inyector ni la columna capilar entre el mezclador estático y el detector UV. La configuración del sistema se muestra en la Figura 5 para evaluar la relación señal-ruido y/o analizar la forma del pico.
Figura 4. Gráfico de la eficiencia de mezcla frente al volumen de mezcla para una gama de mezcladores estáticos. La impureza teórica sigue la misma tendencia que los datos experimentales de impureza, lo que confirma la validez de las simulaciones CFD.
El sistema HPLC utilizado para esta prueba fue un Agilent Serie 1100 con un detector UV controlado por una PC con el software Chemstation. La Tabla 1 muestra las condiciones de ajuste típicas para medir la eficiencia del mezclador mediante el monitoreo de sinusoides básicos en dos estudios de caso. Las pruebas experimentales se llevaron a cabo en dos ejemplos diferentes de solventes. Los dos solventes mezclados en el caso 1 fueron solvente A (acetato de amonio 20 mM en agua desionizada) y solvente B (acetonitrilo (ACN) 80%/agua desionizada 20%). En el caso 2, el solvente A fue una solución de acetona al 0,05% (etiqueta) en agua desionizada. El solvente B es una mezcla de metanol y agua al 80/20%. En el caso 1, la bomba se ajustó a un caudal de 0,25 ml/min a 1,0 ml/min, y en el caso 2, la bomba se ajustó a un caudal constante de 1 ml/min. En ambos casos, la proporción de la mezcla de disolventes A y B fue de 20 % A/80 % B. El detector se ajustó a 220 nm en el caso 1, y la absorción máxima de acetona en el caso 2 se ajustó a una longitud de onda de 265 nm.
Tabla 1. Configuraciones de HPLC para los casos 1 y 2 Caso 1 Caso 2 Velocidad de la bomba 0,25 ml/min a 1,0 ml/min 1,0 ml/min Disolvente A Acetato de amonio 20 mM en agua desionizada Acetona al 0,05% en agua desionizada Disolvente B Acetonitrilo (ACN) al 80% / agua desionizada al 20% Metanol al 80% / agua desionizada al 20% Proporción de disolventes 20% A / 80% B 20% A / 80% B Detector 220 nm 265 nm
Arroz. 6. Gráficas de ondas sinusoidales mixtas medidas antes y después de aplicar un filtro de paso bajo para eliminar los componentes de deriva de la línea base de la señal.
La figura 6 es un ejemplo típico de ruido de línea base mixto en el Caso 1, mostrado como un patrón sinusoidal repetitivo superpuesto a la deriva de la línea base. La deriva de la línea base es un aumento o disminución lenta en la señal de fondo. Si no se permite que el sistema se equilibre el tiempo suficiente, generalmente disminuirá, pero derivará erráticamente incluso cuando el sistema esté completamente estable. Esta deriva de la línea base tiende a aumentar cuando el sistema opera en condiciones de gradiente pronunciado o alta contrapresión. Cuando esta deriva de la línea base está presente, puede ser difícil comparar los resultados de una muestra a otra, lo que se puede solucionar aplicando un filtro de paso bajo a los datos brutos para filtrar estas variaciones de baja frecuencia, proporcionando así una gráfica de oscilación con una línea base plana. En la figura 6 también se muestra una gráfica del ruido de la línea base del mezclador después de aplicar un filtro de paso bajo.
Tras completar las simulaciones CFD y las pruebas experimentales iniciales, se desarrollaron tres mezcladores estáticos independientes utilizando los componentes internos descritos anteriormente con tres volúmenes internos: 30 µl, 60 µl y 90 µl. Este rango cubre el rango de volúmenes y rendimiento de mezcla requerido para aplicaciones de HPLC con analito bajo, donde se requiere una mezcla mejorada y una baja dispersión para producir líneas base de baja amplitud. La figura 7 muestra mediciones básicas de onda sinusoidal obtenidas en el sistema de prueba del Ejemplo 1 (acetonitrilo y acetato de amonio como trazadores) con tres volúmenes de mezcladores estáticos y sin mezcladores instalados. Las condiciones de prueba experimentales para los resultados mostrados en la Figura 7 se mantuvieron constantes durante las 4 pruebas según el procedimiento descrito en la Tabla 1 a un caudal de disolvente de 0,5 ml/min. Aplique un valor de desplazamiento a los conjuntos de datos para que puedan mostrarse uno al lado del otro sin superposición de señales. El desplazamiento no afecta la amplitud de la señal utilizada para evaluar el nivel de rendimiento del mezclador. La amplitud sinusoidal promedio sin el mezclador fue de 0,221 mAi, mientras que las amplitudes de los mezcladores estáticos de Mott a 30 µl, 60 µl y 90 µl disminuyeron a 0,077, 0,017 y 0,004 mAi, respectivamente.
