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La fertilidad de las aves depende de su capacidad para almacenar suficiente esperma viable durante un período prolongado en los túbulos de almacenamiento de esperma (TSE). El mecanismo exacto por el cual los espermatozoides entran, permanecen y salen de los TSE sigue siendo objeto de debate. El esperma de las gallinas sharkasi mostró una alta tendencia a la aglutinación, formando haces filamentosos móviles que contienen muchas células. Debido a la dificultad de observar la motilidad y el comportamiento de los espermatozoides en una trompa de Falopio opaca, utilizamos un dispositivo microfluídico con una sección transversal de microcanal similar a la de los espermatozoides para estudiar la aglutinación y la motilidad de los espermatozoides. Este estudio analiza cómo se forman los haces de esperma, cómo se mueven y su posible papel en la prolongación de la permanencia del esperma en los TSE. Investigamos la velocidad y el comportamiento reológico del esperma cuando se generó un flujo de fluido dentro de un canal microfluídico mediante presión hidrostática (caudal = 33 µm/s). Los espermatozoides tienden a nadar contra la corriente (reología positiva) y la velocidad del haz de espermatozoides se reduce significativamente en comparación con la de un solo espermatozoide. Se ha observado que los haces de espermatozoides se mueven en espiral y aumentan de longitud y grosor a medida que se incorporan más espermatozoides individuales. Se observó que los haces de espermatozoides se acercaban y se adherían a las paredes laterales de los canales microfluídicos para evitar ser arrastrados por una velocidad de flujo de fluido superior a 33 µm/s. Se observó que los haces de espermatozoides se acercaban y se adherían a las paredes laterales de los canales microfluídicos para evitar ser arrastrados por una velocidad de flujo de fluido superior a 33 µm/s. Было замечено, что пучки стенкам микрофлюидных каналов, чтобы избежать сметания со скоростью потока жидкости> 33 мкм / с. Se ha observado que los haces de espermatozoides se aproximan y se adhieren a las paredes laterales de los canales microfluídicos para evitar ser arrastrados a velocidades de flujo de fluido superiores a 33 µm/s.Temperatura de funcionamiento > 33 µm/s > 33 µm/s.33 µm/s 扫过。 Además, las bolsas de espermatozoides se colocan y se aplican a los canales microscópicos de los microbios. избежать сметания потоком жидкости со скоростью > 33 mm/s. Se ha observado que los haces de espermatozoides se aproximan y se adhieren a las paredes laterales del canal microfluídico para evitar ser arrastrados por el flujo de fluido a velocidades superiores a 33 µm/s.La microscopía electrónica de barrido y de transmisión reveló que los haces de espermatozoides estaban sostenidos por abundante material denso. Los datos obtenidos demuestran la movilidad única de los espermatozoides de pollo Sharkazi, así como su capacidad para aglutinarse y formar haces móviles, lo que contribuye a una mejor comprensión del almacenamiento a largo plazo de espermatozoides en SMT.
Para que se produzca la fecundación en humanos y la mayoría de los animales, los espermatozoides y los óvulos deben llegar al lugar de la fecundación en el momento preciso. Por lo tanto, el apareamiento debe ocurrir antes o durante la ovulación. Por otro lado, algunos mamíferos, como los perros, así como especies no mamíferas, como insectos, peces, reptiles y aves, almacenan espermatozoides en sus órganos reproductores durante un período prolongado hasta que sus óvulos estén listos para la fecundación (fecundación asincrónica¹). Las aves pueden mantener la viabilidad de los espermatozoides capaces de fecundar óvulos durante 2 a 10 semanas².
Esta es una característica única que distingue a las aves de otros animales, ya que proporciona una alta probabilidad de fertilización tras una sola inseminación durante varias semanas sin apareamiento ni ovulación simultáneos. El principal órgano de almacenamiento de esperma, denominado túbulo de almacenamiento de esperma (TSE), se localiza en los pliegues mucosos internos de la unión uterovaginal. Hasta la fecha, los mecanismos por los cuales los espermatozoides entran, permanecen y salen del banco de esperma no se comprenden completamente. Con base en estudios previos, se han planteado numerosas hipótesis, pero ninguna ha sido confirmada.
Forman4 planteó la hipótesis de que los espermatozoides mantienen su residencia en la cavidad del SST mediante un movimiento oscilatorio continuo en contra de la dirección del flujo de fluido a través de canales proteicos ubicados en las células epiteliales del SST (reología). El ATP se agota debido a la actividad flagelar constante necesaria para mantener el esperma en el lumen del SST y la motilidad finalmente disminuye hasta que los espermatozoides son transportados fuera del banco de esperma por el flujo de fluido y comienzan un nuevo viaje por la trompa de Falopio ascendente para fertilizar el óvulo (Forman4). Este modelo de almacenamiento de esperma está respaldado por la detección, mediante inmunocitoquímica, de las acuaporinas 2, 3 y 9 presentes en las células epiteliales del SST. Hasta la fecha, faltan estudios sobre la reología del semen de pollo y su papel en el almacenamiento del SST, la selección vaginal de esperma y la competencia espermática. En los pollos, el esperma entra en la vagina después del apareamiento natural, pero más del 80% de los espermatozoides son expulsados ​​de la vagina poco después del apareamiento. Esto sugiere que la vagina es el sitio principal para la selección de esperma en las aves. Además, se ha informado que menos del 1% de los espermatozoides fertilizados en la vagina terminan en SST2. En la inseminación artificial de pollitos en la vagina, el número de espermatozoides que llegan a SST tiende a aumentar 24 horas después de la inseminación. Hasta el momento, el mecanismo de selección de espermatozoides durante este proceso no está claro, y la motilidad espermática puede desempeñar un papel importante en la captación de espermatozoides por SST. Debido a las paredes gruesas y opacas de las trompas de Falopio, es difícil monitorear directamente la motilidad espermática en las trompas de Falopio de las aves. Por lo tanto, carecemos de conocimientos básicos sobre cómo los espermatozoides transitan a SST después de la fertilización.
Recientemente se ha reconocido la reología como un factor importante que controla el transporte de espermatozoides en los genitales de los mamíferos. Basándose en la capacidad de los espermatozoides móviles para migrar a contracorriente, Zaferani et al.⁸ utilizaron un sistema microfluídico Corra para aislar pasivamente espermatozoides móviles de muestras de semen almacenadas. Este tipo de clasificación de semen es esencial para el tratamiento médico de la infertilidad y la investigación clínica, y se prefiere a los métodos tradicionales, que requieren mucho tiempo y mano de obra y pueden comprometer la morfología y la integridad estructural de los espermatozoides. Sin embargo, hasta la fecha, no se han realizado estudios sobre el efecto de las secreciones de los órganos genitales de los pollos en la motilidad de los espermatozoides.
Independientemente del mecanismo que mantiene el esperma almacenado en el SST, muchos investigadores han observado que los espermatozoides residentes se aglutinan cabeza con cabeza en el SST de pollos 9, 10, codornices 2 y pavos 11 para formar haces de espermatozoides aglutinados. Los autores sugieren que existe una relación entre esta aglutinación y el almacenamiento a largo plazo de espermatozoides en el SST.
Tingari y Lake¹² informaron de una fuerte asociación entre los espermatozoides en la glándula receptora de esperma del pollo y cuestionaron si los espermatozoides aviares se aglutinan de la misma manera que los espermatozoides de los mamíferos. Consideran que las profundas conexiones entre los espermatozoides en el conducto deferente podrían deberse al estrés causado por la presencia de una gran cantidad de espermatozoides en un espacio reducido.
Al evaluar el comportamiento de los espermatozoides en portaobjetos frescos suspendidos, se observan signos transitorios de aglutinación, especialmente en los bordes de las gotas de semen. Sin embargo, la aglutinación se ve frecuentemente interrumpida por la rotación asociada al movimiento continuo, lo que explica la naturaleza transitoria de este fenómeno. Los investigadores también observaron que, al añadir el diluyente al semen, aparecían agregados celulares alargados con forma de filamento.
Los primeros intentos de imitar un espermatozoide se realizaron retirando un alambre delgado de una gota colgante, lo que dio como resultado una vesícula alargada similar a un espermatozoide que sobresalía de la gota de semen. Los espermatozoides se alinearon inmediatamente de forma paralela dentro de la vesícula, pero la unidad completa desapareció rápidamente debido a la limitación tridimensional. Por lo tanto, para estudiar la aglutinación de espermatozoides, es necesario observar la motilidad y el comportamiento de los espermatozoides directamente en túbulos de almacenamiento de esperma aislados, lo cual es difícil de lograr. Por consiguiente, es necesario desarrollar un instrumento que imite a los espermatozoides para apoyar los estudios de motilidad y comportamiento de aglutinación de espermatozoides. Brillard et al.¹³ informaron que la longitud promedio de los túbulos de almacenamiento de esperma en pollos adultos es de 400 a 600 µm, pero algunos TSE pueden alcanzar hasta 2000 µm. Mero y Ogasawara14 dividieron las glándulas seminíferas en túbulos de almacenamiento de esperma agrandados y no agrandados, ambos de la misma longitud (~500 µm) y ancho del cuello (~38 µm), pero el diámetro luminal medio de los túbulos fue de 56,6 y 56,6 µm. . , respectivamente 11,2 µm, respectivamente. En el presente estudio, utilizamos un dispositivo microfluídico con un tamaño de canal de 200 µm × 20 µm (An × Al), cuya sección transversal es algo cercana a la del SST amplificado. Además, examinamos la motilidad de los espermatozoides y el comportamiento de aglutinación en fluido en flujo, lo que es consistente con la hipótesis de Foreman de que el fluido producido por las células epiteliales del SST mantiene a los espermatozoides en el lumen en una dirección contracorriente (reológica).
El objetivo de este estudio fue superar los problemas que presenta la observación de la motilidad de los espermatozoides en la trompa de Falopio y evitar las dificultades que conlleva el estudio de la reología y el comportamiento de los espermatozoides en un entorno dinámico. Se utilizó un dispositivo microfluídico que genera presión hidrostática para simular la motilidad de los espermatozoides en los genitales de un pollo.
Al introducir una gota de una muestra de esperma diluida (1:40) en el dispositivo de microcanales, se pudieron identificar dos tipos de motilidad espermática (espermatozoides aislados y espermatozoides unidos). Además, los espermatozoides tendían a nadar contra la corriente (reología positiva; vídeos 1 y 2). Aunque los haces de espermatozoides tenían una velocidad menor que la de los espermatozoides solitarios (p < 0,001), aumentaron el porcentaje de espermatozoides que mostraban reotaxis positiva (p < 0,001; Tabla 2). Aunque los haces de espermatozoides tenían una velocidad menor que la de los espermatozoides solitarios (p < 0,001), aumentaron el porcentaje de espermatozoides que mostraban reotaxis positiva (p < 0,001; Tabla 2). Хотя пучки сперматозоидов имели более низкую скорость, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), они увеличивали процент espermatozoides, демонстрирующих положительный реотаксис (p < 0,001; tabla 2). Aunque los haces de espermatozoides tenían una velocidad menor que la de los espermatozoides individuales (p < 0,001), aumentaron el porcentaje de espermatozoides que mostraron reotaxis positiva (p < 0,001; Tabla 2).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度（p < 0.001），但它们增加了显示阳性流变性的精子百分比（p < 0.001；表2）。尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 （p <0.001） ， 但 增加 了 显示 阳性 流变性 精子百分比 （p <0.001 ； 2。。。。。。）））））） Хотя скорость пучков сперматозоидов была ниже, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), они увеличивали процент espermatozoides s положительной реоLOGией (p < 0,001; tabla 2). Aunque la velocidad de los haces de espermatozoides fue menor que la de los espermatozoides individuales (p < 0,001), aumentaron el porcentaje de espermatozoides con reología positiva (p < 0,001; Tabla 2).Se estima que la reología positiva para espermatozoides individuales y mechones es de aproximadamente el 53 % y el 85 %, respectivamente.
Se ha observado que los espermatozoides de las gallinas sharkashi, inmediatamente después de la eyaculación, forman haces lineales compuestos por decenas de individuos. Estos mechones aumentan de longitud y grosor con el tiempo y pueden permanecer in vitro durante varias horas antes de disiparse (video 3). Estos haces filamentosos tienen forma de espermatozoides de equidna que se forman al final del epidídimo. Se ha descubierto que el semen de la gallina sharkashi tiene una alta tendencia a aglutinarse y formar un haz reticulado en menos de un minuto después de su recolección. Estos haces son dinámicos y capaces de adherirse a cualquier pared cercana u objeto estático. Aunque los haces de espermatozoides reducen la velocidad de las células espermáticas, es evidente que macroscópicamente aumentan su linealidad. La longitud de los haces varía según la cantidad de espermatozoides recolectados en ellos. Se aislaron dos partes del haz: la parte inicial, que incluye la cabeza libre del espermatozoide aglutinado, y la parte terminal, que incluye la cola y todo el extremo distal del espermatozoide. Mediante una cámara de alta velocidad (950 fps), se observaron cabezas libres de espermatozoides aglutinados en la parte inicial del haz, responsables del movimiento del mismo debido a su oscilación, arrastrando a los demás hacia el haz con un movimiento helicoidal (Vídeo 4). Sin embargo, en los mechones largos, se observó que algunas cabezas de espermatozoides libres se adhieren al cuerpo y a la porción terminal del mechón, actuando como paletas para impulsarlo.
En un flujo lento de fluido, los haces de espermatozoides se mueven paralelamente entre sí; sin embargo, comienzan a superponerse y adherirse a todo lo que permanece inmóvil para evitar ser arrastrados por la corriente a medida que aumenta la velocidad del flujo. Los haces se forman cuando un grupo de espermatozoides se aproximan, comienzan a moverse sincronizadamente y se entrelazan, adhiriéndose a una sustancia pegajosa. Las figuras 1 y 2 muestran cómo los espermatozoides se aproximan, formando una unión a medida que sus colas se entrelazan.
Los investigadores aplicaron presión hidrostática para generar flujo de fluido en un microcanal y estudiar la reología del esperma. Se utilizó un microcanal de 200 µm × 20 µm (ancho × alto) y 3,6 µm de longitud. Los microcanales se colocaron entre recipientes con jeringas en los extremos. Se utilizó colorante alimentario para hacer los canales más visibles.
Sujete los cables de interconexión y los accesorios a la pared. El video fue tomado con un microscopio de contraste de fase. Con cada imagen, se presentan imágenes de microscopía de contraste de fase y mapeo. (A) La conexión entre dos corrientes resiste el flujo debido al movimiento helicoidal (flecha roja). (B) La conexión entre el haz de tubos y la pared del canal (flechas rojas), al mismo tiempo están conectados a otros dos haces (flechas amarillas). (C) Los haces de espermatozoides en el canal microfluídico comienzan a conectarse entre sí (flechas rojas), formando una malla de haces de espermatozoides. (D) Formación de una red de haces de espermatozoides.
Cuando se introdujo una gota de esperma diluido en el dispositivo microfluídico y se generó un flujo, se observó que el haz de espermatozoides se movía en sentido contrario a la corriente. Los haces se ajustaban perfectamente a las paredes de los microcanales, y las cabezas libres en la parte inicial de los haces también se ajustaban perfectamente a ellas (vídeo 5). Además, se adherían a cualquier partícula estacionaria en su camino, como residuos, para resistir ser arrastrados por la corriente. Con el tiempo, estos mechones se convertían en largos filamentos que atrapaban otros espermatozoides individuales y mechones más cortos (vídeo 6). A medida que el flujo disminuía, largas líneas de espermatozoides comenzaban a formar una red (vídeo 7; figura 2).
A alta velocidad de flujo (V > 33 µm/s), los movimientos espirales de los filamentos aumentan en un intento de capturar muchos espermatozoides individuales, formando haces que resisten mejor la fuerza de deriva del flujo. A alta velocidad de flujo (V > 33 µm/s), los movimientos espirales de los filamentos aumentan en un intento de capturar muchos espermatozoides individuales, formando haces que resisten mejor la fuerza de deriva del flujo. Si la velocidad de la corriente es alta (V > 33 mm/s), la televisión en espiral no se utilizará durante la noche, después de haber encendido el dispositivo. отдельных espermatozoides, образующих пучки, которые лучше противостоят дрейфующей силе потока. A caudales elevados (V > 33 µm/s), los movimientos helicoidales de las hebras aumentan al intentar capturar muchos espermatozoides individuales, formando haces que son más capaces de resistir la fuerza de deriva del flujo.在高流速(V > 33 µm/s)时，螺纹的螺旋运动增加，以试图捕捉许多形成束的单个精子,从而更好地抵抗流动的漂移力.在 高 流速 (v> 33 µm/s) 时 ， 的 螺旋 运动 增加 ， 以 试图 许多 形成 束 单 个 精子 ， 从而 更 地抵抗 的 漂移力。。。。。。。。。。 При высоких скоростях потока (V > 33 мкм/s) спиральное движение нитей увеличивается в попытке захватить множество отдельных сперматозоидов, образующих пучки, чтобы лучше сопротивляться силам дрейфа потока. A caudales elevados (V > 33 µm/s), el movimiento helicoidal de los filamentos aumenta en un intento por capturar muchos espermatozoides individuales, formando haces para resistir mejor las fuerzas de deriva del flujo.También intentaron instalar microcanales en las paredes laterales.
Los haces de espermatozoides se identificaron como grupos de cabezas de espermatozoides y colas curvadas mediante microscopía óptica (MO). También se han identificado haces de espermatozoides con varios agregados como cabezas retorcidas y agregados flagelares, múltiples colas de espermatozoides fusionadas, cabezas de espermatozoides unidas a una cola y cabezas de espermatozoides con núcleos doblados como múltiples núcleos fusionados. Microscopía electrónica de transmisión (MET). La microscopía electrónica de barrido (MET) mostró que los haces de espermatozoides eran agregados envainados de cabezas de espermatozoides y los agregados de espermatozoides mostraron una red adjunta de colas envueltas.
Se estudió la morfología y la ultraestructura de los espermatozoides, así como la formación de haces de espermatozoides, utilizando microscopía óptica (sección parcial), microscopía electrónica de barrido (MEB) y microscopía electrónica de transmisión (MET). Las muestras de esperma se tiñeron con naranja de acridina y se examinaron mediante microscopía de epifluorescencia.
La tinción de frotis de esperma con naranja de acridina (Fig. 3B) mostró que las cabezas de los espermatozoides estaban adheridas entre sí y cubiertas de material secretor, lo que dio lugar a la formación de grandes mechones (Fig. 3D). Los haces de espermatozoides consistían en agregados de espermatozoides con una red de colas adheridas (Fig. 4A-C). Los haces de espermatozoides están compuestos por las colas de muchos espermatozoides adheridos entre sí (Fig. 4D). Las secreciones (Fig. 4E,F) cubrían las cabezas de los haces de espermatozoides.
Formación del haz de espermatozoides. Mediante microscopía de contraste de fase y frotis de esperma teñidos con naranja de acridina, se observó que las cabezas de los espermatozoides se adhieren entre sí. (A) La formación temprana del mechón de espermatozoides comienza con un espermatozoide (círculo blanco) y tres espermatozoides (círculo amarillo), con la espiral comenzando en la cola y terminando en la cabeza. (B) Fotomicrografía de un frotis de esperma teñido con naranja de acridina que muestra cabezas de espermatozoides adheridas (flechas). La secreción cubre la(s) cabeza(s). Aumento × 1000. (C) Desarrollo de un haz grande transportado por el flujo en un canal microfluídico (utilizando una cámara de alta velocidad a 950 fps). (D) Micrografía de un frotis de esperma teñido con naranja de acridina que muestra grandes mechones (flechas). Aumento: ×200.
Micrografía electrónica de barrido de un haz de espermatozoides y una extensión de espermatozoides teñida con naranja de acridina. (A, B, D, E) son micrografías electrónicas de barrido digitales en color de espermatozoides, y C y F son micrografías de extensiones de espermatozoides teñidas con naranja de acridina que muestran la unión de múltiples espermatozoides que envuelven la red caudal. (AC) Los agregados de espermatozoides se muestran como una red de colas unidas (flechas). (D) Adhesión de varios espermatozoides (con sustancia adhesiva, contorno rosa, flecha) que envuelven la cola. (E y F) Agregados de cabezas de espermatozoides (punteros) cubiertos con material adhesivo (punteros). Los espermatozoides formaron haces con varias estructuras en forma de vórtice (F). (C) ×400 y (F) ×200 aumentos.
Mediante microscopía electrónica de transmisión, observamos que los haces de espermatozoides presentaban colas adheridas (Fig. 6A, C), cabezas adheridas a las colas (Fig. 6B) o cabezas adheridas a las colas (Fig. 6D). Las cabezas de los espermatozoides en el haz son curvas y presentan, en sección, dos regiones nucleares (Fig. 6D). En el haz de incisión, los espermatozoides presentaban una cabeza retorcida con dos regiones nucleares y múltiples regiones flagelares (Fig. 5A).
Micrografía electrónica digital en color que muestra las colas de conexión en el haz de espermatozoides y el material aglutinante que conecta las cabezas de los espermatozoides. (A) Cola adherida de un gran número de espermatozoides. Nótese cómo se ve la cola en las proyecciones vertical (flecha) y horizontal (flecha). (B) La cabeza (flecha) del espermatozoide está conectada a la cola (flecha). (C) Varias colas de espermatozoides (flechas) están adheridas. (D) El material aglutinante (AS, azul) conecta cuatro cabezas de espermatozoides (púrpura).
Se utilizó microscopía electrónica de barrido para detectar cabezas de espermatozoides en haces cubiertos de secreciones o membranas (Figura 6B), lo que indica que los haces de espermatozoides estaban anclados por material extracelular. El material aglutinado se concentraba en la cabeza del espermatozoide (estructura similar a la cabeza de una medusa; Fig. 5B) y se expandía distalmente, adquiriendo un color amarillo brillante bajo microscopía de fluorescencia al teñirse con naranja de acridina (Fig. 6C). Esta sustancia es claramente visible bajo un microscopio de barrido y se considera un aglutinante. Las secciones semifinas (Fig. 5C) y los frotis de espermatozoides teñidos con naranja de acridina mostraron haces de espermatozoides con cabezas densamente empaquetadas y colas curvadas (Fig. 5D).
Varias fotomicrografías que muestran la agregación de cabezas de espermatozoides y colas plegadas utilizando diversos métodos. (A) Micrografía electrónica de transmisión digital en color de sección transversal de un haz de espermatozoides que muestra una cabeza de espermatozoide enrollada con un núcleo de dos partes (azul) y varias partes flagelares (verde). (B) Micrografía electrónica de barrido digital en color que muestra un grupo de cabezas de espermatozoides con forma de medusa (flechas) que parecen estar cubiertas. (C) Sección semifina que muestra cabezas de espermatozoides agregadas (flechas) y colas curvadas (flechas). (D) Micrografía de una extensión de espermatozoides teñida con naranja de acridina que muestra agregados de cabezas de espermatozoides (flechas) y colas curvadas adheridas (flechas). Nótese que una sustancia pegajosa (S) cubre la cabeza del espermatozoide. (D) Aumento de × 1000.
Mediante microscopía electrónica de transmisión (Fig. 7A), también se observó que las cabezas de los espermatozoides estaban retorcidas y los núcleos tenían forma espiral, como se confirmó mediante frotis de esperma teñidos con naranja de acridina y examinados mediante microscopía de fluorescencia (Fig. 7B).
(A) Micrografía electrónica de transmisión digital en color y (B) Frotis de esperma teñido con naranja de acridina que muestra cabezas enrolladas y la unión de las cabezas y colas de los espermatozoides (flechas). (B) Aumento de × 1000.
Un hallazgo interesante es que los espermatozoides de Sharkazi se agregan formando haces filamentosos móviles. Las propiedades de estos haces nos permiten comprender su posible función en la absorción y el almacenamiento de espermatozoides en el SST.
Tras el apareamiento, los espermatozoides entran en la vagina y se someten a un intenso proceso de selección, lo que resulta en que solo un número limitado de espermatozoides ingrese al SST15,16. Hasta la fecha, los mecanismos por los cuales los espermatozoides entran y salen del SST no están claros. En las aves de corral, los espermatozoides se almacenan en el SST durante un período prolongado de 2 a 10 semanas, según la especie6. Persiste la controversia sobre el estado del semen durante el almacenamiento en el SST. ¿Están en movimiento o en reposo? En otras palabras, ¿cómo mantienen los espermatozoides su posición en el SST durante tanto tiempo?
Forman4 sugirió que la residencia y eyección del SST podrían explicarse en términos de motilidad espermática. Los autores plantean la hipótesis de que los espermatozoides mantienen su posición nadando contra el flujo de fluido creado por el epitelio del SST y que son eyectados del SST cuando su velocidad cae por debajo del punto en el que comienzan a moverse hacia atrás debido a la falta de energía. Zaniboni5 confirmó la presencia de acuaporinas 2, 3 y 9 en la porción apical de las células epiteliales del SST, lo que puede respaldar indirectamente el modelo de almacenamiento de espermatozoides de Foreman. En el presente estudio, encontramos que casi la mitad de los espermatozoides de Sharkashi muestran reología positiva en el fluido en movimiento, y que los haces de espermatozoides aglutinados aumentan el número de espermatozoides que muestran reología positiva, aunque la aglutinación los ralentiza. Cómo viajan las células espermáticas por la trompa de Falopio del ave hasta el sitio de fertilización no se comprende completamente. En los mamíferos, el líquido folicular atrae quimiotácticamente a los espermatozoides. Sin embargo, se cree que los quimioatrayentes dirigen a los espermatozoides a acercarse a largas distancias7. Por lo tanto, otros mecanismos son responsables del transporte de espermatozoides. Se ha informado que la capacidad de los espermatozoides para orientarse y fluir contra el fluido de la trompa de Falopio liberado después del apareamiento es un factor importante en la focalización de los espermatozoides en ratones. Parker 17 sugirió que los espermatozoides cruzan los oviductos nadando contra la corriente ciliar en aves y reptiles. Aunque no se ha demostrado experimentalmente en aves, Adolphi18 fue el primero en encontrar que el esperma aviar da resultados positivos cuando se crea una capa delgada de líquido entre un cubreobjetos y un portaobjetos con una tira de papel de filtro. Reología. Hino y Yanagimachi [19] colocaron un complejo ovario-tubá-útero de ratón en un anillo de perfusión e inyectaron 1 µl de tinta en el istmo para visualizar el flujo de fluido en las trompas de Falopio. Observaron un movimiento muy activo de contracción y relajación en la trompa de Falopio, en el que todas las bolitas de tinta se desplazaban constantemente hacia la ampolla de la trompa de Falopio. Los autores enfatizan la importancia del flujo de líquido tubárico desde la parte inferior a la superior de las trompas de Falopio para la elevación y fecundación de los espermatozoides. Brillard20 informó que en pollos y pavos, los espermatozoides migran mediante movimiento activo desde la entrada vaginal, donde se almacenan, hasta la unión útero-vaginal, donde se almacenan. Sin embargo, este movimiento no es necesario entre la unión útero-vaginal y el infundíbulo, ya que los espermatozoides se transportan por desplazamiento pasivo. Conociendo estas recomendaciones previas y los resultados obtenidos en el presente estudio, se puede asumir que la capacidad de los espermatozoides para moverse en contracorriente (reología) es una de las propiedades en las que se basa el proceso de selección. Esto determina el paso de los espermatozoides a través de la vagina y su entrada en el CCT para su almacenamiento. Como sugirió Forman4, esto también puede facilitar el proceso de entrada de los espermatozoides en el SST y su hábitat durante un período de tiempo, para luego salir cuando su velocidad comience a disminuir.
Por otro lado, Matsuzaki y Sasanami 21 sugirieron que los espermatozoides aviares experimentan cambios de motilidad, pasando de la latencia a la motilidad en los tractos reproductivos masculino y femenino. Se ha propuesto que la inhibición de la motilidad de los espermatozoides residentes en el SST explica el largo tiempo de almacenamiento de los espermatozoides y su posterior regeneración tras abandonar el SST. En condiciones hipóxicas, Matsuzaki et al. 1 informaron de una alta producción y liberación de lactato en el SST, lo que podría inhibir la motilidad de los espermatozoides residentes. En este caso, la importancia de la reología de los espermatozoides radica en su selección y absorción, y no en su almacenamiento.
El patrón de aglutinación de espermatozoides se considera una explicación plausible para el largo período de almacenamiento de espermatozoides en el SST, ya que este es un patrón común de retención de espermatozoides en aves de corral2,22,23. Bakst et al. 2 observaron que la mayoría de los espermatozoides se adherían entre sí, formando agregados fasciculares, y los espermatozoides individuales se encontraban raramente en el CCM de codorniz. Por otro lado, Wen et al. 24 observaron espermatozoides más dispersos y menos mechones de espermatozoides en el lumen del SST en pollos. Con base en estas observaciones, se puede asumir que la propensión a la aglutinación de espermatozoides difiere entre aves y entre espermatozoides en el mismo eyaculado. Además, Van Krey et al. 9 sugirieron que la disociación aleatoria de espermatozoides aglutinados es responsable de la penetración gradual de espermatozoides en el lumen de la trompa de Falopio. Según esta hipótesis, los espermatozoides con menor capacidad de aglutinación deberían ser expulsados ​​primero del SST. En este contexto, la capacidad de los espermatozoides para aglutinarse podría ser un factor que influya en el resultado de la competencia espermática en aves con problemas de higiene. Además, cuanto más tiempo permanezca disociado el espermatozoide aglutinado, mayor será la duración de la fertilidad.
Aunque la agregación de espermatozoides y su formación en haces se han observado en varios estudios2,22,24, no se han descrito en detalle debido a la complejidad de su observación cinemática dentro del SST. Se han realizado varios intentos para estudiar la aglutinación de espermatozoides in vitro. Se observó una agregación extensa pero transitoria cuando se retiró el alambre delgado de la gota de semilla colgante. Esto lleva a que una burbuja alargada sobresalga de la gota, imitando la glándula seminal. Debido a las limitaciones 3D y los cortos tiempos de secado por goteo, todo el bloque se deterioró rápidamente9. En el presente estudio, utilizando pollos Sharkashi y chips microfluídicos, pudimos describir cómo se forman estos mechones y cómo se mueven. Los haces de espermatozoides se formaron inmediatamente después de la recolección de semen y se encontró que se movían en espiral, mostrando reología positiva cuando estaban presentes en el flujo. Además, cuando se observaron macroscópicamente, se ha observado que los haces de espermatozoides aumentan la linealidad de la motilidad en comparación con los espermatozoides aislados. Esto sugiere que la aglutinación de espermatozoides puede ocurrir antes de la penetración del SST y que la producción de espermatozoides no se limita a un área pequeña debido al estrés como se sugirió anteriormente (Tingari y Lake12). Durante la formación del mechón, los espermatozoides nadan en sincronía hasta que forman una unión, luego sus colas se enroscan entre sí y la cabeza del espermatozoide permanece libre, pero la cola y la parte distal del espermatozoide se adhieren entre sí con una sustancia pegajosa. Por lo tanto, la cabeza libre del ligamento es responsable del movimiento, arrastrando el resto del ligamento. La microscopía electrónica de barrido de los haces de espermatozoides mostró cabezas de espermatozoides adheridas cubiertas con mucho material pegajoso, lo que sugiere que las cabezas de los espermatozoides estaban adheridas en haces de reposo, lo que pudo haber ocurrido después de llegar al sitio de almacenamiento (SST).
Al teñir una muestra de semen con naranja de acridina, se puede observar material adhesivo extracelular alrededor de los espermatozoides bajo un microscopio de fluorescencia. Esta sustancia permite que los haces de espermatozoides se adhieran a las superficies o partículas circundantes, evitando así que se desplacen con la corriente. Por lo tanto, nuestras observaciones demuestran la función de la adhesión de los espermatozoides en forma de haces móviles. Su capacidad para nadar contra la corriente y adherirse a las superficies cercanas les permite permanecer más tiempo en la capa superficial del mar.
Rothschild25 utilizó una cámara de hemocitometría para estudiar la distribución flotante del semen bovino en una gota de suspensión, tomando fotomicrografías a través de una cámara con ejes ópticos tanto verticales como horizontales del microscopio. Los resultados mostraron que los espermatozoides eran atraídos hacia la superficie de la cámara. Los autores sugieren que podría haber interacciones hidrodinámicas entre los espermatozoides y la superficie. Teniendo esto en cuenta, junto con la capacidad del semen de pollo Sharkashi para formar mechones pegajosos, podría aumentar la probabilidad de que el semen se adhiera a la pared del SST y se almacene durante largos períodos de tiempo.
Bccetti y Afzeliu26 informaron que el glicocálix del esperma es necesario para el reconocimiento y la aglutinación de los gametos. Forman10 observó que la hidrólisis de los enlaces α-glucosídicos en los recubrimientos de glicoproteína-glicolípido mediante el tratamiento del semen aviar con neuraminidasa resultó en una fertilidad reducida sin afectar la motilidad del esperma. Los autores sugieren que el efecto de la neuraminidasa sobre el glicocálix perjudica el secuestro del esperma en la unión útero-vaginal, reduciendo así la fertilidad. Sus observaciones no pueden ignorar la posibilidad de que el tratamiento con neuraminidasa pueda reducir el reconocimiento del esperma y el ovocito. Forman y Engel10 encontraron que la fertilidad se redujo cuando las gallinas fueron inseminadas intravaginalmente con semen tratado con neuraminidasa. Sin embargo, la FIV con esperma tratado con neuraminidasa no afectó la fertilidad en comparación con las gallinas control. Los autores concluyeron que los cambios en la capa de glicoproteína-glicolípido que rodea la membrana del espermatozoide redujeron la capacidad del espermatozoide para fertilizar al afectar el secuestro del espermatozoide en la unión útero-vaginal, lo que a su vez aumentó la pérdida de espermatozoides debido a la velocidad de la unión útero-vaginal, pero no afectó el reconocimiento del espermatozoide y el óvulo.
En pavos Bakst y Bauchan 11 encontraron pequeñas vesículas y fragmentos de membrana en el lumen del SST y observaron que algunos de estos gránulos se habían fusionado con la membrana del espermatozoide. Los autores sugieren que estas relaciones pueden contribuir al almacenamiento a largo plazo de espermatozoides en el SST. Sin embargo, los investigadores no especificaron la fuente de estas partículas, si son secretadas por células epiteliales CCT, producidas y secretadas por el sistema reproductor masculino, o producidas por el propio espermatozoide. Además, estas partículas son responsables de la aglutinación. Grützner et al27 informaron que las células epiteliales del epidídimo producen y secretan una proteína específica que es necesaria para la formación de tractos seminales de un solo poro. Los autores también informan que la dispersión de estos haces depende de la interacción de proteínas epididimarias. Nixon et al28 encontraron que los anexos secretan una proteína, la osteonectina ácida rica en cisteína; SPARC interviene en la formación de penachos de esperma en equidnas de pico corto y ornitorrincos. La dispersión de estos haces está asociada a la pérdida de esta proteína.
En el presente estudio, el análisis ultraestructural mediante microscopía electrónica mostró que los espermatozoides se adhirieron a una gran cantidad de material denso. Se cree que estas sustancias son responsables de la aglutinación que se condensa entre y alrededor de las cabezas adheridas, pero en concentraciones más bajas en la región de la cola. Suponemos que esta sustancia aglutinante se excreta del sistema reproductor masculino (epidídimo o conducto deferente) junto con el semen, ya que a menudo observamos que el semen se separa de la linfa y el plasma seminal durante la eyaculación. Se ha informado que, a medida que los espermatozoides aviares pasan por el epidídimo y el conducto deferente, experimentan cambios relacionados con la maduración que favorecen su capacidad para unirse a proteínas y adquirir glicoproteínas asociadas a la lema plasmática. La persistencia de estas proteínas en las membranas espermáticas residentes en el SST sugiere que estas proteínas pueden influir en la adquisición de la estabilidad de la membrana espermática 30 y determinar su fertilidad 31. Ahammad et al32 informaron que los espermatozoides obtenidos de varias partes del sistema reproductor masculino (desde los testículos hasta el conducto deferente distal) mostraron un aumento progresivo de la viabilidad en condiciones de almacenamiento líquido, independientemente de la temperatura de almacenamiento, y la viabilidad en pollos también aumenta en las trompas de Falopio después de la inseminación artificial.
Los mechones de esperma de los pollos Sharkashi tienen características y funciones diferentes a las de otras especies como equidnas, ornitorrincos, ratones de bosque, ratas ciervo y cobayas. En los pollos Sharkashi, la formación de haces de espermatozoides redujo su velocidad de natación en comparación con los espermatozoides individuales. Sin embargo, estos haces aumentaron el porcentaje de espermatozoides reológicamente positivos y mejoraron la capacidad de los espermatozoides para estabilizarse en un entorno dinámico. Por lo tanto, nuestros resultados confirman la sugerencia previa de que la aglutinación de espermatozoides en el SST está asociada con el almacenamiento de esperma a largo plazo. También planteamos la hipótesis de que la propensión de los espermatozoides a formar mechones puede controlar la tasa de pérdida de esperma en el SST, lo que podría alterar el resultado de la competencia espermática. Según esta suposición, los espermatozoides con baja capacidad de aglutinación liberan el SST primero, mientras que los espermatozoides con alta capacidad de aglutinación producen la mayor parte de la descendencia. La formación de haces de espermatozoides de poro único es beneficiosa y afecta la proporción progenitor-hijo, pero utiliza un mecanismo diferente. En los equidnas y ornitorrincos, los espermatozoides se disponen en paralelo para aumentar la velocidad de avance del haz. Los haces de espermatozoides en los equidnas se mueven aproximadamente tres veces más rápido que los espermatozoides individuales. Se cree que la formación de estos mechones de espermatozoides en los equidnas es una adaptación evolutiva para mantener la dominancia, ya que las hembras son promiscuas y suelen aparearse con varios machos. Por lo tanto, los espermatozoides de diferentes eyaculaciones compiten ferozmente por la fecundación del óvulo.
Los espermatozoides aglutinados de los pollos sharkasi son fáciles de visualizar usando microscopía de contraste de fase, lo que se considera ventajoso porque permite un estudio fácil del comportamiento de los espermatozoides in vitro. El mecanismo por el cual la formación del mechón de esperma promueve la reproducción en los pollos sharkasi también es diferente del que se observa en algunos mamíferos placentarios que representan un comportamiento cooperativo de los espermatozoides, como los ratones de bosque, donde algunos espermatozoides llegan a los huevos, ayudando a otros individuos relacionados a llegar y dañar sus huevos. para demostrar que eres. comportamiento altruista. Autofecundación 34. Otro ejemplo de comportamiento cooperativo en los espermatozoides se encontró en los ratones ciervo, donde los espermatozoides pudieron identificar y combinarse con los espermatozoides genéticamente más relacionados y formar grupos cooperativos para aumentar su velocidad en comparación con los espermatozoides no relacionados35.
Los resultados obtenidos en este estudio no contradicen la teoría de Foman sobre el almacenamiento a largo plazo de espermatozoides en el SST. Los investigadores informan que las células espermáticas continúan moviéndose en el flujo de células epiteliales que recubren el SST durante un período prolongado de tiempo, y después de cierto período de tiempo, las reservas de energía de las células espermáticas se agotan, lo que resulta en una disminución de la velocidad, lo que permite la expulsión de sustancias de bajo peso molecular. energía de los espermatozoides con el flujo de fluido desde el lumen del SST La cavidad de la trompa de Falopio. En el presente estudio, observamos que la mitad de los espermatozoides individuales mostraron la capacidad de nadar contra los fluidos en movimiento, y su adhesión en el haz aumentó su capacidad de mostrar reología positiva. Además, nuestros datos son consistentes con los de Matsuzaki et al. 1 quienes informaron que el aumento de la secreción de lactato en el SST puede inhibir la motilidad de los espermatozoides residentes. Sin embargo, nuestros resultados describen la formación de ligamentos móviles de espermatozoides y su comportamiento reológico en presencia de un entorno dinámico dentro de un microcanal, con el fin de dilucidar su comportamiento en SST. Investigaciones futuras podrían centrarse en determinar la composición química y el origen del agente aglutinante, lo que sin duda ayudará a los investigadores a desarrollar nuevas formas de almacenar semen líquido y aumentar la duración de la fertilidad.
Quince ejemplares machos de sharkasi de cuello desnudo de 30 semanas de edad (homocigotos dominantes; Na Na) fueron seleccionados como donantes de esperma en el estudio. Las aves fueron criadas en la Granja Avícola de Investigación de la Facultad de Agricultura de la Universidad de Ashit, Gobernación de Ashit, Egipto. Las aves fueron alojadas en jaulas individuales (30 x 40 x 40 cm), sometidas a un programa de luz (16 horas de luz y 8 horas de oscuridad) y alimentadas con una dieta que contenía 160 g de proteína bruta, 2800 kcal de energía metabolizable, 35 g de calcio cada una y 5 gramos de fósforo disponible por kilogramo de dieta.
Según los datos 36, ​​37, el semen se recolectó de machos mediante masaje abdominal. Se recolectaron un total de 45 muestras de semen de 15 hombres durante 3 días. El semen (n = 15/día) se diluyó inmediatamente 1:1 (v:v) con Belsville Poultry Semen Diluent, que contiene difosfato de potasio (1,27 g), glutamato monosódico monohidratado (0,867 g), fructosa (0,5 d), acetato de sodio anhidro (0,43 g), tris(hidroximetil)aminometano (0,195 g), citrato de potasio monohidratado (0,064 g), monofosfato de potasio (0,065 g), cloruro de magnesio (0,034 g) y H2O (100 ml), pH = 7, 5, osmolaridad 333 mOsm/kg38. Las muestras de semen diluidas se examinaron primero bajo un microscopio óptico para asegurar una buena calidad del semen (humedad) y luego se almacenaron en un baño de agua a 37 °C hasta su uso, dentro de la media hora posterior a la recolección.
La cinemática y la reología de los espermatozoides se describen utilizando un sistema de dispositivos microfluídicos. Las muestras de semen se diluyeron aún más a 1:40 en Beltsville Avian Semen Diluent, se cargaron en un dispositivo microfluídico (ver más abajo) y los parámetros cinéticos se determinaron utilizando un sistema de análisis de semen computarizado (CASA) desarrollado previamente para la caracterización microfluídica. sobre la movilidad de los espermatozoides en medios líquidos (Departamento de Ingeniería Mecánica, Facultad de Ingeniería, Universidad de Assiut, Egipto). El complemento se puede descargar en: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39. Se midieron la velocidad de curva (VCL, μm/s), la velocidad lineal (VSL, μm/s) y la velocidad de trayectoria promedio (VAP, μm/s). Se tomaron videos de espermatozoides usando un microscopio de contraste de fase invertido Optika XDS-3 (con objetivo de 40x) conectado a una cámara Tucson ISH1000 a 30 fps durante 3 s. Use el software CASA para estudiar al menos tres áreas y 500 trayectorias de espermatozoides por muestra. El video grabado se procesó usando un CASA casero. La definición de motilidad en el complemento CASA se basa en la velocidad de natación del espermatozoide en comparación con el caudal, y no incluye otros parámetros como el movimiento lateral, ya que se ha encontrado que este es más fiable en el flujo de fluidos. El movimiento reológico se describe como el movimiento de las células espermáticas en contra de la dirección del flujo de fluido. Los espermatozoides con propiedades reológicas se dividieron por el número de espermatozoides móviles; los espermatozoides que estaban en reposo y los espermatozoides que se movían convectivamente se excluyeron del recuento.
Todos los productos químicos utilizados se obtuvieron de Elgomhoria Pharmaceuticals (El Cairo, Egipto) a menos que se indique lo contrario. El dispositivo se fabricó como se describe en El-sherry et al. 40 con algunas modificaciones. Los materiales utilizados para fabricar los microcanales incluyeron placas de vidrio (Howard Glass, Worcester, MA), fotorresina negativa SU-8-25 (MicroChem, Newton, CA), alcohol diacetónico (Sigma Aldrich, Steinheim, Alemania) y poliacetona. -184, Dow Corning, Midland, Michigan). Los microcanales se fabrican utilizando litografía blanda. Primero, se imprimió una mascarilla protectora transparente con el diseño de microcanal deseado en una impresora de alta resolución (Prismatic, El Cairo, Egipto y Pacific Arts and Design, Markham, ON). Los maestros se hicieron utilizando placas de vidrio como sustratos. Las placas se limpiaron en acetona, isopropanol y agua desionizada y luego se recubrieron con una capa de 20 µm de SU8-25 mediante recubrimiento por centrifugación (3000 rpm, 1 min). Las capas de SU-8 se secaron suavemente (65 °C durante 2 minutos y 95 °C durante 10 minutos) y se expusieron a radiación UV durante 50 segundos. Tras la exposición, se hornearon a 65 °C y 95 °C durante 1 y 4 minutos, respectivamente, para reticular las capas de SU-8 expuestas, seguido de un revelado en alcohol diacetónico durante 6,5 minutos. Finalmente, se hornearon los waffles a 200 °C durante 15 minutos para solidificar aún más la capa de SU-8.
El PDMS se preparó mezclando el monómero y el endurecedor en una proporción de peso de 10:1, luego se desgasificó en un desecador al vacío y se vertió sobre el marco principal de SU-8. El PDMS se curó en un horno (120 °C, 30 min), luego se cortaron los canales, se separaron del molde y se perforaron para permitir la conexión de tubos en la entrada y la salida del microcanal. Finalmente, los microcanales de PDMS se fijaron permanentemente a portaobjetos de microscopio utilizando un procesador corona portátil (Electro-Technic Products, Chicago, IL), como se describe en otra publicación. El microcanal utilizado en este estudio mide 200 µm × 20 µm (ancho × alto) y tiene 3,6 cm de longitud.
El flujo de fluido inducido por la presión hidrostática dentro del microcanal se logra manteniendo el nivel de fluido en el depósito de entrada por encima de la diferencia de altura Δh39 en el depósito de salida (Fig. 1).
donde f es el coeficiente de fricción, definido como f = C/Re para flujo laminar en un canal rectangular, donde C es una constante que depende de la relación de aspecto del canal, L es la longitud del microcanal, Vav es la velocidad promedio dentro del microcanal, Dh es el diámetro hidráulico del canal, g es la aceleración de la gravedad. Usando esta ecuación, la velocidad promedio del canal se puede calcular usando la siguiente ecuación: