Спасибо за посещение сайта Nature.com. Версия вашего браузера имеет ограниченную поддержку CSS. Для наилучшего взаимодействия с сайтом мы рекомендуем использовать обновлённую версию браузера (или отключить режим совместимости в Internet Explorer). В настоящее время, для обеспечения дальнейшей поддержки, мы будем отображать сайт без стилей и JavaScript.
Фертильность птиц зависит от их способности хранить достаточное количество жизнеспособных сперматозоидов в течение длительного периода времени в сперматозоидных канальцах (ССК). Точный механизм проникновения, пребывания и выхода сперматозоидов из ССК остается предметом дискуссий. Сперматозоиды кур породы шаркаси демонстрировали высокую склонность к агглютинации, образуя подвижные нитевидные пучки, содержащие множество клеток. Из-за сложности наблюдения за подвижностью и поведением сперматозоидов в непрозрачной фаллопиевой трубе мы использовали микрофлюидное устройство с микроканалом, поперечным сечением которого аналогично сперматозоидам, для изучения агглютинации и подвижности сперматозоидов. В этом исследовании обсуждается, как образуются пучки сперматозоидов, как они движутся и их возможная роль в продлении пребывания сперматозоидов в ССК. Мы исследовали скорость и реологическое поведение сперматозоидов при создании потока жидкости внутри микрофлюидного канала под действием гидростатического давления (скорость потока = 33 мкм/с). Сперматозоиды, как правило, плывут против течения (положительная реология), и скорость пучка сперматозоидов значительно снижается по сравнению с одиночными сперматозоидами. Было замечено, что пучки сперматозоидов движутся по спирали и увеличиваются в длину и толщину по мере вовлечения большего количества одиночных сперматозоидов. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются к боковым стенкам микрофлюидных каналов и прилипают к ним, чтобы избежать воздействия потока жидкости со скоростью > 33 мкм/с. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются к боковым стенкам микрофлюидных каналов и прилипают к ним, чтобы избежать воздействия потока жидкости со скоростью > 33 мкм/с. Было замечено, что пучки сперматозоидов появляются и прилипают к боковым стенкам микрофлюидных каналов, чтобы избежать сметания со скоростью потока жидкости > 33 мкм/с. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются к боковым стенкам микрофлюидных каналов и прилипают к ним, чтобы избежать уноса потоком жидкости со скоростью >33 мкм/с.Скорость передачи данных выше 33 мкм/с.33 мкм/с. Было замечено, что пучки сперматозоидов появляются и прилипают к боковым стенкам микрожидкостного канала, чтобы избежать сметания потока жидкости со скоростью > 33 мкм/с. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются к боковым стенкам микрофлюидного канала и прилипают к ним, чтобы избежать уноса потоком жидкости со скоростью >33 мкм/с.Сканирующая и трансмиссионная электронная микроскопия показали, что пучки сперматозоидов поддерживаются обильным плотным материалом. Полученные данные демонстрируют уникальную подвижность сперматозоидов цыплят породы Шаркази, а также способность сперматозоидов агглютинировать и образовывать подвижные пучки, что способствует лучшему пониманию длительного хранения сперматозоидов в SMT.
Для оплодотворения у человека и большинства животных сперматозоиды и яйцеклетки должны прибыть к месту оплодотворения в нужное время. Следовательно, спаривание должно происходить до или во время овуляции. С другой стороны, некоторые млекопитающие, такие как собаки, а также виды, не относящиеся к млекопитающим, такие как насекомые, рыбы, рептилии и птицы, хранят сперму в своих репродуктивных органах в течение длительного периода времени, пока их яйцеклетки не будут готовы к оплодотворению (асинхронное оплодотворение¹). Птицы способны поддерживать жизнеспособность сперматозоидов, способных оплодотворить яйцеклетки, в течение 2-10 недель².
Это уникальная особенность, отличающая птиц от других животных, поскольку она обеспечивает высокую вероятность оплодотворения после однократного осеменения в течение нескольких недель без одновременного спаривания и овуляции. Главный орган хранения спермы, называемый сперматозоидным канальцем (ССК), расположен во внутренних слизистых складках в области маточно-влагалищного соединения. До настоящего времени механизмы проникновения, хранения и выхода спермы из сперматозоидного банка до конца не изучены. На основе предыдущих исследований было выдвинуто множество гипотез, но ни одна из них не подтвердилась.
Форман4 выдвинул гипотезу, что сперматозоиды поддерживают свое пребывание в полости семявыносящего протока (СПП) за счет непрерывного колебательного движения против направления потока жидкости через белковые каналы, расположенные на эпителиальных клетках СПП (реология). АТФ истощается из-за постоянной активности жгутиков, необходимой для удержания сперматозоидов в просвете СПП, и подвижность в конечном итоге снижается, пока сперматозоиды не будут вынесены из сперматозоидного банка потоком жидкости и не начнут новый путь вниз по восходящей фаллопиевой трубе для оплодотворения яйцеклетки (Форман4). Эта модель хранения спермы подтверждается обнаружением с помощью иммуноцитохимии аквапоринов 2, 3 и 9, присутствующих в эпителиальных клетках СПП. На сегодняшний день отсутствуют исследования реологии спермы цыплят и ее роли в хранении спермы в СПП, вагинальном отборе сперматозоидов и конкуренции сперматозоидов. У цыплят сперматозоиды попадают во влагалище после естественного спаривания, но более 80% сперматозоидов выводятся из влагалища вскоре после спаривания. Это предполагает, что влагалище является основным местом отбора сперматозоидов у птиц. Кроме того, сообщалось, что менее 1% сперматозоидов, оплодотворенных во влагалище, попадают в SST2. При искусственном осеменении цыплят во влагалище количество сперматозоидов, достигающих SST, имеет тенденцию увеличиваться через 24 часа после осеменения. До сих пор механизм отбора сперматозоидов в этом процессе неясен, и подвижность сперматозоидов может играть важную роль в их попадании в SST. Из-за толстых и непрозрачных стенок фаллопиевых труб трудно напрямую отслеживать подвижность сперматозоидов в фаллопиевых трубах птиц. Поэтому нам не хватает базовых знаний о том, как сперматозоиды переходят в SST после оплодотворения.
Недавно было установлено, что реология является важным фактором, контролирующим транспорт сперматозоидов в половых органах млекопитающих. Основываясь на способности подвижных сперматозоидов мигрировать противотоком, Заферани и др.⁸ использовали микрофлюидную систему Corra для пассивной изоляции подвижных сперматозоидов из образцов спермы, содержащихся в загонах. Этот тип сортировки спермы необходим для лечения бесплодия и клинических исследований, и предпочтительнее традиционных методов, которые требуют много времени и труда и могут ухудшать морфологию и структурную целостность сперматозоидов. Однако до настоящего времени не проводились исследования влияния секретов половых органов кур на подвижность сперматозоидов.
Независимо от механизма, поддерживающего хранение сперматозоидов в сперматозоидах, многие исследователи наблюдали, что находящиеся в них сперматозоиды агглютинируют друг с другом в сперматозоидах цыплят 9, 10, перепелов 2 и индеек 11, образуя агглютинированные пучки сперматозоидов. Авторы предполагают, что существует связь между этой агглютинацией и длительным хранением сперматозоидов в сперматозоидах.
Тингари и Лейк12 сообщили о сильной связи между сперматозоидами в семявыносящей железе курицы и поставили под сомнение, агглютинируют ли птичьи сперматозоиды так же, как и сперматозоиды млекопитающих. Они считают, что глубокие связи между сперматозоидами в семявыносящем протоке могут быть обусловлены стрессом, вызванным присутствием большого количества сперматозоидов в небольшом пространстве.
При оценке поведения сперматозоидов на свежих предметных стеклах можно наблюдать кратковременные признаки агглютинации, особенно по краям капель спермы. Однако агглютинация часто нарушалась вращательным движением, связанным с непрерывным перемещением, что объясняет кратковременный характер этого явления. Исследователи также заметили, что при добавлении разбавителя к сперме появлялись удлиненные «нитевидные» клеточные агрегаты.
Первые попытки имитировать сперматозоид были предприняты путем удаления тонкой проволоки из висячей капли, в результате чего из капли спермы выступала удлиненная спермоподобная везикула. ​​Сперматозоиды немедленно выстраивались параллельно внутри везикулы, но вся единица быстро исчезала из-за трехмерного ограничения. Поэтому для изучения агглютинации сперматозоидов необходимо наблюдать подвижность и поведение сперматозоидов непосредственно в изолированных сперматозоидных канальцах, что трудно осуществить. Следовательно, необходимо разработать инструмент, имитирующий сперматозоиды, для поддержки исследований подвижности и агглютинационного поведения сперматозоидов. Бриллард и др.¹³ сообщили, что средняя длина сперматозоидных канальцев у взрослых цыплят составляет 400–600 мкм, но некоторые сперматозоидные канальцы могут достигать длины 2000 мкм. Меро и Огасавара14 разделили семенные железы на увеличенные и неувеличенные канальцы для хранения спермы, которые имели одинаковую длину (~500 мкм) и ширину шейки (~38 мкм), но средний диаметр просвета канальцев составлял 56,6 и 56,6 мкм соответственно, 11,2 мкм соответственно. В данном исследовании мы использовали микрофлюидное устройство с размером канала 200 мкм × 20 мкм (Ш × В), поперечное сечение которого несколько близко к поперечному сечению амплифицированных семенных канальцев. Кроме того, мы исследовали подвижность сперматозоидов и их агглютинацию в текущей жидкости, что согласуется с гипотезой Формана о том, что жидкость, вырабатываемая эпителиальными клетками семенных канальцев, удерживает сперматозоиды в просвете в противоточном (реологическом) направлении.
Целью данного исследования было преодоление проблем, связанных с наблюдением за подвижностью сперматозоидов в фаллопиевой трубе, и избежание трудностей, связанных с изучением реологии и поведения сперматозоидов в динамической среде. Для имитации подвижности сперматозоидов в половых органах курицы использовалось микрофлюидное устройство, создающее гидростатическое давление.
Когда каплю разбавленного образца спермы (1:40) помещали в микроканальное устройство, можно было идентифицировать два типа подвижности сперматозоидов (изолированные сперматозоиды и связанные сперматозоиды). Кроме того, сперматозоиды имели тенденцию двигаться против течения (положительная реология; видео 1, 2). Хотя пучки сперматозоидов имели меньшую скорость, чем одиночные сперматозоиды (p < 0,001), они увеличивали процент сперматозоидов, демонстрирующих положительный реотаксис (p < 0,001; Таблица 2). Хотя пучки сперматозоидов имели меньшую скорость, чем одиночные сперматозоиды (p < 0,001), они увеличивали процент сперматозоидов, демонстрирующих положительный реотаксис (p < 0,001; Таблица 2). Хотя пучки сперматозоидов имели более низкую скорость, чем у одиночных сперматозоидов (р < 0,001), они увеличивали процент сперматозоидов, демонстрирующих положительный реотаксис (р < 0,001; таблица 2). Хотя пучки сперматозоидов имели меньшую скорость, чем отдельные сперматозоиды (p < 0,001), они увеличивали процент сперматозоидов, демонстрирующих положительный реотаксис (p < 0,001; Таблица 2).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度（p < 0,001）, 但它们增加了显示阳性流变性的精子百分比（p < 0,001；表2）。流变性 精子百分比 （p <0,001 ； 2。。。。。。）））））） Хотя скорость пучков сперматозоидов была ниже, чем у одиночных сперматозоидов (р < 0,001), они увеличивали процент сперматозоидов с положительной реологией (р < 0,001; таблица 2). Хотя скорость движения пучков сперматозоидов была ниже, чем скорость движения отдельных сперматозоидов (p < 0,001), они увеличили процент сперматозоидов с положительными реологическими свойствами (p < 0,001; Таблица 2).Положительная реология для отдельных сперматозоидов и пучков оценивается примерно в 53% и 85% соответственно.
Было замечено, что сперматозоиды кур породы Шаркаши сразу после эякуляции образуют линейные пучки, состоящие из десятков особей. Эти пучки увеличиваются в длину и толщину со временем и могут оставаться in vitro в течение нескольких часов, прежде чем исчезнуть (видео 3). Эти нитевидные пучки имеют форму сперматозоидов ехидны, которые образуются на конце эпидидимиса. Было обнаружено, что сперма кур породы Шаркаши обладает высокой склонностью к агглютинации и образованию сетчатого пучка менее чем за одну минуту после сбора. Эти пучки динамичны и способны прилипать к любым близлежащим стенам или неподвижным объектам. Хотя пучки сперматозоидов снижают скорость сперматозоидов, очевидно, что макроскопически они увеличивают их линейность. Длина пучков варьируется в зависимости от количества сперматозоидов, собранных в пучки. Были выделены две части пучка: начальная часть, включающая свободную головку агглютинированного сперматозоида, и терминальная часть, включающая хвост и весь дистальный конец сперматозоида. С помощью высокоскоростной камеры (950 кадров в секунду) в начальной части пучка наблюдались свободные головки агглютинированных сперматозоидов, которые, благодаря своим колебательным движениям, заставляли пучок двигаться, а оставшиеся сперматозоиды втягивались в пучок по спирали (Видео 4). Однако в длинных пучках было замечено, что некоторые свободные головки сперматозоидов прилипли к телу, а концевая часть пучка действует как лопатки, помогая продвигать пучок.
В медленном потоке жидкости пучки сперматозоидов движутся параллельно друг другу, однако они начинают перекрываться и прилипать ко всему неподвижному, чтобы не быть смытыми течением по мере увеличения скорости потока. Пучки образуются, когда несколько сперматозоидов приближаются друг к другу, начинают двигаться синхронно, обвиваются друг вокруг друга, а затем прилипают к липкому веществу. На рисунках 1 и 2 показано, как сперматозоиды приближаются друг к другу, образуя соединение, когда их хвосты обвиваются друг вокруг друга.
Исследователи применили гидростатическое давление для создания потока жидкости в микроканале с целью изучения реологии сперматозоидов. Использовался микроканал размером 200 мкм × 20 мкм (Ш × В) и длиной 3,6 мкм. Микроканалы располагались между контейнерами, на концах которых были установлены шприцы. Для повышения видимости каналов использовался пищевой краситель.
Прикрепите соединительные кабели и аксессуары к стене. Видео было снято с помощью фазово-контрастного микроскопа. К каждому изображению прилагаются изображения фазово-контрастной микроскопии и картирования. (A) Соединение двух потоков сопротивляется потоку из-за спирального движения (красная стрелка). (B) Соединение пучка трубок со стенкой канала (красные стрелки), при этом они одновременно соединены с двумя другими пучками (желтые стрелки). (C) Пучки сперматозоидов в микрофлюидном канале начинают соединяться друг с другом (красные стрелки), образуя сетку из пучков сперматозоидов. (D) Формирование сети пучков сперматозоидов.
Когда капля разбавленной спермы была помещена в микрофлюидное устройство и был создан поток, наблюдалось движение пучка сперматозоидов против направления потока. Пучки плотно прилегали к стенкам микроканалов, а свободные головки в начальной части пучков плотно прилегали к ним (видео 5). Они также прилипают к любым неподвижным частицам на своем пути, таким как мусор, чтобы противостоять сносу течением. Со временем эти пучки превращаются в длинные нити, захватывающие другие отдельные сперматозоиды и более короткие пучки (видео 6). По мере замедления потока длинные линии сперматозоидов начинают формировать сеть сперматозоидных линий (видео 7; рисунок 2).
При высокой скорости потока (V > 33 мкм/с) спиральные движения нитей усиливаются в попытке захватить множество отдельных сперматозоидов, образующих пучки, которые лучше противостоят силе дрейфа потока. При высокой скорости потока (V > 33 мкм/с) спиральные движения нитей усиливаются в попытке захватить множество отдельных сперматозоидов, образующих пучки, которые лучше противостоят силе дрейфа потока. При высокой скорости потока (V > 33 мкм/с) спиральвидные движения нитей усиливаются, поскольку они пытаются поймать множество отдельных сперматозоидов, образующих пучки, которые лучше противостоят дрейфующей силе потока. При высоких скоростях потока (V > 33 мкм/с) спиральные движения нитей усиливаются, поскольку они стремятся захватить множество отдельных сперматозоидов, образуя пучки, которые лучше противостоят силе потока.在高流速(V > 33 мкм/с)时, 螺纹的螺旋运动增加,以试图捕捉许多形成束的单个精子,从而更好地抵抗流动的漂移力。在 高 流速 (v> 33 мкм/с) 时 , 的 螺旋 运动 增加 , 以 试图 许多 形成 束 单 个 精子 ,从而 更 地 抵抗 的 漂移力。。。。。。。。。。 При высоких скоростях потока (V > 33 мкм/с) спиральное движение нитей увеличивается в захвате, захватывая множество отдельных сперматозоидов, образующих пучки, чтобы лучше стабилизироваться силам дрейфа потока. При высоких скоростях потока (V > 33 мкм/с) спиральное движение филаментов усиливается в попытке захватить множество отдельных сперматозоидов, образуя пучки, которые лучше противостоят силам дрейфа потока.Они также пытались прикрепить микроканалы к боковым стенкам.
С помощью световой микроскопии (СМ) были идентифицированы пучки сперматозоидов как скопления головок и закрученных хвостов. Также были идентифицированы пучки сперматозоидов с различными агрегатами, представляющие собой скрученные головки и жгутиковые агрегаты, множественные слитые хвосты сперматозоидов, головки сперматозоидов, прикрепленные к хвосту, и головки сперматозоидов с изогнутыми ядрами как множественные слитые ядра. Трансмиссионная электронная микроскопия (ТЭМ) показала, что пучки сперматозоидов представляют собой оболочечные агрегаты головок сперматозоидов, а агрегаты сперматозоидов демонстрируют прикрепленную сеть обернутых хвостов.
Морфология и ультраструктура сперматозоидов, формирование пучков сперматозоидов изучались с помощью световой микроскопии (половинный срез), сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) и трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ), мазки спермы окрашивались акридиновым оранжевым и исследовались с помощью эпифлуоресцентной микроскопии.
Окрашивание мазков сперматозоидов акридиновым оранжевым (рис. 3B) показало, что головки сперматозоидов слиплись и были покрыты секреторным материалом, что привело к образованию больших пучков (рис. 3D). Сперматозоидные пучки состояли из агрегатов сперматозоидов с сетью прикрепленных хвостов (рис. 4A-C). Сперматозоидные пучки состоят из хвостов множества сперматозоидов, слипшихся вместе (рис. 4D). Секреты (рис. 4E,F) покрывали головки сперматозоидов в пучках.
Формирование пучка сперматозоидов. С помощью фазово-контрастной микроскопии и мазков сперматозоидов, окрашенных акридиновым оранжевым, было показано, что головки сперматозоидов слипаются. (A) Раннее формирование пучка сперматозоидов начинается с одного сперматозоида (белый круг) и трех сперматозоидов (желтый круг), при этом спираль начинается от хвоста и заканчивается у головки. (B) Микрофотография мазка сперматозоида, окрашенного акридиновым оранжевым, показывающая прилипшие головки сперматозоидов (стрелки). Выделение покрывает головку (головки). Увеличение × 1000. (C) Развитие большого пучка, переносимого потоком в микрофлюидном канале (с использованием высокоскоростной камеры со скоростью 950 кадров в секунду). (D) Микрофотография мазка сперматозоида, окрашенного акридиновым оранжевым, показывающая большие пучки (стрелки). Увеличение: ×200.
Сканирующая электронная микрофотография пучка сперматозоидов и мазка сперматозоидов, окрашенного акридиновым оранжевым. (A, B, D, E) — цифровые цветные сканирующие электронные микрофотографии сперматозоидов, а C и F — микрофотографии мазков сперматозоидов, окрашенных акридиновым оранжевым, демонстрирующие прикрепление множества сперматозоидов, обвивающих хвостовую перепонку. (AC) Агрегаты сперматозоидов показаны в виде сети прикрепленных хвостов (стрелки). (D) Прикрепление нескольких сперматозоидов (с адгезивным веществом, розовая обводка, стрелка), обвивающих хвост. (E и F) Агрегаты головок сперматозоидов (указатели), покрытые адгезивным материалом (указатели). Сперматозоиды образовали пучки с несколькими вихреобразными структурами (F). (C) Увеличение ×400 и (F) ×200.
С помощью трансмиссионной электронной микроскопии мы обнаружили, что пучки сперматозоидов имели прикрепленные хвосты (рис. 6А, С), головки, прикрепленные к хвостам (рис. 6В), или головки, прикрепленные к хвостам (рис. 6D). Головки сперматозоидов в пучке изогнуты, в разрезе видны две ядерные области (рис. 6D). В пучке с разрезом сперматозоиды имели скрученную головку с двумя ядерными областями и множеством жгутиковых областей (рис. 5А).
Цифровая цветная электронная микрофотография, показывающая соединительные хвосты в пучке сперматозоидов и агглютинирующий материал, соединяющий головки сперматозоидов. (A) Прикрепленный хвост большого количества сперматозоидов. Обратите внимание, как выглядит хвост в портретной (стрелка) и альбомной (стрелка) проекциях. (B) Головка (стрелка) сперматозоида соединена с хвостом (стрелка). (C) Несколько хвостов сперматозоидов (стрелки) соединены. (D) Агглютинирующий материал (AS, синий) соединяет четыре головки сперматозоидов (фиолетовый).
Сканирующая электронная микроскопия использовалась для обнаружения головок сперматозоидов в пучках сперматозоидов, покрытых секретами или мембранами (рис. 6B), что указывало на то, что пучки сперматозоидов были закреплены внеклеточным материалом. Агглютинированный материал концентрировался в головке сперматозоида (подобная головке медузы структура; рис. 5B) и расширялся дистально, придавая ярко-желтый цвет при флуоресцентной микроскопии при окрашивании акридиновым оранжевым (рис. 6C). Это вещество хорошо видно под сканирующим микроскопом и считается связующим веществом. Полутонкие срезы (рис. 5C) и мазки сперматозоидов, окрашенные акридиновым оранжевым, показали пучки сперматозоидов, содержащие плотно упакованные головки и закрученные хвосты (рис. 5D).
Различные микрофотографии, демонстрирующие агрегацию головок и свернутых хвостов сперматозоидов с использованием различных методов. (A) Цифровая цветная микрофотография поперечного сечения пучка сперматозоидов, показывающая свернутую головку сперматозоида с двухчастным ядром (синий) и несколькими жгутиковыми частями (зеленый). (B) Цифровая цветная микрофотография сканирующей электронной микроскопии, показывающая скопление похожих на медуз головок сперматозоидов (стрелки), которые, по-видимому, покрыты. (C) Полутонкий срез, показывающий агрегированные головки сперматозоидов (стрелки) и свернутые хвосты (стрелки). (D) Микрофотография мазка сперматозоида, окрашенного акридиновым оранжевым, показывающая скопления головок сперматозоидов (стрелки) и свернутые прилипшие хвосты (стрелки). Обратите внимание, что головку сперматозоида покрывает липкое вещество (S). (D) Увеличение × 1000.
С помощью трансмиссионной электронной микроскопии (рис. 7А) также было отмечено, что головки сперматозоидов были скручены, а ядра имели спиралевидную форму, что было подтверждено мазками сперматозоидов, окрашенными акридиновым оранжевым и исследованными с помощью флуоресцентной микроскопии (рис. 7В).
(A) Цифровая цветная электронная микрофотография и (B) мазок сперматозоида, окрашенный акридиновым оранжевым, демонстрирующий свернутые головки и прикрепление головок и хвостов сперматозоидов (стрелки). (B) Увеличение × 1000.
Интересной находкой является то, что сперматозоиды Шаркази агрегируются, образуя подвижные нитевидные пучки. Свойства этих пучков позволяют понять их возможную роль в поглощении и хранении сперматозоидов в SST.
После спаривания сперматозоиды попадают во влагалище и подвергаются интенсивному процессу отбора, в результате чего в околоплодную жидкость (ОПЖ) попадает лишь ограниченное количество сперматозоидов15,16. До настоящего времени механизмы проникновения и выхода сперматозоидов из ОПЖ остаются неясными. У домашней птицы сперматозоиды хранятся в ОПЖ в течение длительного периода от 2 до 10 недель, в зависимости от вида6. Остаются спорными вопросы о состоянии спермы во время хранения в ОПЖ. Находятся ли они в движении или в состоянии покоя? Другими словами, как сперматозоиды сохраняют свое положение в ОПЖ так долго?
Форман4 предположил, что пребывание и выведение сперматозоидов из SST можно объяснить подвижностью сперматозоидов. Авторы выдвинули гипотезу, что сперматозоиды удерживают свое положение, плывя против потока жидкости, создаваемого эпителием SST, и что сперматозоиды выводятся из SST, когда их скорость падает ниже точки, при которой они начинают двигаться назад из-за недостатка энергии. Занибони5 подтвердил наличие аквапоринов 2, 3 и 9 в апикальной части эпителиальных клеток SST, что может косвенно подтверждать модель хранения сперматозоидов Формана. В данном исследовании мы обнаружили, что почти половина сперматозоидов Шаркаши демонстрируют положительную реологию в текущей жидкости, и что агглютинированные пучки сперматозоидов увеличивают количество сперматозоидов, демонстрирующих положительную реологию, хотя агглютинация замедляет их движение. Механизм перемещения сперматозоидов вверх по фаллопиевой трубе птицы к месту оплодотворения до конца не изучен. У млекопитающих фолликулярная жидкость хемоаттрактирует сперматозоиды. Однако считается, что хемоаттрактанты направляют сперматозоиды на большие расстояния7. Следовательно, за транспорт сперматозоидов отвечают другие механизмы. Сообщается, что способность сперматозоидов ориентироваться и двигаться против потока жидкости, выделяемой в фаллопиевых трубах после спаривания, является важным фактором в нацеливании сперматозоидов у мышей. Паркер 17 предположил, что сперматозоиды пересекают яйцеводы, плывя против ресничного течения у птиц и рептилий. Хотя это не было экспериментально продемонстрировано у птиц, Адольфи18 первым обнаружил, что сперматозоиды птиц дают положительные результаты, когда тонкий слой жидкости между покровным стеклом и предметным стеклом создается полоской фильтровальной бумаги. Реология. Хино и Янагимачи [19] поместили комплекс яичник-труба-матка мыши в перфузионное кольцо и ввели 1 мкл чернил в перешеек, чтобы визуализировать поток жидкости в фаллопиевых трубах. Они заметили очень активное движение сокращения и расслабления в фаллопиевой трубе, при котором все шарики с чернилами неуклонно двигались к ампуле фаллопиевой трубы. Авторы подчеркивают важность потока жидкости из нижних фаллопиевых труб в верхние для подъема сперматозоидов и оплодотворения. Бриллард20 сообщил, что у кур и индеек сперматозоиды мигрируют активным движением от входа во влагалище, где они хранятся, к маточно-влагалищному соединению, где они также хранятся. Однако это движение не требуется между маточно-влагалищным соединением и воронкой, поскольку сперматозоиды транспортируются пассивным перемещением. Зная эти предыдущие рекомендации и результаты, полученные в данном исследовании, можно предположить, что способность сперматозоидов двигаться вверх по течению (реология) является одним из свойств, на которых основан процесс отбора. Это определяет прохождение сперматозоидов через влагалище и их попадание в цервикальный канал для хранения. Как предположил Forman4, это также может облегчить процесс проникновения сперматозоидов в SST и его среду обитания на определенный период времени, а затем их выхода, когда их скорость начинает снижаться.
С другой стороны, Мацудзаки и Сасанами 21 предположили, что сперматозоиды птиц претерпевают изменения подвижности от состояния покоя к подвижности в репродуктивных путях самцов и самок. Для объяснения длительного времени хранения спермы и последующего её восстановления после выхода из СПТ было предложено подавление подвижности резидентных сперматозоидов в СПТ. В условиях гипоксии Мацудзаки и др. 1 сообщили о высокой выработке и выделении лактата в СПТ, что может привести к подавлению подвижности резидентных сперматозоидов. В этом случае важность реологии спермы проявляется в отборе и абсорбции сперматозоидов, а не в их хранении.
Характер агглютинации сперматозоидов считается правдоподобным объяснением длительного периода хранения спермы в маточном сфинктере, поскольку это распространенный характер удержания спермы у домашней птицы2,22,23. Бакст и др. 2 наблюдали, что большинство сперматозоидов слипались друг с другом, образуя пучкообразные агрегаты, а отдельные сперматозоиды редко обнаруживались в маточном сфинктере перепелов. С другой стороны, Вэнь и др. 24 наблюдали больше рассеянных сперматозоидов и меньше пучков сперматозоидов в просвете маточного сфинктера у кур. На основании этих наблюдений можно предположить, что склонность к агглютинации сперматозоидов различается у разных птиц и между сперматозоидами в одном и том же эякуляте. Кроме того, Ван Крей и др. 9 предположили, что случайная диссоциация агглютинированных сперматозоидов ответственна за постепенное проникновение сперматозоидов в просвет фаллопиевой трубы. Согласно этой гипотезе, сперматозоиды с более низкой способностью к агглютинации должны быть первыми вытеснены из SST. В этом контексте способность сперматозоидов к агглютинации может быть фактором, влияющим на исход конкуренции сперматозоидов у загрязненных птиц. Кроме того, чем дольше агглютинированные сперматозоиды диссоциируют, тем дольше сохраняется фертильность.
Хотя агрегация сперматозоидов и их объединение в пучки наблюдались в нескольких исследованиях2,22,24, они не были подробно описаны из-за сложности их кинематического наблюдения в рамках SST. Было предпринято несколько попыток изучить агглютинацию сперматозоидов in vitro. Обширная, но кратковременная агрегация наблюдалась при удалении тонкой проволоки из свисающей капли семени. Это приводит к тому, что из капли выступает вытянутый пузырек, имитирующий семенную железу. Из-за ограничений 3D-моделирования и короткого времени сушки капель весь блок быстро приходил в негодность9. В данном исследовании, используя цыплят Шаркаши и микрофлюидные чипы, мы смогли описать, как образуются эти пучки и как они движутся. Пучки сперматозоидов формировались сразу после сбора спермы и двигались по спирали, демонстрируя положительную реологию при присутствии в потоке. Кроме того, при макроскопическом наблюдении было замечено, что пучки сперматозоидов увеличивают линейность подвижности по сравнению с изолированными сперматозоидами. Это позволяет предположить, что агглютинация сперматозоидов может происходить до проникновения в место хранения (SST), и что производство сперматозоидов не ограничивается небольшой областью из-за стресса, как предполагалось ранее (Тингари и Лейк12). Во время формирования пучка сперматозоиды плавают синхронно, пока не образуют соединение, затем их хвосты обвиваются друг вокруг друга, и головка сперматозоида остается свободной, но хвост и дистальная часть сперматозоида слипаются вместе липким веществом. Таким образом, свободная головка связки отвечает за движение, увлекая за собой остальную часть связки. Сканирующая электронная микроскопия пучков сперматозоидов показала прикрепленные головки сперматозоидов, покрытые большим количеством липкого материала, что предполагает, что головки сперматозоидов были прикреплены в покоящихся пучках, что могло произойти после достижения места хранения (SST).
При окрашивании мазка сперматозоидов акридиновым оранжевым под флуоресцентным микроскопом можно увидеть внеклеточный адгезивный материал вокруг сперматозоидов. Это вещество позволяет сперматозоидам прикрепляться к окружающим поверхностям или частицам, предотвращая их перемещение с течением. Таким образом, наши наблюдения демонстрируют роль адгезии сперматозоидов в виде подвижных пучков. Их способность плыть против течения и прикрепляться к близлежащим поверхностям позволяет сперматозоидам дольше оставаться в соматической жидкости.
Ротшильд25 использовал камеру для гемоцитометрии, чтобы изучить распределение бычьей спермы в капле суспензии, делая микрофотографии через камеру с вертикальной и горизонтальной оптическими осями микроскопа. Результаты показали, что сперматозоиды притягивались к поверхности камеры. Авторы предполагают, что между сперматозоидами и поверхностью могут происходить гидродинамические взаимодействия. Учитывая это, а также способность спермы цыплят Шаркаши образовывать липкие пучки, это может увеличить вероятность того, что сперма прилипнет к стенке SST и будет храниться в течение длительного времени.
Бцкетти и Афзелиу26 сообщили, что гликокаликс сперматозоидов необходим для распознавания гамет и агглютинации. Форман10 наблюдал, что гидролиз α-гликозидных связей в гликопротеин-гликолипидных покрытиях при обработке птичьей спермы нейраминидазой приводил к снижению фертильности без влияния на подвижность сперматозоидов. Авторы предполагают, что воздействие нейраминидазы на гликокаликс нарушает секвестрацию сперматозоидов в маточно-влагалищном соединении, тем самым снижая фертильность. Их наблюдения не могут игнорировать возможность того, что обработка нейраминидазой может снизить распознавание сперматозоидов и ооцитов. Форман и Энгель10 обнаружили, что фертильность снижалась при интравагинальном осеменении кур спермой, обработанной нейраминидазой. Однако ЭКО с использованием спермы, обработанной нейраминидазой, не влияло на фертильность по сравнению с контрольными курами. Авторы пришли к выводу, что изменения в гликопротеиново-гликолипидном покрытии вокруг мембраны сперматозоида снижают способность сперматозоида к оплодотворению, нарушая его секвестрацию в маточно-влагалищном соединении, что, в свою очередь, увеличивает потерю сперматозоидов из-за скорости движения в этом соединении, но не влияет на распознавание сперматозоидов и яйцеклеток.
У индеек Бакст и Баухан¹¹ обнаружили небольшие везикулы и фрагменты мембран в просвете семенного канала и заметили, что некоторые из этих гранул слились с мембраной сперматозоида. Авторы предполагают, что эти взаимоотношения могут способствовать длительному хранению сперматозоидов в семенном канале. Однако исследователи не уточнили источник этих частиц: секретируются ли они эпителиальными клетками рогового слоя семенного канала, производятся и секретируются мужской репродуктивной системой или самими сперматозоидами. Кроме того, эти частицы вызывают агглютинацию. Грютцнер и др.²⁷ сообщили, что эпителиальные клетки придатка яичка продуцируют и секретируют специфический белок, необходимый для формирования семенных каналов с одним пором. Авторы также сообщают, что дисперсия этих пучков зависит от взаимодействия эпидидимальных белков. Никсон и др.²⁸ обнаружили, что придатки яичка секретируют белок, кислый, богатый цистеином остеонектин; Белок SPARC участвует в формировании сперматозоидных пучков у короткоклювых ехидн и утконосов. Рассеяние этих пучков связано с потерей этого белка.
В данном исследовании ультраструктурный анализ с использованием электронной микроскопии показал, что сперматозоиды прикреплялись к большому количеству плотного материала. Считается, что эти вещества ответственны за агглютинацию, которая конденсируется между и вокруг прикрепившихся головок, но в меньшей концентрации в хвостовой области. Мы предполагаем, что это агглютинирующее вещество выводится из мужской репродуктивной системы (эпидидимиса или семявыносящего протока) вместе со спермой, поскольку мы часто наблюдаем отделение спермы от лимфы и семенной плазмы во время эякуляции. Сообщалось, что по мере прохождения сперматозоидов птиц через эпидидимис и семявыносящий проток они претерпевают связанные с созреванием изменения, которые поддерживают их способность связывать белки и приобретать гликопротеины, ассоциированные с плазматической мембраной. Сохранение этих белков на мембранах сперматозоидов в SST предполагает, что эти белки могут влиять на приобретение стабильности мембраны сперматозоидов 30 и определять их фертильность 31. Ахаммад и др.32 сообщили, что сперматозоиды, полученные из различных частей мужской репродуктивной системы (от яичек до дистального отдела семявыносящего протока), демонстрировали прогрессивное увеличение жизнеспособности в условиях хранения в жидкой среде, независимо от температуры хранения, а жизнеспособность у цыплят также увеличивалась в фаллопиевых трубах после искусственного осеменения.
Сперматозоидные пучки у кур породы Шаркаши обладают иными характеристиками и функциями, чем у других видов, таких как ехидны, утконосы, лесные мыши, оленьи крысы и морские свинки. У кур Шаркаши образование пучков сперматозоидов снижает их скорость плавания по сравнению с одиночными сперматозоидами. Однако эти пучки увеличивают процент реологически положительных сперматозоидов и повышают способность сперматозоидов стабилизироваться в динамической среде. Таким образом, наши результаты подтверждают ранее высказанное предположение о том, что агглютинация сперматозоидов в SST связана с длительным хранением спермы. Мы также предполагаем, что склонность сперматозоидов к образованию пучков может контролировать скорость потери спермы в SST, что может изменить исход конкуренции сперматозоидов. Согласно этому предположению, сперматозоиды с низкой агглютинационной способностью первыми высвобождают SST, в то время как сперматозоиды с высокой агглютинационной способностью производят большую часть потомства. Образование пучков сперматозоидов с одиночными порами является полезным и влияет на соотношение родителей и потомков, но использует другой механизм. У ехидн и утконосов сперматозоиды расположены параллельно друг другу, чтобы увеличить скорость движения. Пучки сперматозоидов у ехидн движутся примерно в три раза быстрее, чем отдельные сперматозоиды. Считается, что образование таких пучков сперматозоидов у ехидн является эволюционной адаптацией для поддержания доминирования, поскольку самки беспорядочно спариваются и обычно спариваются с несколькими самцами. Поэтому сперматозоиды из разных эякулятов яростно конкурируют за оплодотворение яйцеклетки.
Агглютинированные сперматозоиды кур породы Шаркаси легко визуализируются с помощью фазово-контрастной микроскопии, что считается преимуществом, поскольку позволяет легко изучать поведение сперматозоидов in vitro. Механизм, посредством которого образование сперматозоидных пучков способствует размножению у кур Шаркаси, также отличается от механизма, наблюдаемого у некоторых плацентарных млекопитающих, демонстрирующих кооперативное поведение сперматозоидов, таких как лесные мыши, где некоторые сперматозоиды достигают яйцеклеток, помогая другим родственным особям достичь и повредить их яйцеклетки. Самооплодотворение 34. Другой пример кооперативного поведения сперматозоидов был обнаружен у оленевых мышей, где сперматозоиды смогли идентифицировать и объединяться с наиболее генетически родственными сперматозоидами и формировать кооперативные группы, чтобы увеличить свою скорость по сравнению с неродственными сперматозоидами35.
Результаты, полученные в данном исследовании, не противоречат теории Фомана о длительном хранении сперматозоидов в SWS. Исследователи сообщают, что сперматозоиды продолжают двигаться в потоке эпителиальных клеток, выстилающих SST, в течение длительного периода времени, и по истечении определенного времени запасы энергии сперматозоидов истощаются, что приводит к снижению скорости, позволяющей выводить вещества с малой молекулярной массой. Энергия сперматозоидов перемещается вместе с потоком жидкости из просвета SST (полости фаллопиевой трубы). В данном исследовании мы наблюдали, что половина отдельных сперматозоидов демонстрировала способность плавать против потока жидкости, а их адгезия в пучке увеличивала их способность проявлять положительную реологию. Кроме того, наши данные согласуются с данными Мацудзаки и др.¹, которые сообщили, что повышенная секреция лактата в SST может подавлять подвижность резидентных сперматозоидов. Однако наши результаты описывают образование подвижных связок сперматозоидов и их реологическое поведение в присутствии динамической среды внутри микроканала в попытке выяснить их поведение в условиях хранения жидкой спермы. Будущие исследования могут быть сосредоточены на определении химического состава и происхождения агглютинирующего агента, что, несомненно, поможет исследователям разработать новые способы хранения жидкой спермы и увеличить продолжительность фертильности.
В качестве доноров спермы для исследования были отобраны пятнадцать 30-недельных самцов шаркаси с голой шеей (гомозиготный доминантный генотип; Na Na). Птицы выращивались на научно-исследовательской птицеферме факультета сельского хозяйства Университета Ашит, провинция Ашит, Египет. Птицы содержались в отдельных клетках (30 х 40 х 40 см), в условиях светового режима (16 часов света и 8 часов темноты) и получали корм, содержащий 160 г сырого протеина, 2800 ккал усваиваемой энергии, 35 г кальция и 5 граммов доступного фосфора на килограмм корма.
Согласно данным 36, 37, сперма была собрана у мужчин путем массажа живота. Всего было собрано 45 образцов спермы от 15 мужчин в течение 3 дней. Сперма (n = 15/день) немедленно разбавлялась в соотношении 1:1 (объем:объем) разбавителем для спермы птицы Belsville, который содержит дифосфат калия (1,27 г), моногидрат глутамата натрия (0,867 г), фруктозу (0,5 г), безводный ацетат натрия (0,43 г), трис(гидроксиметил)аминометан (0,195 г), моногидрат цитрата калия (0,064 г), монофосфат калия (0,065 г), хлорид магния (0,034 г) и H2O (100 мл), pH = 7,5, осмолярность 333 мОсм/кг38. Разбавленные образцы спермы сначала исследовали под световым микроскопом для обеспечения хорошего качества спермы (влажности), а затем хранили в водяной бане при температуре 37°C до использования в течение получаса после сбора.
Кинематика и реология сперматозоидов описаны с использованием системы микрофлюидных устройств. Образцы спермы были дополнительно разбавлены в соотношении 1:40 в растворителе для птичьей спермы Beltsville, загружены в микрофлюидное устройство (см. ниже), и кинетические параметры были определены с помощью системы компьютерного анализа спермы (CASA), ранее разработанной для микрофлюидной характеризации. Исследование подвижности сперматозоидов в жидкой среде (кафедра машиностроения, инженерный факультет, Университет Асьюта, Египет). Плагин можно загрузить по адресу: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39. Были измерены скорость кривой (VCL, мкм/с), линейная скорость (VSL, мкм/с) и средняя скорость траектории (VAP, мкм/с). Видеозаписи сперматозоидов были получены с помощью инвертированного фазово-контрастного микроскопа Optika XDS-3 (с объективом 40x), подключенного к камере Tucson ISH1000, со скоростью 30 кадров в секунду в течение 3 секунд. Для исследования использовалось программное обеспечение CASA, позволяющее изучить не менее трех областей и 500 траекторий сперматозоидов на образец. Записанное видео обрабатывалось с помощью самодельной программы CASA. Определение подвижности в плагине CASA основано на скорости плавания сперматозоидов относительно скорости потока и не включает другие параметры, такие как движение из стороны в сторону, поскольку было установлено, что это более надежный показатель в условиях потока жидкости. Реологическое движение описывается как движение сперматозоидов против направления потока жидкости. Количество сперматозоидов с реологическими свойствами делилось на количество подвижных сперматозоидов; сперматозоиды, находящиеся в состоянии покоя, и сперматозоиды, движущиеся конвективно, исключались из подсчета.
Все использованные химические вещества были получены от компании Elgomhoria Pharmaceuticals (Каир, Египет), если не указано иное. Устройство было изготовлено, как описано в работе El-sherry et al. 40, с некоторыми модификациями. Материалы, использованные для изготовления микроканалов, включали стеклянные пластины (Howard Glass, Вустер, Массачусетс), негативный резист SU-8-25 (MicroChem, Ньютон, Калифорния), диацетоновый спирт (Sigma Aldrich, Штайнхайм, Германия) и полиацетон (-184, Dow Corning, Мидленд, Мичиган). Микроканалы изготавливались с использованием мягкой литографии. Сначала на принтере высокого разрешения (Prismatic, Каир, Египет и Pacific Arts and Design, Маркхэм, Онтарио) печаталась прозрачная защитная лицевая маска с желаемым дизайном микроканалов. Мастер-модели изготавливались с использованием стеклянных пластин в качестве подложек. Пластины очищали в ацетоне, изопропаноле и деионизированной воде, а затем покрывали слоем SU8-25 толщиной 20 мкм методом центрифугирования (3000 об/мин, 1 мин). Затем слои SU-8 аккуратно высушивали (65°C, 2 мин и 95°C, 10 мин) и подвергали УФ-облучению в течение 50 с. После облучения проводили сухую обработку при 65°C и 95°C в течение 1 мин и 4 мин для сшивания облученных слоев SU-8, после чего проводили проявление в диацетоновом спирте в течение 6,5 мин. Для дальнейшего затвердевания слоя SU-8 проводили твердую сухую обработку вафель (200°C в течение 15 мин).
Полидиметилсилоксан (PDMS) получали путем смешивания мономера и отвердителя в весовом соотношении 10:1, затем дегазировали в вакуумном эксикаторе и заливали на основную раму из SU-8. PDMS отверждали в печи (120°C, 30 мин), затем вырезали каналы, отделяли от матрицы и перфорировали, чтобы прикрепить трубки к входу и выходу микроканала. Наконец, микроканалы из PDMS permanently прикрепляли к предметным стеклам микроскопа с помощью портативного коронного процессора (Electro-Technic Products, Чикаго, Иллинойс), как описано ранее. Микроканал, использованный в этом исследовании, имеет размеры 200 мкм × 20 мкм (Ш × В) и длину 3,6 см.
Поток жидкости, создаваемый гидростатическим давлением внутри микроканала, достигается за счет поддержания уровня жидкости во входном резервуаре выше разницы высот Δh39 в выходном резервуаре (рис. 1).
где f — коэффициент трения, определяемый как f = C/Re для ламинарного потока в прямоугольном канале, где C — константа, зависящая от соотношения сторон канала, L — длина микроканала, Vav — средняя скорость внутри микроканала, Dh — гидравлический диаметр канала, g — ускорение свободного падения. Используя это уравнение, среднюю скорость в канале можно рассчитать по следующей формуле: