Terima kasih telah mengunjungi Nature.com. Versi browser yang Anda gunakan memiliki dukungan CSS yang terbatas. Untuk pengalaman terbaik, kami sarankan Anda menggunakan browser yang diperbarui (atau nonaktifkan Mode Kompatibilitas di Internet Explorer). Sementara itu, untuk memastikan dukungan yang berkelanjutan, kami akan menampilkan situs tanpa gaya dan JavaScript.
Kesuburan burung bergantung pada kemampuan mereka untuk menyimpan cukup sperma yang layak untuk jangka waktu yang lama di tubulus penyimpanan sperma (SST). Mekanisme pasti yang menyebabkan spermatozoa masuk, tinggal di, dan meninggalkan SST masih kontroversial. Sperma ayam sharkasi menunjukkan kecenderungan tinggi untuk menggumpal, membentuk berkas filamen bergerak yang mengandung banyak sel. Karena sulitnya mengamati motilitas dan perilaku spermatozoa di tuba falopi yang buram, kami menggunakan perangkat mikrofluida dengan penampang mikrokanal yang mirip dengan spermatozoa untuk mempelajari aglutinasi dan motilitas spermatozoa. Studi ini membahas bagaimana berkas sperma terbentuk, bagaimana mereka bergerak, dan kemungkinan peran mereka dalam memperpanjang tempat tinggal sperma di SST. Kami menyelidiki kecepatan sperma dan perilaku reologi ketika aliran fluida dihasilkan dalam saluran mikrofluida oleh tekanan hidrostatik (laju aliran = 33 µm/s). Spermatozoa cenderung berenang melawan arus (reologi positif) dan kecepatan kumpulan spermatozoa berkurang secara signifikan dibandingkan dengan spermatozoa tunggal. Kumpulan sperma telah diamati bergerak dalam bentuk spiral dan bertambah panjang dan tebal karena lebih banyak sperma tunggal yang direkrut. Kumpulan sperma diamati mendekati dan melekat pada dinding samping saluran mikrofluida untuk menghindari tersapu oleh kecepatan aliran fluida > 33 µm/s. Kumpulan sperma diamati mendekati dan melekat pada dinding samping saluran mikrofluida untuk menghindari tersapu oleh kecepatan aliran fluida > 33 µm/s. Selain itu, Anda juga perlu menggunakan dan menggunakan kartu kredit микрофлюидных каналов, чтобы избежать сметания со скоростью потока жидкости> 33 menit / с. Kumpulan sperma telah diamati mendekati dan menempel pada dinding samping saluran mikrofluida untuk menghindari tersapu pada laju aliran fluida >33 µm/s.kecepatan aliran udara > 33 µm/s 扫过。33 µm/s. Selain itu, Anda juga perlu menggunakan dan menggunakan kartu kredit микрожидкостного канала, чтобы избежать kecepatan aliran udara > 33 mm/detik. Berkas sperma diamati mendekati dan menempel pada dinding samping saluran mikrofluida untuk menghindari tersapu oleh aliran fluida pada kecepatan >33 µm/s.Pemindaian dan mikroskop elektron transmisi mengungkapkan bahwa kumpulan sperma didukung oleh material padat yang melimpah. Data yang diperoleh menunjukkan mobilitas unik spermatozoa ayam Sharkazi, serta kemampuan spermatozoa untuk menggumpal dan membentuk kumpulan bergerak, yang berkontribusi pada pemahaman yang lebih baik tentang penyimpanan spermatozoa jangka panjang di SMT.
Untuk mencapai pembuahan pada manusia dan sebagian besar hewan, sperma dan sel telur harus tiba di tempat pembuahan pada waktu yang tepat. Oleh karena itu, perkawinan harus terjadi sebelum atau pada saat ovulasi. Di sisi lain, beberapa mamalia, seperti anjing, serta spesies non-mamalia, seperti serangga, ikan, reptil, dan burung, menyimpan sperma di organ reproduksi mereka untuk jangka waktu yang lama hingga sel telur mereka siap untuk pembuahan (fertilisasi asinkron 1 ). Burung mampu mempertahankan viabilitas spermatozoa yang mampu membuahi sel telur selama 2-10 minggu2.
Ini adalah fitur unik yang membedakan burung dari hewan lain, karena memberikan kemungkinan pembuahan yang tinggi setelah inseminasi tunggal selama beberapa minggu tanpa perkawinan dan ovulasi secara bersamaan. Organ penyimpanan sperma utama, yang disebut tubulus penyimpanan sperma (SST), terletak di lipatan mukosa internal di persimpangan uterovaginal. Hingga saat ini, mekanisme masuknya sperma, berada, dan keluar dari bank sperma belum sepenuhnya dipahami. Berdasarkan penelitian sebelumnya, banyak hipotesis telah diajukan, tetapi tidak satu pun yang dikonfirmasi.
Forman4 berhipotesis bahwa spermatozoa mempertahankan tempat tinggalnya di rongga SST melalui gerakan osilasi terus-menerus melawan arah aliran cairan melalui saluran protein yang terletak pada sel epitel SST (reologi). ATP terkuras karena aktivitas flagela konstan yang dibutuhkan untuk menjaga sperma dalam lumen SST dan motilitas akhirnya menurun hingga sperma dibawa keluar dari bank sperma oleh aliran cairan dan memulai perjalanan baru menyusuri tuba falopi yang menaik untuk membuahi sperma. Telur (Forman4). Model penyimpanan sperma ini didukung oleh deteksi oleh imunositokimia akuaporin 2, 3 dan 9 yang ada dalam sel epitel SST. Sampai saat ini, penelitian tentang reologi semen ayam dan perannya dalam penyimpanan SST, seleksi sperma vagina, dan kompetisi sperma masih kurang. Pada ayam, sperma memasuki vagina setelah perkawinan alami, tetapi lebih dari 80% spermatozoa dikeluarkan dari vagina segera setelah perkawinan. Hal ini menunjukkan bahwa vagina adalah lokasi utama untuk seleksi sperma pada burung. Selain itu, telah dilaporkan bahwa kurang dari 1% spermatozoa yang dibuahi di vagina berakhir di SST2. Dalam inseminasi buatan anak ayam di vagina, jumlah spermatozoa yang mencapai SST cenderung meningkat 24 jam setelah inseminasi. Sejauh ini, mekanisme seleksi sperma selama proses ini tidak jelas, dan motilitas sperma mungkin memainkan peran penting dalam penyerapan sperma SST. Karena dinding tuba falopi yang tebal dan buram, sulit untuk secara langsung memantau motilitas sperma di tuba falopi burung. Oleh karena itu, kita tidak memiliki pengetahuan dasar tentang bagaimana spermatozoa bertransisi ke SST setelah pembuahan.
Reologi baru-baru ini telah diakui sebagai faktor penting yang mengendalikan transportasi sperma di alat kelamin mamalia. Berdasarkan kemampuan spermatozoa motil untuk bermigrasi secara berlawanan arah, Zaferani et al8 menggunakan sistem mikrofluida corra untuk mengisolasi spermatozoa motil secara pasif dari sampel semen yang dikandangkan. Jenis penyortiran semen ini penting untuk perawatan infertilitas medis dan penelitian klinis, dan lebih disukai daripada metode tradisional yang membutuhkan banyak waktu dan tenaga serta dapat membahayakan morfologi dan integritas struktural sperma. Namun, hingga saat ini, belum ada penelitian yang dilakukan mengenai pengaruh sekresi dari organ genital ayam terhadap motilitas sperma.
Terlepas dari mekanisme yang mempertahankan sperma yang disimpan dalam SST, banyak peneliti telah mengamati bahwa spermatozoa yang ada menggumpal secara langsung dalam SST pada ayam 9, 10, burung puyuh 2, dan kalkun 11 untuk membentuk kumpulan sperma yang menggumpal. Para penulis berpendapat bahwa ada hubungan antara penggumpalan ini dan penyimpanan spermatozoa jangka panjang dalam SST.
Tingari dan Lake12 melaporkan adanya hubungan yang kuat antara spermatozoa di kelenjar penerima sperma ayam dan mempertanyakan apakah spermatozoa unggas menggumpal dengan cara yang sama seperti spermatozoa mamalia. Mereka percaya bahwa hubungan yang dalam antara sperma di vas deferens mungkin disebabkan oleh stres yang disebabkan oleh keberadaan sejumlah besar sperma dalam ruang yang kecil.
Ketika mengevaluasi perilaku spermatozoa pada slide kaca gantung segar, tanda-tanda aglutinasi sementara dapat terlihat, terutama di tepi tetesan air mani. Namun, aglutinasi sering terganggu oleh aksi rotasi yang terkait dengan gerakan berkelanjutan, yang menjelaskan sifat sementara dari fenomena ini. Para peneliti juga memperhatikan bahwa ketika pengencer ditambahkan ke air mani, agregat sel memanjang "seperti benang" muncul.
Upaya awal untuk meniru spermatozoa dilakukan dengan melepaskan kawat tipis dari tetesan yang menggantung, yang menghasilkan vesikel memanjang seperti sperma yang menonjol dari tetesan air mani. Spermatozoa segera berbaris secara paralel di dalam vesikel, tetapi seluruh unit dengan cepat menghilang karena keterbatasan 3D. Oleh karena itu, untuk mempelajari aglutinasi spermatozoa, perlu untuk mengamati motilitas dan perilaku spermatozoa secara langsung dalam tubulus penyimpanan sperma yang terisolasi, yang sulit dicapai. Oleh karena itu, perlu untuk mengembangkan instrumen yang meniru spermatozoa untuk mendukung studi motilitas sperma dan perilaku aglutinasi. Brillard et al13 melaporkan bahwa panjang rata-rata tubulus penyimpanan sperma pada anak ayam dewasa adalah 400–600 µm, tetapi beberapa SST dapat mencapai panjang 2000 µm. Mero dan Ogasawara14 membagi kelenjar seminiferus menjadi tubulus penyimpanan sperma yang membesar dan tidak membesar, keduanya sama panjangnya (~500 µm) dan lebar leher (~38 µm), tetapi diameter lumen rata-rata tubulus adalah 56,6 dan 56,6 µm. . , masing-masing 11,2 μm. Dalam penelitian saat ini, kami menggunakan perangkat mikrofluida dengan ukuran saluran 200 µm × 20 µm (L × T), yang penampang melintangnya agak dekat dengan SST yang diperkuat. Selain itu, kami memeriksa motilitas sperma dan perilaku aglutinasi dalam cairan yang mengalir, yang konsisten dengan hipotesis Foreman bahwa cairan yang diproduksi oleh sel epitel SST menjaga sperma di dalam lumen dalam arah arus berlawanan (reologi).
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengatasi masalah pengamatan motilitas spermatozoa di tuba fallopi dan menghindari kesulitan dalam mempelajari reologi dan perilaku spermatozoa dalam lingkungan yang dinamis. Sebuah perangkat mikrofluida digunakan untuk menciptakan tekanan hidrostatik guna mensimulasikan motilitas sperma di alat kelamin ayam.
Ketika setetes sampel sperma yang diencerkan (1:40) dimasukkan ke dalam perangkat mikrokanal, dua jenis motilitas sperma dapat diidentifikasi (sperma yang terisolasi dan sperma yang terikat). Selain itu, spermatozoa cenderung berenang melawan arus (reologi positif; video 1, 2). Walaupun kumpulan sperma memiliki kecepatan lebih rendah dibanding sperma tunggal (p < 0,001), kumpulan sperma meningkatkan persentase sperma yang menunjukkan rheotaksis positif (p < 0,001; Tabel 2). Walaupun kumpulan sperma memiliki kecepatan lebih rendah dibanding sperma tunggal (p < 0,001), kumpulan sperma meningkatkan persentase sperma yang menunjukkan rheotaksis positif (p < 0,001; Tabel 2). Хотя пучки сперматозоидов имели более низкую скорость, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), они увеличивали процент сперматозоидов, демонстрирующих положительный реотаксис (p < 0,001; таблица 2). Walaupun kumpulan spermatozoa memiliki kecepatan yang lebih rendah dibandingkan dengan spermatozoa tunggal (p < 0,001), namun kumpulan spermatozoa tersebut meningkatkan persentase spermatozoa yang menunjukkan rheotaksis positif (p < 0,001; Tabel 2).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度（p < 0,001）,但它们增加了显示阳性流变性的精子百分比（p < 0,001；表2）。尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 （p <0,001） , 但 增加 了 显示 阳性 流变性 精子百分比 （p <0,001 ； 2。。。。。。）））））） Хотя скорость пучков сперматозоидов была ниже, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), они увеличивали процент сперматозоидов с положительной реологией (p < 0,001; таблица 2). Meskipun kecepatan kumpulan sperma lebih rendah daripada kecepatan spermatozoa tunggal (p < 0,001), namun mereka meningkatkan persentase spermatozoa dengan reologi positif (p < 0,001; Tabel 2).Reologi positif untuk spermatozoa tunggal dan jumbai diperkirakan masing-masing sekitar 53% dan 85%.