Figura 7. Desplazamiento de la señal del detector UV de HPLC frente al tiempo para el caso 1 (acetonitrilo con indicador de acetato de amonio) que muestra la mezcla del disolvente sin mezclador, con mezcladores Mott de 30 µl, 60 µl y 90 µl, mostrando una mejor mezcla (menor amplitud de la señal) a medida que aumenta el volumen del mezclador estático. (Desplazamientos de datos reales: 0,13 (sin mezclador), 0,32, 0,4, 0,45 mA para una mejor visualización).
Los datos mostrados en la figura 8 son los mismos que en la figura 7, pero esta vez incluyen los resultados de tres mezcladores estáticos de HPLC de uso común con volúmenes internos de 50 µl, 150 µl y 250 µl. Rice. Figura 8. Gráfico de desplazamiento de señal del detector UV de HPLC en función del tiempo para el caso 1 (acetonitrilo y acetato de amonio como indicadores) que muestra la mezcla del disolvente sin mezclador estático, la nueva serie de mezcladores estáticos Mott y tres mezcladores convencionales (el desplazamiento de datos real es 0,1 (sin mezclador), 0,32, 0,48, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 mA respectivamente para un mejor efecto de visualización). La reducción porcentual de la onda sinusoidal base se calcula mediante la relación de la amplitud de la onda sinusoidal a la amplitud sin el mezclador instalado. Los porcentajes de atenuación de onda sinusoidal medidos para los Casos 1 y 2 se enumeran en la Tabla 2, junto con los volúmenes internos de un nuevo mezclador estático y siete mezcladores estándar comúnmente utilizados en la industria. Los datos en las Figuras 8 y 9, así como los cálculos presentados en la Tabla 2, muestran que el Mott Static Mixer puede proporcionar hasta un 98,1 % de atenuación de onda sinusoidal, superando con creces el rendimiento de un mezclador HPLC convencional bajo estas condiciones de prueba. Figura 9. Gráfico de desplazamiento de señal del detector UV HPLC versus tiempo para el caso 2 (metanol y acetona como trazadores) que muestra sin mezclador estático (combinado), una nueva serie de mezcladores estáticos Mott y dos mezcladores convencionales (los desplazamientos de datos reales son 0, 11 (sin mezclador), 0,22, 0,3, 0,35 mA y para una mejor visualización). También se evaluaron siete mezcladores comúnmente utilizados en la industria. Esto incluye mezcladoras con tres volúmenes internos diferentes de la compañía A (denominadas Mezcladora A1, A2 y A3) y de la compañía B (denominadas Mezcladora B1, B2 y B3). La compañía C solo calificó un tamaño.
Tabla 2. Características de agitación del mezclador estático y volumen interno Mezclador estático Caso 1 Recuperación sinusoidal: prueba de acetonitrilo (eficiencia) Caso 2 Recuperación sinusoidal: prueba de metanol-agua (eficiencia) Volumen interno (µl) Sin mezclador – - 0 Mezclador 30 65% 67,2% 30 Mezclador 60 92,2% 91,3% 60 Mezclador 90 98,1% 97,5% 90 Mezclador A1 66,4% 73,7% 50 Mezclador A2 89,8% 91,6% 150 Mezclador A3 92,2% 94,5% 250 Mezclador B1 44,8% 45,7% 9 35 Mezclador B2 845% 96,2% 370 Mezclador C 97,2% 97,4% 250
El análisis de los resultados en la Figura 8 y la Tabla 2 muestra que el mezclador estático Mott de 30 µl tiene la misma eficiencia de mezcla que el mezclador A1, es decir, 50 µl, sin embargo, el Mott de 30 µl tiene un 30% menos de volumen interno. Al comparar el mezclador Mott de 60 µl con el mezclador A2 de 150 µl de volumen interno, hubo una ligera mejora en la eficiencia de mezcla del 92% frente al 89%, pero más importante, este mayor nivel de mezcla se logró con 1/3 del volumen del mezclador. mezclador A2 similar. El rendimiento del mezclador Mott de 90 µl siguió la misma tendencia que el mezclador A3 con un volumen interno de 250 µl. También se observaron mejoras en el rendimiento de mezcla del 98% y 92% con una reducción de 3 veces en el volumen interno. Se obtuvieron resultados y comparaciones similares para los mezcladores B y C. Como resultado, la nueva serie de mezcladores estáticos Mott PerfectPeak™ proporciona una mayor eficiencia de mezcla que los mezcladores de la competencia comparables, pero con un menor volumen interno, proporcionando un menor ruido de fondo y una mejor relación señal-ruido, mayor sensibilidad al analito, forma del pico y resolución del pico. Se observaron tendencias similares en la eficiencia de mezcla en los estudios del Caso 1 y del Caso 2. Para el Caso 2, se realizaron pruebas utilizando (metanol y acetona como indicadores) para comparar la eficiencia de mezcla de Mott de 60 ml, un mezclador comparable A1 (volumen interno de 50 µl) y un mezclador comparable B1 (volumen interno de 35 µl). El rendimiento fue deficiente sin un mezclador instalado, pero se utilizó para el análisis de referencia. El mezclador Mott de 60 ml demostró ser el mejor mezclador en el grupo de prueba, proporcionando un aumento del 90 % en la eficiencia de mezcla. Un mezclador comparable A1 mostró una mejora del 75 % en la eficiencia de mezcla, seguido de una mejora del 45 % en un mezclador comparable B1. Se realizó una prueba básica de reducción de onda sinusoidal con caudal en una serie de mezcladores bajo las mismas condiciones que la prueba de curva sinusoidal en el Caso 1, con solo el caudal modificado. Los datos mostraron que en el rango de caudales de 0,25 a 1 ml/min, la disminución inicial de la onda sinusoidal se mantuvo relativamente constante para los tres volúmenes de mezclador. Para los dos mezcladores de menor volumen, hay un ligero aumento en la contracción sinusoidal a medida que disminuye el caudal, lo cual es esperado debido al mayor tiempo de residencia del disolvente en el mezclador, lo que permite una mayor mezcla por difusión. Se espera que la sustracción de la onda sinusoidal aumente a medida que el caudal disminuye aún más. Sin embargo, para el mayor volumen de mezclador con la mayor atenuación de la base de la onda sinusoidal, la atenuación de la base de la onda sinusoidal se mantuvo prácticamente sin cambios (dentro del rango de incertidumbre experimental), con valores que oscilan entre el 95 % y el 98 %. Rice. 10. Atenuación básica de una onda sinusoidal en función del caudal en el caso 1. La prueba se llevó a cabo en condiciones similares a la prueba sinusoidal con caudal variable, inyectando un 80 % de una mezcla 80/20 de acetonitrilo y agua y un 20 % de acetato de amonio 20 mM.
La nueva gama de mezcladores estáticos en línea PerfectPeak™ patentados, con tres volúmenes internos de 30 µl, 60 µl y 90 µl, cubre el rango de volumen y rendimiento de mezcla requerido para la mayoría de los análisis de HPLC que exigen una mezcla mejorada y bajos niveles de dispersión. El nuevo mezclador estático logra esto mediante el uso de una nueva tecnología de impresión 3D para crear una estructura 3D única que proporciona una mezcla estática hidrodinámica mejorada con la mayor reducción porcentual del ruido de base por unidad de volumen de mezcla interna. El uso de 1/3 del volumen interno de un mezclador convencional reduce el ruido de base en un 98 %. Estos mezcladores constan de canales de flujo tridimensionales interconectados con diferentes áreas de sección transversal y diferentes longitudes de trayectoria a medida que el líquido atraviesa barreras geométricas complejas en su interior. La nueva familia de mezcladores estáticos proporciona un rendimiento superior al de los mezcladores de la competencia, pero con un menor volumen interno, lo que resulta en una mejor relación señal-ruido y límites de cuantificación más bajos, así como una mejor forma de pico, eficiencia y resolución para una mayor sensibilidad.
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