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La fertilité des oiseaux dépend de leur capacité à stocker suffisamment de spermatozoïdes viables pendant une période prolongée dans les tubules de stockage des spermatozoïdes (TSS). Le mécanisme exact par lequel les spermatozoïdes pénètrent dans les TSS, y séjournent et les quittent reste controversé. Les spermatozoïdes des poules sharkasi présentent une forte tendance à l'agglutination, formant des faisceaux filamenteux mobiles contenant de nombreuses cellules. La difficulté d'observer la motilité et le comportement des spermatozoïdes dans une trompe de Fallope opaque nous a conduits à utiliser un dispositif microfluidique dont la section transversale des microcanaux est similaire à celle des spermatozoïdes, afin d'étudier leur agglutination et leur motilité. Cette étude examine la formation des faisceaux de spermatozoïdes, leur déplacement et leur rôle potentiel dans la prolongation du séjour des spermatozoïdes dans les TSS. Nous avons étudié la vitesse et le comportement rhéologique des spermatozoïdes lorsqu'un flux de fluide était généré dans un canal microfluidique par pression hydrostatique (débit = 33 µm/s). Les spermatozoïdes ont tendance à nager à contre-courant (rhéologie positive) et la vitesse du faisceau de spermatozoïdes est significativement réduite par rapport à celle des spermatozoïdes isolés. On observe que les faisceaux de spermatozoïdes se déplacent en spirale et augmentent en longueur et en épaisseur à mesure que de nouveaux spermatozoïdes isolés y sont recrutés. On a observé des faisceaux de spermatozoïdes s'approcher et adhérer aux parois latérales des canaux microfluidiques pour éviter d'être emportés par une vitesse d'écoulement de fluide > 33 µm/s. On a observé des faisceaux de spermatozoïdes s'approcher et adhérer aux parois latérales des canaux microfluidiques pour éviter d'être emportés par une vitesse d'écoulement de fluide > 33 µm/s. Il est prévu que les spermatozoïdes s'utilisent et se propagent dans les canaux microscopiques pour permettre l'alimentation. со скоростью потока жидкости> 33 мкм / с. On a observé que les faisceaux de spermatozoïdes s'approchaient et adhéraient aux parois latérales des canaux microfluidiques pour éviter d'être emportés à des débits de fluide > 33 µm/s.33 µm/s 扫过。33 µm/s. Il est prévu que les spermatozoïdes puissent s'appliquer et se propager aux canaux microscopiques, ce qui permet d'utiliser le canal microscopique. потоком жидкости со скоростью > 33 мкм/с. On a observé que les faisceaux de spermatozoïdes s'approchaient et adhéraient aux parois latérales du canal microfluidique pour éviter d'être emportés par le flux de fluide à >33 µm/s.La microscopie électronique à balayage et à transmission a révélé que les faisceaux de spermatozoïdes étaient soutenus par une abondante matrice dense. Les données obtenues démontrent la mobilité exceptionnelle des spermatozoïdes de poulet Sharkazi, ainsi que leur capacité à s'agglutiner et à former des faisceaux mobiles, ce qui contribue à une meilleure compréhension de leur conservation à long terme dans le SMT.
Pour que la fécondation ait lieu chez l'humain et la plupart des animaux, les spermatozoïdes et les ovules doivent atteindre le site de fécondation au moment opportun. L'accouplement doit donc se produire avant ou au moment de l'ovulation. En revanche, certains mammifères, comme les chiens, ainsi que des espèces non mammifères, comme les insectes, les poissons, les reptiles et les oiseaux, stockent les spermatozoïdes dans leurs organes reproducteurs pendant une période prolongée, jusqu'à ce que leurs ovules soient prêts à être fécondés (fécondation asynchrone¹). Les oiseaux sont capables de maintenir la viabilité des spermatozoïdes aptes à féconder les ovules pendant 2 à 10 semaines².
Il s'agit d'une caractéristique unique qui distingue les oiseaux des autres animaux, car elle assure une forte probabilité de fécondation après une seule insémination pendant plusieurs semaines, sans accouplement ni ovulation simultanés. Le principal organe de stockage des spermatozoïdes, appelé tubule de stockage des spermatozoïdes (TSS), est situé dans les replis de la muqueuse interne à la jonction utéro-vaginale. À ce jour, les mécanismes par lesquels les spermatozoïdes pénètrent, séjournent et quittent ce « réservoir de spermatozoïdes » restent encore mal compris. De nombreuses hypothèses ont été formulées à partir d'études antérieures, mais aucune n'a été confirmée.
Forman⁴ a émis l'hypothèse que les spermatozoïdes se maintiennent dans la cavité du SST grâce à un mouvement oscillatoire continu à contre-courant du flux de fluide, à travers des canaux protéiques situés sur les cellules épithéliales du SST (rhéologie). L'ATP s'épuise en raison de l'activité flagellaire constante nécessaire au maintien des spermatozoïdes dans la lumière du SST, et leur mobilité diminue progressivement jusqu'à ce que les spermatozoïdes soient expulsés de la réserve spermatique par le flux de fluide et entament un nouveau voyage dans la trompe de Fallope ascendante pour féconder l'ovule (Forman⁴). Ce modèle de stockage des spermatozoïdes est étayé par la détection, par immunocytochimie, des aquaporines 2, 3 et 9 présentes dans les cellules épithéliales du SST. À ce jour, les études sur la rhéologie du sperme de poulet et son rôle dans le stockage dans le SST, la sélection vaginale des spermatozoïdes et la compétition spermatique sont insuffisantes. Chez les poulets, les spermatozoïdes pénètrent dans le vagin après l'accouplement naturel, mais plus de 80 % d'entre eux sont expulsés du vagin peu après. Ceci suggère que le vagin est le principal site de sélection des spermatozoïdes chez les oiseaux. De plus, il a été rapporté que moins de 1 % des spermatozoïdes fécondés dans le vagin atteignent les SST2. Lors de l'insémination artificielle de poussins dans le vagin, le nombre de spermatozoïdes atteignant les SST tend à augmenter 24 heures après l'insémination. À ce jour, le mécanisme de sélection des spermatozoïdes au cours de ce processus reste obscur, et leur mobilité pourrait jouer un rôle important dans leur absorption par les SST. En raison de l'épaisseur et de l'opacité des parois des trompes de Fallope, il est difficile d'observer directement la mobilité des spermatozoïdes dans ces trompes chez les oiseaux. Par conséquent, nos connaissances fondamentales sur la manière dont les spermatozoïdes transitent vers les SST après la fécondation sont lacunaires.
La rhéologie est désormais reconnue comme un facteur important du transport des spermatozoïdes dans les organes génitaux des mammifères. S'appuyant sur la capacité des spermatozoïdes mobiles à migrer à contre-courant, Zaferani et al.⁸ ont utilisé un système microfluidique Corra pour isoler passivement les spermatozoïdes mobiles à partir d'échantillons de sperme. Ce type de tri du sperme est essentiel pour le traitement médical de l'infertilité et la recherche clinique ; il est privilégié par rapport aux méthodes traditionnelles, longues et laborieuses, qui peuvent altérer la morphologie et l'intégrité structurale des spermatozoïdes. Cependant, à ce jour, aucune étude n'a été menée sur l'effet des sécrétions des organes génitaux de poulet sur la mobilité des spermatozoïdes.
Quel que soit le mécanisme de maintien des spermatozoïdes stockés dans le SST, de nombreux chercheurs ont observé que les spermatozoïdes résidents s'agglutinent tête-bêche dans le SST des poulets^9,10, des cailles² et des dindes¹¹ pour former des amas de spermatozoïdes. Les auteurs suggèrent un lien entre cette agglutination et le stockage à long terme des spermatozoïdes dans le SST.
Tingari et Lake¹² ont rapporté une forte association entre les spermatozoïdes dans la glande réceptrice du sperme chez le poulet et se sont interrogés sur la possibilité que les spermatozoïdes aviaires s'agglutinent de la même manière que les spermatozoïdes de mammifères. Ils suggèrent que les fortes connexions entre les spermatozoïdes dans le canal déférent pourraient être dues au stress engendré par la présence d'un grand nombre de spermatozoïdes dans un espace restreint.
Lors de l'observation du comportement des spermatozoïdes sur des lames de verre fraîchement suspendues, des signes transitoires d'agglutination sont visibles, notamment à la périphérie des gouttelettes de sperme. Cependant, l'agglutination est souvent perturbée par la rotation induite par le mouvement continu, ce qui explique le caractère transitoire de ce phénomène. Les chercheurs ont également constaté que l'ajout de diluant au sperme entraînait l'apparition d'agrégats cellulaires allongés, filiformes.
Les premières tentatives de simulation d'un spermatozoïde consistaient à retirer un fil fin d'une goutte suspendue, ce qui entraînait la formation d'une vésicule allongée, semblable à un spermatozoïde, faisant saillie de la goutte de sperme. Les spermatozoïdes s'alignaient immédiatement parallèlement à l'intérieur de la vésicule, mais l'ensemble disparaissait rapidement en raison des limitations tridimensionnelles. Par conséquent, pour étudier l'agglutination des spermatozoïdes, il est nécessaire d'observer directement leur motilité et leur comportement dans des tubules de stockage isolés, ce qui est difficile à réaliser. Il est donc nécessaire de développer un instrument mimant les spermatozoïdes afin de faciliter les études sur leur motilité et leur comportement d'agglutination. Brillard et al.¹³ ont rapporté que la longueur moyenne des tubules de stockage des spermatozoïdes chez les poussins adultes est de 400 à 600 µm, mais que certains peuvent atteindre 2000 µm. Mero et Ogasawara¹⁴ ont classé les glandes séminifères en tubules de stockage des spermatozoïdes dilatés et non dilatés. Ces tubules présentaient une longueur identique (environ 500 µm) et une largeur de col similaire (environ 38 µm), mais un diamètre moyen de la lumière de 56,6 µm pour les deux groupes et de 11,2 µm pour les deux groupes. Dans la présente étude, nous avons utilisé un dispositif microfluidique dont le canal mesure 200 µm × 20 µm (largeur × hauteur), une section transversale proche de celle du tubule séminifère amplifié. De plus, nous avons examiné la motilité et l'agglutination des spermatozoïdes dans un fluide en écoulement, ce qui corrobore l'hypothèse de Foreman selon laquelle le fluide produit par les cellules épithéliales du tubule séminifère maintient les spermatozoïdes dans la lumière du tubule, selon un mouvement à contre-courant (effet rhéologique).
Cette étude visait à surmonter les difficultés d'observation de la motilité des spermatozoïdes dans la trompe de Fallope et à éviter celles liées à l'étude de leur rhéologie et de leur comportement en milieu dynamique. Un dispositif microfluidique, créant une pression hydrostatique, a été utilisé pour simuler la motilité des spermatozoïdes dans les organes génitaux d'une poule.
Lorsqu'une goutte d'un échantillon de sperme dilué (1:40) a été introduite dans le dispositif à microcanaux, deux types de mobilité spermatique ont pu être identifiés (spermatozoïdes isolés et spermatozoïdes liés). De plus, les spermatozoïdes avaient tendance à nager à contre-courant (rhéologie positive ; vidéos 1 et 2). Bien que les faisceaux de spermatozoïdes aient une vitesse inférieure à celle des spermatozoïdes isolés (p < 0,001), ils ont augmenté le pourcentage de spermatozoïdes présentant une rhéotaxie positive (p < 0,001 ; Tableau 2). Bien que les faisceaux de spermatozoïdes aient une vitesse inférieure à celle des spermatozoïdes isolés (p < 0,001), ils ont augmenté le pourcentage de spermatozoïdes présentant une rhéotaxie positive (p < 0,001 ; Tableau 2). Les nombres de spermatozoïdes sont plus élevés que ceux des spermatozoïdes (p < 0,001), dont la proportion de spermatozoïdes est largement reconnue, демонстрирующих положительный реотаксис (p < 0,001 ; tableau 2). Bien que les faisceaux de spermatozoïdes aient une vitesse inférieure à celle des spermatozoïdes isolés (p < 0,001), ils ont augmenté le pourcentage de spermatozoïdes présentant une rhéotaxie positive (p < 0,001 ; Tableau 2).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度（p < 0,001），但它们增加了显示阳性流变性的精子百分比（p < 0,001；表2）。尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 （p <0.001） ， 但 增加 了 显示 阳性 流变性 精子百分比 （p <0,001 ； 2。。。。。。）））））） Le taux de spermatozoïdes est faible, c'est-à-dire que vous avez une forte proportion de spermatozoïdes (p < 0,001), dont la proportion de spermatozoïdes est très élevée. положительной реологией (p < 0,001 ; tableau 2). Bien que la vitesse des faisceaux de spermatozoïdes soit inférieure à celle des spermatozoïdes isolés (p < 0,001), ils augmentent le pourcentage de spermatozoïdes avec une rhéologie positive (p < 0,001 ; Tableau 2).La rhéologie positive pour les spermatozoïdes isolés et les touffes est estimée à environ 53 % et 85 %, respectivement.
Il a été observé que les spermatozoïdes des poulets sharkashi forment, immédiatement après l'éjaculation, des faisceaux linéaires composés de plusieurs dizaines d'individus. Ces amas augmentent en longueur et en épaisseur au fil du temps et peuvent persister in vitro pendant plusieurs heures avant de se dissiper (vidéo 3). Ces faisceaux filamenteux ont une forme similaire à celle des spermatozoïdes d'échidné qui se forment à l'extrémité de l'épididyme. Le sperme de la poule sharkashi présente une forte tendance à s'agglutiner et à former un faisceau réticulé en moins d'une minute après la collecte. Ces faisceaux sont dynamiques et peuvent adhérer aux parois ou objets immobiles environnants. Bien que les faisceaux de spermatozoïdes ralentissent les spermatozoïdes, il est clair qu'à l'échelle macroscopique, ils augmentent leur linéarité. La longueur des faisceaux varie en fonction du nombre de spermatozoïdes qui les composent. Deux parties du faisceau ont été isolées : la partie initiale, comprenant la tête libre du spermatozoïde agglutiné, et la partie terminale, comprenant la queue et l'extrémité distale complète du spermatozoïde. À l'aide d'une caméra haute vitesse (950 images/seconde), on a observé, dans la partie initiale du faisceau, des têtes libres de spermatozoïdes agglutinés. Ces têtes, responsables du mouvement du faisceau par leur déplacement oscillatoire, entraînent les autres spermatozoïdes à l'intérieur par un mouvement hélicoïdal (Vidéo 4). Cependant, dans les longs faisceaux, on a observé que certaines têtes de spermatozoïdes libres adhéraient au corps et à la partie terminale du faisceau, agissant comme des ailerons pour contribuer à sa propulsion.
Dans un courant lent, les faisceaux de spermatozoïdes se déplacent parallèlement les uns aux autres. Cependant, ils commencent à se chevaucher et à adhérer aux surfaces immobiles afin de ne pas être emportés par le courant lorsque sa vitesse augmente. Ces faisceaux se forment lorsqu'un petit nombre de spermatozoïdes se rapprochent, se déplacent de manière synchrone, s'enroulent les uns autour des autres et adhèrent à une substance collante. Les figures 1 et 2 illustrent comment les spermatozoïdes se rapprochent et forment une jonction lorsque leurs flagelles s'enroulent l'un autour de l'autre.
Les chercheurs ont appliqué une pression hydrostatique pour créer un écoulement de fluide dans un microcanal afin d'étudier la rhéologie des spermatozoïdes. Un microcanal de 200 µm × 20 µm (largeur × hauteur) et de 3,6 µm de longueur a été utilisé. Les microcanaux étaient placés entre des récipients munis de seringues à leurs extrémités. Un colorant alimentaire a été utilisé pour rendre les canaux plus visibles.
Fixez les câbles d'interconnexion et les accessoires à la paroi. La vidéo a été enregistrée à l'aide d'un microscope à contraste de phase. Chaque image présente des images de microscopie à contraste de phase et de cartographie. (A) La connexion entre deux flux oppose une résistance à l'écoulement en raison d'un mouvement hélicoïdal (flèche rouge). (B) La connexion entre le faisceau tubulaire et la paroi du canal (flèches rouges) est établie, ces faisceaux étant simultanément connectés à deux autres faisceaux (flèches jaunes). (C) Les faisceaux de spermatozoïdes présents dans le canal microfluidique commencent à se connecter entre eux (flèches rouges), formant un réseau. (D) Formation d'un réseau de faisceaux de spermatozoïdes.
Lorsqu'une goutte de sperme dilué a été introduite dans le dispositif microfluidique et qu'un flux a été créé, on a observé que le faisceau de spermatozoïdes se déplaçait à contre-courant. Les amas de spermatozoïdes épousent parfaitement les parois des microcanaux, et les têtes libres de leur partie initiale s'y agrippent également (vidéo 5). Ils adhèrent aussi aux particules stationnaires sur leur passage, comme les débris, pour résister au courant. Au fil du temps, ces touffes se transforment en longs filaments piégeant d'autres spermatozoïdes isolés et en touffes plus courtes (vidéo 6). Lorsque le flux ralentit, de longs filaments de spermatozoïdes forment un réseau (vidéo 7 ; figure 2).
À une vitesse d'écoulement élevée (V > 33 µm/s), les mouvements en spirale des filaments augmentent dans le but de capturer de nombreux spermatozoïdes individuels formant des faisceaux qui résistent mieux à la force de dérive du flux. À une vitesse d'écoulement élevée (V > 33 µm/s), les mouvements en spirale des filaments augmentent dans le but de capturer de nombreux spermatozoïdes individuels formant des faisceaux qui résistent mieux à la force de dérive du flux. Si votre puissance est élevée (V > 33 mcm/s), la durée d'utilisation de la spirale est supérieure à 33 mcm/s. Les spermatozoïdes, les poches de contact, les produits de votre vie quotidienne. À des débits élevés (V > 33 µm/s), les mouvements hélicoïdaux des brins augmentent car ils tentent d'attraper de nombreux spermatozoïdes individuels formant des faisceaux mieux capables de résister à la force de dérive du flux.在高流速(V > 33 µm/s)时，螺纹的螺旋运动增加，以试图捕捉许多形成束的单个精子，从而更好地抵抗流动的漂移力。在 高 流速 (v> 33 µm/s) 时 ， 的 螺旋 运动 增加 ， 以 试图 许多 形成 束 单 个 精子 ， 从而 更地 抵抗 的 漂移力。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 Lors de votre consommation de puissance (V > 33 µm/s), une légère poussée en spirale s'applique à la plupart des autres utilisateurs. les spermatozoïdes, les poches qui s'occupent de la peau. À des débits élevés (V > 33 µm/s), le mouvement hélicoïdal des filaments augmente dans une tentative de capturer de nombreux spermatozoïdes individuels formant des faisceaux pour mieux résister aux forces de dérive du flux.Ils ont également essayé de fixer des microcanaux aux parois latérales.
Les faisceaux de spermatozoïdes ont été identifiés comme des amas de têtes de spermatozoïdes et de flagelles enroulés par microscopie optique (MO). Des faisceaux de spermatozoïdes présentant divers agrégats ont également été identifiés par microscopie électronique à transmission (MET) : têtes torsadées et agrégats flagellaires, flagelles multiples fusionnés, têtes de spermatozoïdes attachées à un flagelle, et têtes de spermatozoïdes à noyaux courbés (noyaux multiples fusionnés). La microscopie électronique à balayage (MEB) a révélé que les faisceaux de spermatozoïdes étaient des agrégats de têtes de spermatozoïdes gainés, ces agrégats présentant un réseau de flagelles enroulés.
La morphologie et l'ultrastructure des spermatozoïdes, la formation de faisceaux de spermatozoïdes ont été étudiées à l'aide de la microscopie optique (demi-section), de la microscopie électronique à balayage (MEB) et de la microscopie électronique à transmission (MET), les frottis de sperme ont été colorés à l'orange d'acridine et examinés à l'aide de la microscopie à épifluorescence.
La coloration des frottis de sperme à l'orange d'acridine (Fig. 3B) a révélé que les têtes des spermatozoïdes étaient agglutinées et recouvertes de sécrétions, formant ainsi de larges amas (Fig. 3D). Ces amas étaient constitués de spermatozoïdes reliés par un réseau de flagelles (Fig. 4A-C). Ils étaient composés des flagelles de nombreux spermatozoïdes agglutinés (Fig. 4D). Les sécrétions (Fig. 4E,F) recouvraient les têtes des spermatozoïdes agglutinés.
Formation du faisceau de spermatozoïdes : L’observation au microscope à contraste de phase et sur des frottis de sperme colorés à l’orange d’acridine a révélé que les têtes des spermatozoïdes s’agglutinent. (A) La formation précoce du faisceau de spermatozoïdes débute avec un spermatozoïde (cercle blanc) et trois spermatozoïdes (cercle jaune), la spirale partant de la queue et se terminant à la tête. (B) Photomicrographie d’un frottis de sperme coloré à l’orange d’acridine montrant des têtes de spermatozoïdes adhérentes (flèches). Le liquide séminal recouvre la ou les têtes. Grossissement : × 1000. (C) Développement d’un faisceau important transporté par un flux dans un canal microfluidique (à l’aide d’une caméra haute vitesse à 950 images/s). (D) Micrographie d’un frottis de sperme coloré à l’orange d’acridine montrant de larges faisceaux (flèches). Grossissement : × 200.
Micrographie électronique à balayage d'un faisceau de spermatozoïdes et d'un frottis de spermatozoïdes coloré à l'orange d'acridine. (A, B, D, E) sont des micrographies électroniques à balayage couleur numériques de spermatozoïdes, et C et F sont des micrographies de frottis de spermatozoïdes colorés à l'orange d'acridine montrant l'attachement de plusieurs spermatozoïdes enroulant la membrane caudale. (AC) Les agrégats de spermatozoïdes sont représentés comme un réseau de flagelles attachés (flèches). (D) Adhésion de plusieurs spermatozoïdes (avec substance adhésive, contour rose, flèche) enroulés autour du flagelle. (E et F) Agrégats de têtes de spermatozoïdes (pointeurs) recouverts de substance adhésive (pointeurs). Les spermatozoïdes forment des faisceaux avec plusieurs structures en forme de vortex (F). (C) ×400 et (F) ×200.
L’observation au microscope électronique à transmission a révélé que les faisceaux de spermatozoïdes présentaient des flagelles (Fig. 6A, C), des têtes attachées à des flagelles (Fig. 6B) ou des têtes attachées à des flagelles (Fig. 6D). Les têtes des spermatozoïdes au sein du faisceau sont incurvées et présentent, en coupe transversale, deux régions nucléaires (Fig. 6D). Dans le faisceau incisé, les spermatozoïdes présentaient une tête torsadée avec deux régions nucléaires et plusieurs régions flagellaires (Fig. 5A).
Micrographie électronique numérique en couleur montrant les flagelles connectés au sein du faisceau de spermatozoïdes et le matériel d'agglutination reliant les têtes des spermatozoïdes. (A) Flagelles attachées d'un grand nombre de spermatozoïdes. Observez l'aspect des flagelles en projection portrait (flèche) et paysage (flèche). (B) La tête (flèche) du spermatozoïde est reliée à son flagelle (flèche). (C) Plusieurs flagelles de spermatozoïdes (flèches) sont attachés. (D) Le matériel d'agglutination (AS, bleu) relie quatre têtes de spermatozoïdes (violet).
La microscopie électronique à balayage a permis de détecter les têtes de spermatozoïdes au sein de faisceaux recouverts de sécrétions ou de membranes (Figure 6B), indiquant que ces faisceaux étaient ancrés par du matériel extracellulaire. Ce matériel agglutiné était concentré dans la tête du spermatozoïde (assemblage ressemblant à une tête de méduse ; Fig. 5B) et s’étendait distalement, présentant une coloration jaune vif en microscopie à fluorescence après coloration à l’orange d’acridine (Fig. 6C). Cette substance, clairement visible au microscope électronique à balayage, est considérée comme un liant. Les coupes semi-fines (Fig. 5C) et les frottis de spermatozoïdes colorés à l’orange d’acridine ont révélé des faisceaux de spermatozoïdes contenant des têtes densément regroupées et des flagelles enroulés (Fig. 5D).
Diverses photomicrographies illustrant l'agrégation des têtes et des flagelles repliés des spermatozoïdes, obtenues par différentes méthodes. (A) Micrographie électronique à transmission en couleur, coupe transversale d'un faisceau de spermatozoïdes montrant une tête enroulée avec un noyau bilobé (bleu) et plusieurs segments flagellaires (vert). (B) Micrographie électronique à balayage en couleur montrant un amas de têtes de spermatozoïdes à l'aspect de méduse (flèches), semblant recouvertes. (C) Coupe semi-fine montrant des têtes de spermatozoïdes agrégées (flèches) et des flagelles enroulés (flèches). (D) Micrographie d'un frottis de sperme coloré à l'orange d'acridine montrant des agrégats de têtes de spermatozoïdes (flèches) et des flagelles adhérents enroulés (flèches). Noter la présence d'une substance collante (S) recouvrant la tête du spermatozoïde. (D) Grossissement × 1000.
En utilisant la microscopie électronique à transmission (Fig. 7A), on a également noté que les têtes des spermatozoïdes étaient tordues et que les noyaux avaient une forme en spirale, comme confirmé par les frottis de sperme colorés à l'orange d'acridine et examinés à l'aide de la microscopie à fluorescence (Fig. 7B).
(A) Micrographie électronique à transmission en couleur numérique et (B) frottis de sperme coloré à l'orange d'acridine montrant les têtes enroulées et l'attachement des têtes et des flagelles des spermatozoïdes (flèches). (B) Grossissement × 1000.
Une découverte intéressante est que les spermatozoïdes de Sharkazi s'agrègent pour former des faisceaux filamenteux mobiles. Les propriétés de ces faisceaux nous permettent de comprendre leur rôle potentiel dans l'absorption et le stockage des spermatozoïdes dans le SST.
Après l'accouplement, les spermatozoïdes pénètrent dans le vagin et subissent une sélection rigoureuse, ne laissant qu'un nombre limité d'entre eux atteindre le SST^15,16. À ce jour, les mécanismes d'entrée et de sortie des spermatozoïdes du SST restent mal compris. Chez les volailles, les spermatozoïdes sont stockés dans le SST pendant une période prolongée de 2 à 10 semaines, selon l'espèce⁶. L'état du sperme durant ce stockage fait encore débat. Les spermatozoïdes sont-ils en mouvement ou immobiles ? Autrement dit, comment maintiennent-ils leur position dans le SST pendant une durée aussi longue ?
Forman⁴ a suggéré que la résidence et l'éjection des spermatozoïdes dans le SST pourraient s'expliquer par leur motilité. Les auteurs émettent l'hypothèse que les spermatozoïdes maintiennent leur position en nageant à contre-courant du fluide créé par l'épithélium du SST et qu'ils sont éjectés du SST lorsque leur vitesse chute en dessous du seuil à partir duquel ils commencent à reculer par manque d'énergie. Zaniboni⁵ a confirmé la présence d'aquaporines 2, 3 et 9 dans la portion apicale des cellules épithéliales du SST, ce qui pourrait indirectement étayer le modèle de stockage des spermatozoïdes de Forman. Dans la présente étude, nous avons constaté que près de la moitié des spermatozoïdes de Sharkashi présentent une rhéologie positive dans le fluide en mouvement et que les amas de spermatozoïdes agglutinés augmentent le nombre de spermatozoïdes présentant une rhéologie positive, bien que l'agglutination les ralentisse. Le mécanisme de la migration des spermatozoïdes dans la trompe de Fallope de l'oiseau jusqu'au site de fécondation reste encore mal compris. Chez les mammifères, le liquide folliculaire exerce une chimioattraction sur les spermatozoïdes. Cependant, on pense que les chimioattractants dirigent les spermatozoïdes sur de longues distances⁷. Par conséquent, d'autres mécanismes sont responsables du transport des spermatozoïdes. La capacité des spermatozoïdes à s'orienter et à remonter le courant du liquide tubaire libéré après l'accouplement est considérée comme un facteur majeur de leur ciblage chez la souris. Parker¹⁷ a suggéré que, chez les oiseaux et les reptiles, les spermatozoïdes traversent les oviductes en nageant à contre-courant ciliaire. Bien que cela n'ait pas été démontré expérimentalement chez les oiseaux, Adolphi¹⁸ a été le premier à observer que les spermatozoïdes aviaires donnent des résultats positifs lorsqu'une fine couche de liquide est créée entre une lamelle et une lame à l'aide d'une bande de papier filtre. Rhéologie. Hino et Yanagimachi¹⁹ ont placé un complexe ovaire-tubaire-utérin de souris dans un anneau de perfusion et ont injecté 1 µl d'encre dans l'isthme pour visualiser le flux de liquide dans les trompes de Fallope. Ils ont observé un mouvement de contraction et de relaxation très actif dans la trompe, où toutes les billes d'encre se déplaçaient régulièrement vers l'ampoule de la trompe. Les auteurs soulignent l'importance du flux de fluide tubaire des trompes de Fallope inférieures vers les supérieures pour la remontée des spermatozoïdes et la fécondation. Brillard²⁰ a rapporté que chez les poulets et les dindes, les spermatozoïdes migrent activement de l'entrée du vagin, où ils sont stockés, jusqu'à la jonction utéro-vaginale, où ils sont également stockés. Cependant, ce mouvement n'est pas nécessaire entre la jonction utéro-vaginale et l'infundibulum, car les spermatozoïdes y sont transportés par déplacement passif. Compte tenu de ces recommandations antérieures et des résultats obtenus dans la présente étude, on peut supposer que la capacité des spermatozoïdes à remonter le flux (rhéologie) est l'une des propriétés sur lesquelles repose le processus de sélection. Ceci détermine le passage des spermatozoïdes à travers le vagin et leur entrée dans le tube contourné commun (TCC) pour leur stockage. Comme l'a suggéré Forman⁴, cela pourrait également faciliter l'entrée des spermatozoïdes dans le tube séminal et leur séjour temporaire, puis leur sortie lorsque leur vitesse commence à diminuer.
Par ailleurs, Matsuzaki et Sasanami²¹ ont suggéré que les spermatozoïdes aviaires subissent des modifications de leur motilité, passant de la dormance à la mobilité dans les voies génitales mâles et femelles. L'inhibition de la motilité des spermatozoïdes résidents dans le SST a été proposée pour expliquer la longue durée de stockage des spermatozoïdes, puis leur rajeunissement après leur sortie du SST. En conditions hypoxiques, Matsuzaki et al.¹ ont rapporté une forte production et libération de lactate dans le SST, ce qui pourrait inhiber la motilité des spermatozoïdes résidents. Dans ce cas, l'importance de la rhéologie des spermatozoïdes se manifeste dans leur sélection et leur absorption, et non dans leur stockage.
Le mode d'agglutination des spermatozoïdes est considéré comme une explication plausible de la longue durée de conservation du sperme dans le tube séminal, car il s'agit d'un mode de rétention spermatique courant chez les volailles^2,22,23. Bakst et al.² ont observé que la plupart des spermatozoïdes adhéraient les uns aux autres, formant des agrégats fasciculés, et que les spermatozoïdes isolés étaient rarement observés dans le liquide céphalo-rachidien de la caille. En revanche, Wen et al.²⁴ ont observé des spermatozoïdes plus dispersés et moins de touffes de spermatozoïdes dans la lumière du tube séminal chez les poulets. D'après ces observations, on peut supposer que la propension à l'agglutination des spermatozoïdes diffère selon les oiseaux et entre les spermatozoïdes d'un même éjaculat. De plus, Van Krey et al.⁹ ont suggéré que la dissociation aléatoire des spermatozoïdes agglutinés est responsable de la pénétration progressive des spermatozoïdes dans la lumière de la trompe de Fallope. Selon cette hypothèse, les spermatozoïdes ayant la plus faible capacité d'agglutination seraient expulsés du tube séminal en premier. Dans ce contexte, la capacité des spermatozoïdes à s'agglutiner pourrait influencer l'issue de la compétition spermatique chez les oiseaux exposés à des conditions d'hygiène déplorables. De plus, plus la dissociation des spermatozoïdes agglutinés se prolonge, plus la fertilité est maintenue.
Bien que l'agrégation des spermatozoïdes et leur regroupement en faisceaux aient été observés dans plusieurs études^2,22,24, leur description détaillée reste limitée en raison de la complexité de leur observation cinématique au sein du SST. Plusieurs tentatives ont été menées pour étudier l'agglutination des spermatozoïdes in vitro. Une agrégation importante, mais transitoire, a été observée lors du retrait du fil fin de la goutte de sperme suspendue. Ceci a conduit à la formation d'une bulle allongée imitant la glande séminale. En raison des limitations 3D et des temps de séchage courts, le bloc s'est rapidement dégradé⁹. Dans la présente étude, utilisant des poulets Sharkashi et des puces microfluidiques, nous avons pu décrire la formation et le mouvement de ces amas. Les faisceaux de spermatozoïdes se forment immédiatement après la collecte du sperme et se déplacent en spirale, présentant une rhéologie positive en présence du flux. De plus, observés macroscopiquement, les faisceaux de spermatozoïdes présentent une linéarité de motilité accrue par rapport aux spermatozoïdes isolés. Ceci suggère que l'agglutination des spermatozoïdes pourrait se produire avant la pénétration du SST et que la production de spermatozoïdes n'est pas limitée à une petite zone sous l'effet du stress, contrairement à ce qui avait été suggéré précédemment (Tingari et Lake¹²). Lors de la formation du faisceau, les spermatozoïdes nagent de manière synchrone jusqu'à former une jonction, puis leurs flagelles s'enroulent l'un autour de l'autre. La tête du spermatozoïde reste libre, tandis que le flagelle et la partie distale adhèrent grâce à une substance collante. Ainsi, la tête libre du ligament est responsable du mouvement, entraînant le reste du ligament. L'observation des faisceaux de spermatozoïdes au microscope électronique à balayage a révélé des têtes de spermatozoïdes recouvertes d'une grande quantité de substance collante, suggérant que les têtes étaient agrégées en faisceaux de repos, probablement après avoir atteint le site de stockage (SST).
Lorsqu'un frottis de sperme est coloré à l'orange d'acridine, la substance adhésive extracellulaire entourant les spermatozoïdes devient visible au microscope à fluorescence. Cette substance permet aux amas de spermatozoïdes d'adhérer aux surfaces ou particules environnantes et de s'y fixer, les empêchant ainsi d'être emportés par le courant. Nos observations mettent donc en évidence le rôle de l'adhésion des spermatozoïdes sous forme d'amas mobiles. Leur capacité à nager à contre-courant et à adhérer aux surfaces voisines leur permet de prolonger leur séjour dans le milieu de culture.
Rothschild²⁵ a utilisé une caméra d'hémocytométrie pour étudier la distribution en suspension du sperme bovin dans une goutte, en prenant des photomicrographies grâce à un microscope à axes optiques vertical et horizontal. Les résultats ont montré que les spermatozoïdes étaient attirés par la surface de la chambre. Les auteurs suggèrent l'existence d'interactions hydrodynamiques entre les spermatozoïdes et cette surface. Compte tenu de ce phénomène, et de la capacité du sperme de poulet Sharkashi à former des amas collants, la probabilité que le sperme adhère à la paroi du récipient de stockage de sperme (SST) et y soit conservé pendant de longues périodes pourrait être accrue.
Bccetti et Afzeliu26 ont rapporté que le glycocalyx des spermatozoïdes est nécessaire à la reconnaissance et à l'agglutination des gamètes. Forman10 a observé que l'hydrolyse des liaisons α-glycosidiques des revêtements glycoprotéiques-glycolipidiques par traitement du sperme aviaire à la neuraminidase entraînait une réduction de la fertilité sans affecter la mobilité des spermatozoïdes. Les auteurs suggèrent que l'effet de la neuraminidase sur le glycocalyx perturbe la séquestration des spermatozoïdes à la jonction utéro-vaginale, réduisant ainsi la fertilité. Leurs observations ne permettent pas d'exclure la possibilité que le traitement à la neuraminidase puisse réduire la reconnaissance des spermatozoïdes par les ovocytes. Forman et Engel10 ont constaté une réduction de la fertilité chez les poules inséminées par voie intravaginale avec du sperme traité à la neuraminidase. Cependant, la fécondation in vitro (FIV) avec du sperme traité à la neuraminidase n'a pas affecté la fertilité par rapport aux poules témoins. Les auteurs ont conclu que les modifications du revêtement glycoprotéique-glycolipidique autour de la membrane du spermatozoïde réduisaient la capacité de fécondation des spermatozoïdes en altérant leur séquestration au niveau de la jonction utéro-vaginale, ce qui augmentait la perte de spermatozoïdes en raison de la rapidité de la jonction utéro-vaginale, mais n'affectaient pas la reconnaissance des spermatozoïdes et des ovules.
Chez la dinde, Bakst et Bauchan¹¹ ont découvert de petites vésicules et des fragments de membrane dans la lumière du canal séminal à pore unique (SST) et ont observé que certains de ces granules avaient fusionné avec la membrane du spermatozoïde. Les auteurs suggèrent que ces interactions pourraient contribuer au stockage à long terme des spermatozoïdes dans le SST. Cependant, les chercheurs n'ont pas précisé l'origine de ces particules : sont-elles sécrétées par les cellules épithéliales du canal séminal commun (CCT), produites et sécrétées par l'appareil reproducteur mâle, ou produites par le spermatozoïde lui-même ? De plus, ces particules sont responsables de l'agglutination. Grützner et al.²⁷ ont rapporté que les cellules épithéliales de l'épididyme produisent et sécrètent une protéine spécifique nécessaire à la formation des canaux séminaux à pore unique. Les auteurs indiquent également que la dispersion de ces faisceaux dépend de l'interaction des protéines épididymaires. Nixon et al.²⁸ ont découvert que les annexes sécrètent une protéine, l'ostéonectine, une protéine acide riche en cystéine. La protéine SPARC intervient dans la formation des touffes de spermatozoïdes chez les échidnés à nez court et les ornithorynques. La dispersion de ces faisceaux est liée à la perte de cette protéine.
Dans la présente étude, l'analyse ultrastructurale par microscopie électronique a révélé que les spermatozoïdes adhéraient à une grande quantité de matériel dense. Ces substances seraient responsables de l'agglutination qui se condense entre et autour des têtes adhérentes, mais à des concentrations plus faibles dans la région caudale. Nous supposons que cette substance agglutinante est excrétée par l'appareil reproducteur mâle (épididyme ou canal déférent) avec le sperme, car nous observons fréquemment une séparation du sperme de la lymphe et du plasma séminal lors de l'éjaculation. Il a été rapporté que, lors de leur passage dans l'épididyme et le canal déférent, les spermatozoïdes aviaires subissent des modifications liées à leur maturation, qui favorisent leur capacité à se lier aux protéines et à acquérir des glycoprotéines associées à la membrane plasmique. La persistance de ces protéines sur les membranes des spermatozoïdes résidents dans le SST suggère que ces protéines pourraient influencer l'acquisition de la stabilité membranaire des spermatozoïdes³⁰ et déterminer leur fertilité³¹. Ahammad et al32 ont rapporté que les spermatozoïdes obtenus à partir de diverses parties du système reproducteur masculin (des testicules au canal déférent distal) montraient une augmentation progressive de la viabilité dans des conditions de stockage liquide, quelle que soit la température de stockage, et que la viabilité chez les poulets augmente également dans les trompes de Fallope après insémination artificielle.
Les amas de spermatozoïdes du poulet sharkashi présentent des caractéristiques et des fonctions différentes de celles observées chez d'autres espèces comme l'échidné, l'ornithorynque, le mulot sylvestre, le rat sylvestre et le cobaye. Chez le poulet sharkashi, la formation d'amas de spermatozoïdes réduit leur vitesse de nage par rapport aux spermatozoïdes isolés. Cependant, ces amas augmentent le pourcentage de spermatozoïdes rhéologiquement positifs et leur capacité à se stabiliser dans un environnement dynamique. Nos résultats confirment donc l'hypothèse selon laquelle l'agglutination des spermatozoïdes dans le SST est associée à leur stockage à long terme. Nous formulons également l'hypothèse que la propension des spermatozoïdes à former des amas pourrait contrôler le taux de perte de spermatozoïdes dans le SST, ce qui pourrait influencer l'issue de la compétition spermatique. Selon cette hypothèse, les spermatozoïdes à faible capacité d'agglutination seraient libérés du SST en premier, tandis que ceux à forte capacité d'agglutination seraient à l'origine de la majorité des descendants. La formation d'amas de spermatozoïdes à pore unique est bénéfique et influence le ratio parent-enfant, mais selon un mécanisme différent. Chez les échidnés et les ornithorynques, les spermatozoïdes sont disposés parallèlement les uns aux autres afin d'augmenter la vitesse de leur jet. Les amas de spermatozoïdes chez les échidnés se déplacent environ trois fois plus vite que les spermatozoïdes isolés. On pense que la formation de ces touffes de spermatozoïdes chez les échidnés est une adaptation évolutive leur permettant de maintenir leur dominance, car les femelles sont polygames et s'accouplent généralement avec plusieurs mâles. Ainsi, les spermatozoïdes issus de différents éjaculats se livrent à une compétition acharnée pour la fécondation de l'ovule.
Les spermatozoïdes agglutinés des poulets sharkasi sont facilement visualisables par microscopie à contraste de phase, ce qui est avantageux car cela facilite l'étude du comportement des spermatozoïdes in vitro. Le mécanisme par lequel la formation de touffes de spermatozoïdes favorise la reproduction chez les poulets sharkasi diffère également de celui observé chez certains mammifères placentaires présentant un comportement coopératif, comme les mulots sylvestres, où certains spermatozoïdes atteignent les œufs, aidant d'autres individus apparentés à les atteindre et à les endommager. Ce comportement altruiste, appelé autofécondation, constitue une autre forme de coopération chez les spermatozoïdes. Un autre exemple de coopération a été observé chez les souris sylvestres, où les spermatozoïdes sont capables d'identifier et de s'associer aux spermatozoïdes les plus proches génétiquement pour former des groupes coopératifs et ainsi augmenter leur vitesse par rapport aux spermatozoïdes non apparentés.
Les résultats obtenus dans cette étude ne contredisent pas la théorie de Foman concernant le stockage à long terme des spermatozoïdes dans le liquide de sphincter inférieur de l'œsophage (LSI). Les chercheurs rapportent que les spermatozoïdes continuent de se déplacer dans le flux des cellules épithéliales tapissant le LSI pendant une période prolongée. Après un certain temps, leurs réserves énergétiques s'épuisent, entraînant une diminution de leur vitesse et l'expulsion de substances de faible poids moléculaire. Cette énergie est libérée par le flux de fluide provenant de la lumière du LSI, la cavité de la trompe de Fallope. Dans cette étude, nous avons observé que la moitié des spermatozoïdes isolés étaient capables de nager à contre-courant et que leur adhésion en faisceau augmentait leur capacité à présenter une rhéologie positive. De plus, nos données concordent avec celles de Matsuzaki et al.¹, qui ont rapporté qu'une augmentation de la sécrétion de lactate dans le LSI pourrait inhiber la motilité des spermatozoïdes résidents. Nos résultats décrivent la formation de ligaments mobiles de spermatozoïdes et leur comportement rhéologique en présence d'un environnement dynamique au sein d'un microcanal, dans le but d'élucider leur comportement dans le LSI. Les recherches futures pourraient se concentrer sur la détermination de la composition chimique et de l'origine de l'agent agglutinant, ce qui aidera sans aucun doute les chercheurs à développer de nouvelles méthodes de conservation du sperme liquide et à augmenter la durée de la fertilité.
Quinze mâles sharkasi à cou nu (homozygotes dominants ; Na Na) âgés de 30 semaines ont été sélectionnés comme donneurs de sperme pour cette étude. Les oiseaux ont été élevés à la ferme avicole expérimentale de la Faculté d’agriculture de l’Université d’Ashit, dans le gouvernorat d’Ashit, en Égypte. Ils étaient logés individuellement en cages (30 × 40 × 40 cm), soumis à un cycle lumineux de 16 heures de lumière et 8 heures d’obscurité, et nourris avec un aliment contenant 160 g de protéines brutes, 2 800 kcal d’énergie métabolisable, 35 g de calcium et 5 g de phosphore disponible par kilogramme d’aliment.
D'après les données 36 et 37, le sperme a été recueilli chez des mâles par massage abdominal. Au total, 45 échantillons de sperme ont été collectés auprès de 15 mâles sur une période de 3 jours. Le sperme (n = 15/jour) a été immédiatement dilué à 1:1 (v/v) avec le diluant pour sperme de volaille Belsville, contenant du diphosphate de potassium (1,27 g), du glutamate monosodique monohydraté (0,867 g), du fructose (0,5 g), de l'acétate de sodium anhydre (0,43 g), du tris(hydroxyméthyl)aminométhane (0,195 g), du citrate de potassium monohydraté (0,064 g), du monophosphate de potassium (0,065 g), du chlorure de magnésium (0,034 g) et de l'eau (100 ml), à un pH de 7,5 et une osmolarité de 333 mOsm/kg. Les échantillons de sperme dilués ont d'abord été examinés au microscope optique pour s'assurer de leur bonne qualité (humidité), puis conservés dans un bain-marie à 37 °C jusqu'à leur utilisation dans la demi-heure suivant la collecte.
La cinématique et la rhéologie des spermatozoïdes sont décrites à l'aide d'un système de dispositifs microfluidiques. Les échantillons de sperme ont été dilués au 1/40e dans le diluant pour sperme aviaire de Beltsville, chargés dans un dispositif microfluidique (voir ci-dessous), et les paramètres cinétiques ont été déterminés grâce au système d'analyse informatisée du sperme (CASA), développé précédemment pour la caractérisation microfluidique. Ce système étudie la mobilité des spermatozoïdes en milieu liquide (Département de génie mécanique, Faculté d'ingénierie, Université d'Assiout, Égypte). Le plugin est disponible en téléchargement à l'adresse : http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39. La vitesse de courbure (VCL, μm/s), la vitesse linéaire (VSL, μm/s) et la vitesse moyenne de la trajectoire (VAP, μm/s) ont été mesurées. Des vidéos de spermatozoïdes ont été enregistrées à l'aide d'un microscope inversé à contraste de phase Optika XDS-3 (objectif 40x) couplé à une caméra Tucson ISH1000, à 30 images par seconde pendant 3 secondes. Le logiciel CASA a été utilisé pour étudier au moins trois zones et 500 trajectoires de spermatozoïdes par échantillon. La vidéo enregistrée a été traitée à l'aide d'un module CASA développé en interne. La définition de la motilité dans le module CASA repose sur la vitesse de nage des spermatozoïdes par rapport au débit, et n'inclut pas d'autres paramètres tels que les mouvements latéraux, car ces derniers se sont avérés plus fiables en présence d'un flux de fluide. Le mouvement rhéologique est décrit comme le mouvement des spermatozoïdes à contre-courant du flux. Le nombre de spermatozoïdes présentant des propriétés rhéologiques a été divisé par le nombre de spermatozoïdes mobiles ; les spermatozoïdes immobiles et ceux en mouvement convectif ont été exclus du comptage.
Tous les produits chimiques utilisés provenaient d'Elgomhoria Pharmaceuticals (Le Caire, Égypte), sauf indication contraire. Le dispositif a été fabriqué selon la méthode décrite par El-sherry et al.⁴⁰, avec quelques modifications. Les matériaux utilisés pour la fabrication des microcanaux comprenaient des plaques de verre (Howard Glass, Worcester, MA, États-Unis), une résine négative SU-8-25 (MicroChem, Newton, CA, États-Unis), de l'alcool diacétonique (Sigma Aldrich, Steinheim, Allemagne) et du polyacétone (Dow Corning, Midland, Michigan, États-Unis). Les microcanaux sont fabriqués par lithographie douce. Un masque de protection transparent, comportant le motif de microcanaux souhaité, a d'abord été imprimé sur une imprimante haute résolution (Prismatic, Le Caire, Égypte et Pacific Arts and Design, Markham, ON, États-Unis). Les matrices ont été réalisées à partir de plaques de verre. Ces plaques ont été nettoyées à l'acétone, à l'isopropanol et à l'eau déminéralisée, puis recouvertes d'une couche de 20 µm de SU-8-25 par centrifugation (3 000 tr/min, 1 min). Les couches de SU-8 ont ensuite été séchées délicatement (65 °C pendant 2 min et 95 °C pendant 10 min) et exposées à un rayonnement UV pendant 50 s. Après cuisson à 65 °C et 95 °C pendant 1 min et 4 min respectivement pour réticuler les couches de SU-8 exposées, un développement dans de l'alcool diacétonique a été effectué pendant 6,5 min. Les gaufres ont ensuite été cuites à 200 °C pendant 15 min pour solidifier davantage la couche de SU-8.
Le PDMS a été préparé en mélangeant le monomère et le durcisseur dans un rapport pondéral de 10:1, puis dégazé sous vide et coulé sur le support principal en SU-8. Après polymérisation au four (120 °C, 30 min), les microcanaux ont été découpés, séparés du moule et perforés pour permettre la fixation de tubes à l'entrée et à la sortie. Enfin, les microcanaux en PDMS ont été fixés de manière permanente sur des lames de microscope à l'aide d'un processeur corona portable (Electro-Technic Products, Chicago, IL), selon une méthode décrite précédemment. Le microcanal utilisé dans cette étude mesure 200 µm × 20 µm (largeur × hauteur) et a une longueur de 3,6 cm.
L'écoulement du fluide induit par la pression hydrostatique à l'intérieur du microcanal est obtenu en maintenant le niveau du fluide dans le réservoir d'entrée au-dessus de la différence de hauteur Δh39 dans le réservoir de sortie (Fig. 1).
où f est le coefficient de frottement, défini par f = C/Re pour un écoulement laminaire dans un canal rectangulaire, C étant une constante dépendant du rapport d'aspect du canal, L la longueur du microcanal, Vav la vitesse moyenne dans le microcanal, Dh le diamètre hydraulique du canal et g l'accélération de la pesanteur. À partir de cette équation, la vitesse moyenne dans le canal peut être calculée à l'aide de l'équation suivante :