Telah diamati bahwa spermatozoa ayam sharkasi segera setelah ejakulasi membentuk bundel linier, yang terdiri dari lusinan individu. Jumbai ini bertambah panjang dan tebal dari waktu ke waktu dan dapat bertahan in vitro selama beberapa jam sebelum menghilang (video 3). Bundel filamen ini berbentuk seperti spermatozoa echidna yang terbentuk di ujung epididimis. Semen ayam sharkashi telah ditemukan memiliki kecenderungan tinggi untuk menggumpal dan membentuk bundel retikulat dalam waktu kurang dari satu menit setelah pengumpulan. Balok-balok ini dinamis dan dapat menempel pada dinding atau benda statis di dekatnya. Meskipun bundel sperma mengurangi kecepatan sel sperma, jelas bahwa secara makroskopis mereka meningkatkan linearitasnya. Panjang bundel bervariasi tergantung pada jumlah sperma yang dikumpulkan dalam bundel. Dua bagian bundel diisolasi: bagian awal, termasuk kepala bebas dari sperma yang menggumpal, dan bagian terminal, termasuk ekor dan seluruh ujung distal sperma. Dengan menggunakan kamera berkecepatan tinggi (950 fps), kepala spermatozoa yang menggumpal diamati di bagian awal berkas, yang bertanggung jawab atas pergerakan berkas karena gerakan osilasinya, menyeret yang tersisa ke dalam berkas dengan gerakan heliks (Video 4). Namun, pada berkas yang panjang, telah diamati bahwa beberapa kepala sperma bebas menempel pada badan dan bagian ujung berkas bertindak sebagai baling-baling untuk membantu mendorong berkas.
Sementara dalam aliran cairan yang lambat, kumpulan sperma bergerak sejajar satu sama lain, namun, mereka mulai tumpang tindih dan menempel pada apa pun yang diam, agar tidak terhanyut oleh aliran arus saat kecepatan aliran meningkat. Kumpulan terbentuk ketika segenggam sel sperma saling mendekati, mereka mulai bergerak secara serempak dan saling melilit, lalu menempel pada zat yang lengket. Gambar 1 dan 2 menunjukkan bagaimana sperma saling mendekati, membentuk sambungan saat ekor saling melilit.
Para peneliti menerapkan tekanan hidrostatik untuk menciptakan aliran fluida dalam mikrokanal untuk mempelajari reologi sperma. Mikrokanal dengan ukuran 200 µm × 20 µm (L × T) dan panjang 3,6 µm digunakan. Gunakan mikrokanal di antara wadah dengan jarum suntik yang dipasang di ujungnya. Pewarna makanan digunakan untuk membuat saluran lebih terlihat.
Ikat kabel interkoneksi dan aksesori ke dinding. Video diambil dengan mikroskop kontras fase. Pada setiap gambar, mikroskopi kontras fase dan gambar pemetaan disajikan. (A) Sambungan antara dua aliran menahan aliran karena gerakan heliks (panah merah). (B) Sambungan antara berkas tabung dan dinding saluran (panah merah), pada saat yang sama keduanya terhubung ke dua berkas lainnya (panah kuning). (C) Berkas sperma di saluran mikrofluida mulai terhubung satu sama lain (panah merah), membentuk jaring berkas sperma. (D) Pembentukan jaringan berkas sperma.
Ketika setetes sperma yang diencerkan dimasukkan ke dalam perangkat mikrofluida dan aliran tercipta, berkas sperma diamati bergerak melawan arah aliran. Berkas-berkas tersebut pas menempel pada dinding mikrokanal, dan kepala-kepala yang bebas di bagian awal berkas-berkas tersebut pas menempel padanya (video 5). Berkas-berkas tersebut juga menempel pada partikel-partikel yang tidak bergerak di jalurnya, seperti serpihan, agar tidak tersapu oleh arus. Seiring berjalannya waktu, berkas-berkas ini menjadi filamen panjang yang menjebak spermatozoa tunggal lainnya dan berkas-berkas yang lebih pendek (Video 6). Ketika aliran mulai melambat, garis-garis sperma yang panjang mulai membentuk jaringan garis-garis sperma (Video 7; Gambar 2).
Pada kecepatan aliran tinggi (V > 33 µm/s), gerakan spiral benang meningkat sebagai upaya untuk menangkap banyak sperma individu yang membentuk berkas yang lebih mampu menahan gaya hanyut aliran. Pada kecepatan aliran tinggi (V > 33 µm/s), gerakan spiral benang meningkat sebagai upaya untuk menangkap banyak sperma individu yang membentuk berkas yang lebih mampu menahan gaya hanyut aliran. При высокой скорости потока (V > 33 mm/с) спиралевидные нижения нитей усиливаются, поскольку они пытаются поймать множество отдельных сперматозоидов, образующих пучки, которые лучше противостоят дрейфующей силе foto. Pada laju aliran tinggi (V > 33 µm/s), gerakan heliks untaian meningkat karena mencoba menangkap banyak spermatozoa individu sehingga membentuk ikatan yang lebih mampu menahan gaya hanyut aliran.在高流速(V > 33 µm/s)时，螺纹的螺旋运动增加，以试图捕捉许多形成束的单个精子,从而更好地抵抗流动的漂移力。在 高 流速 (v> 33 µm/s) 时 , 的 螺旋 运动 增加 , 以 试图 许多 形成 束 单 个 精子 , 从而更 地 抵抗 的 漂移力。。。。。。。。。。 При высоких скоростях потока (V > 33 mm/с) спиральное нижение увеличивается в попытке захватить множество отдельных сперматозоидов, образующих пучки, чтобы лучше сопротивляться силам дрейфа потока. Pada laju aliran tinggi (V > 33 µm/s), gerakan heliks filamen meningkat dalam upaya untuk menangkap banyak spermatozoa individu yang membentuk bundel untuk lebih menahan gaya hanyut aliran.Mereka juga mencoba menempelkan saluran mikro pada dinding sampingnya.
Kumpulan sperma diidentifikasi sebagai kelompok kepala sperma dan ekor yang melingkar menggunakan mikroskop cahaya (LM). Kumpulan sperma dengan berbagai agregat juga telah diidentifikasi sebagai kepala yang terpilin dan agregat flagela, beberapa ekor sperma yang menyatu, kepala sperma yang menempel pada ekor, dan kepala sperma dengan inti yang tertekuk sebagai beberapa inti yang menyatu. mikroskop elektron transmisi (TEM). Mikroskop elektron pemindaian (SEM) menunjukkan bahwa kumpulan sperma adalah agregat kepala sperma yang berselubung dan agregat sperma menunjukkan jaringan ekor yang terbungkus yang melekat.
Morfologi dan ultrastruktur spermatozoa, pembentukan berkas spermatozoa dipelajari menggunakan mikroskop cahaya (setengah bagian), mikroskop elektron pemindaian (SEM) dan mikroskop elektron transmisi (TEM), apusan sperma diwarnai dengan akridin oranye dan diperiksa menggunakan mikroskop epifluoresensi.
Pewarnaan apusan sperma dengan akridin oranye (Gbr. 3B) menunjukkan bahwa kepala sperma saling menempel dan ditutupi oleh bahan sekretori, yang menyebabkan terbentuknya gumpalan besar (Gbr. 3D). Kumpulan sperma terdiri dari agregat sperma dengan jaringan ekor yang menempel (Gbr. 4A-C). Kumpulan sperma terdiri dari ekor banyak spermatozoa yang saling menempel (Gbr. 4D). Sekresi (Gbr. 4E,F) menutupi kepala kumpulan spermatozoa.
Pembentukan kumpulan spermatozoa Menggunakan mikroskop fase kontras dan apusan sperma yang diwarnai dengan akridin oranye, menunjukkan bahwa kepala spermatozoa saling menempel. (A) Pembentukan gumpalan sperma awal dimulai dengan sperma (lingkaran putih) dan tiga sperma (lingkaran kuning), dengan spiral dimulai di ekor dan berakhir di kepala. (B) Fotomikrograf apusan sperma yang diwarnai dengan akridin oranye yang menunjukkan kepala sperma yang melekat (anak panah). Kotoran menutupi kepala. Pembesaran × 1000. (C) Perkembangan berkas besar yang diangkut oleh aliran dalam saluran mikrofluida (menggunakan kamera kecepatan tinggi pada 950 fps). (D) Mikrograf apusan sperma yang diwarnai dengan akridin oranye yang menunjukkan gumpalan besar (anak panah). Pembesaran: ×200.
Mikrograf elektron pemindaian berkas sperma dan apusan sperma yang diwarnai dengan akridin jingga. (A, B, D, E) adalah mikrograf elektron pemindaian warna digital dari spermatozoa, dan C dan F adalah mikrograf apusan sperma yang diwarnai dengan akridin jingga yang menunjukkan perlekatan beberapa spermatozoa yang membungkus jaringan ekor. (AC) Agregat sperma ditunjukkan sebagai jaringan ekor yang menempel (panah). (D) Adhesi beberapa spermatozoa (dengan zat perekat, garis tepi merah muda, panah) yang membungkus ekor. (E dan F) Agregat kepala sperma (penunjuk) yang ditutupi dengan bahan perekat (penunjuk). Spermatozoa membentuk bundel dengan beberapa struktur seperti pusaran (F). (C) Pembesaran ×400 dan (F) ×200.
Dengan menggunakan mikroskop elektron transmisi, kami menemukan bahwa kumpulan sperma memiliki ekor yang menempel (Gbr. 6A, C), kepala yang menempel pada ekor (Gbr. 6B), atau kepala yang menempel pada ekor (Gbr. 6D). Kepala spermatozoa dalam kumpulan tersebut melengkung, yang terdapat pada bagian dua daerah inti (Gbr. 6D). Pada kumpulan sayatan, spermatozoa memiliki kepala yang terpilin dengan dua daerah inti dan beberapa daerah flagela (Gbr. 5A).
Mikrograf elektron berwarna digital yang menunjukkan ekor penghubung dalam kumpulan sperma dan bahan penggumpal yang menghubungkan kepala sperma. (A) Ekor yang menempel dari sejumlah besar spermatozoa. Perhatikan bagaimana ekor terlihat dalam proyeksi potret (panah) dan lanskap (panah). (B) Kepala sperma (panah) terhubung ke ekor (panah). (C) Beberapa ekor sperma (panah) menempel. (D) Bahan penggumpal (AS, biru) menghubungkan empat kepala sperma (ungu).
Mikroskopi elektron pemindaian digunakan untuk mendeteksi kepala sperma dalam kumpulan sperma yang ditutupi oleh sekresi atau membran (Gambar 6B), yang menunjukkan bahwa kumpulan sperma tersebut ditambatkan oleh bahan ekstraseluler. Bahan yang menggumpal terkonsentrasi di kepala sperma (rangkaian seperti kepala ubur-ubur; Gambar 5B) dan mengembang ke arah distal, sehingga memberikan tampilan kuning cemerlang di bawah mikroskop fluoresensi saat diwarnai dengan akridin oranye (Gambar 6C). Zat ini terlihat jelas di bawah mikroskop pemindaian dan dianggap sebagai pengikat. Irisan semi-tipis (Gambar 5C) dan apusan sperma yang diwarnai dengan akridin oranye menunjukkan kumpulan sperma yang berisi kepala yang rapat dan ekor yang melengkung (Gambar 5D).
Berbagai fotomikrograf yang menunjukkan agregasi kepala sperma dan ekor terlipat menggunakan berbagai metode. (A) Mikrograf elektron transmisi warna digital penampang melintang dari kumpulan sperma yang menunjukkan kepala sperma melingkar dengan inti dua bagian (biru) dan beberapa bagian flagela (hijau). (B) Mikrograf elektron pemindaian warna digital yang menunjukkan sekelompok kepala sperma seperti ubur-ubur (panah) yang tampak tertutup. (C) Potongan setengah tipis yang menunjukkan kepala sperma yang teragregasi (panah) dan ekor yang melingkar (panah). (D) Mikrograf apusan sperma yang diwarnai dengan akridin oranye yang menunjukkan agregat kepala sperma (panah) dan ekor yang melekat melingkar (panah). Perhatikan bahwa zat lengket (S) menutupi kepala spermatozoa. (D) Pembesaran × 1000.
Dengan menggunakan mikroskop elektron transmisi (Gbr. 7A), juga diperhatikan bahwa kepala sperma terpelintir dan nukleusnya berbentuk spiral, seperti yang dikonfirmasi oleh apusan sperma yang diwarnai dengan akridin oranye dan diperiksa menggunakan mikroskop fluoresensi (Gbr. 7B).
(A) Mikrograf elektron transmisi warna digital dan (B) Apusan sperma yang diwarnai dengan warna jingga akridin yang menunjukkan kepala melingkar dan pelekatan kepala dan ekor sperma (panah). (B) Pembesaran × 1000.
Temuan yang menarik adalah bahwa sperma Sharkazi berkumpul membentuk berkas-berkas filamen yang mudah bergerak. Sifat berkas-berkas ini memungkinkan kita untuk memahami kemungkinan perannya dalam penyerapan dan penyimpanan spermatozoa di SST.
Setelah kawin, sperma memasuki vagina dan menjalani proses seleksi yang ketat, sehingga hanya sedikit sperma yang memasuki SST15,16. Hingga saat ini, mekanisme masuk dan keluarnya sperma dari SST belum jelas. Pada unggas, spermatozoa disimpan dalam SST untuk jangka waktu 2 hingga 10 minggu, tergantung pada spesiesnya6. Masih ada kontroversi mengenai kondisi semen selama penyimpanan di SST. Apakah sperma bergerak atau diam? Dengan kata lain, bagaimana sel sperma mempertahankan posisinya di SST selama itu?
Forman4 mengemukakan bahwa tempat tinggal dan pengeluaran sperma di SST dapat dijelaskan dalam hal motilitas sperma. Penulis berhipotesis bahwa sperma mempertahankan posisinya dengan berenang melawan aliran cairan yang diciptakan oleh epitel SST dan bahwa sperma dikeluarkan dari SST ketika kecepatannya turun di bawah titik di mana mereka mulai bergerak mundur karena kekurangan energi. Zaniboni5 mengonfirmasi keberadaan akuaporin 2, 3, dan 9 di bagian apikal sel epitel SST, yang secara tidak langsung dapat mendukung model penyimpanan sperma Foreman. Dalam penelitian saat ini, kami menemukan bahwa hampir setengah dari spermatozoa Sharkashi menunjukkan reologi positif dalam cairan yang mengalir, dan bahwa kumpulan sperma yang menggumpal meningkatkan jumlah spermatozoa yang menunjukkan reologi positif, meskipun penggumpalan memperlambatnya. Bagaimana sel sperma bergerak naik ke tuba falopi burung ke tempat pembuahan belum sepenuhnya dipahami. Pada mamalia, cairan folikel bersifat kemoatraktan terhadap spermatozoa. Namun, kemoatraktan diyakini mengarahkan spermatozoa untuk mendekati jarak jauh7. Oleh karena itu, mekanisme lain bertanggung jawab atas transportasi sperma. Kemampuan sperma untuk berorientasi dan mengalir melawan cairan tuba fallopi yang dilepaskan setelah perkawinan telah dilaporkan menjadi faktor utama dalam menargetkan sperma pada tikus. Parker 17 menyarankan bahwa spermatozoa melintasi saluran telur dengan berenang melawan arus silia pada burung dan reptil. Meskipun belum dibuktikan secara eksperimental pada burung, Adolphi18 adalah orang pertama yang menemukan bahwa sperma burung memberikan hasil positif ketika lapisan tipis cairan antara penutup kaca dan slide dibuat dengan selembar kertas saring. Reologi. Hino dan Yanagimachi [19] menempatkan kompleks ovarium-tuba-uterus tikus dalam cincin perfusi dan menyuntikkan 1 µl tinta ke dalam tanah genting untuk memvisualisasikan aliran cairan di tuba fallopi. Mereka melihat gerakan kontraksi dan relaksasi yang sangat aktif di tuba fallopi, di mana semua bola tinta terus bergerak menuju ampula tuba fallopi. Para penulis menekankan pentingnya aliran cairan tuba dari tuba fallopi bagian bawah ke bagian atas untuk pengangkatan sperma dan pembuahan. Brillard20 melaporkan bahwa pada ayam dan kalkun, spermatozoa bermigrasi dengan gerakan aktif dari pintu masuk vagina, tempat mereka disimpan, ke persimpangan utero-vagina, tempat mereka disimpan. Namun, gerakan ini tidak diperlukan antara persimpangan uterovagina dan infundibulum karena spermatozoa diangkut dengan perpindahan pasif. Mengetahui rekomendasi sebelumnya dan hasil yang diperoleh dalam penelitian saat ini, dapat diasumsikan bahwa kemampuan spermatozoa untuk bergerak ke hulu (reologi) adalah salah satu sifat yang menjadi dasar proses seleksi. Ini menentukan perjalanan spermatozoa melalui vagina dan masuknya mereka ke CCT untuk penyimpanan. Seperti yang disarankan Forman4, ini juga dapat memfasilitasi proses sperma memasuki SST dan habitatnya untuk jangka waktu tertentu dan kemudian keluar saat kecepatannya mulai melambat.
Di sisi lain, Matsuzaki dan Sasanami 21 mengemukakan bahwa spermatozoa unggas mengalami perubahan motilitas dari dormansi menjadi motilitas di saluran reproduksi jantan dan betina. Penghambatan motilitas sperma residen di SST telah diusulkan untuk menjelaskan waktu penyimpanan sperma yang lama dan kemudian peremajaan setelah meninggalkan SST. Dalam kondisi hipoksia, Matsuzaki et al. 1 melaporkan produksi dan pelepasan laktat yang tinggi di SST, yang dapat menyebabkan penghambatan motilitas sperma residen. Dalam hal ini, pentingnya reologi sperma tercermin dalam pemilihan dan penyerapan spermatozoa, dan bukan dalam penyimpanannya.
Pola aglutinasi sperma dianggap sebagai penjelasan yang masuk akal untuk periode penyimpanan sperma yang lama di SST, karena ini adalah pola umum retensi sperma pada unggas2,22,23. Bakst et al. 2 mengamati bahwa sebagian besar spermatozoa saling menempel, membentuk agregat fasikular, dan spermatozoa tunggal jarang ditemukan di CCM puyuh. Di sisi lain, Wen et al. 24 mengamati lebih banyak spermatozoa yang tersebar dan lebih sedikit jumbai spermatozoa di lumen SST pada ayam. Berdasarkan pengamatan ini, dapat diasumsikan bahwa kecenderungan aglutinasi sperma berbeda antara burung dan antara spermatozoa dalam ejakulasi yang sama. Selain itu, Van Krey et al. 9 menyarankan bahwa disosiasi acak spermatozoa yang diaglutinasi bertanggung jawab atas penetrasi spermatozoa secara bertahap ke dalam lumen tuba falopi. Menurut hipotesis ini, spermatozoa dengan kapasitas aglutinasi yang lebih rendah harus dikeluarkan dari SST terlebih dahulu. Dalam konteks ini, kemampuan spermatozoa untuk menggumpal dapat menjadi faktor yang memengaruhi hasil kompetisi sperma pada burung yang kotor. Selain itu, semakin lama sperma yang menggumpal terdisosiasi, semakin lama pula kesuburannya dipertahankan.
Meskipun agregasi spermatozoa dan agregasi menjadi bundel telah diamati dalam beberapa penelitian2,22,24, mereka belum dijelaskan secara rinci karena kompleksitas pengamatan kinematik mereka dalam SST. Beberapa upaya telah dilakukan untuk mempelajari aglutinasi sperma secara in vitro. Agregasi yang luas tetapi sementara diamati ketika kawat tipis dilepaskan dari tetesan benih yang menggantung. Hal ini mengarah pada fakta bahwa gelembung memanjang menonjol dari tetesan, meniru kelenjar mani. Karena keterbatasan 3D dan waktu pengeringan tetes yang singkat, seluruh blok dengan cepat rusak9. Dalam penelitian saat ini, menggunakan ayam Sharkashi dan chip mikrofluida, kami dapat menjelaskan bagaimana jumbai ini terbentuk dan bagaimana mereka bergerak. Bundel sperma terbentuk segera setelah pengumpulan semen dan ditemukan bergerak dalam spiral, menunjukkan reologi positif ketika hadir dalam aliran. Lebih jauh, ketika dilihat secara makroskopis, bundel sperma telah diamati meningkatkan linearitas motilitas dibandingkan dengan spermatozoa yang terisolasi. Ini menunjukkan bahwa penggumpalan sperma dapat terjadi sebelum penetrasi SST dan bahwa produksi sperma tidak terbatas pada area kecil karena stres seperti yang disarankan sebelumnya (Tingari dan Lake12). Selama pembentukan jumbai, spermatozoa berenang secara serempak hingga membentuk sambungan, kemudian ekornya saling melilit dan kepala spermatozoa tetap bebas, tetapi ekor dan bagian distal spermatozoa saling menempel dengan zat lengket. Oleh karena itu, kepala ligamen yang bebas bertanggung jawab atas pergerakan, menyeret sisa ligamen. Mikroskop elektron pemindaian dari berkas sperma menunjukkan kepala sperma yang menempel ditutupi dengan banyak bahan lengket, yang menunjukkan bahwa kepala sperma menempel dalam berkas istirahat, yang mungkin terjadi setelah mencapai tempat penyimpanan (SST).
Bila apusan sperma diwarnai dengan akridin oranye, bahan perekat ekstraseluler di sekitar sel sperma dapat dilihat di bawah mikroskop fluoresensi. Zat ini memungkinkan berkas sperma menempel dan melekat pada permukaan atau partikel di sekitarnya sehingga tidak hanyut bersama aliran di sekitarnya. Dengan demikian, pengamatan kami menunjukkan peran adhesi spermatozoa dalam bentuk berkas bergerak. Kemampuan mereka untuk berenang melawan arus dan menempel pada permukaan di dekatnya memungkinkan sperma bertahan lebih lama di SST.
Rothschild25 menggunakan kamera hemocytometry untuk mempelajari distribusi semen sapi yang mengapung dalam setetes suspensi, mengambil fotomikrograf melalui kamera dengan sumbu optik vertikal dan horizontal mikroskop. Hasilnya menunjukkan bahwa spermatozoa tertarik ke permukaan bilik. Penulis menyarankan bahwa mungkin ada interaksi hidrodinamik antara sperma dan permukaan. Dengan mempertimbangkan hal ini, bersama dengan kemampuan semen anak ayam Sharkashi untuk membentuk gumpalan lengket, hal itu dapat meningkatkan kemungkinan bahwa semen akan menempel pada dinding SST dan disimpan untuk jangka waktu yang lama.
Bccetti dan Afzeliu26 melaporkan bahwa glikokaliks sperma diperlukan untuk pengenalan dan penggumpalan gamet. Forman10 mengamati bahwa hidrolisis ikatan α-glikosidik dalam lapisan glikoprotein-glikolipid dengan memperlakukan semen unggas dengan neuraminidase mengakibatkan penurunan kesuburan tanpa memengaruhi motilitas sperma. Para penulis menyarankan bahwa efek neuraminidase pada glikokaliks mengganggu penyerapan sperma di persimpangan utero-vagina, sehingga mengurangi kesuburan. Pengamatan mereka tidak dapat mengabaikan kemungkinan bahwa perlakuan neuraminidase dapat mengurangi pengenalan sperma dan oosit. Forman dan Engel10 menemukan bahwa kesuburan berkurang ketika ayam diinseminasi secara intravaginal dengan semen yang diperlakukan dengan neuraminidase. Namun, IVF dengan sperma yang diperlakukan dengan neuraminidase tidak memengaruhi kesuburan dibandingkan dengan ayam kontrol. Para penulis menyimpulkan bahwa perubahan pada lapisan glikoprotein-glikolipid di sekitar membran sperma mengurangi kemampuan sperma untuk membuahi dengan mengganggu penyerapan sperma di persimpangan utero-vagina, yang pada gilirannya meningkatkan kehilangan sperma karena kecepatan persimpangan utero-vagina, tetapi tidak memengaruhi pengenalan sperma dan sel telur.
Pada kalkun, Bakst dan Bauchan 11 menemukan vesikel kecil dan fragmen membran dalam lumen SST dan mengamati bahwa beberapa granula ini telah menyatu dengan membran sperma. Para penulis menyarankan bahwa hubungan ini dapat berkontribusi pada penyimpanan spermatozoa jangka panjang dalam SST. Namun, para peneliti tidak menentukan sumber partikel ini, apakah mereka disekresikan oleh sel epitel CCT, diproduksi dan disekresikan oleh sistem reproduksi pria, atau diproduksi oleh sperma itu sendiri. Selain itu, partikel-partikel ini bertanggung jawab untuk aglutinasi. Grützner et al27 melaporkan bahwa sel epitel epididimis memproduksi dan mengeluarkan protein spesifik yang diperlukan untuk pembentukan traktus mani berpori tunggal. Para penulis juga melaporkan bahwa dispersi bundel ini bergantung pada interaksi protein epididimis. Nixon et al28 menemukan bahwa adneksa mengeluarkan protein, osteonectin kaya sistein yang bersifat asam; SPARC terlibat dalam pembentukan gumpalan sperma pada ekidna berparuh pendek dan platipus. Hamburan berkas-berkas ini dikaitkan dengan hilangnya protein ini.
Dalam studi terkini, analisis ultrastruktur menggunakan mikroskop elektron menunjukkan bahwa spermatozoa melekat pada sejumlah besar bahan padat. Zat-zat ini dianggap bertanggung jawab atas penggumpalan yang mengembun di antara dan di sekitar kepala yang melekat, tetapi pada konsentrasi yang lebih rendah di daerah ekor. Kami berasumsi bahwa zat penggumpalan ini dikeluarkan dari sistem reproduksi pria (epididimis atau vas deferens) bersama dengan air mani, karena kami sering mengamati air mani terpisah dari getah bening dan plasma mani selama ejakulasi. Telah dilaporkan bahwa saat spermatozoa burung melewati epididimis dan vas deferens, mereka mengalami perubahan terkait pematangan yang mendukung kemampuan mereka untuk mengikat protein dan memperoleh glikoprotein terkait plasma lemma. Persistensi protein-protein ini pada membran sperma residen di SST menunjukkan bahwa protein-protein ini dapat memengaruhi perolehan stabilitas membran sperma 30 dan menentukan kesuburannya 31 . Ahammad et al32 melaporkan bahwa spermatozoa yang diperoleh dari berbagai bagian sistem reproduksi jantan (dari testis hingga vas deferens distal) menunjukkan peningkatan progresif dalam viabilitas dalam kondisi penyimpanan cairan, terlepas dari suhu penyimpanan, dan viabilitas pada ayam juga meningkat di tuba falopi setelah inseminasi buatan.
Jambul sperma ayam Sharkashi memiliki karakteristik dan fungsi yang berbeda dengan spesies lain seperti ekidna, platipus, tikus hutan, tikus rusa, dan marmut. Pada ayam Sharkashi, pembentukan berkas spermatozoa mengurangi kecepatan berenang mereka dibandingkan dengan spermatozoa tunggal. Namun, berkas-berkas ini meningkatkan persentase spermatozoa positif secara reologi dan meningkatkan kemampuan spermatozoa untuk menstabilkan diri mereka sendiri dalam lingkungan yang dinamis. Dengan demikian, hasil kami mengonfirmasi saran sebelumnya bahwa aglutinasi sperma dalam SST dikaitkan dengan penyimpanan sperma jangka panjang. Kami juga berhipotesis bahwa kecenderungan sperma untuk membentuk jambul dapat mengendalikan laju kehilangan sperma dalam SST, yang dapat mengubah hasil kompetisi sperma. Menurut asumsi ini, spermatozoa dengan kapasitas aglutinasi rendah melepaskan SST terlebih dahulu, sementara spermatozoa dengan kapasitas aglutinasi tinggi menghasilkan sebagian besar keturunan. Pembentukan berkas sperma berpori tunggal bermanfaat dan memengaruhi rasio induk-anak, tetapi menggunakan mekanisme yang berbeda. Pada ekidna dan platipus, spermatozoa tersusun sejajar satu sama lain untuk meningkatkan kecepatan maju berkas sperma. Kumpulan ekidna bergerak sekitar tiga kali lebih cepat daripada spermatozoa tunggal. Dipercayai bahwa pembentukan kumpulan sperma seperti itu pada ekidna merupakan adaptasi evolusi untuk mempertahankan dominasi, karena betina bersifat promiscuous dan biasanya kawin dengan beberapa jantan. Oleh karena itu, spermatozoa dari ejakulat yang berbeda bersaing ketat untuk membuahi sel telur.
Spermatozoa yang menggumpal dari ayam sharkasi mudah divisualisasikan menggunakan mikroskopi kontras fase, yang dianggap menguntungkan karena memungkinkan studi mudah tentang perilaku spermatozoa in vitro. Mekanisme pembentukan gumpalan sperma yang mendorong reproduksi pada ayam sharkasi juga berbeda dari yang terlihat pada beberapa mamalia berplasenta yang mewakili perilaku sperma kooperatif seperti tikus hutan, di mana beberapa spermatozoa mencapai sel telur, membantu individu lain yang terkait mencapai dan merusak sel telur mereka. untuk membuktikan diri. perilaku altruistik. Pembuahan sendiri 34. Contoh lain dari perilaku kooperatif pada spermatozoa ditemukan pada tikus rusa, di mana spermatozoa mampu mengidentifikasi dan bergabung dengan spermatozoa yang paling terkait secara genetik dan membentuk kelompok kooperatif untuk meningkatkan kecepatan mereka dibandingkan dengan spermatozoa yang tidak terkait35.
Hasil yang diperoleh dalam penelitian ini tidak bertentangan dengan teori Foman tentang penyimpanan spermatozoa jangka panjang di SWS. Para peneliti melaporkan bahwa sel sperma terus bergerak dalam aliran sel epitel yang melapisi SST untuk jangka waktu yang lama, dan setelah jangka waktu tertentu, simpanan energi sel sperma habis, sehingga terjadi penurunan kecepatan, yang memungkinkan pengeluaran zat-zat dengan berat molekul kecil. energi spermatozoa dengan aliran cairan dari lumen SST Rongga tuba fallopi. Dalam penelitian saat ini, kami mengamati bahwa setengah dari sperma tunggal menunjukkan kemampuan untuk berenang melawan cairan yang mengalir, dan adhesi mereka dalam bundel meningkatkan kemampuan mereka untuk menunjukkan reologi positif. Lebih jauh, data kami konsisten dengan data Matsuzaki et al. 1 yang melaporkan bahwa peningkatan sekresi laktat di SST dapat menghambat motilitas sperma residen. Namun, hasil kami menggambarkan pembentukan ligamen motil sperma dan perilaku reologi mereka di hadapan lingkungan yang dinamis dalam mikrokanal dalam upaya untuk menjelaskan perilaku mereka dalam SST. Penelitian di masa mendatang dapat difokuskan pada penentuan komposisi kimia dan asal agen penggumpalan, yang tidak diragukan lagi akan membantu para peneliti mengembangkan cara-cara baru untuk menyimpan air mani cair dan meningkatkan durasi kesuburan.
Lima belas ekor ikan hiu jantan berleher telanjang berumur 30 minggu (dominan homozigot; Na Na) dipilih sebagai donor sperma dalam penelitian ini. Unggas-unggas tersebut dipelihara di Peternakan Unggas Riset Fakultas Pertanian, Universitas Ashit, Provinsi Ashit, Mesir. Unggas-unggas tersebut ditempatkan dalam kandang-kandang tersendiri (30 x 40 x 40 cm), diberi program pencahayaan (16 jam cahaya dan 8 jam kegelapan) dan diberi makanan yang mengandung 160 g protein kasar, 2800 kkal energi metabolisme, 35 g kalsium masing-masing. 5 gram fosfor tersedia per kilogram makanan.
Berdasarkan data 36, ​​​​37, semen dikumpulkan dari jantan dengan cara dipijat perut. Sebanyak 45 sampel semen dikumpulkan dari 15 jantan selama 3 hari. Semen (n = 15/hari) segera diencerkan 1:1 (v:v) dengan Belsville Poultry Semen Diluent, yang mengandung kalium difosfat (1,27 g), monosodium glutamat monohidrat (0,867 g), fruktosa (0,5 d) natrium asetat anhidrat (0,43 g), tris(hidroksimetil)aminometana (0,195 g), kalium sitrat monohidrat (0,064 g), kalium monofosfat (0,065 g), magnesium klorida (0,034 g) dan H2O (100 ml), pH = 7, 5, osmolaritas 333 mOsm/kg38. Sampel air mani yang diencerkan pertama-tama diperiksa di bawah mikroskop cahaya untuk memastikan kualitas air mani yang baik (kelembapan) dan kemudian disimpan dalam bak air pada suhu 37°C hingga digunakan dalam waktu setengah jam setelah pengumpulan.
Kinematika dan reologi spermatozoa dijelaskan menggunakan sistem perangkat mikrofluida. Sampel semen diencerkan lebih lanjut hingga 1:40 dalam Beltsville Avian Semen Diluent, dimasukkan ke dalam perangkat mikrofluida (lihat di bawah), dan parameter kinetik ditentukan menggunakan sistem Computerized Semen Analysis (CASA) yang sebelumnya dikembangkan untuk karakterisasi mikrofluida. tentang mobilitas spermatozoa dalam media cair (Departemen Teknik Mesin, Fakultas Teknik, Universitas Assiut, Mesir). Plugin dapat diunduh di: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39. Kecepatan lengkung (VCL, μm/s), kecepatan linier (VSL, μm/s) dan kecepatan lintasan rata-rata (VAP, μm/s) diukur. Video spermatozoa diambil menggunakan mikroskop kontras fase Optika XDS-3 terbalik (dengan lensa objektif 40x) yang terhubung ke kamera Tucson ISH1000 pada 30 fps selama 3 detik. Gunakan perangkat lunak CASA untuk mempelajari setidaknya tiga area dan 500 lintasan sperma per sampel. Video yang direkam diproses menggunakan CASA buatan sendiri. Definisi motilitas dalam plug-in CASA didasarkan pada kecepatan berenang sperma dibandingkan dengan laju aliran, dan tidak termasuk parameter lain seperti gerakan dari sisi ke sisi, karena ini telah ditemukan lebih dapat diandalkan dalam aliran fluida. Gerakan reologi digambarkan sebagai gerakan sel sperma melawan arah aliran fluida. Spermatozoa dengan sifat reologi dibagi dengan jumlah spermatozoa motil; spermatozoa yang diam dan spermatozoa yang bergerak secara konvektif dikeluarkan dari hitungan.
Semua bahan kimia yang digunakan diperoleh dari Elgomhoria Pharmaceuticals (Kairo, Mesir) kecuali dinyatakan lain. Perangkat ini diproduksi seperti yang dijelaskan oleh El-sherry et al. 40 dengan beberapa modifikasi. Bahan yang digunakan untuk membuat mikrokanal meliputi pelat kaca (Howard Glass, Worcester, MA), resist negatif SU-8-25 (MicroChem, Newton, CA), alkohol diaseton (Sigma Aldrich, Steinheim, Jerman), dan poliaseton. -184, Dow Corning, Midland, Michigan). Mikrokanal dibuat menggunakan litografi lunak. Pertama, masker pelindung wajah bening dengan desain mikrokanal yang diinginkan dicetak pada printer resolusi tinggi (Prismatic, Kairo, Mesir dan Pacific Arts and Design, Markham, ON). Master dibuat menggunakan pelat kaca sebagai substrat. Pelat dibersihkan dalam aseton, isopropanol dan air deionisasi dan kemudian dilapisi dengan lapisan 20 µm SU8-25 dengan pelapisan putar (3000 rpm, 1 menit). Lapisan SU-8 kemudian dikeringkan dengan lembut (65°C, 2 menit dan 95°C, 10 menit) dan disinari dengan sinar UV selama 50 detik. Panggang pasca-pemanasan pada suhu 65°C dan 95°C selama 1 menit dan 4 menit untuk mengikat silang lapisan SU-8 yang diekspos, diikuti dengan pengembangan dalam alkohol diaseton selama 6,5 ​​menit. Panggang wafel dengan suhu tinggi (200°C selama 15 menit) untuk lebih memadatkan lapisan SU-8.
PDMS disiapkan dengan mencampur monomer dan pengeras dalam rasio berat 10:1, kemudian didegaskan dalam desikator vakum dan dituangkan ke rangka utama SU-8. PDMS diawetkan dalam oven (120°C, 30 menit), kemudian saluran dipotong, dipisahkan dari saluran utama, dan dilubangi untuk memungkinkan tabung dipasang di saluran masuk dan keluar mikrokanal. Akhirnya, mikrokanal PDMS dipasang secara permanen pada slide mikroskop menggunakan prosesor korona portabel (Electro-Technic Products, Chicago, IL) seperti yang dijelaskan di tempat lain. Mikrokanal yang digunakan dalam penelitian ini berukuran 200 µm × 20 µm (L × T) dan panjang 3,6 cm.
Aliran fluida yang disebabkan oleh tekanan hidrostatik di dalam mikrokanal dicapai dengan mempertahankan level fluida di reservoir masuk di atas perbedaan ketinggian Δh39 di reservoir keluar (Gbr. 1).
di mana f adalah koefisien gesekan, didefinisikan sebagai f = C/Re untuk aliran laminar dalam saluran persegi panjang, di mana C adalah konstanta yang bergantung pada rasio aspek saluran, L adalah panjang mikrokanal, Vav adalah kecepatan rata-rata di dalam mikrokanal, Dh adalah diameter hidrolik saluran, g – percepatan gravitasi. Dengan menggunakan persamaan ini, kecepatan rata-rata saluran dapat dihitung menggunakan persamaan berikut: