Nature.com'u ziyaret ettiğiniz için teşekkür ederiz. Kullandığınız tarayıcı sürümü sınırlı CSS desteğine sahiptir. En iyi deneyim için güncellenmiş bir tarayıcı kullanmanızı (veya Internet Explorer'da Uyumluluk Modunu devre dışı bırakmanızı) öneririz. Bu arada, sürekli desteği sağlamak için siteyi stiller ve JavaScript olmadan sunacağız.
Kuşların doğurganlığı, sperm depolama tübüllerinde (SST) uzun süre yeterli miktarda canlı sperm depolayabilme yeteneklerine bağlıdır. Spermatozoaların SST'ye girme, kalma ve ayrılma mekanizmaları hala tartışmalıdır. Sharkasi tavuklarının spermleri, birçok hücre içeren hareketli filamentöz demetler oluşturarak yüksek bir aglütinasyon eğilimi göstermiştir. Opak bir fallop tüpünde spermatozoanın hareketliliğini ve davranışını gözlemlemenin zorluğu nedeniyle, spermatozoanın aglütinasyonunu ve hareketliliğini incelemek için spermatozoanınkine benzer bir mikrokanal kesitine sahip bir mikroakışkan cihaz kullandık. Bu çalışma, sperm demetlerinin nasıl oluştuğunu, nasıl hareket ettiğini ve SST'de spermin kalış süresini uzatmadaki olası rollerini tartışmaktadır. Hidrostatik basınçla (akış hızı = 33 µm/s) bir mikroakışkan kanal içinde sıvı akışı oluşturulduğunda sperm hızını ve reolojik davranışını araştırdık. Spermatozoalar akıntıya karşı yüzme eğilimindedir (pozitif reoloji) ve spermatozoa demetinin hızı tek spermatozoalara kıyasla önemli ölçüde azalır. Sperm demetlerinin spiral şeklinde hareket ettiği ve daha fazla tek sperm toplandıkça uzunluk ve kalınlıklarının arttığı gözlemlenmiştir. Sperm demetlerinin, 33 µm/s'den daha hızlı akışkan akış hızıyla süpürülmekten kaçınmak için mikroakışkan kanallarının yan duvarlarına yaklaştığı ve yapıştığı gözlendi. Sperm demetlerinin, 33 µm/s'den daha hızlı akışkan akış hızıyla süpürülmekten kaçınmak için mikroakışkan kanallarının yan duvarlarına yaklaştığı ve yapıştığı gözlendi. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются ve прилипают к боковым стенкам микрофлюидных kanallar, чтобы избежать со скоростью потока жидкости> 33 мкм / с. Sperm demetlerinin, 33 µm/s'den fazla sıvı akış hızlarında sürüklenmekten kaçınmak için mikroakışkan kanallarının yan duvarlarına yaklaştığı ve yapıştığı gözlemlenmiştir.Verim hızı > 33 µm/sn.33 µm/sn. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются ve прилипают к боковым стенкам микрожидкостного kanala, чтобы избежать сметания потоком жидкости со скоростью > 33 мкм/с. Sperm demetlerinin, >33 µm/s hızındaki sıvı akışı tarafından sürüklenmekten kaçınmak için mikroakışkan kanalın yan duvarlarına yaklaştığı ve yapıştığı gözlemlenmiştir.Tarama ve transmisyon elektron mikroskobu, sperm demetlerinin bol miktarda yoğun materyal tarafından desteklendiğini ortaya koydu. Elde edilen veriler, Sharkazi tavuk spermatozoasının benzersiz hareketliliğini ve spermatozoanın aglütine olma ve hareketli demetler oluşturma yeteneğini ortaya koyuyor ve bu da spermatozoanın SMT'de uzun süreli depolanmasının daha iyi anlaşılmasına katkıda bulunuyor.
İnsanlarda ve çoğu hayvanda döllenmeyi başarmak için sperm ve yumurtalar döllenme yerine doğru zamanda ulaşmalıdır. Bu nedenle, çiftleşme yumurtlamadan önce veya yumurtlama anında gerçekleşmelidir. Öte yandan, köpekler gibi bazı memeliler ve böcekler, balıklar, sürüngenler ve kuşlar gibi memeli olmayan türler, yumurtaları döllenmeye hazır olana kadar spermi üreme organlarında uzun bir süre depolarlar (eşzamansız döllenme 1 ). Kuşlar, yumurtaları dölleyebilen spermatozoanın canlılığını 2-10 hafta boyunca koruyabilirler2.
Bu, kuşları diğer hayvanlardan ayıran benzersiz bir özelliktir, çünkü birkaç hafta boyunca eş zamanlı çiftleşme ve yumurtlama olmadan tek bir tohumlamadan sonra yüksek bir döllenme olasılığı sağlar. Sperm depolama tübülü (SST) adı verilen ana sperm depolama organı, uterovajinal bağlantıdaki iç mukozal kıvrımlarda bulunur. Bugüne kadar, spermin sperm bankasına girme, kalma ve çıkma mekanizmaları tam olarak anlaşılmamıştır. Önceki çalışmalara dayanarak, birçok hipotez öne sürülmüştür, ancak bunların hiçbiri doğrulanmamıştır.
Forman4, spermatozoa'nın SST epitel hücrelerinde bulunan protein kanallarından sıvı akışının yönüne karşı sürekli salınımlı hareketle SST boşluğunda ikametini sürdürdüğünü öne sürdü (reoloji). Spermi SST lümeninde tutmak için gereken sürekli flagellar aktivite nedeniyle ATP tükenir ve hareketlilik sonunda spermler sıvı akışıyla sperm bankasından taşınana ve spermi döllemek için yükselen fallop tüpünden aşağı yeni bir yolculuğa başlayana kadar azalır. Yumurta (Forman4). Bu sperm depolama modeli, SST epitel hücrelerinde bulunan aquaporin 2, 3 ve 9'un immünositokimya ile saptanmasıyla desteklenmektedir. Bugüne kadar, tavuk semen reolojisi ve SST depolama, vajinal sperm seçimi ve sperm rekabetindeki rolü üzerine çalışmalar eksiktir. Tavuklarda, sperm doğal çiftleşmeden sonra vajinaya girer, ancak spermatozoa'nın %80'inden fazlası çiftleşmeden kısa bir süre sonra vajinadan atılır. Bu, vajinanın kuşlarda sperm seçimi için birincil yer olduğunu göstermektedir. Ek olarak, vajinada döllenen spermatozoaların %1'den azının SST'lerde sonlandığı bildirilmiştir2. Vajinada civcivlerin yapay tohumlanmasında, SST'ye ulaşan spermatozoa sayısı tohumlamadan 24 saat sonra artma eğilimindedir. Şimdiye kadar, bu süreçte sperm seçiminin mekanizması belirsizdir ve sperm hareketliliği SST sperm alımında önemli bir rol oynayabilir. Fallop tüplerinin kalın ve opak duvarları nedeniyle, kuşların fallop tüplerindeki sperm hareketliliğini doğrudan izlemek zordur. Bu nedenle, spermatozoanın döllenmeden sonra SST'ye nasıl geçtiğine dair temel bilgiden yoksunduruz.
Reoloji, son zamanlarda memeli genital organlarında sperm taşınmasını kontrol eden önemli bir faktör olarak kabul edilmiştir. Hareketli spermatozoaların ters akımla göç etme yeteneğine dayanarak, Zaferani ve arkadaşları8, hareketli spermatozoaları kalemle tutulan semen örneklerinden pasif olarak izole etmek için bir corra mikroakışkan sistemi kullanmışlardır. Bu tür semen ayırma, tıbbi kısırlık tedavisi ve klinik araştırmalar için önemlidir ve zaman ve emek yoğun olan ve sperm morfolojisini ve yapısal bütünlüğünü tehlikeye atabilen geleneksel yöntemlere göre tercih edilir. Ancak, bugüne kadar tavukların genital organlarından gelen salgıların sperm hareketliliği üzerindeki etkisine dair hiçbir çalışma yapılmamıştır.
SST'de depolanan spermi koruyan mekanizmadan bağımsız olarak, birçok araştırmacı yerleşik spermatozoaların tavuk 9, 10, bıldırcın 2 ve hindi 11'in SST'sinde aglütine sperm demetleri oluşturmak için kafa kafaya aglütine olduğunu gözlemlemiştir. Yazarlar, bu aglütinasyon ile spermatozoanın SST'de uzun süreli depolanması arasında bir bağlantı olduğunu öne sürmektedir.
Tingari ve Lake12, tavuğun sperm alıcı bezindeki spermatozoa arasında güçlü bir ilişki olduğunu bildirdi ve kuş spermatozoasının memeli spermatozoasıyla aynı şekilde aglütine olup olmadığını sorguladı. Vas deferens'teki spermler arasındaki derin bağlantıların, küçük bir alanda çok sayıda spermin bulunmasının neden olduğu stresten kaynaklanabileceğine inanıyorlar.
Taze asılı cam slaytlardaki spermatozoa davranışını değerlendirirken, özellikle semen damlacıklarının kenarlarında geçici aglütinasyon belirtileri görülebilir. Ancak, aglütinasyon genellikle sürekli hareketle ilişkili dönme eylemi tarafından bozulmuştur ve bu da bu olgunun geçici doğasını açıklar. Araştırmacılar ayrıca, seyreltici semen eklendiğinde, uzunlamasına "iplik benzeri" hücre kümelerinin ortaya çıktığını fark ettiler.
Bir spermatozoayı taklit etmeye yönelik erken girişimler, sarkan bir damladan ince bir telin çıkarılmasıyla yapıldı; bu, semen damlasından dışarı doğru uzanan uzun bir sperm benzeri vezikülün oluşmasıyla sonuçlandı. Spermatozoalar vezikülün içinde hemen paralel bir şekilde sıralandı, ancak tüm birim 3B sınırlaması nedeniyle hızla kayboldu. Bu nedenle, spermatozoa aglütinasyonunu incelemek için, izole edilmiş sperm depolama tübüllerinde spermatozoanın hareketliliğini ve davranışını doğrudan gözlemlemek gerekir; bu da elde edilmesi zor bir şeydir. Bu nedenle, sperm hareketliliği ve aglütinasyon davranışı çalışmalarını desteklemek için spermatozoayı taklit eden bir araç geliştirmek gerekir. Brillard ve ark.13 yetişkin civcivlerde sperm depolama tübüllerinin ortalama uzunluğunun 400-600 µm olduğunu, ancak bazı SST'lerin 2000 µm kadar uzun olabileceğini bildirmiştir. Mero ve Ogasawara14 seminifer bezleri, her ikisi de uzunluk (~500 µm) ve boyun genişliği (~38 µm) olarak aynı olan genişlemiş ve genişlememiş sperm depolama tübüllerine ayırdı, ancak tübüllerin ortalama lümen çapı sırasıyla 56,6 ve 56,6 µm idi. . , sırasıyla 11,2 µm. Mevcut çalışmada, kesiti yükseltilmiş SST'ninkine biraz yakın olan, kanal boyutu 200 µm × 20 µm (G × Y) olan bir mikroakışkan cihaz kullandık. Ek olarak, akan sıvıda sperm hareketliliğini ve aglütinasyon davranışını inceledik; bu, SST epitel hücreleri tarafından üretilen sıvının spermi lümende ters akım (reolojik) yönde tuttuğu yönündeki Foreman hipoteziyle tutarlıdır.
Bu çalışmanın amacı, fallop tüpündeki spermatozoa hareketliliğini gözlemleme sorunlarının üstesinden gelmek ve dinamik bir ortamda spermatozoa reolojisi ve davranışını incelemenin zorluklarından kaçınmaktı. Bir tavuğun genital organlarındaki sperm hareketliliğini simüle etmek için hidrostatik basınç oluşturan bir mikroakışkan cihaz kullanıldı.
Seyreltilmiş bir sperm örneğinin (1:40) bir damlası mikrokanal cihazına yüklendiğinde, iki tip sperm hareketliliği tanımlanabildi (izole sperm ve bağlı sperm). Ek olarak, spermatozoa akıntıya karşı yüzme eğilimindeydi (pozitif reoloji; video 1, 2). Sperm demetleri tek başına spermlere göre daha düşük hıza sahip olsa da (p < 0,001), pozitif reotaksis gösteren sperm yüzdesini artırdı (p < 0,001; Tablo 2). Sperm demetleri tek başına spermlere göre daha düşük hıza sahip olsa da (p < 0,001), pozitif reotaksis gösteren sperm yüzdesini artırdı (p < 0,001; Tablo 2). Хотя пучки сперматозоидов имели более низкую скорость, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), они увеличивали процент сперматозоидов, демонстрирующих положительный реотаксис (p < 0,001; таблица 2). Spermatozoa demetlerinin hızı tek spermatozoalara göre daha düşük olmasına rağmen (p < 0,001), pozitif reotaksis gösteren spermatozoaların yüzdesini artırdı (p < 0,001; Tablo 2).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度（p < 0,001），但它们增加了显示阳性流变性的精子百分比（p < 0,001；表2）。尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 （p <0,001） ， 但 增加 了 显示 阳性 流变性 精子（p <0,001 ； 2。。。。。。）））））） Хотя скорость пучков сперматозоидов была ниже, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), они увеличивали процент сперматозоидов с положительной реологией (p < 0,001; таблица 2). Sperm demetlerinin hızı tekli spermlere göre daha düşük olmasına rağmen (p < 0,001), pozitif reolojiye sahip spermlerin yüzdesini artırdı (p < 0,001; Tablo 2).Tek spermatozoa ve tutam spermatozoa için pozitif reolojinin sırasıyla yaklaşık %53 ve %85 olduğu tahmin edilmektedir.
Sharkashi tavuklarının spermatozoalarının boşalmadan hemen sonra düzinelerce bireyden oluşan doğrusal demetler oluşturduğu gözlemlenmiştir. Bu tutamlar zamanla uzunluk ve kalınlık olarak artar ve dağılmadan önce birkaç saat in vitro kalabilir (video 3). Bu filamentli demetler, epididimin sonunda oluşan echidna spermatozoalarına benzer şekildedir. Sharkashi tavuk sperminin toplandıktan sonra bir dakikadan kısa bir sürede aglütine olma ve retiküle bir demet oluşturma eğiliminin yüksek olduğu bulunmuştur. Bu ışınlar dinamiktir ve yakındaki herhangi bir duvara veya statik nesneye yapışabilir. Sperm demetleri sperm hücrelerinin hızını azaltsa da, makroskobik olarak doğrusallıklarını artırdıkları açıktır. Demetlerin uzunluğu, demetlerde toplanan sperm sayısına bağlı olarak değişir. Demetin iki kısmı izole edilmiştir: aglütine olmuş spermin serbest başını içeren başlangıç ​​kısmı ve kuyruğu ve spermin tüm distal ucunu içeren terminal kısmı. Yüksek hızlı bir kamera (950 fps) kullanılarak, demetin başlangıç ​​kısmında, salınımlı hareketleri nedeniyle demetin hareketinden sorumlu olan ve kalanları helezoni bir hareketle demete sürükleyen aglütine spermatozoa'nın serbest başları gözlemlendi (Video 4). Ancak, uzun tutamlarda, bazı serbest sperm başlarının gövdeye yapıştığı ve tutamın terminal kısmının tutamı itmeye yardımcı olmak için kanat görevi gördüğü gözlemlendi.
Yavaş bir sıvı akışında, sperm demetleri birbirine paralel hareket eder, ancak akış hızı arttıkça akım tarafından yıkanmamak için üst üste binmeye ve hareketsiz olan her şeye yapışmaya başlarlar. Bir avuç sperm hücresi birbirine yaklaştığında demetler oluşur, senkronize olarak hareket etmeye ve birbirlerinin etrafına sarılmaya başlarlar ve sonra yapışkan bir maddeye yapışırlar. Şekil 1 ve 2, spermlerin birbirlerine nasıl yaklaştığını ve kuyruklar birbirinin etrafına sarıldığında bir bağlantı oluşturduğunu gösterir.
Araştırmacılar sperm reolojisini incelemek için bir mikrokanalda sıvı akışı oluşturmak için hidrostatik basınç uyguladılar. 200 µm × 20 µm (G × Y) boyutunda ve 3,6 µm uzunluğunda bir mikrokanal kullanıldı. Kaplar arasında uçlarına şırıngalar takılmış mikrokanallar kullanıldı. Kanalları daha görünür hale getirmek için gıda boyası kullanıldı.
Bağlantı kablolarını ve aksesuarları duvara bağlayın. Video bir faz kontrast mikroskobu ile çekildi. Her görüntüde faz kontrast mikroskopisi ve haritalama görüntüleri sunulur. (A) İki akış arasındaki bağlantı, helezoni hareket nedeniyle akışa direnir (kırmızı ok). (B) Tüp demeti ile kanal duvarı arasındaki bağlantı (kırmızı oklar), aynı zamanda diğer iki demete bağlıdırlar (sarı oklar). (C) Mikroakışkan kanaldaki sperm demetleri birbirleriyle bağlantı kurmaya başlar (kırmızı oklar), bir sperm demetleri ağı oluştururlar. (D) Bir sperm demetleri ağının oluşumu.
Seyreltilmiş sperm damlası mikroakışkan cihazına yüklendiğinde ve bir akış oluşturulduğunda, sperm ışınının akış yönünün tersine hareket ettiği gözlemlendi. Demetler mikrokanalların duvarlarına sıkıca oturur ve demetlerin başlangıç ​​kısmındaki serbest başlar sıkıca oturur (video 5). Ayrıca, akım tarafından sürüklenmeye direnmek için yollarındaki kalıntılar gibi herhangi bir sabit parçacığa yapışırlar. Zamanla, bu tutamlar diğer tek spermatozoaları ve daha kısa tutamları hapseden uzun filamentler haline gelir (Video 6). Akış yavaşlamaya başladığında, uzun sperm hatları bir sperm hattı ağı oluşturmaya başlar (Video 7; Şekil 2).
Yüksek akış hızında (V > 33 µm/s), akışın sürüklenme kuvvetine daha iyi direnen çok sayıda bireysel spermi yakalama girişimi olarak ipliklerin spiral hareketleri artar. Yüksek akış hızında (V > 33 µm/s), akışın sürüklenme kuvvetine daha iyi direnen çok sayıda bireysel spermi yakalama girişimi olarak ipliklerin spiral hareketleri artar. При высокой скорости потока (V > 33 мкм/с) спиралевидные движения нитей усиливаются, поскольку они пытаются поймать множество отдельных сперматозоидов, образующих пучки, которые лучше противостоят дрейфующей силе потока. Yüksek akış hızlarında (V > 33 µm/s), akışın sürüklenme kuvvetine daha iyi direnebilen demetler oluşturan çok sayıda bireysel spermatozoayı yakalamaya çalıştıkça, tellerin sarmal hareketleri artar.Yükseklik(V > 33 µm/s)时,螺纹的螺旋运动增加,以试图捕捉许多形成束的单个精子, 从而更好地抵抗流动的漂移力。在 高 流速 (v> 33 µm/s) 时 ， 的 螺旋 运动 增加 ， 以 试图 许多 形成 束 单 个 精子 ， Bu, şu an için çok önemli bir şey. При высоких скоростях потока (V > 33 мкм/с) попытке захватить При высоких скоростях потока (V > 33 mкм/с) спиральное движение нитей увеличивается çok fazla отдельных сперматозоидов, образующих пучки, чтобы лучше сопротивляться силам дрейфа потока. Yüksek akış hızlarında (V > 33 µm/s), akışın sürüklenme kuvvetlerine daha iyi direnmek için çok sayıda bireysel spermatozoayı yakalayıp demetler oluşturmak amacıyla filamentlerin sarmal hareketi artar.Ayrıca yan duvarlara mikrokanallar bağlamaya çalıştılar.
Sperm demetleri, ışık mikroskobu (LM) kullanılarak sperm başları ve kıvrık kuyruk kümeleri olarak tanımlandı. Çeşitli kümelere sahip sperm demetleri ayrıca bükülmüş baş ve kamçı kümeleri, çoklu kaynaşmış sperm kuyrukları, bir kuyruğa bağlı sperm başları ve bükülmüş çekirdeklere sahip sperm başları çoklu kaynaşmış çekirdekler olarak tanımlandı. Transmisyon elektron mikroskobu (TEM). Taramalı elektron mikroskobu (SEM), sperm demetlerinin sperm başlarının kılıflanmış kümeleri olduğunu ve sperm kümelerinin sarılı kuyruklardan oluşan bağlı bir ağ gösterdiğini gösterdi.
Spermatozoaların morfolojisi ve ultra yapısı, spermatozoa demetlerinin oluşumu ışık mikroskobu (yarım kesit), taramalı elektron mikroskobu (SEM) ve transmisyon elektron mikroskobu (TEM) kullanılarak incelendi, sperm yaymaları akridin turuncusu ile boyandı ve epifloresan mikroskopi kullanılarak incelendi.
Akridin turuncusu ile sperm yayma boyama (Şekil 3B), sperm başlarının birbirine yapıştığını ve salgı materyaliyle kaplandığını gösterdi, bu da büyük tutamların oluşumuna yol açtı (Şekil 3D). Sperm demetleri, bağlı kuyruklardan oluşan bir ağa sahip sperm kümelerinden oluşuyordu (Şekil 4A-C). Sperm demetleri, birbirine yapışmış birçok spermatozoanın kuyruklarından oluşur (Şekil 4D). Sırlar (Şekil 4E,F), spermatozoa demetlerinin başlarını kapladı.
Spermatozoa demetinin oluşumu Faz kontrast mikroskopisi ve akridin turuncusu ile boyanmış sperm yaymaları kullanılarak, spermatozoa başlarının birbirine yapıştığı gösterilmiştir. (A) Erken sperm tutamı oluşumu bir sperm (beyaz daire) ve üç sperm (sarı daire) ile başlar, spiral kuyruktan başlayıp başta biter. (B) Akridin turuncusu ile boyanmış bir sperm yaymasının fotomikrografisinde yapışık sperm başları (oklar) görülmektedir. Akridin turuncusu başları (başları) kaplamaktadır. Büyütme × 1000. (C) Bir mikroakışkan kanalda akışla taşınan büyük bir ışının gelişimi (950 fps'de yüksek hızlı bir kamera kullanılarak). (D) Akridin turuncusu ile boyanmış bir sperm yaymasının mikrografisinde büyük tutamlar (oklar) görülmektedir. Büyütme: ×200.
Akridin turuncusu ile boyanmış bir sperm demeti ve sperm yaymasının taramalı elektron mikroskobu. (A, B, D, E) spermatozoanın dijital renkli taramalı elektron mikroskobu görüntüleri ve C ve F, kuyruk ağını saran çok sayıda spermatozoanın tutunmasını gösteren akridin turuncusu ile boyanmış sperm yaymalarının mikroskobu görüntüleridir. (AC) Sperm kümeleri, bağlı kuyruklardan oluşan bir ağ şeklinde gösterilmiştir (oklar). (D) Kuyruğun etrafına dolanan birkaç spermatozoanın yapışması (yapışkan madde, pembe dış hat, ok). (E ve F) Yapışkan madde ile kaplı sperm başı kümeleri (işaretçiler). Spermatozoa, birkaç girdap benzeri yapıya sahip demetler oluşturmuştur (F). (C) ×400 ve (F) ×200 büyütme.
Transmisyon elektron mikroskobu kullanarak sperm demetlerinin bağlı kuyruklara (Şekil 6A, C), kuyruklara bağlı başlara (Şekil 6B) veya kuyruklara bağlı başlara (Şekil 6D) sahip olduğunu bulduk. Demetteki spermatozoa başları kavislidir ve kesitte iki nükleer bölge sunar (Şekil 6D). Kesik demetinde spermatozoa, iki nükleer bölge ve çoklu kamçı bölgeleri olan bükülmüş bir başa sahipti (Şekil 5A).
Sperm demetindeki bağlantı kuyruklarını ve sperm başlarını birbirine bağlayan aglutinasyon materyalini gösteren dijital renkli elektron mikroskobu. (A) Çok sayıda spermatozoanın bağlı kuyruğu. Kuyruğun hem portre (ok) hem de manzara (ok) projeksiyonlarında nasıl göründüğüne dikkat edin. (B) Spermin başı (ok) kuyruğa (ok) bağlıdır. (C) Birkaç sperm kuyruğu (ok) bağlıdır. (D) Aglütinasyon materyali (AS, mavi) dört sperm başını (mor) birbirine bağlar.
Taramalı elektron mikroskobu, salgılar veya zarlarla kaplı sperm demetlerindeki sperm başlarını tespit etmek için kullanıldı (Şekil 6B), bu da sperm demetlerinin hücre dışı materyal tarafından sabitlendiğini gösteriyordu. Aglütine olmuş materyal sperm başında yoğunlaştı (denizanası başı benzeri birleşim; Şekil 5B) ve distal olarak genişledi, akridin turuncusu ile boyandığında floresan mikroskopisi altında parlak sarı bir görünüm verdi (Şekil 6C). Bu madde bir tarama mikroskobu altında açıkça görülebilir ve bir bağlayıcı olarak kabul edilir. Yarı ince kesitler (Şekil 5C) ve akridin turuncusu ile boyanan sperm yaymaları, yoğun şekilde paketlenmiş başlar ve kıvrık kuyruklar içeren sperm demetleri gösterdi (Şekil 5D).
Çeşitli yöntemler kullanılarak sperm başlarının ve kıvrılmış kuyrukların bir araya gelmesini gösteren çeşitli fotomikrografiler. (A) İki parçalı bir çekirdeğe (mavi) ve birkaç kamçı parçasına (yeşil) sahip kıvrılmış bir sperm başını gösteren bir sperm demetinin enine kesitli dijital renkli transmisyon elektron mikroskobu. (B) Örtülü gibi görünen denizanası benzeri sperm başlarının (oklar) bir kümesini gösteren dijital renkli taramalı elektron mikroskobu. (C) Kümelenmiş sperm başlarını (oklar) ve kıvrık kuyrukları (oklar) gösteren yarı ince kesit. (D) Akridin turuncusu ile boyanmış bir sperm yaymasının mikroskobu, sperm başlarının (oklar) ve kıvrık yapışkan kuyrukların (oklar) bir araya gelmesini gösteriyor. Spermatozoonun başının yapışkan bir madde (S) ile kaplı olduğuna dikkat edin. (D) × 1000 büyütme.
Transmisyon elektron mikroskobu kullanılarak (Şekil 7A), sperm başlarının bükülmüş olduğu ve çekirdeklerin spiral bir şekle sahip olduğu, akridin turuncusu ile boyanmış ve floresan mikroskobu kullanılarak incelenen sperm yaymalarıyla doğrulandı (Şekil 7B).
(A) Dijital renkli transmisyon elektron mikroskobu fotoğrafı ve (B) Akridin turuncusu boyalı sperm yayması, kıvrılmış başlar ve sperm başları ile kuyruklarının tutunmasını (oklar) göstermektedir. (B) × 1000 büyütme.
İlginç bir bulgu, Sharkazi'nin sperminin hareketli filamentli demetler oluşturmak üzere bir araya gelmesidir. Bu demetlerin özellikleri, SST'de spermatozoanın emilimi ve depolanmasındaki olası rollerini anlamamızı sağlar.
Çiftleşmeden sonra sperm vajinaya girer ve yoğun bir seçilim sürecinden geçer, bunun sonucunda SST'ye yalnızca sınırlı sayıda sperm girer15,16. Bugüne kadar spermin SST'ye girip çıkma mekanizmaları belirsizdir. Kümes hayvanlarında spermatozoa, türe bağlı olarak 2 ila 10 hafta gibi uzun bir süre SST'de saklanır6. SST'de saklanırken spermin durumu hakkında tartışmalar devam etmektedir. Hareket halindeler mi yoksa hareketsizler mi? Başka bir deyişle, sperm hücreleri SST'deki pozisyonlarını bu kadar uzun süre nasıl koruyorlar?
Forman4, SST ikametgahının ve atılımının sperm hareketliliği açısından açıklanabileceğini öne sürdü. Yazarlar, spermin SST epiteli tarafından oluşturulan sıvı akışına karşı yüzerek pozisyonlarını koruduğunu ve enerji eksikliği nedeniyle geriye doğru hareket etmeye başladıkları noktanın altına düştüklerinde SST'den atıldığını varsaymaktadır. Zaniboni5, SST epitel hücrelerinin apikal kısmında aquaporin 2, 3 ve 9'un varlığını doğruladı; bu, Foreman'ın sperm depolama modelini dolaylı olarak destekleyebilir. Mevcut çalışmada, Sharkashi'nin spermatozoalarının neredeyse yarısının akan sıvıda pozitif reoloji gösterdiğini ve aglütine olmuş sperm demetlerinin pozitif reoloji gösteren spermatozoa sayısını artırdığını, ancak aglütinasyonun onları yavaşlattığını bulduk. Sperm hücrelerinin kuşun fallop tüpünden döllenme bölgesine nasıl ilerlediği tam olarak anlaşılmamıştır. Memelilerde, foliküler sıvı spermatozoaları kemo çeker. Ancak kemotaktik maddelerin spermatozoaları uzun mesafelere yaklaşmaya yönlendirdiğine inanılmaktadır7. Bu nedenle, sperm taşınmasından diğer mekanizmalar sorumludur. Spermin çiftleşmeden sonra salgılanan fallop tüpü sıvısına karşı yönlenme ve akma yeteneğinin farelerde spermi hedeflemede önemli bir faktör olduğu bildirilmiştir. Parker 17 spermatozoaların kuşlarda ve sürüngenlerde siliyer akıntıya karşı yüzerek yumurta kanallarından geçtiğini öne sürmüştür. Kuşlarda deneysel olarak gösterilmemiş olmasına rağmen, Adolphi18 bir filtre kağıdı şeridiyle bir lamel ve slayt arasında ince bir sıvı tabakası oluşturulduğunda kuş sperminin pozitif sonuçlar verdiğini bulan ilk kişi olmuştur. Reoloji. Hino ve Yanagimachi [19] bir perfüzyon halkasına bir fare yumurtalık-tüp-uterin kompleksi yerleştirdiler ve fallop tüplerindeki sıvı akışını görselleştirmek için istmusa 1 µl mürekkep enjekte ettiler. Fallop tüpünde çok aktif bir kasılma ve gevşeme hareketi fark ettiler; bu harekette tüm mürekkep topları fallop tüpünün ampullasına doğru istikrarlı bir şekilde hareket ediyordu. Yazarlar, spermin yukarı kaldırılması ve döllenmesi için alt fallop tüplerinden üst fallop tüplerine doğru tüp sıvısı akışının önemini vurgulamaktadır. Brillard20, tavuklarda ve hindilerde spermatozoa'nın, depolandıkları vajinal girişten, depolandıkları utero-vajinal birleşim noktasına aktif hareketle göç ettiğini bildirmiştir. Ancak, bu hareketin uterovajinal birleşim ile infundibulum arasında gerekli olmadığını, çünkü spermatozoa'nın pasif yer değiştirmeyle taşındığını bildirmiştir. Bu önceki önerileri ve mevcut çalışmada elde edilen sonuçları bilerek, spermatozoa'nın yukarı akışta hareket etme yeteneğinin (reoloji) seçilim sürecinin dayandığı özelliklerden biri olduğu varsayılabilir. Bu, spermatozoa'nın vajinadan geçişini ve depolanmak üzere CCT'ye girişini belirler. Forman4'ün de belirttiği gibi bu durum, spermin bir süreliğine SST'ye ve yaşam alanına girmesini ve daha sonra hızı yavaşlamaya başladığında çıkmasını kolaylaştırabilir.
Öte yandan, Matsuzaki ve Sasanami 21 kuş spermatozoasının erkek ve dişi üreme yollarında uyku halinden hareketliliğe doğru hareketlilik değişimleri geçirdiğini ileri sürmüştür. SST'de yerleşik sperm hareketliliğinin inhibisyonu, spermin uzun süre depolanmasını ve ardından SST'den ayrıldıktan sonra gençleşmesini açıklamak için önerilmiştir. Hipoksik koşullar altında, Matsuzaki ve ark. 1 SST'de yüksek laktat üretimi ve salınımı olduğunu bildirmiştir, bu da yerleşik sperm hareketliliğinin inhibisyonuna yol açabilir. Bu durumda, sperm reolojisinin önemi, spermatozoaların depolanmasında değil, seçilmesinde ve emiliminde yansıtılmaktadır.
Sperm aglütinasyon örüntüsü, SST'de spermin uzun süre depolanması için makul bir açıklama olarak kabul edilir, çünkü bu kümes hayvanlarında sperm tutulmasının yaygın bir örüntüsüdür2,22,23. Bakst ve ark. 2 çoğu spermatozoanın birbirine yapışarak demetler oluşturduğunu ve tek spermatozoanın bıldırcın CCM'sinde nadiren bulunduğunu gözlemlemiştir. Öte yandan Wen ve ark. 24 tavuklarda SST lümeninde daha dağınık spermatozoa ve daha az spermatozoa tutamı gözlemlemiştir. Bu gözlemlere dayanarak, sperm aglütinasyon eğiliminin kuşlar arasında ve aynı ejakülattaki spermatozoa arasında farklılık gösterdiği varsayılabilir. Ek olarak, Van Krey ve ark. 9 aglütine olmuş spermatozoanın rastgele ayrışmasının spermatozoanın fallop tüpünün lümenine kademeli olarak nüfuz etmesinden sorumlu olduğunu öne sürmüştür. Bu hipoteze göre, daha düşük aglütinasyon kapasitesine sahip spermatozoalar önce SST'den atılmalıdır. Bu bağlamda, spermatozoaların aglütine olma yeteneği kirli kuşlarda sperm rekabetinin sonucunu etkileyen bir faktör olabilir. Ayrıca, aglütine olmuş sperm ne kadar uzun süre ayrışırsa, doğurganlık o kadar uzun süre korunur.
Spermatozoa agregasyonu ve demetler halinde agregasyonu çeşitli çalışmalarda gözlemlenmiş olsa da2,22,24, SST içindeki kinematik gözlemlerinin karmaşıklığı nedeniyle ayrıntılı olarak açıklanmamıştır. Sperm aglütinasyonunu in vitro incelemek için çeşitli girişimlerde bulunulmuştur. İnce tel sarkan tohum damlasının üzerinden çıkarıldığında kapsamlı ancak geçici agregasyon gözlemlenmiştir. Bu, damladan seminal bezi taklit eden uzun bir kabarcığın çıkmasına neden olur. 3D sınırlamaları ve kısa damla kurutma süreleri nedeniyle, tüm blok hızla harap olmuştur9. Mevcut çalışmada, Sharkashi tavukları ve mikroakışkan çipler kullanarak, bu tutamların nasıl oluştuğunu ve nasıl hareket ettiğini tanımlayabildik. Sperm demetleri, semen toplandıktan hemen sonra oluşmuştur ve akışta mevcut olduğunda pozitif reoloji gösteren bir spiral içinde hareket ettikleri bulunmuştur. Dahası, makroskobik olarak bakıldığında, sperm demetlerinin izole edilmiş spermatozoa ile karşılaştırıldığında hareketliliğin doğrusallığını artırdığı gözlemlenmiştir. Bu, sperm aglütinasyonunun SST penetrasyonundan önce meydana gelebileceğini ve sperm üretiminin daha önce öne sürüldüğü gibi stres nedeniyle küçük bir alanla sınırlı olmadığını göstermektedir (Tingari ve Lake12). Tuft oluşumu sırasında, spermatozoa birleşme noktası oluşturana kadar senkronize bir şekilde yüzer, daha sonra kuyrukları birbirine dolanır ve spermatozoanın başı serbest kalır, ancak kuyruk ve spermatozoanın distal kısmı yapışkan bir maddeyle birbirine yapışır. Bu nedenle, bağın serbest başı hareketten sorumludur ve bağın geri kalanını sürükler. Sperm demetlerinin taramalı elektron mikroskobu, çok fazla yapışkan maddeyle kaplı bağlı sperm başlarını gösterdi, bu da sperm başlarının depolama alanına (SST) ulaştıktan sonra meydana gelmiş olabilecek dinlenme demetlerinde bağlı olduğunu düşündürmektedir.
Bir sperm yayması akridin turuncusu ile boyandığında, sperm hücrelerinin etrafındaki hücre dışı yapışkan madde floresan mikroskop altında görülebilir. Bu madde, sperm demetlerinin çevredeki herhangi bir yüzeye veya parçacığa yapışmasını ve tutunmasını sağlar, böylece çevredeki akışla sürüklenmezler. Bu nedenle, gözlemlerimiz spermatozoa yapışmasının hareketli demetler biçimindeki rolünü göstermektedir. Akıntıya karşı yüzme ve yakındaki yüzeylere yapışma yetenekleri, spermin SST'de daha uzun süre kalmasını sağlar.
Rothschild25, bir süspansiyon damlasındaki sığır semeninin yüzen dağılımını incelemek için hemositometri kamerası kullandı ve mikroskobun hem dikey hem de yatay optik eksenine sahip bir kameradan fotomikrograflar aldı. Sonuçlar, spermatozoa'nın haznenin yüzeyine çekildiğini gösterdi. Yazarlar, sperm ile yüzey arasında hidrodinamik etkileşimler olabileceğini öne sürüyorlar. Bunu ve Sharkashi civciv semeninin yapışkan tutamlar oluşturma yeteneğini hesaba katarsak, semenin SST duvarına yapışması ve uzun süreler boyunca saklanması olasılığını artırabilir.
Bccetti ve Afzeliu26, sperm glikokaliksinin gamet tanınması ve aglütinasyonu için gerekli olduğunu bildirdi. Forman10, kuş sperminin nöraminidaz ile muamele edilmesiyle glikoprotein-glikolipid kaplamalarındaki α-glikozidik bağların hidrolizinin, sperm hareketliliğini etkilemeden azalmış doğurganlıkla sonuçlandığını gözlemledi. Yazarlar, nöraminidazın glikokaliks üzerindeki etkisinin, utero-vajinal kavşakta sperm sekestrasyonuna zarar verdiğini ve böylece doğurganlığı azalttığını öne sürüyorlar. Gözlemleri, nöraminidaz tedavisinin sperm ve oosit tanınmasını azaltabileceği olasılığını göz ardı edemez. Forman ve Engel10, tavuklar nöraminidaz ile muamele edilmiş spermlerle intravajinal olarak tohumlandığında doğurganlığın azaldığını buldular. Ancak, nöraminidaz ile muamele edilmiş spermlerle IVF, kontrol tavuklarına kıyasla doğurganlığı etkilemedi. Yazarlar, sperm zarı etrafındaki glikoprotein-glikolipid kaplamadaki değişikliklerin, spermin utero-vajinal birleşim noktasında sekestrasyonunun bozulması yoluyla spermin dölleme yeteneğini azalttığı, bunun da utero-vajinal birleşim noktasının hızına bağlı olarak sperm kaybını artırdığı, ancak sperm ve yumurta tanınmasını etkilemediği sonucuna varmışlardır.
Hindilerde Bakst ve Bauchan 11 SST'nin lümeninde küçük veziküller ve zar parçaları buldular ve bu granüllerden bazılarının sperm zarıyla kaynaştığını gözlemlediler. Yazarlar bu ilişkilerin SST'de spermatozoanın uzun süreli depolanmasına katkıda bulunabileceğini öne sürüyorlar. Ancak araştırmacılar bu parçacıkların kaynağını, CCT epitel hücreleri tarafından salgılanıp salgılanmadığını, erkek üreme sistemi tarafından üretilip salgılanıp salgılanmadığını veya spermin kendisi tarafından üretilip üretilmediğini belirtmediler. Ayrıca bu parçacıklar aglütinasyondan sorumludur. Grützner ve ark.27 epididimal epitel hücrelerinin tek gözenekli seminal yolların oluşumu için gerekli olan spesifik bir proteini ürettiğini ve salgıladığını bildirdiler. Yazarlar ayrıca bu demetlerin dağılımının epididimal proteinlerin etkileşimine bağlı olduğunu bildirdiler. Nixon ve ark.28 adnekslerin asidik sistein açısından zengin osteonektin adlı bir protein salgıladığını buldular; SPARC, kısa gagalı ekidnalarda ve ornitorenklerde sperm tutamlarının oluşumunda rol oynar. Bu ışınların saçılması, bu proteinin kaybıyla ilişkilidir.
Mevcut çalışmada, elektron mikroskobu kullanılarak yapılan ultra yapısal analiz, spermatozoanın büyük miktarda yoğun maddeye yapıştığını göstermiştir. Bu maddelerin, yapışık başlar arasında ve çevresinde yoğunlaşan aglütinasyondan sorumlu olduğu düşünülmektedir, ancak kuyruk bölgesinde daha düşük konsantrasyonlardadır. Bu aglütine edici maddenin, boşalma sırasında sıklıkla lenf ve seminal plazmadan ayrılan semen gözlemlediğimiz için, erkek üreme sisteminden (epididim veya vas deferens) semenle birlikte atıldığını varsayıyoruz. Kuş spermatozoasının epididim ve vas deferens'ten geçerken, protein bağlama ve plazma lemmasıyla ilişkili glikoproteinleri edinme yeteneklerini destekleyen olgunlaşmayla ilgili değişikliklere uğradığı bildirilmiştir. Bu proteinlerin SST'deki yerleşik sperm zarlarında kalıcılığı, bu proteinlerin sperm zarı stabilitesinin edinilmesini etkileyebileceğini 30 ve doğurganlıklarını belirleyebileceğini 31 düşündürmektedir. Ahammad ve ark.32 erkek üreme sisteminin çeşitli kısımlarından (testislerden distal vas deferenslere kadar) elde edilen spermatozoanın, depolama sıcaklığından bağımsız olarak sıvı depolama koşulları altında canlılığında giderek artış gösterdiğini ve tavuklarda canlılığın yapay tohumlamadan sonra fallop tüplerinde de arttığını bildirmiştir.
Sharkashi tavuğu sperm tutamları, echidnalar, ornitorenkler, orman fareleri, geyik sıçanları ve kobaylar gibi diğer türlerden farklı özelliklere ve işlevlere sahiptir. Sharkashi tavuklarında, spermatozoa demetlerinin oluşumu, tek spermatozoa ile karşılaştırıldığında yüzme hızlarını azaltmıştır. Ancak, bu demetler reolojik olarak pozitif spermatozoa yüzdesini artırmış ve spermatozoaların dinamik bir ortamda kendilerini stabilize etme yeteneğini artırmıştır. Bu nedenle, sonuçlarımız SST'deki sperm aglütinasyonunun uzun süreli sperm depolama ile ilişkili olduğu yönündeki önceki öneriyi doğrulamaktadır. Ayrıca, spermin tutam oluşturma eğiliminin SST'deki sperm kaybı oranını kontrol edebileceği ve bunun sperm rekabetinin sonucunu değiştirebileceği hipotezini de öne sürüyoruz. Bu varsayıma göre, düşük aglütinasyon kapasitesine sahip spermatozoalar önce SST'yi serbest bırakırken, yüksek aglütinasyon kapasitesine sahip spermatozoalar yavruların çoğunu üretir. Tek gözenekli sperm demetlerinin oluşumu faydalıdır ve ebeveyn-çocuk oranını etkiler, ancak farklı bir mekanizma kullanır. Echidnalarda ve ornitorenklerde, spermatozoalar ışının ileri hızını artırmak için birbirine paralel olarak düzenlenmiştir. Echidna demetleri tek spermatozoalardan yaklaşık üç kat daha hızlı hareket eder. Echidnalarda bu tür sperm tutamlarının oluşumunun, dişiler rastgele çiftleştiği ve genellikle birkaç erkekle çiftleştiği için, egemenliği sürdürmek için evrimsel bir adaptasyon olduğuna inanılmaktadır. Bu nedenle, farklı ejakülatlardan gelen spermatozoalar yumurtanın döllenmesi için şiddetle rekabet eder.
Sharkasi tavuklarının aglutine spermatozoa'ları faz kontrast mikroskopisi kullanılarak kolayca görüntülenebilir, bu da spermatozoa davranışının in vitro olarak kolayca incelenmesine olanak tanıdığı için avantajlı kabul edilir. Sperm tutamı oluşumunun Sharkasi tavuklarında üremeyi teşvik ettiği mekanizma, bazı plasentalı memelilerde görülenlerden de farklıdır, örneğin odun fareleri gibi kooperatif sperm davranışını temsil eder, burada bazı spermatozoa yumurtalara ulaşır ve diğer ilgili bireylerin yumurtalarına ulaşmalarına ve onlara zarar vermelerine yardımcı olur. kendinizi kanıtlamak için. fedakar davranış. Kendi kendine döllenme 34. Spermatozoa'daki kooperatif davranışın bir başka örneği, spermatozoa'ların genetik olarak en ilgili spermatozoa'ları belirleyip birleşebildiği ve akraba olmayan spermatozoa'lara kıyasla hızlarını artırmak için kooperatif gruplar oluşturabildiği geyik farelerinde bulunmuştur35.
Bu çalışmada elde edilen sonuçlar Foman'ın SWS'de spermatozoanın uzun süreli depolanması teorisine aykırı değildir. Araştırmacılar, sperm hücrelerinin SST'yi kaplayan epitel hücrelerinin akışında uzun bir süre hareket etmeye devam ettiğini ve belirli bir süre sonra sperm hücrelerinin enerji depolarının tükendiğini, bunun sonucunda hızda bir azalma olduğunu ve bunun da küçük molekül ağırlıklı maddelerin atılmasına izin verdiğini bildirmektedir. SST lümeninden sıvı akışıyla spermatozoanın enerjisi Fallop tüpünün boşluğu. Mevcut çalışmada, tek spermlerin yarısının akan sıvılara karşı yüzme yeteneği gösterdiğini ve demet içindeki yapışmalarının pozitif reoloji gösterme yeteneklerini artırdığını gözlemledik. Dahası, verilerimiz SST'de laktat salgılanmasının artmasının yerleşik sperm hareketliliğini engelleyebileceğini bildiren Matsuzaki ve ark.'nın verileriyle tutarlıdır. Ancak sonuçlarımız, SST'deki davranışlarını açıklamak amacıyla bir mikrokanal içindeki dinamik bir ortamın varlığında sperm hareketli bağlarının oluşumunu ve reolojik davranışlarını açıklar. Gelecekteki araştırmalar, aglütinasyon ajanının kimyasal bileşimini ve kökenini belirlemeye odaklanabilir; bu da şüphesiz araştırmacıların sıvı semeni depolamak ve doğurganlık süresini artırmak için yeni yollar geliştirmelerine yardımcı olacaktır.
Çalışmada sperm donörü olarak 15 adet 30 haftalık çıplak boyunlu erkek sharkasi (homozigot dominant; Na Na) seçildi. Kuşlar Mısır, Ashit Valiliği, Ashit Üniversitesi Ziraat Fakültesi Araştırma Tavuk Çiftliği'nde yetiştirildi. Kuşlar ayrı kafeslerde (30 x 40 x 40 cm) barındırıldı, ışık programına tabi tutuldu (16 saat ışık ve 8 saat karanlık) ve her biri 160 g ham protein, 2800 kcal metabolize edilebilir enerji, 35 g kalsiyum içeren bir diyetle beslendi. Kilogram diyet başına 5 gram kullanılabilir fosfor.
Veri 36, ​​37'ye göre, erkeklerden karın masajı yoluyla semen toplandı. 15 erkekten 3 gün boyunca toplam 45 semen örneği toplandı. Semen (n = 15/gün) potasyum difosfat (1,27 g), monosodyum glutamat monohidrat (0,867 g), fruktoz (0,5 g) susuz sodyum asetat (0,43 g), tris(hidroksimetil)aminometan (0,195 g), potasyum sitrat monohidrat (0,064 g), potasyum monofosfat (0,065 g), magnezyum klorür (0,034 g) ve H2O (100 ml) içeren Belsville Tavuk Semen Seyreltici ile hemen 1:1 (h:h) oranında seyreltildi, pH = 7, 5, ozmolarite 333 mOsm/kg38. Seyreltilmiş semen örnekleri öncelikle iyi semen kalitesini (nem) sağlamak için ışık mikroskobu altında incelendi ve daha sonra toplandıktan sonra yarım saat içinde kullanılıncaya kadar 37°C'lik su banyosunda saklandı.
Spermatozoa kinematiği ve reolojisi bir mikroakışkan cihaz sistemi kullanılarak tanımlanmıştır. Semen örnekleri daha sonra Beltsville Kuş Semen Seyrelticisinde 1:40'a kadar seyreltilmiş, bir mikroakışkan cihaza yüklenmiştir (aşağıya bakınız) ve kinetik parametreler daha önce mikroakışkan karakterizasyonu için geliştirilen bir Bilgisayarlı Semen Analizi (CASA) sistemi kullanılarak belirlenmiştir. spermatozoaların sıvı ortamdaki hareketliliği üzerine (Makine Mühendisliği Bölümü, Mühendislik Fakültesi, Assiut Üniversitesi, Mısır). Eklenti şu adresten indirilebilir: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39. Eğri hızı (VCL, μm/s), doğrusal hız (VSL, μm/s) ve ortalama yörünge hızı (VAP, μm/s) ölçülmüştür. Spermatozoa videoları, 3 saniye boyunca 30 fps'de bir Tucson ISH1000 kameraya bağlı ters Optika XDS-3 faz kontrast mikroskobu (40x objektifli) kullanılarak çekildi. En az üç alanı ve örnek başına 500 sperm yörüngesini incelemek için CASA yazılımını kullanın. Kaydedilen video, ev yapımı bir CASA kullanılarak işlendi. CASA eklentisindeki hareketlilik tanımı, spermin akış hızına kıyasla yüzme hızına dayanır ve sıvı akışında daha güvenilir olduğu bulunduğu için yan yana hareket gibi diğer parametreleri içermez. Reolojik hareket, sperm hücrelerinin sıvı akış yönüne karşı hareketi olarak tanımlanır. Reolojik özelliklere sahip spermatozoa, hareketli spermatozoa sayısına bölündü; dinlenme halindeki spermatozoa ve konvektif olarak hareket eden spermatozoa sayımdan hariç tutuldu.
Aksi belirtilmediği takdirde kullanılan tüm kimyasallar Elgomhoria Pharmaceuticals'dan (Kahire, Mısır) temin edilmiştir. Cihaz El-sherry ve ark. tarafından açıklandığı gibi bazı değişikliklerle üretilmiştir. 40 Mikrokanalları üretmek için kullanılan malzemeler arasında cam levhalar (Howard Glass, Worcester, MA), SU-8-25 negatif rezist (MicroChem, Newton, CA), diaseton alkol (Sigma Aldrich, Steinheim, Almanya) ve poliaseton yer almaktadır. -184, Dow Corning, Midland, Michigan). Mikrokanallar yumuşak litografi kullanılarak üretilir. İlk olarak, istenen mikrokanal tasarımına sahip şeffaf bir koruyucu yüz maskesi yüksek çözünürlüklü bir yazıcıda (Prismatic, Kahire, Mısır ve Pacific Arts and Design, Markham, ON) basılmıştır. Ustalar alt tabaka olarak cam levhalar kullanılarak yapılmıştır. Plakalar aseton, izopropanol ve deiyonize su ile temizlendi ve daha sonra spin kaplama ile 20 µm'lik bir SU8-25 tabakası ile kaplandı (3000 rpm, 1 dk). SU-8 tabakaları daha sonra nazikçe kurutuldu (65°C, 2 dk ve 95°C, 10 dk) ve 50 saniye boyunca UV radyasyonuna maruz bırakıldı. Maruz kalan SU-8 tabakalarını çapraz bağlamak için 65°C ve 95°C'de 1 dk ve 4 dk'lık pozlama sonrası fırınlama, ardından 6,5 dk diaseton alkolünde geliştirme. SU-8 tabakasını daha da katılaştırmak için waffle'ları sert bir şekilde pişirin (200°C'de 15 dk).
PDMS, monomer ve sertleştiriciyi 10:1 ağırlık oranında karıştırarak hazırlandı, ardından vakumlu bir desikatörde gazı alındı ​​ve SU-8 ana çerçevesine döküldü. PDMS bir fırında kürlendi (120°C, 30 dk), ardından kanallar kesildi, ana parçadan ayrıldı ve tüplerin mikro kanalın giriş ve çıkışına takılmasına izin vermek için delindi. Son olarak, PDMS mikro kanalları başka bir yerde açıklandığı gibi taşınabilir bir korona işlemcisi (Electro-Technic Products, Chicago, IL) kullanılarak mikroskop slaytlarına kalıcı olarak takıldı. Bu çalışmada kullanılan mikro kanal 200 µm × 20 µm (G × Y) ölçülerindedir ve 3,6 cm uzunluğundadır.
Mikrokanalın içindeki hidrostatik basınçtan kaynaklanan akışkan akışı, giriş haznesindeki akışkan seviyesinin çıkış haznesindeki Δh39 yükseklik farkının üzerinde tutulmasıyla sağlanır (Şekil 1).
Burada f, dikdörtgen bir kanaldaki laminer akış için f = C/Re olarak tanımlanan sürtünme katsayısıdır; burada C, kanalın en boy oranına bağlı bir sabittir, L, mikrokanalın uzunluğudur, Vav, mikrokanalın içindeki ortalama hızdır, Dh, kanalın hidrolik çapıdır, g, yerçekimi ivmesidir. Bu denklemi kullanarak, ortalama kanal hızı aşağıdaki denklem kullanılarak hesaplanabilir: