È stato sviluppato un nuovo e rivoluzionario miscelatore statico in linea, progettato specificamente per soddisfare i rigorosi requisiti dei sistemi di cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) e cromatografia liquida ad altissime prestazioni (HPLC e UHPLC). Una miscelazione inadeguata di due o più fasi mobili può comportare un rapporto segnale/rumore più elevato, riducendo la sensibilità. La miscelazione statica omogenea di due o più fluidi con un volume interno e dimensioni fisiche minimi rappresenta il più alto standard per un miscelatore statico ideale. Il nuovo miscelatore statico raggiunge questo obiettivo utilizzando una nuova tecnologia di stampa 3D per creare una struttura 3D unica che fornisce una miscelazione statica idrodinamica migliorata con la massima riduzione percentuale dell'onda sinusoidale di base per unità di volume interno della miscela. Utilizzando 1/3 del volume interno di un miscelatore convenzionale, l'onda sinusoidale di base si riduce del 98%. Il miscelatore è costituito da canali di flusso 3D interconnessi con aree di sezione trasversale e lunghezze di percorso variabili, mentre il fluido attraversa complesse geometrie 3D. La miscelazione lungo molteplici percorsi di flusso tortuosi, combinata con turbolenze e vortici locali, si traduce in una miscelazione a livello micro, meso e macroscopico. Questo miscelatore unico è stato progettato utilizzando simulazioni di fluidodinamica computazionale (CFD). I dati sperimentali presentati dimostrano che si ottiene un'eccellente miscelazione con un volume interno minimo.
Da oltre 30 anni, la cromatografia liquida viene utilizzata in numerosi settori, tra cui quello farmaceutico, dei pesticidi, della protezione ambientale, della medicina legale e dell'analisi chimica. La capacità di misurare concentrazioni fino a parti per milione o meno è fondamentale per lo sviluppo tecnologico in qualsiasi settore. Una scarsa efficienza di miscelazione porta a un basso rapporto segnale/rumore, un problema che affligge la comunità cromatografica in termini di limiti di rilevamento e sensibilità. Quando si miscelano due solventi per HPLC, a volte è necessario forzare la miscelazione con mezzi esterni per omogeneizzare i due solventi, poiché alcuni solventi non si mescolano bene. Se i solventi non vengono miscelati accuratamente, può verificarsi un degrado del cromatogramma HPLC, che si manifesta con un rumore di fondo eccessivo e/o una forma dei picchi non ottimale. Con una miscelazione insufficiente, il rumore di fondo apparirà come un'onda sinusoidale (con salite e discese) del segnale del rivelatore nel tempo. Allo stesso tempo, una miscelazione insufficiente può portare ad allargamento e asimmetria dei picchi, riducendo le prestazioni analitiche, la forma e la risoluzione dei picchi. L'industria ha riconosciuto che i miscelatori statici in linea e a T rappresentano un mezzo per migliorare questi limiti e consentire agli utenti di raggiungere limiti di rilevamento (sensibilità) inferiori. Il miscelatore statico ideale combina i vantaggi di un'elevata efficienza di miscelazione, un basso volume morto e una bassa caduta di pressione con un volume minimo e una massima produttività del sistema. Inoltre, con l'aumentare della complessità delle analisi, gli analisti devono utilizzare regolarmente solventi più polari e difficili da miscelare. Ciò significa che una migliore miscelazione è fondamentale per le analisi future, aumentando ulteriormente la necessità di una progettazione e di prestazioni dei miscelatori superiori.
Mott ha recentemente sviluppato una nuova gamma di miscelatori statici in linea brevettati PerfectPeak™ con tre volumi interni: 30 µl, 60 µl e 90 µl. Queste dimensioni coprono la gamma di volumi e caratteristiche di miscelazione necessarie per la maggior parte dei test HPLC in cui sono richiesti una miscelazione migliorata e una bassa dispersione. Tutti e tre i modelli hanno un diametro di 0,5" e offrono prestazioni leader del settore in un design compatto. Sono realizzati in acciaio inossidabile 316L, passivato per l'inerzia chimica, ma sono disponibili anche titanio e altre leghe metalliche resistenti alla corrosione e chimicamente inerti. Questi miscelatori hanno una pressione operativa massima fino a 20.000 psi. La figura 1a mostra una fotografia di un miscelatore statico Mott da 60 µl progettato per fornire la massima efficienza di miscelazione utilizzando un volume interno inferiore rispetto ai miscelatori standard di questo tipo. Questo nuovo design di miscelatore statico utilizza una nuova tecnologia di produzione additiva per creare una struttura 3D unica che utilizza un flusso interno inferiore rispetto a qualsiasi miscelatore attualmente utilizzato nel settore della cromatografia per ottenere la miscelazione statica. Tali miscelatori sono costituiti da canali di flusso tridimensionali interconnessi con diverse aree di sezione trasversale e diverse lunghezze di percorso, man mano che il liquido attraversa complesse barriere geometriche al loro interno. La Figura 1b mostra uno schema del nuovo miscelatore, che utilizza raccordi a compressione filettati HPLC standard 10-32 per l'ingresso e l'uscita, e presenta bordi blu ombreggiati della porta di miscelazione interna brevettata. Le diverse aree di sezione trasversale dei percorsi di flusso interni e le variazioni di direzione del flusso all'interno del volume di flusso interno creano regioni di flusso turbolento e laminare, causando la miscelazione a livello micro, meso e macroscopico. La progettazione di questo miscelatore unico ha utilizzato simulazioni di fluidodinamica computazionale (CFD) per analizzare i modelli di flusso e perfezionare il design prima della prototipazione per test analitici interni e valutazioni sul campo da parte del cliente. La produzione additiva è il processo di stampa di componenti geometrici 3D direttamente da disegni CAD senza la necessità di lavorazioni meccaniche tradizionali (fresatrici, torni, ecc.). Questi nuovi miscelatori statici sono progettati per essere realizzati con questo processo, in cui il corpo del miscelatore viene creato a partire da disegni CAD e le parti vengono fabbricate (stampate) strato per strato mediante produzione additiva. In questo processo, viene depositato uno strato di polvere metallica di circa 20 micron di spessore e un laser controllato da computer fonde e solidifica selettivamente la polvere. Successivamente, viene applicato un altro strato sopra questo e si procede alla sinterizzazione laser. Questo processo viene ripetuto fino al completamento del pezzo. La polvere viene quindi rimossa dalla parte non saldata al laser, lasciando un componente stampato in 3D che corrisponde al disegno CAD originale. Il prodotto finale è in qualche modo simile al processo microfluidico, con la principale differenza che i componenti microfluidici sono solitamente bidimensionali (piatti), mentre con la produzione additiva è possibile creare complessi modelli di flusso in geometria tridimensionale. Questi rubinetti sono attualmente disponibili come componenti stampati in 3D in acciaio inossidabile 316L e titanio. La maggior parte delle leghe metalliche, dei polimeri e di alcune ceramiche possono essere utilizzati per realizzare componenti con questo metodo e saranno presi in considerazione per progetti/prodotti futuri.
Riso. 1. Fotografia (a) e diagramma (b) di un miscelatore statico Mott da 90 μl che mostra una sezione trasversale del percorso del flusso del fluido del miscelatore ombreggiato in blu.
Eseguire simulazioni di fluidodinamica computazionale (CFD) delle prestazioni di un miscelatore statico durante la fase di progettazione per contribuire allo sviluppo di progetti efficienti e ridurre esperimenti per tentativi ed errori, dispendiosi in termini di tempo e costi. Simulazione CFD di miscelatori statici e tubazioni standard (simulazione senza miscelatore) utilizzando il pacchetto software COMSOL Multiphysics. Modellazione tramite fluidodinamica laminare a pressione per comprendere la velocità e la pressione del fluido all'interno di un componente. Questa fluidodinamica, combinata con il trasporto chimico dei composti della fase mobile, aiuta a comprendere la miscelazione di due liquidi con concentrazioni diverse. Il modello viene studiato in funzione del tempo, pari a 10 secondi, per facilitare i calcoli durante la ricerca di soluzioni comparabili. I dati teorici sono stati ottenuti in uno studio correlato al tempo utilizzando lo strumento di proiezione della sonda puntiforme, dove è stato scelto un punto al centro dell'uscita per la raccolta dei dati. Il modello CFD e le prove sperimentali hanno utilizzato due solventi diversi attraverso una valvola di campionamento proporzionale e un sistema di pompaggio, con conseguente sostituzione del tappo per ciascun solvente nella linea di campionamento. Questi solventi vengono quindi miscelati in un miscelatore statico. Le figure 2 e 3 mostrano rispettivamente le simulazioni di flusso attraverso un tubo standard (senza miscelatore) e attraverso un miscelatore statico Mott. La simulazione è stata eseguita su un tubo diritto lungo 5 cm e con diametro interno di 0,25 mm per dimostrare il concetto di immissione alternata di acqua e acetonitrile puro nel tubo in assenza di un miscelatore statico, come mostrato in figura 2. La simulazione ha utilizzato le dimensioni esatte del tubo e del miscelatore e una portata di 0,3 ml/min.
Riso. 2. Simulazione del flusso CFD in un tubo di 5 cm con un diametro interno di 0,25 mm per rappresentare ciò che accade in un tubo HPLC, ovvero in assenza di un miscelatore. Il rosso pieno rappresenta la frazione di massa dell'acqua. Il blu rappresenta l'assenza di acqua, ovvero acetonitrile puro. Si possono osservare regioni di diffusione tra le bolle alternate di due liquidi diversi.
Riso. 3. Miscelatore statico con un volume di 30 ml, modellato nel software COMSOL CFD. La legenda rappresenta la frazione di massa dell'acqua nel miscelatore. L'acqua pura è mostrata in rosso e l'acetonitrile puro in blu. La variazione della frazione di massa dell'acqua simulata è rappresentata da una variazione del colore della miscelazione dei due liquidi.
La figura 4 mostra uno studio di validazione del modello di correlazione tra efficienza di miscelazione e volume di miscelazione. All'aumentare del volume di miscelazione, aumenta anche l'efficienza di miscelazione. A quanto risulta agli autori, altre complesse forze fisiche che agiscono all'interno del miscelatore non possono essere considerate in questo modello CFD, il che si traduce in una maggiore efficienza di miscelazione nei test sperimentali. L'efficienza di miscelazione sperimentale è stata misurata come percentuale di riduzione della sinusoide di base. Inoltre, una maggiore contropressione di solito comporta livelli di miscelazione più elevati, che non sono stati presi in considerazione nella simulazione.
Le seguenti condizioni HPLC e configurazione di prova sono state utilizzate per misurare le onde sinusoidali grezze al fine di confrontare le prestazioni relative di diversi miscelatori statici. Il diagramma in Figura 5 mostra una tipica configurazione di un sistema HPLC/UHPLC. Il miscelatore statico è stato testato posizionandolo direttamente dopo la pompa e prima dell'iniettore e della colonna di separazione. La maggior parte delle misurazioni sinusoidali di fondo vengono effettuate bypassando l'iniettore e la colonna capillare tra il miscelatore statico e il rivelatore UV. La configurazione del sistema, mostrata in Figura 5, è illustrata per la valutazione del rapporto segnale/rumore e/o l'analisi della forma del picco.
Figura 4. Grafico dell'efficienza di miscelazione in funzione del volume di miscelazione per una serie di miscelatori statici. L'impurità teorica segue lo stesso andamento dei dati sperimentali sull'impurità, confermando la validità delle simulazioni CFD.
Il sistema HPLC utilizzato per questo test era un sistema Agilent serie 1100 con rivelatore UV controllato da un PC con software Chemstation. La Tabella 1 mostra le condizioni di regolazione tipiche per la misurazione dell'efficienza del miscelatore tramite il monitoraggio delle sinusoidi di base in due casi di studio. I test sperimentali sono stati condotti su due diversi esempi di solventi. I due solventi miscelati nel caso 1 erano il solvente A (acetato di ammonio 20 mM in acqua deionizzata) e il solvente B (acetonitrile (ACN) all'80%/acqua deionizzata al 20%). Nel caso 2, il solvente A era una soluzione di acetone allo 0,05% (etichetta) in acqua deionizzata. Il solvente B è una miscela di metanolo e acqua all'80/20%. Nel caso 1, la pompa è stata impostata a una portata da 0,25 ml/min a 1,0 ml/min, mentre nel caso 2 è stata impostata a una portata costante di 1 ml/min. In entrambi i casi, il rapporto della miscela di solventi A e B era del 20% A/80% B. Il rivelatore è stato impostato a 220 nm nel caso 1, mentre nel caso 2 l'assorbimento massimo dell'acetone è stato impostato a una lunghezza d'onda di 265 nm.
Tabella 1. Configurazioni HPLC per i casi 1 e 2 Caso 1 Caso 2 Velocità della pompa da 0,25 ml/min a 1,0 ml/min 1,0 ml/min Solvente A Acetato di ammonio 20 mM in acqua deionizzata Acetone 0,05% in acqua deionizzata Solvente B Acetonitrile (ACN) 80% / acqua deionizzata 20% metanolo 80% / acqua deionizzata 20% Rapporto solvente 20% A / 80% B 20% A / 80% B Rivelatore 220 nm 265 nm
Rice. 6. Grafici di onde sinusoidali miste misurate prima e dopo l'applicazione di un filtro passa-basso per rimuovere le componenti di deriva della linea di base del segnale.
La Figura 6 mostra un tipico esempio di rumore di base misto nel Caso 1, rappresentato da un pattern sinusoidale ripetitivo sovrapposto alla deriva della linea di base. La deriva della linea di base è un lento aumento o diminuzione del segnale di fondo. Se al sistema non viene concesso un tempo sufficiente per stabilizzarsi, di solito diminuirà, ma continuerà a variare in modo irregolare anche quando il sistema è completamente stabile. Questa deriva della linea di base tende ad aumentare quando il sistema opera in condizioni di forte gradiente o di elevata contropressione. In presenza di questa deriva della linea di base, può risultare difficile confrontare i risultati tra i diversi campioni; questo problema può essere superato applicando un filtro passa-basso ai dati grezzi per eliminare queste variazioni a bassa frequenza, ottenendo così un grafico di oscillazione con una linea di base piatta. La Figura 6 mostra anche un grafico del rumore di base del miscelatore dopo l'applicazione di un filtro passa-basso.
Dopo aver completato le simulazioni CFD e i test sperimentali iniziali, sono stati successivamente sviluppati tre miscelatori statici separati utilizzando i componenti interni descritti in precedenza, con tre volumi interni: 30 µl, 60 µl e 90 µl. Questo intervallo copre la gamma di volumi e prestazioni di miscelazione richiesti per applicazioni HPLC a basso analita, dove sono necessari una miscelazione migliorata e una bassa dispersione per produrre linee di base a bassa ampiezza. La figura 7 mostra le misurazioni di base dell'onda sinusoidale ottenute sul sistema di prova dell'Esempio 1 (acetonitrile e acetato di ammonio come traccianti) con tre volumi di miscelatori statici e senza miscelatori installati. Le condizioni di prova sperimentali per i risultati mostrati nella Figura 7 sono state mantenute costanti durante tutti e 4 i test secondo la procedura descritta nella Tabella 1 a una velocità di flusso del solvente di 0,5 ml/min. Applicare un valore di offset ai set di dati in modo che possano essere visualizzati uno accanto all'altro senza sovrapposizione del segnale. L'offset non influisce sull'ampiezza del segnale utilizzato per valutare il livello di prestazione del miscelatore. L'ampiezza sinusoidale media senza il miscelatore era di 0,221 mAi, mentre le ampiezze dei miscelatori statici di Mott a 30 µl, 60 µl e 90 µl sono scese rispettivamente a 0,077, 0,017 e 0,004 mAi.
Figura 7. Offset del segnale del rivelatore UV HPLC in funzione del tempo per il Caso 1 (acetonitrile con indicatore di acetato di ammonio) che mostra la miscelazione del solvente senza miscelatore, con miscelatori Mott da 30 µl, 60 µl e 90 µl che mostrano una miscelazione migliorata (ampiezza del segnale inferiore) all'aumentare del volume del miscelatore statico. (offset dei dati effettivi: 0,13 (senza miscelatore), 0,32, 0,4, 0,45 mA per una migliore visualizzazione).
I dati mostrati nella figura 8 sono gli stessi della figura 7, ma questa volta includono i risultati di tre miscelatori statici HPLC comunemente utilizzati con volumi interni di 50 µl, 150 µl e 250 µl. Rice. Figura 8. Grafico dell'offset del segnale del rivelatore UV HPLC in funzione del tempo per il caso 1 (acetonitrile e acetato di ammonio come indicatori) che mostra la miscelazione del solvente senza miscelatore statico, la nuova serie di miscelatori statici Mott e tre miscelatori convenzionali (l'offset dei dati effettivi è rispettivamente 0,1 (senza miscelatore), 0,32, 0,48, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 mA per un migliore effetto di visualizzazione). La riduzione percentuale dell'onda sinusoidale di base è calcolata dal rapporto tra l'ampiezza dell'onda sinusoidale e l'ampiezza senza il miscelatore installato. Le percentuali di attenuazione dell'onda sinusoidale misurate per i casi 1 e 2 sono elencate nella Tabella 2, insieme ai volumi interni di un nuovo miscelatore statico e di sette miscelatori standard comunemente utilizzati nel settore. I dati nelle Figure 8 e 9, così come i calcoli presentati nella Tabella 2, mostrano che il miscelatore statico Mott può fornire un'attenuazione dell'onda sinusoidale fino al 98,1%, superando di gran lunga le prestazioni di un miscelatore HPLC convenzionale in queste condizioni di prova. Figura 9. Grafico dell'offset del segnale del rivelatore UV HPLC in funzione del tempo per il caso 2 (metanolo e acetone come traccianti) che mostra l'assenza di un miscelatore statico (combinato), una nuova serie di miscelatori statici Mott e due miscelatori convenzionali (gli offset dei dati effettivi sono 0, 11 (senza miscelatore), 0,22, 0,3, 0,35 mA e per una migliore visualizzazione). Sono stati valutati anche sette miscelatori comunemente utilizzati nel settore. Tra questi figurano miscelatori con tre diversi volumi interni, prodotti dall'azienda A (denominati Miscelatore A1, A2 e A3) e dall'azienda B (denominati Miscelatore B1, B2 e B3). L'azienda C ha valutato un solo modello.
Tabella 2. Caratteristiche di agitazione del miscelatore statico e volume interno Miscelatore statico Caso 1 Recupero sinusoidale: test con acetonitrile (efficienza) Caso 2 Recupero sinusoidale: test con metanolo e acqua (efficienza) Volume interno (µl) Senza miscelatore – - 0 Mott 30 65% 67,2% 30 Mott 60 92,2% 91,3% 60 Mott 90 98,1% 97,5% 90 Miscelatore A1 66,4% 73,7% 50 Miscelatore A2 89,8% 91,6% 150 Miscelatore A3 92,2% 94,5% 250 Miscelatore B1 44,8% 45,7% 9 35 Miscelatore B2 845% 96,2% 370 Miscelatore C 97,2% 97,4% 250
L'analisi dei risultati in Figura 8 e Tabella 2 mostra che il miscelatore statico Mott da 30 µl ha la stessa efficienza di miscelazione del miscelatore A1, ovvero da 50 µl, tuttavia, il Mott da 30 µl ha un volume interno inferiore del 30%. Confrontando il miscelatore Mott da 60 µl con il miscelatore A2 da 150 µl di volume interno, si è osservato un leggero miglioramento nell'efficienza di miscelazione, pari al 92% rispetto all'89%, ma soprattutto, questo livello di miscelazione più elevato è stato raggiunto con 1/3 del volume del miscelatore. Le prestazioni del miscelatore Mott da 90 µl hanno seguito lo stesso andamento del miscelatore A3 con un volume interno di 250 µl. Sono stati inoltre osservati miglioramenti nelle prestazioni di miscelazione del 98% e del 92% con una riduzione di 3 volte del volume interno. Risultati e confronti simili sono stati ottenuti per i miscelatori B e C. Di conseguenza, la nuova serie di miscelatori statici Mott PerfectPeakTM offre una maggiore efficienza di miscelazione rispetto ai miscelatori concorrenti comparabili, ma con un volume interno inferiore, fornendo un rumore di fondo migliore e un migliore rapporto segnale/rumore, una migliore sensibilità dell'analita, forma del picco e risoluzione del picco. Tendenze simili nell'efficienza di miscelazione sono state osservate sia negli studi del Caso 1 che del Caso 2. Per il Caso 2, sono stati eseguiti test utilizzando (metanolo e acetone come indicatori) per confrontare l'efficienza di miscelazione di un Mott da 60 ml, un miscelatore comparabile A1 (volume interno 50 µl) e un miscelatore comparabile B1 (volume interno 35 µl). Le prestazioni erano scarse senza un miscelatore installato, ma è stato utilizzato per l'analisi di base. Il miscelatore Mott da 60 ml si è dimostrato il miglior miscelatore nel gruppo di test, fornendo un aumento del 90% nell'efficienza di miscelazione. Un miscelatore comparabile A1 ha visto un miglioramento del 75% nell'efficienza di miscelazione seguito da un miglioramento del 45% in un miscelatore comparabile B1. Un test di base di riduzione dell'onda sinusoidale con portata è stato condotto su una serie di miscelatori nelle stesse condizioni del test della curva sinusoidale nel Caso 1, variando solo la portata. I dati hanno mostrato che nell'intervallo di portate da 0,25 a 1 ml/min, la diminuzione iniziale dell'onda sinusoidale è rimasta relativamente costante per tutti e tre i volumi del miscelatore. Per i due miscelatori di volume inferiore, si osserva un leggero aumento della contrazione sinusoidale al diminuire della portata, come previsto a causa del maggiore tempo di permanenza del solvente nel miscelatore, che consente una maggiore miscelazione per diffusione. Ci si aspetta che la sottrazione dell'onda sinusoidale aumenti al diminuire ulteriormente della portata. Tuttavia, per il volume del miscelatore più grande con la maggiore attenuazione della base dell'onda sinusoidale, l'attenuazione della base dell'onda sinusoidale è rimasta praticamente invariata (entro l'intervallo di incertezza sperimentale), con valori compresi tra il 95% e il 98%. Rice. 10. Attenuazione di base di un'onda sinusoidale in funzione della portata nel caso 1. Il test è stato eseguito in condizioni simili al test sinusoidale con portata variabile, iniettando l'80% di una miscela 80/20 di acetonitrile e acqua e il 20% di acetato di ammonio 20 mM.
La nuova gamma di miscelatori statici in linea brevettati PerfectPeak™, disponibile in tre volumi interni (30 µl, 60 µl e 90 µl), copre l'intervallo di volume e prestazioni di miscelazione richiesto per la maggior parte delle analisi HPLC che necessitano di una miscelazione migliorata e di bassi livelli di dispersione. Il nuovo miscelatore statico raggiunge questo obiettivo grazie all'utilizzo di una nuova tecnologia di stampa 3D che crea una struttura 3D unica, garantendo una miscelazione statica idrodinamica ottimizzata con la massima riduzione percentuale del rumore di fondo per unità di volume di miscelazione interna. L'utilizzo di 1/3 del volume interno di un miscelatore convenzionale riduce il rumore di fondo del 98%. Questi miscelatori sono costituiti da canali di flusso tridimensionali interconnessi con diverse aree di sezione trasversale e diverse lunghezze di percorso, man mano che il liquido attraversa complesse barriere geometriche al loro interno. La nuova famiglia di miscelatori statici offre prestazioni superiori rispetto ai miscelatori della concorrenza, ma con un volume interno inferiore, con conseguente miglioramento del rapporto segnale/rumore e dei limiti di quantificazione, nonché una migliore forma del picco, efficienza e risoluzione per una maggiore sensibilità.
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