Nature.com'u ziyaret ettiğiniz için teşekkür ederiz. Kullandığınız tarayıcı sürümünün CSS desteği sınırlıdır. En iyi deneyim için, güncel bir tarayıcı kullanmanızı (veya Internet Explorer'da Uyumluluk Modunu devre dışı bırakmanızı) öneririz. Bu süre zarfında, desteğin devamlılığını sağlamak için siteyi stiller ve JavaScript olmadan görüntüleyeceğiz.
Kuşların doğurganlığı, sperm depolama tüplerinde (SST) uzun bir süre boyunca yeterli miktarda canlı sperm depolayabilme yeteneklerine bağlıdır. Spermatozoaların SST'ye giriş, burada kalma ve buradan ayrılma mekanizması hala tartışmalıdır. Sharkasi tavuklarının spermleri, çok sayıda hücre içeren hareketli ipliksi demetler oluşturarak yüksek oranda aglütinasyon eğilimi göstermiştir. Opak bir fallop tüpünde spermatozoaların hareketliliğini ve davranışını gözlemlemenin zorluğu nedeniyle, spermatozoa aglütinasyonunu ve hareketliliğini incelemek için spermatozoalarınkine benzer bir mikrokanal kesitine sahip bir mikroakışkan cihaz kullandık. Bu çalışma, sperm demetlerinin nasıl oluştuğunu, nasıl hareket ettiğini ve spermlerin SST'de kalma süresini uzatmadaki olası rollerini tartışmaktadır. Hidrostatik basınçla (akış hızı = 33 µm/s) bir mikroakışkan kanal içinde sıvı akışı oluşturulduğunda sperm hızı ve reolojik davranışını araştırdık. Spermatozoalar akıntıya karşı yüzme eğilimindedir (pozitif reoloji) ve spermatozoon demetinin hızı, tek spermatozoonlara kıyasla önemli ölçüde azalır. Sperm demetlerinin spiral şeklinde hareket ettiği ve daha fazla tek sperm toplandıkça uzunluk ve kalınlıklarının arttığı gözlemlenmiştir. Sperm demetlerinin, 33 µm/s'den yüksek sıvı akış hızlarıyla sürüklenmekten kaçınmak için mikroakışkan kanalların yan duvarlarına yaklaştığı ve yapıştığı gözlemlendi. Sperm demetlerinin, 33 µm/s'den yüksek sıvı akış hızlarıyla sürüklenmekten kaçınmak için mikroakışkan kanalların yan duvarlarına yaklaştığı ve yapıştığı gözlemlendi. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются ve прилипают к боковым стенкам микрофлюидных kanallar, чтобы избежать со скоростью потока жидкости> 33 мкм / с. Sperm demetlerinin, 33 µm/s'den yüksek sıvı akış hızlarında sürüklenmekten kaçınmak için mikroakışkan kanalların yan duvarlarına yaklaştığı ve yapıştığı gözlemlenmiştir.Verim hızı > 33 µm/sn.33 µm/sn. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются ve прилипают к боковым стенкам микрожидкостного kanala, чтобы избежать сметания потоком жидкости со скоростью > 33 мкм/с. Sperm demetlerinin, 33 µm/s'den yüksek hızdaki sıvı akışı tarafından sürüklenmemek için mikroakışkan kanalın yan duvarlarına yaklaştığı ve yapıştığı gözlemlenmiştir.Taramalı ve transmisyon elektron mikroskobu, sperm demetlerinin bol miktarda yoğun madde ile desteklendiğini ortaya koymuştur. Elde edilen veriler, Sharkazi tavuk spermlerinin benzersiz hareketliliğini ve spermlerin bir araya gelerek hareketli demetler oluşturma yeteneğini göstermekte olup, bu da spermlerin SMT'de uzun süreli depolanmasının daha iyi anlaşılmasına katkıda bulunmaktadır.
İnsanlarda ve çoğu hayvanda döllenmenin gerçekleşmesi için sperm ve yumurtaların döllenme bölgesine doğru zamanda ulaşması gerekir. Bu nedenle, çiftleşme yumurtlamadan önce veya yumurtlama anında gerçekleşmelidir. Öte yandan, köpekler gibi bazı memeliler ve böcekler, balıklar, sürüngenler ve kuşlar gibi memeli olmayan türler, yumurtaları döllenmeye hazır olana kadar spermi üreme organlarında uzun bir süre saklarlar (asenkron döllenme 1). Kuşlar, yumurtaları dölleyebilecek sperm hücrelerinin canlılığını 2-10 hafta boyunca koruyabilirler 2.
Bu, kuşları diğer hayvanlardan ayıran eşsiz bir özelliktir; çünkü eş zamanlı çiftleşme ve yumurtlama olmaksızın, tek bir suni döllenme sonrasında birkaç hafta boyunca yüksek bir döllenme olasılığı sağlar. Sperm depolama tüpü (SST) adı verilen ana sperm depolama organı, rahim-vajinal birleşim yerindeki iç mukoza kıvrımlarında bulunur. Bugüne kadar, spermin sperm bankasına nasıl girdiği, orada nasıl kaldığı ve nasıl çıktığı mekanizmaları tam olarak anlaşılamamıştır. Önceki çalışmalara dayanarak birçok hipotez öne sürülmüştür, ancak bunların hiçbiri doğrulanmamıştır.
Forman4, spermlerin SST boşluğunda kalmalarını, SST epitel hücrelerinde bulunan protein kanalları aracılığıyla sıvı akışının yönüne karşı sürekli salınım hareketi (reoloji) yoluyla sağladığını varsaymıştır. Spermin SST lümeninde kalması için gereken sürekli kamçı aktivitesi nedeniyle ATP tükenir ve hareketlilik sonunda azalır; spermler sıvı akışı ile sperm bankasından dışarı taşınır ve yumurtayı döllemek için yükselen fallop tüpünden aşağı doğru yeni bir yolculuğa başlar (Forman4). Bu sperm depolama modeli, SST epitel hücrelerinde bulunan aquaporin 2, 3 ve 9'un immünositokimya ile saptanmasıyla desteklenmektedir. Bugüne kadar, tavuk meni reolojisi ve bunun SST depolaması, vajinal sperm seçimi ve sperm rekabetindeki rolü üzerine yapılan çalışmalar yetersizdir. Tavuklarda sperm doğal çiftleşmeden sonra vajinaya girer, ancak spermlerin %80'inden fazlası çiftleşmeden kısa bir süre sonra vajinadan atılır. Bu, vajinanın kuşlarda sperm seçimi için birincil bölge olduğunu düşündürmektedir. Ayrıca, vajinada döllenmiş spermlerin %1'inden azının SST'lere ulaştığı bildirilmiştir². Civcivlerin vajinal suni döllenmesinde, döllenmeden 24 saat sonra SST'ye ulaşan sperm sayısı artma eğilimindedir. Şimdiye kadar, bu süreçte sperm seçiminin mekanizması net değildir ve sperm hareketliliği SST'ye sperm alımında önemli bir rol oynayabilir. Fallop tüplerinin kalın ve opak duvarları nedeniyle, kuşların fallop tüplerinde sperm hareketliliğini doğrudan izlemek zordur. Bu nedenle, döllenmeden sonra spermlerin SST'ye nasıl geçtiğine dair temel bilgilerden yoksunuz.
Son zamanlarda reoloji, memeli üreme organlarında sperm taşınmasını kontrol eden önemli bir faktör olarak kabul edilmiştir. Hareketli spermlerin ters yönde göç etme yeteneğine dayanarak, Zaferani ve ark.8, kafeslenmiş meni örneklerinden hareketli spermleri pasif olarak izole etmek için bir Corra mikroakışkan sistemi kullanmıştır. Bu tür meni ayırma yöntemi, tıbbi kısırlık tedavisi ve klinik araştırmalar için gereklidir ve zaman ve emek yoğun olan ve sperm morfolojisini ve yapısal bütünlüğünü tehlikeye atabilen geleneksel yöntemlere tercih edilir. Bununla birlikte, bugüne kadar tavukların üreme organlarından salgılanan sıvıların sperm hareketliliği üzerindeki etkisine dair hiçbir çalışma yapılmamıştır.
Sperm hücrelerinin SST'de depolanmasını sağlayan mekanizmadan bağımsız olarak, birçok araştırmacı, tavukların 9, 10, bıldırcınların 2 ve hindilerin 11 SST'sinde yerleşik sperm hücrelerinin başa baş birleşerek aglütine sperm demetleri oluşturduğunu gözlemlemiştir. Yazarlar, bu aglütinasyon ile sperm hücrelerinin SST'de uzun süreli depolanması arasında bir bağlantı olduğunu öne sürmektedir.
Tingari ve Lake12, tavuğun sperm alıcı bezindeki sperm hücreleri arasında güçlü bir ilişki olduğunu bildirmiş ve kuş sperm hücrelerinin memeli sperm hücreleriyle aynı şekilde kümelenip kümelenmediğini sorgulamışlardır. Vas deferens'teki sperm hücreleri arasındaki derin bağlantıların, küçük bir alanda çok sayıda sperm hücresinin bulunmasından kaynaklanan stresten kaynaklanabileceğine inanmaktadırlar.
Taze asılı cam slaytlar üzerindeki spermatozoaların davranışını değerlendirirken, özellikle meni damlacıklarının kenarlarında geçici aglütinasyon belirtileri görülebilir. Bununla birlikte, aglütinasyon genellikle sürekli hareketle ilişkili dönme hareketiyle bozulmaktadır; bu da bu olayın geçici doğasını açıklamaktadır. Araştırmacılar ayrıca, meniye seyreltici eklendiğinde, uzamış "iplik benzeri" hücre kümelerinin ortaya çıktığını da fark ettiler.
Bir sperm hücresini taklit etmeye yönelik ilk girişimler, asılı bir damladan ince bir telin çıkarılmasıyla yapılmış ve bu da meni damlasından dışarı doğru uzanan, sperm benzeri uzun bir kesecik oluşmasına neden olmuştur. Spermatozoalar hemen kesecik içinde paralel bir şekilde sıralanmış, ancak 3 boyutlu sınırlama nedeniyle tüm ünite hızla kaybolmuştur. Bu nedenle, sperm aglütinasyonunu incelemek için, spermatozoaların hareketliliğini ve davranışını doğrudan izole edilmiş sperm depolama tüplerinde gözlemlemek gereklidir ki bu da elde edilmesi zordur. Bu nedenle, sperm hareketliliği ve aglütinasyon davranışı çalışmalarını desteklemek için spermatozoaları taklit eden bir alet geliştirmek gereklidir. Brillard ve ark.13, yetişkin civcivlerdeki sperm depolama tüplerinin ortalama uzunluğunun 400-600 µm olduğunu, ancak bazı SST'lerin 2000 µm kadar uzun olabileceğini bildirmiştir. Mero ve Ogasawara14, seminifer bezleri genişlemiş ve genişlememiş sperm depolama tüplerine ayırmışlardır; her ikisi de uzunluk (~500 µm) ve boyun genişliği (~38 µm) bakımından aynıydı, ancak tüplerin ortalama lümen çapı sırasıyla 56,6 ve 11,2 µm idi. Mevcut çalışmada, kesiti büyütülmüş SST'ninkine oldukça yakın olan 200 µm × 20 µm (G × Y) kanal boyutuna sahip bir mikroakışkan cihaz kullandık. Ek olarak, Foreman'ın SST epitel hücreleri tarafından üretilen sıvının spermi lümende ters akım (reolojik) yönünde tuttuğu hipoteziyle tutarlı olarak, akan sıvıda sperm hareketliliğini ve aglütinasyon davranışını inceledik.
Bu çalışmanın amacı, fallop tüpünde sperm hareketliliğinin gözlemlenmesindeki sorunların üstesinden gelmek ve dinamik bir ortamda sperm reolojisi ve davranışının incelenmesindeki zorluklardan kaçınmaktı. Bir tavuğun üreme organlarında sperm hareketliliğini simüle etmek için hidrostatik basınç oluşturan bir mikroakışkan cihaz kullanıldı.
Seyreltilmiş bir sperm örneğinden (1:40) bir damla mikrokanal cihazına yüklendiğinde, iki tür sperm hareketliliği tanımlanabildi (izole sperm ve bağlı sperm). Ek olarak, spermatozoaların akıntıya karşı yüzme eğiliminde olduğu görüldü (pozitif reoloji; video 1, 2). Sperm demetlerinin hızı tek başına hareket eden spermlere göre daha düşük olmasına rağmen (p < 0.001), pozitif reotaksi gösteren sperm yüzdesini artırdılar (p < 0.001; Tablo 2). Sperm demetlerinin hızı tek başına hareket eden spermlere göre daha düşük olmasına rağmen (p < 0.001), pozitif reotaksi gösteren sperm yüzdesini artırdılar (p < 0.001; Tablo 2). Хотя пучки сперматозоидов имели более низкую скорость, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), они увеличивали процент сперматозоидов, демонстрирующих положительный реотаксис (p < 0,001; таблица 2). Spermatozoa demetlerinin hızı tek spermatozoalara göre daha düşük olmasına rağmen (p < 0.001), pozitif reotaksi gösteren spermatozoa yüzdesini artırdılar (p < 0.001; Tablo 2).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度（p < 0,001），但它们增加了显示阳性流变性的精子百分比（p < 0,001；表2）。尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 （p <0,001） ， 但 增加 了 显示 阳性 流变性 精子（p <0,001 ； 2。。。。。。）））））） Хотя скорость пучков сперматозоидов была ниже, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), они увеличивали процент сперматозоидов с положительной реологией (p < 0,001; таблица 2). Sperm demetlerinin hızı tek sperm hücrelerine göre daha düşük olmasına rağmen (p < 0.001), pozitif reolojiye sahip sperm hücrelerinin yüzdesini artırdılar (p < 0.001; Tablo 2).Tek sperm hücresi ve sperm kümeleri için pozitif reolojinin sırasıyla yaklaşık %53 ve %85 olduğu tahmin edilmektedir.
Sharkashi tavuklarının spermlerinin, boşalmadan hemen sonra düzinelerce bireyden oluşan doğrusal demetler oluşturduğu gözlemlenmiştir. Bu demetler zamanla uzunluk ve kalınlık bakımından artar ve dağılmadan önce birkaç saat boyunca in vitro ortamda kalabilir (video 3). Bu ipliksi demetler, epididimisin ucunda oluşan dikenli karınca yiyen spermlerine benzer bir şekle sahiptir. Sharkashi tavuk sperminin, toplandıktan sonra bir dakikadan kısa sürede aglütinasyona uğrayarak ağsı bir demet oluşturma eğiliminin yüksek olduğu bulunmuştur. Bu demetler dinamiktir ve yakındaki herhangi bir duvara veya statik nesneye yapışabilir. Sperm demetleri sperm hücrelerinin hızını azaltmasına rağmen, makroskobik olarak doğrusallıklarını artırdıkları açıktır. Demetlerin uzunluğu, demetlerde toplanan sperm sayısına bağlı olarak değişir. Demetin iki kısmı izole edilmiştir: aglütine olmuş spermin serbest başını içeren başlangıç ​​kısmı ve spermin kuyruğunu ve tüm distal ucunu içeren terminal kısım. Yüksek hızlı bir kamera (950 fps) kullanılarak, demetin başlangıç ​​kısmında, salınan hareketleriyle demetin hareketinden sorumlu olan ve geri kalanları sarmal bir hareketle demetin içine çeken, aglütine olmuş spermatozoaların serbest başları gözlemlenmiştir (Video 4). Bununla birlikte, uzun demetlerde, bazı serbest sperm başlarının gövdeye yapıştığı ve demetin uç kısmının, demeti hareket ettirmeye yardımcı olan kanatçıklar gibi davrandığı gözlemlenmiştir.
Yavaş bir sıvı akışında, sperm demetleri birbirine paralel hareket eder; ancak akış hızı arttıkça, akıntı tarafından sürüklenmemek için üst üste binmeye ve hareketsiz olan her şeye yapışmaya başlarlar. Demetler, bir avuç sperm hücresi birbirine yaklaştığında oluşur; senkronize bir şekilde hareket etmeye ve birbirlerinin etrafına sarılmaya başlarlar ve ardından yapışkan bir maddeye yapışırlar. Şekil 1 ve 2, sperm hücrelerinin birbirine nasıl yaklaştığını ve kuyruklarının birbirinin etrafına sarılarak birleşme noktası oluşturduğunu göstermektedir.
Araştırmacılar, sperm reolojisini incelemek için bir mikrokanalda sıvı akışı oluşturmak amacıyla hidrostatik basınç uyguladılar. 200 µm × 20 µm (G × Y) boyutlarında ve 3,6 µm uzunluğunda bir mikrokanal kullanıldı. Uçlarına şırıngalar yerleştirilmiş kaplar arasına mikrokanallar yerleştirildi. Kanalları daha görünür hale getirmek için gıda boyası kullanıldı.
Ara bağlantı kablolarını ve aksesuarları duvara bağlayın. Video, faz kontrast mikroskobu ile çekilmiştir. Her görüntüde faz kontrast mikroskobu ve haritalama görüntüleri sunulmaktadır. (A) İki akış arasındaki bağlantı, sarmal hareket nedeniyle akışa direnç gösterir (kırmızı ok). (B) Tüp demeti ile kanal duvarı arasındaki bağlantı (kırmızı oklar), aynı zamanda iki başka demete de bağlıdır (sarı oklar). (C) Mikroakışkan kanaldaki sperm demetleri birbirine bağlanmaya başlar (kırmızı oklar), bir sperm demeti ağı oluşturur. (D) Sperm demeti ağının oluşumu.
Seyreltilmiş sperm damlası mikroakışkan cihaza yüklendiğinde ve bir akış oluşturulduğunda, sperm demetinin akış yönünün tersine hareket ettiği gözlemlendi. Demetler mikrokanalların duvarlarına sıkıca oturuyor ve demetlerin başlangıç ​​kısmındaki serbest başlar da onlara sıkıca yapışıyor (video 5). Ayrıca, akıntı tarafından sürüklenmemek için yollarındaki enkaz gibi sabit parçacıklara da yapışıyorlar. Zamanla, bu demetler diğer tek sperm hücrelerini ve daha kısa demetleri hapseden uzun filamentler haline geliyor (Video 6). Akış yavaşlamaya başladığında, uzun sperm hatları bir sperm hattı ağı oluşturmaya başlıyor (Video 7; Şekil 2).
Yüksek akış hızlarında (V > 33 µm/s), çok sayıda bireysel spermi yakalamaya yönelik bir girişim olarak ipliklerin spiral hareketleri artar ve bu da demetlerin akışın sürükleme kuvvetine daha iyi direnmesini sağlar. Yüksek akış hızlarında (V > 33 µm/s), çok sayıda bireysel spermi yakalamaya yönelik bir girişim olarak ipliklerin spiral hareketleri artar ve bu da demetlerin akışın sürükleme kuvvetine daha iyi direnmesini sağlar. При высокой скорости потока (V > 33 мкм/с) спиралевидные движения нитей усиливаются, поскольку они пытаются поймать множество отдельных сперматозоидов, образующих пучки, которые лучше противостоят дрейфующей силе потока. Yüksek akış hızlarında (V > 33 µm/s), ipliklerin sarmal hareketleri artar çünkü çok sayıda bireysel sperm hücresini yakalamaya çalışarak, akışın sürükleme kuvvetine daha iyi direnebilen demetler oluştururlar.Yükseklik(V > 33 µm/s)时,螺纹的螺旋运动增加,以试图捕捉许多形成束的单个精子, 从而更好地抵抗流动的漂移力。在 高 流速 (v> 33 µm/s) 时 ， 的 螺旋 运动 增加 ， 以 试图 许多 形成 束 单 个 精子 ， Bu, şu an için çok önemli bir şey. При высоких скоростях потока (V > 33 мкм/с) попытке захватить При высоких скоростях потока (V > 33 mкм/с) спиральное движение нитей увеличивается çok fazla отдельных сперматозоидов, образующих пучки, чтобы лучше сопротивляться силам дрейфа потока. Yüksek akış hızlarında (V > 33 µm/s), filamentlerin sarmal hareketi, akışın sürüklenme kuvvetlerine daha iyi direnmek için demetler oluşturan çok sayıda bireysel sperm hücresini yakalama girişiminde artarak gerçekleşir.Ayrıca yan duvarlara mikro kanallar eklemeyi de denediler.
Işık mikroskobu (LM) kullanılarak sperm demetleri, sperm başları ve kıvrılan kuyrukların kümeleri olarak tanımlandı. Ayrıca, transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ile çeşitli agregasyonlara sahip sperm demetleri, bükülmüş başlar ve kamçı agregasyonları, çoklu kaynaşmış sperm kuyrukları, bir kuyruğa bağlı sperm başları ve çoklu kaynaşmış çekirdekler olarak bükülmüş çekirdekli sperm başları olarak tanımlandı. Taramalı elektron mikroskobu (SEM), sperm demetlerinin kılıflı sperm başı agregasyonları olduğunu ve sperm agregasyonlarının sarılmış kuyrukların bağlı bir ağını gösterdiğini ortaya koydu.
Spermatozoaların morfolojisi ve ultrastruktürü, spermatozoa demetlerinin oluşumu, ışık mikroskobu (yarım kesit), taramalı elektron mikroskobu (SEM) ve transmisyon elektron mikroskobu (TEM) kullanılarak incelendi; sperm yaymaları akridin turuncu ile boyandı ve epifluoresans mikroskobu kullanılarak incelendi.
Akridin turuncu ile boyanmış sperm yayma preparatı (Şekil 3B), sperm başlarının birbirine yapıştığını ve salgı maddesiyle kaplı olduğunu, bunun da büyük demetlerin oluşmasına yol açtığını gösterdi (Şekil 3D). Sperm demetleri, birbirine yapışmış kuyrukların ağından oluşan sperm agregatlarından oluşuyordu (Şekil 4A-C). Sperm demetleri, birbirine yapışmış birçok sperm hücresinin kuyruklarından oluşur (Şekil 4D). Salgılar (Şekil 4E,F), sperm demetlerinin başlarını kaplıyordu.
Spermatozoa demetinin oluşumu Faz kontrast mikroskobu ve akridin turuncu ile boyanmış sperm yaymaları kullanılarak, spermatozoa başlarının birbirine yapıştığı gösterilmiştir. (A) Erken sperm demeti oluşumu, bir sperm (beyaz daire) ve üç sperm (sarı daire) ile başlar, spiral kuyruktan başlar ve başa doğru biter. (B) Akridin turuncu ile boyanmış bir sperm yaymasının yapışık sperm başlarını (oklar) gösteren fotomikrografı. Boşaltım baş(lar)ı kaplar. Büyütme × 1000. (C) Mikroakışkan bir kanalda akışla taşınan büyük bir ışın demetinin gelişimi (950 fps'de yüksek hızlı bir kamera kullanılarak). (D) Akridin turuncu ile boyanmış bir sperm yaymasının büyük demetleri (oklar) gösteren mikrografı. Büyütme: ×200.
Akridin turuncu ile boyanmış bir sperm demeti ve sperm yaymasının taramalı elektron mikrografı. (A, B, D, E) spermatozoaların dijital renkli taramalı elektron mikrograflarıdır ve C ve F, kuyruk ağını saran çok sayıda spermatozoanın yapışmasını gösteren akridin turuncu ile boyanmış sperm yaymalarının mikrograflarıdır. (AC) Sperm agregatları, yapışmış kuyrukların (oklar) bir ağı olarak gösterilmiştir. (D) Kuyruğu saran birkaç spermatozoanın yapışması (yapışkan madde ile, pembe çerçeve, ok). (E ve F) Yapışkan madde (işaretçiler) ile kaplı sperm başı agregatları (işaretçiler). Spermatozoalar, birkaç girdap benzeri yapı içeren demetler oluşturmuştur (F). (C) ×400 ve (F) ×200 büyütmeler.
İletim elektron mikroskobu kullanarak, sperm demetlerinin bağlı kuyrukları (Şekil 6A, C), kuyruklara bağlı başları (Şekil 6B) veya kuyruklara bağlı başları (Şekil 6D) olduğunu bulduk. Demetteki spermatozoaların başları kavisli olup, kesitte iki nükleer bölge göstermektedir (Şekil 6D). Kesik demetinde ise spermatozoaların iki nükleer bölgeye ve çok sayıda kamçı bölgesine sahip, bükülmüş bir başı vardı (Şekil 5A).
Sperm demetindeki bağlantı kuyruklarını ve sperm başlarını birbirine bağlayan yapışkan maddeyi gösteren dijital renkli elektron mikrografı. (A) Çok sayıda sperm hücresinin bağlı kuyruğu. Kuyruğun hem dikey (ok) hem de yatay (ok) projeksiyonlarda nasıl göründüğüne dikkat edin. (B) Spermin başı (ok) kuyruğa (ok) bağlıdır. (C) Birkaç sperm kuyruğu (ok) bağlıdır. (D) Yapışkan madde (AS, mavi) dört sperm başını (mor) birbirine bağlar.
Sperm demetlerinde salgılar veya zarlar ile kaplı sperm başlarını tespit etmek için taramalı elektron mikroskobu kullanıldı (Şekil 6B), bu da sperm demetlerinin hücre dışı materyal tarafından sabitlendiğini gösteriyor. Aglütine olmuş materyal sperm başında yoğunlaşmış (denizanası başı benzeri yapı; Şekil 5B) ve distal yönde genişleyerek akridin turuncu ile boyandığında floresan mikroskopi altında parlak sarı bir görünüm vermiştir (Şekil 6C). Bu madde taramalı mikroskop altında açıkça görülebilir ve bir bağlayıcı olarak kabul edilir. Yarı ince kesitler (Şekil 5C) ve akridin turuncu ile boyanmış sperm yaymaları, yoğun bir şekilde paketlenmiş başlar ve kıvrılmış kuyruklar içeren sperm demetlerini göstermiştir (Şekil 5D).
Çeşitli yöntemler kullanılarak sperm başlarının ve katlanmış kuyrukların kümelenmesini gösteren çeşitli fotomikrograflar. (A) İki parçalı çekirdeğe (mavi) ve birkaç kamçı parçasına (yeşil) sahip kıvrılmış bir sperm başını gösteren bir sperm demetinin kesitsel dijital renkli transmisyon elektron mikrografı. (B) Örtülü gibi görünen denizanası benzeri sperm başlarının (oklar) kümesini gösteren dijital renkli taramalı elektron mikrografı. (C) Kümelenmiş sperm başlarını (oklar) ve kıvrılmış kuyrukları (oklar) gösteren yarı ince kesit. (D) Akridin turuncu ile boyanmış bir sperm yaymasının mikrografı, sperm başlarının (oklar) ve kıvrılmış yapışkan kuyrukların (oklar) kümelerini göstermektedir. Yapışkan bir maddenin (S) spermatozoonun başını kapladığına dikkat edin. (D) × 1000 büyütme.
İletim elektron mikroskobu kullanılarak (Şekil 7A), akridin turuncu ile boyanmış ve floresan mikroskobu kullanılarak incelenen sperm yaymalarında da doğrulandığı gibi, sperm başlarının bükülmüş ve çekirdeklerin spiral bir şekle sahip olduğu gözlemlenmiştir (Şekil 7B).
(A) Dijital renkli transmisyon elektron mikrografı ve (B) Akridin turuncu ile boyanmış sperm yayması, kıvrılmış başları ve sperm başları ile kuyruklarının birbirine yapışmasını (oklar) göstermektedir. (B) × 1000 büyütme.
İlginç bir bulgu, Sharkazi'nin spermlerinin hareketli, lifli demetler oluşturmak üzere bir araya gelmesidir. Bu demetlerin özellikleri, SST'de spermlerin emilimi ve depolanmasındaki olası rollerini anlamamızı sağlar.
Çiftleşmeden sonra spermler vajinaya girer ve yoğun bir seçilim sürecinden geçer; bu da sadece sınırlı sayıda spermin SST'ye girmesiyle sonuçlanır15,16. Bugüne kadar, spermlerin SST'ye giriş ve çıkış mekanizmaları net değildir. Kanatlılarda, spermler türe bağlı olarak 2 ila 10 hafta arasında değişen uzun bir süre boyunca SST'de depolanır6. SST'de depolama sırasında meni durumuna ilişkin tartışmalar devam etmektedir. Hareket halinde mi yoksa hareketsiz mi? Başka bir deyişle, sperm hücreleri SST'deki konumlarını bu kadar uzun süre nasıl koruyor?
Forman4, SST'deki yerleşim ve atılımın sperm hareketliliği açısından açıklanabileceğini öne sürmüştür. Yazarlar, spermlerin SST epitelinin oluşturduğu sıvı akışına karşı yüzerek pozisyonlarını koruduklarını ve enerji eksikliğinden dolayı geriye doğru hareket etmeye başladıkları noktanın altına düştüklerinde SST'den atıldıklarını varsaymaktadırlar. Zaniboni5, SST epitel hücrelerinin apikal kısmında aquaporin 2, 3 ve 9'un varlığını doğrulamıştır; bu da Foreman'ın sperm depolama modelini dolaylı olarak destekleyebilir. Mevcut çalışmada, Sharkashi'nin spermlerinin neredeyse yarısının akan sıvıda pozitif reoloji gösterdiğini ve aglütine sperm demetlerinin pozitif reoloji gösteren sperm sayısını artırdığını, ancak aglütinasyonun onları yavaşlattığını bulduk. Sperm hücrelerinin kuşun fallop tüpünden döllenme bölgesine nasıl ulaştığı tam olarak anlaşılamamıştır. Memelilerde, foliküler sıvı spermleri kemoatraksiyon yoluyla çeker. Ancak kemoçekicilerin spermleri uzun mesafelere yaklaştırdığına inanılmaktadır7. Bu nedenle, sperm taşınmasından sorumlu başka mekanizmalar da vardır. Spermin çiftleşmeden sonra salınan fallop tüpü sıvısına karşı yönlenme ve akma yeteneğinin, farelerde spermin hedeflenmesinde önemli bir faktör olduğu bildirilmiştir. Parker 17, kuşlarda ve sürüngenlerde spermlerin siliyer akıma karşı yüzerek yumurta kanallarını geçtiğini öne sürmüştür. Kuşlarda deneysel olarak gösterilmemiş olsa da, Adolphi18, bir lam ve slayt arasına ince bir sıvı tabakası oluşturulduğunda, kuş sperminin pozitif sonuçlar verdiğini bulan ilk kişi olmuştur. Reoloji. Hino ve Yanagimachi [19], bir fare yumurtalık-tüp-rahim kompleksini bir perfüzyon halkasına yerleştirmiş ve fallop tüplerindeki sıvı akışını görselleştirmek için isthmus'a 1 µl mürekkep enjekte etmiştir. Fallop tüpünde çok aktif bir kasılma ve gevşeme hareketi gözlemlediler; bu hareket sırasında tüm mürekkep topları sürekli olarak fallop tüpünün ampullasına doğru hareket ediyordu. Yazarlar, sperm yükselmesi ve döllenme için alt fallop tüplerinden üst fallop tüplerine tüp sıvısı akışının önemini vurguluyorlar. Brillard20, tavuklarda ve hindilerde spermlerin, depolandıkları vajina girişinden, depolandıkları rahim-vajinal birleşime doğru aktif hareketle göç ettiklerini bildirmiştir. Bununla birlikte, spermler pasif yer değiştirme ile taşındığı için rahim-vajinal birleşim ile infundibulum arasında bu hareket gerekli değildir. Bu önceki öneriler ve mevcut çalışmada elde edilen sonuçlar göz önüne alındığında, spermlerin yukarı doğru hareket etme yeteneğinin (reoloji), seçim sürecinin dayandığı özelliklerden biri olduğu varsayılabilir. Bu, spermlerin vajinadan geçişini ve depolanmak üzere CCT'ye girişini belirler. Forman4'ün de belirttiği gibi, bu durum sperm hücrelerinin SST'ye ve yaşam alanına bir süre girmesini ve hızları yavaşlamaya başladığında oradan çıkmasını da kolaylaştırabilir.
Öte yandan, Matsuzaki ve Sasanami 21, kuş spermlerinin erkek ve dişi üreme yollarında uykudan hareketli hale geçişte hareketlilik değişiklikleri geçirdiğini öne sürmüştür. Sperm hücrelerinin uzun süre depolanmasının ve SST'den ayrıldıktan sonra yenilenmesinin, SST'deki yerleşik sperm hareketliliğinin inhibisyonu ile açıklanabileceği öne sürülmüştür. Hipoksik koşullar altında, Matsuzaki ve ark. 1, SST'de yüksek miktarda laktat üretimi ve salınımı olduğunu ve bunun da yerleşik sperm hareketliliğinin inhibisyonuna yol açabileceğini bildirmiştir. Bu durumda, sperm reolojisinin önemi, sperm hücrelerinin depolanmasında değil, seçimi ve emiliminde yansıtılmaktadır.
Sperm aglütinasyon paterni, kanatlılarda sperm tutulumunun yaygın bir paterni olduğu için, spermin SST'de uzun süre saklanmasının olası bir açıklaması olarak kabul edilir2,22,23. Bakst ve ark. 2, bıldırcın CCM'sinde çoğu sperm hücresinin birbirine yapışarak demetler oluşturduğunu ve tek sperm hücrelerinin nadiren bulunduğunu gözlemlemiştir. Öte yandan, Wen ve ark. 24, tavuklarda SST lümeninde daha dağınık sperm hücreleri ve daha az sperm hücresi demeti gözlemlemiştir. Bu gözlemlere dayanarak, sperm aglütinasyon eğiliminin kuşlar arasında ve aynı ejakülattaki sperm hücreleri arasında farklılık gösterdiği varsayılabilir. Ek olarak, Van Krey ve ark. 9, aglütine sperm hücrelerinin rastgele ayrışmasının, sperm hücrelerinin fallop tüpü lümenine kademeli olarak nüfuz etmesinden sorumlu olduğunu öne sürmüştür. Bu hipoteze göre, aglütinasyon kapasitesi düşük olan spermatozoaların SST'den ilk önce atılması gerekir. Bu bağlamda, spermatozoaların aglütinasyon yeteneği, kirli kuşlarda sperm rekabetinin sonucunu etkileyen bir faktör olabilir. Ayrıca, aglütine olmuş sperm ne kadar uzun süre ayrışırsa, doğurganlık da o kadar uzun süre korunur.
Spermatozoa agregasyonu ve demetler halinde agregasyonu çeşitli çalışmalarda gözlemlenmiş olmasına rağmen2,22,24, SST içindeki kinematik gözlemlerinin karmaşıklığı nedeniyle ayrıntılı olarak tanımlanmamıştır. İn vitro sperm aglütinasyonunu incelemek için çeşitli girişimlerde bulunulmuştur. İnce tel, sarkıtılan tohum damlasından çıkarıldığında kapsamlı ancak geçici bir agregasyon gözlemlenmiştir. Bu, meni bezini taklit eden, damladan dışarı doğru uzanan uzun bir kabarcığın oluşmasına yol açar. 3D sınırlamaları ve kısa damla kuruma süreleri nedeniyle, tüm blok hızla bozulmuştur9. Mevcut çalışmada, Sharkashi tavukları ve mikroakışkan çipler kullanarak, bu demetlerin nasıl oluştuğunu ve nasıl hareket ettiğini tanımlayabildik. Sperm demetleri meni toplandıktan hemen sonra oluşmuş ve akışta bulunduklarında pozitif reoloji göstererek spiral şeklinde hareket ettikleri bulunmuştur. Ayrıca, makroskobik olarak bakıldığında, sperm demetlerinin izole spermatozoalara kıyasla hareketliliğin doğrusallığını artırdığı gözlemlenmiştir. Bu, sperm aglütinasyonunun SST penetrasyonundan önce meydana gelebileceğini ve sperm üretiminin daha önce öne sürüldüğü gibi stres nedeniyle küçük bir alanla sınırlı olmadığını göstermektedir (Tingari ve Lake12). Demet oluşumu sırasında, sperm hücreleri birleşme noktasına ulaşana kadar senkronize olarak yüzerler, ardından kuyrukları birbirlerinin etrafına sarılır ve sperm hücresinin başı serbest kalır, ancak kuyruk ve sperm hücresinin distal kısmı yapışkan bir maddeyle birbirine yapışır. Bu nedenle, bağın serbest başı, bağın geri kalanını sürükleyerek hareketten sorumludur. Sperm demetlerinin taramalı elektron mikroskobu incelemesi, çok miktarda yapışkan maddeyle kaplı bağlı sperm başlarını gösterdi; bu da sperm başlarının, depolama alanına (SST) ulaştıktan sonra meydana gelmiş olabilecek dinlenme demetlerinde bağlı olduğunu düşündürmektedir.
Sperm yayması akridin turuncu ile boyandığında, sperm hücrelerinin etrafındaki hücre dışı yapışkan madde floresan mikroskop altında görülebilir. Bu madde, sperm demetlerinin çevredeki yüzeylere veya parçacıklara yapışmasını ve tutunmasını sağlayarak, çevredeki akıntı ile sürüklenmelerini engeller. Dolayısıyla, gözlemlerimiz sperm yapışmasının hareketli demetler halindeki rolünü göstermektedir. Akıntıya karşı yüzme ve yakındaki yüzeylere yapışma yetenekleri, spermlerin SST'de daha uzun süre kalmasını sağlar.
Rothschild25, bir damla süspansiyon içindeki sığır sperminin yüzer dağılımını incelemek için hemositometri kamerası kullandı ve mikroskobun hem dikey hem de yatay optik eksenine sahip bir kamera aracılığıyla fotomikrograflar çekti. Sonuçlar, spermlerin haznenin yüzeyine çekildiğini gösterdi. Yazarlar, sperm ile yüzey arasında hidrodinamik etkileşimler olabileceğini öne sürüyor. Bunu, Sharkashi tavuk sperminin yapışkan topaklar oluşturma yeteneğiyle birlikte dikkate alırsak, spermin SST duvarına yapışma ve uzun süre saklanma olasılığının artabileceğini düşünüyoruz.
Bccetti ve Afzeliu26, sperm glikokaliksinin gamet tanıma ve aglütinasyon için gerekli olduğunu bildirmiştir. Forman10, kuş sperminin nöraminidaz ile işlenmesiyle glikoprotein-glikolipit kaplamalarındaki α-glikozidik bağların hidrolizinin, sperm hareketliliğini etkilemeden doğurganlığı azalttığını gözlemlemiştir. Yazarlar, nöraminidazın glikokaliks üzerindeki etkisinin, spermin rahim-vajinal birleşim yerinde tutulmasını bozarak doğurganlığı azalttığını öne sürmektedir. Gözlemleri, nöraminidaz tedavisinin sperm ve oosit tanınmasını azaltabileceği olasılığını göz ardı edemez. Forman ve Engel10, tavuklara nöraminidaz ile işlenmiş sperm ile vajinal yolla suni dölleme yapıldığında doğurganlığın azaldığını bulmuştur. Bununla birlikte, nöraminidaz ile işlenmiş sperm ile yapılan IVF, kontrol tavuklarına kıyasla doğurganlığı etkilememiştir. Yazarlar, sperm zarı çevresindeki glikoprotein-glikolipit kaplamadaki değişikliklerin, sperm hücrelerinin rahim-vajina birleşim yerinde tutulmasını bozarak sperm döllenme yeteneğini azalttığı, bunun da rahim-vajina birleşim yerinin hızı nedeniyle sperm kaybını artırdığı, ancak sperm ve yumurta tanınmasını etkilemediği sonucuna vardılar.
Bakst ve Bauchan 11, hindilerde SST lümeninde küçük veziküller ve membran parçaları bulmuş ve bu granüllerin bazılarının sperm membranıyla kaynaştığını gözlemlemiştir. Yazarlar, bu ilişkilerin spermatozoanın SST'de uzun süreli depolanmasına katkıda bulunabileceğini öne sürmektedir. Bununla birlikte, araştırmacılar bu parçacıkların kaynağını, CCT epitel hücreleri tarafından salgılanıp salgılanmadığını, erkek üreme sistemi tarafından üretilip salgılanıp salgılanmadığını veya spermin kendisi tarafından üretilip üretilmediğini belirtmemiştir. Ayrıca, bu parçacıklar aglütinasyondan sorumludur. Grützner ve ark.27, epididimal epitel hücrelerinin tek gözenekli seminal kanalların oluşumu için gerekli olan spesifik bir proteini ürettiğini ve salgıladığını bildirmiştir. Yazarlar ayrıca, bu demetlerin dağılımının epididimal proteinlerin etkileşimine bağlı olduğunu da belirtmiştir. Nixon ve ark.28, adnekslerin asidik sistein açısından zengin osteonektin adı verilen bir protein salgıladığını bulmuştur; SPARC, kısa gagalı dikenli karıncalar ve platipuslarda sperm demetlerinin oluşumunda rol oynar. Bu ışınların saçılması, bu proteinin kaybıyla ilişkilidir.
Mevcut çalışmada, elektron mikroskobu kullanılarak yapılan ultrastrüktürel analiz, sperm hücrelerinin yoğun bir maddeye yapıştığını göstermiştir. Bu maddelerin, yapışan başlar arasında ve çevresinde yoğunlaşan aglütinasyondan sorumlu olduğu düşünülmektedir, ancak kuyruk bölgesinde daha düşük konsantrasyonlarda bulunurlar. Bu aglütinasyon maddesinin, ejakülasyon sırasında sıklıkla meni ile birlikte lenf ve seminal plazmanın ayrıldığını gözlemlediğimiz için, erkek üreme sisteminden (epididimis veya vas deferens) meni ile birlikte atıldığını varsayıyoruz. Kuş sperm hücrelerinin epididimis ve vas deferens'ten geçerken, proteinlere bağlanma ve plazma lemma ile ilişkili glikoproteinleri edinme yeteneklerini destekleyen olgunlaşma ile ilgili değişikliklere uğradığı bildirilmiştir. Bu proteinlerin SST'deki yerleşik sperm zarlarında kalıcılığı, bu proteinlerin sperm zarı stabilitesinin kazanımını etkileyebileceğini 30 ve doğurganlıklarını belirleyebileceğini 31 düşündürmektedir. Ahammad ve diğerleri32, erkek üreme sisteminin çeşitli kısımlarından (testislerden distal vas deferens'e kadar) elde edilen spermlerin, depolama sıcaklığından bağımsız olarak, sıvı depolama koşulları altında canlılıklarında kademeli bir artış gösterdiğini ve tavuklarda da suni döllenmeden sonra fallop tüplerinde canlılığın arttığını bildirmiştir.
Sharkashi tavuklarının sperm demetleri, echidna, platypus, orman faresi, geyik sıçanı ve kobay gibi diğer türlerden farklı özelliklere ve işlevlere sahiptir. Sharkashi tavuklarında, sperm demetlerinin oluşumu, tek sperm hücrelerine kıyasla yüzme hızlarını düşürmüştür. Bununla birlikte, bu demetler reolojik olarak pozitif sperm hücrelerinin yüzdesini artırmış ve sperm hücrelerinin dinamik bir ortamda kendilerini stabilize etme yeteneğini artırmıştır. Bu nedenle, sonuçlarımız, SST'deki sperm aglütinasyonunun uzun süreli sperm depolamasıyla ilişkili olduğu yönündeki önceki öneriyi doğrulamaktadır. Ayrıca, sperm hücrelerinin demet oluşturma eğiliminin, SST'deki sperm kaybı oranını kontrol edebileceğini ve bunun da sperm rekabetinin sonucunu değiştirebileceğini varsayıyoruz. Bu varsayıma göre, düşük aglütinasyon kapasitesine sahip sperm hücreleri SST'yi ilk önce salarken, yüksek aglütinasyon kapasitesine sahip sperm hücreleri yavruların çoğunu üretir. Tek gözenekli sperm demetlerinin oluşumu faydalıdır ve ebeveyn-çocuk oranını etkiler, ancak farklı bir mekanizma kullanır. Kirpi ve platipuslarda, sperm hücreleri ışının ileri hızını artırmak için birbirine paralel olarak dizilmiştir. Kirpi sperm demetleri, tek bir sperm hücresine göre yaklaşık üç kat daha hızlı hareket eder. Kirpilerde bu tür sperm demetlerinin oluşmasının, dişilerin çok eşli olması ve genellikle birden fazla erkekle çiftleşmesi nedeniyle, baskınlığı korumak için evrimsel bir adaptasyon olduğuna inanılmaktadır. Bu nedenle, farklı ejakülatlardan gelen sperm hücreleri, yumurtanın döllenmesi için şiddetli bir şekilde rekabet eder.
Sharkasi tavuklarının aglütine olmuş spermleri, faz kontrast mikroskobu kullanılarak kolayca görüntülenebilir; bu da spermlerin in vitro davranışlarının kolayca incelenmesine olanak sağladığı için avantajlı kabul edilir. Sharkasi tavuklarında sperm demeti oluşumunun üremeyi teşvik etme mekanizması, bazı plasental memelilerde görülen ve işbirlikçi sperm davranışını temsil eden mekanizmadan da farklıdır; örneğin, bazı spermler yumurtalara ulaşır ve diğer ilgili bireylerin yumurtalarına ulaşmasına ve zarar vermesine yardımcı olur. Kendini kanıtlamak için. Özgeci davranış. Kendi kendine döllenme 34. Spermlerde işbirlikçi davranışın bir başka örneği de geyik farelerinde bulunmuştur; burada spermler en genetik olarak ilişkili spermleri tanımlayabilmiş ve onlarla birleşerek, akraba olmayan spermlere kıyasla hızlarını artırmak için işbirlikçi gruplar oluşturabilmiştir35.
Bu çalışmada elde edilen sonuçlar, Foman'ın sperm hücrelerinin SWS'de uzun süreli depolanması teorisiyle çelişmemektedir. Araştırmacılar, sperm hücrelerinin SST'yi çevreleyen epitel hücrelerinin akışında uzun bir süre hareket etmeye devam ettiğini ve belirli bir süre sonra sperm hücrelerinin enerji depolarının tükendiğini, bunun da hızda bir azalmaya yol açarak küçük molekül ağırlıklı maddelerin atılımına olanak sağladığını bildirmektedir. Bu durum, SST lümeninden fallop tüpü boşluğuna doğru akan sıvının akışıyla sperm hücrelerinin enerjisini etkiler. Mevcut çalışmada, tek sperm hücrelerinin yarısının akan sıvılara karşı yüzme yeteneği gösterdiğini ve demet halindeki yapışmalarının pozitif reoloji gösterme yeteneklerini artırdığını gözlemledik. Ayrıca, verilerimiz, SST'deki artan laktat salgısının yerleşik sperm hareketliliğini engelleyebileceğini bildiren Matsuzaki ve ark. 1'in verileriyle tutarlıdır. Bununla birlikte, sonuçlarımız, SST'deki davranışlarını aydınlatmak amacıyla, mikrokanal içindeki dinamik bir ortamda sperm hareketli bağlarının oluşumunu ve reolojik davranışlarını tanımlamaktadır. Gelecekteki araştırmalar, yapışkanlaştırıcı maddenin kimyasal bileşimini ve kökenini belirlemeye odaklanabilir; bu da araştırmacıların sıvı meniyi saklamanın ve doğurganlık süresini uzatmanın yeni yollarını geliştirmelerine şüphesiz yardımcı olacaktır.
Çalışmada sperm donörü olarak 30 haftalık on beş adet çıplak boyunlu erkek sharkasi (homozigot dominant; Na Na) seçildi. Kuşlar, Mısır'ın Aşit Valiliği, Aşit Üniversitesi Ziraat Fakültesi Araştırma Kanatlı Çiftliği'nde yetiştirildi. Kuşlar, bireysel kafeslerde (30 x 40 x 40 cm) barındırıldı, ışık programına (16 saat ışık ve 8 saat karanlık) tabi tutuldu ve her biri kilogram başına 160 g ham protein, 2800 kcal metabolize edilebilir enerji, 35 g kalsiyum ve 5 gram kullanılabilir fosfor içeren bir diyetle beslendi.
Verilere göre 36, ​​37, erkeklerden karın masajı yoluyla meni toplandı. 3 gün boyunca 15 erkekten toplam 45 meni örneği toplandı. Meni (n = 15/gün), potasyum difosfat (1,27 g), monosodyum glutamat monohidrat (0,867 g), fruktoz (0,5 d), susuz sodyum asetat (0,43 g), tris(hidroksimetil)aminometan (0,195 g), potasyum sitrat monohidrat (0,064 g), potasyum monofosfat (0,065 g), magnezyum klorür (0,034 g) ve H2O (100 ml) içeren Belsville Kanatlı Menisi Seyrelticisi ile hemen 1:1 (v:v) oranında seyreltildi, pH = 7,5, ozmolarite 333 mOsm/kg38. Seyreltilmiş meni örnekleri, öncelikle meni kalitesinin (nem oranının) iyi olduğundan emin olmak için ışık mikroskobu altında incelendi ve daha sonra toplandıktan sonraki yarım saat içinde kullanılana kadar 37°C'lik bir su banyosunda saklandı.
Spermatozoaların kinematik ve reolojisi, mikroakışkan cihazlar sistemi kullanılarak tanımlanmıştır. Semen örnekleri, Beltsville Kuş Semeni Seyrelticisi ile 1:40 oranında daha da seyreltilmiş, bir mikroakışkan cihaza yüklenmiş (aşağıya bakınız) ve kinetik parametreler, daha önce mikroakışkan karakterizasyonu için geliştirilmiş bir Bilgisayarlı Semen Analizi (CASA) sistemi kullanılarak belirlenmiştir. Bu sistem, sıvı ortamda spermatozoaların hareketliliği üzerine bir çalışmadır (Makine Mühendisliği Bölümü, Mühendislik Fakültesi, Assiut Üniversitesi, Mısır). Eklenti şu adresten indirilebilir: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39. Eğri hızı (VCL, μm/s), doğrusal hız (VSL, μm/s) ve ortalama yörünge hızı (VAP, μm/s) ölçülmüştür. Spermatozoaların videoları, Tucson ISH1000 kameraya bağlı ters çevrilmiş bir Optika XDS-3 faz kontrast mikroskobu (40x objektifli) kullanılarak 30 fps hızında 3 saniye süreyle kaydedildi. Her örnek için en az üç alan ve 500 sperm yörüngesi incelemek üzere CASA yazılımı kullanıldı. Kaydedilen video, ev yapımı bir CASA kullanılarak işlendi. CASA eklentisindeki hareketlilik tanımı, sperm hücrelerinin akış hızına göre yüzme hızına dayanmaktadır ve yan yana hareket gibi diğer parametreleri içermez, çünkü bunun sıvı akışında daha güvenilir olduğu bulunmuştur. Reolojik hareket, sperm hücrelerinin sıvı akış yönünün tersine hareketi olarak tanımlanır. Reolojik özelliklere sahip spermatozoalar, hareketli spermatozoa sayısına bölündü; hareketsiz spermatozoalar ve konvektif olarak hareket eden spermatozoalar sayıma dahil edilmedi.
Aksi belirtilmedikçe, kullanılan tüm kimyasallar Elgomhoria Pharmaceuticals'tan (Kahire, Mısır) temin edilmiştir. Cihaz, El-sherry ve ark. 40 tarafından tanımlandığı gibi, bazı değişikliklerle üretilmiştir. Mikrokanalların imalatında kullanılan malzemeler arasında cam plakalar (Howard Glass, Worcester, MA), SU-8-25 negatif direnç (MicroChem, Newton, CA), diaseton alkol (Sigma Aldrich, Steinheim, Almanya) ve poliaseton (-184, Dow Corning, Midland, Michigan) bulunmaktadır. Mikrokanallar yumuşak litografi kullanılarak üretilir. İlk olarak, istenen mikrokanal tasarımına sahip şeffaf bir koruyucu yüz maskesi yüksek çözünürlüklü bir yazıcıda (Prismatic, Kahire, Mısır ve Pacific Arts and Design, Markham, ON) basılmıştır. Ana kalıplar, altlık olarak cam plakalar kullanılarak yapılmıştır. Plakalar aseton, izopropanol ve deiyonize suda temizlendikten sonra, döndürerek kaplama yöntemiyle (3000 rpm, 1 dk) 20 µm kalınlığında SU8-25 tabakası ile kaplandı. SU-8 tabakaları daha sonra yavaşça kurutuldu (65°C, 2 dk ve 95°C, 10 dk) ve 50 saniye boyunca UV ışınlarına maruz bırakıldı. Maruz kalan SU-8 tabakalarını çapraz bağlamak için 65°C ve 95°C'de sırasıyla 1 dk ve 4 dk süreyle fırınlama yapıldı, ardından 6,5 dakika boyunca diaseton alkolde geliştirme işlemi uygulandı. SU-8 tabakasını daha da katılaştırmak için waffle'lar sert fırınlama işlemine tabi tutuldu (200°C, 15 dk).
PDMS, monomer ve sertleştiricinin 10:1 ağırlık oranında karıştırılmasıyla hazırlandı, ardından vakumlu kurutucuda gazı giderildi ve SU-8 ana çerçeveye döküldü. PDMS, fırında (120°C, 30 dk) kürlendi, daha sonra kanallar kesildi, ana kalıptan ayrıldı ve mikrokanalın giriş ve çıkışına tüplerin takılabilmesi için delikler açıldı. Son olarak, PDMS mikrokanalları, başka bir yerde açıklandığı gibi, taşınabilir bir korona işlemcisi (Electro-Technic Products, Chicago, IL) kullanılarak mikroskop lamlarına kalıcı olarak yapıştırıldı. Bu çalışmada kullanılan mikrokanal 200 µm × 20 µm (G × Y) ölçülerinde ve 3,6 cm uzunluğundadır.
Mikrokanal içindeki hidrostatik basınç tarafından oluşturulan akışkan akışı, giriş haznesindeki akışkan seviyesinin çıkış haznesindeki yükseklik farkı Δh39'un üzerinde tutulmasıyla sağlanır (Şekil 1).
Burada f, dikdörtgen bir kanalda laminer akış için f = C/Re olarak tanımlanan sürtünme katsayısıdır; burada C, kanalın en boy oranına bağlı bir sabittir, L mikrokanalın uzunluğudur, Vav mikrokanal içindeki ortalama hızdır, Dh kanalın hidrolik çapıdır ve g yerçekimi ivmesidir. Bu denklem kullanılarak, ortalama kanal hızı aşağıdaki denklemle hesaplanabilir: