Köszönjük, hogy felkereste a Nature.com weboldalt. Az Ön által használt böngészőverzió korlátozott CSS-támogatással rendelkezik. A legjobb élmény érdekében javasoljuk, hogy egy frissített böngészőt használjon (vagy tiltsa le a kompatibilitási módot az Internet Explorerben). Időközben a folyamatos támogatás biztosítása érdekében stílusok és JavaScript nélkül jelenítjük meg az oldalt.
A madarak termékenysége attól függ, hogy képesek-e elegendő életképes spermiumot tárolni hosszabb ideig a spermiumtároló tubulusokban (SST). A spermiumok SST-be való bejutásának, ott tartózkodásának és onnan való távozásának pontos mechanizmusa továbbra is vitatott. A sharkasi tyúkok spermái nagyfokú agglutinációs hajlamot mutattak, mozgékony, fonalas kötegeket képezve, amelyek sok sejtet tartalmaztak. Mivel a spermiumok motilitásának és viselkedésének megfigyelése átlátszatlan petevezetékben nehézkes, egy a spermiumokéhoz hasonló mikrocsatorna keresztmetszetű mikrofluidikai eszközt használtunk a spermiumok agglutinációjának és motilitásának vizsgálatára. Ez a tanulmány azt tárgyalja, hogyan alakulnak ki a spermiumkötegek, hogyan mozognak, és milyen szerepet játszhatnak a spermiumok SST-ben való tartózkodásának meghosszabbításában. Vizsgáltuk a spermiumok sebességét és reológiai viselkedését, amikor a folyadékáramlást hidrosztatikai nyomás (áramlási sebesség = 33 µm/s) generált egy mikrofluidikai csatornán belül. A spermiumok hajlamosak az áramlattal szemben úszni (pozitív reológia), és a spermiumköteg sebessége jelentősen csökken az egyes spermiumokhoz képest. Megfigyelték, hogy a spermiumkötegek spirálisan mozognak, és hosszukban és vastagságukban növekednek, ahogy egyre több egyedi spermium gyűlik össze. Megfigyelték, hogy a spermiumkötegek a mikrofluidikai csatornák oldalfalaihoz közelednek és azokhoz tapadnak, hogy elkerüljék a 33 µm/s-nál nagyobb folyadékáramlási sebességgel történő elsodorást. Megfigyelték, hogy a spermiumkötegek a mikrofluidikai csatornák oldalfalaihoz közelednek és azokhoz tapadnak, hogy elkerüljék a 33 µm/s-nál nagyobb folyadékáramlási sebességgel történő elsodorást. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрофлюиканачтов, избежать сметания со скоростью потока жидкости> 33 мкм / с. Megfigyelték, hogy a spermiumkötegek megközelítik és megtapadnak a mikrofluidikai csatornák oldalfalaihoz, hogy elkerüljék a 33 µm/s-nál nagyobb folyadékáramlási sebességnél történő elsodorást.观察到精子束接近并粘附在微流体通道的侧壁上，以避免被流体流速> 流体流速> 33 悉µm/s> 3333 µm/s 扫过. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрожидкатостного, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрожидкатостного, избежать сметания потоком жидкости со скоростью > 33 мкм/с. Megfigyelték, hogy a spermiumkötegek megközelítik és megtapadnak a mikrofluidikai csatorna oldalfalaihoz, hogy elkerüljék a 33 µm/s-nál nagyobb folyadékáramlás általi elsodort sérüléseket.A pásztázó és transzmissziós elektronmikroszkópia kimutatta, hogy a spermiumkötegeket bőséges, sűrű anyag támasztja alá. A kapott adatok a Sharkazi csirke spermiumainak egyedülálló mobilitását, valamint az agglutinációra és mozgékony kötegek képzésére való képességét bizonyítják, ami hozzájárul a spermiumok SMT-ben történő hosszú távú tárolásának jobb megértéséhez.
Az emberek és a legtöbb állat megtermékenyítéséhez a spermiumoknak és a petesejteknek a megfelelő időben kell megérkezniük a megtermékenyítés helyére. Ezért a párzásnak az ovuláció előtt vagy alatt kell történnie. Másrészt egyes emlősök, például a kutyák, valamint a nem emlős fajok, például a rovarok, halak, hüllők és madarak, hosszabb ideig tárolják a spermiumokat a szaporítószerveikben, amíg a petesejtjeik készen nem állnak a megtermékenyítésre (aszinkron megtermékenyítés1). A madarak 2-10 hétig képesek fenntartani a petesejtek megtermékenyítésére képes spermiumok életképességét2.
Ez egy egyedülálló tulajdonság, amely megkülönbözteti a madarakat más állatoktól, mivel nagy valószínűséggel biztosít megtermékenyítést egyetlen, több hétig tartó megtermékenyítés után, egyidejű párzás és ovuláció nélkül. A fő spermiumtároló szerv, az úgynevezett spermiumtároló tubulus (SST), a méh-hüvely csatlakozásánál található belső nyálkahártya-redőkben található. A mai napig nem teljesen ismertek azok a mechanizmusok, amelyek révén a spermiumok bejutnak a spermabankba, ott tartózkodnak, és kilépnek onnan. Korábbi tanulmányok alapján számos hipotézist fogalmaztak meg, de egyiket sem erősítették meg.
Forman4 azt a hipotézist állította fel, hogy a spermiumok a SST üregében folyamatos oszcilláló mozgással tartják fenn tartózkodási helyüket a folyadékáramlás irányával ellentétes irányban, az SST hámsejtjein található fehérjecsatornákon keresztül (reológia). Az ATP elfogy a spermiumok SST lumenben tartásához szükséges állandó ostoros aktivitás miatt, és a motilitás végül csökken, amíg a spermiumok a folyadékáramlás révén ki nem kerülnek a spermabankból, és új útra indulnak a felszálló petevezetéken keresztül, hogy megtermékenyítsék a spermiumot. Petesejt (Forman4). A spermiumtárolás ezen modelljét alátámasztja az SST hámsejtekben jelen lévő 2., 3. és 9. akvaporinok immuncitokémiai kimutatása. A mai napig hiányoznak a csirkesperma reológiájáról és annak az SST tárolásban, a hüvelyi spermiumok szelekciójában és a spermiumok versenyében betöltött szerepéről szóló tanulmányok. Csirkéknél a spermiumok természetes párzás után jutnak be a hüvelybe, de a spermiumok több mint 80%-a a párzás után röviddel kilökődik a hüvelyből. Ez arra utal, hogy a hüvely a spermiumok szelekciójának elsődleges helyszíne a madaraknál. Ezenkívül arról is beszámoltak, hogy a hüvelyben megtermékenyített spermiumok kevesebb mint 1%-a kerül az SST-kbe. A csirkék hüvelyben történő mesterséges megtermékenyítése során a megtermékenyítést követő 24 órában a spermiumok SST-be jutó száma általában megnő. A spermiumok szelekciójának mechanizmusa ebben a folyamatban eddig nem tisztázott, és a spermiumok motilitásának fontos szerepe lehet a SST spermiumok felvételében. A petevezetékek vastag és átlátszatlan falai miatt nehéz közvetlenül monitorozni a spermiumok motilitását a madarak petevezetékeiben. Ezért hiányoznak az alapvető ismereteink arról, hogyan mennek át a spermiumok SST-be a megtermékenyítés után.
A reológiát a közelmúltban felismerték, mint az emlősök nemi szerveiben a spermiumok transzportját szabályozó fontos tényezőt. A mozgó spermiumok ellenáramú vándorlási képessége alapján Zaferani és munkatársai8 egy Corra mikrofluidikai rendszert használtak a mozgó spermiumok passzív izolálására a tollban tartott spermamintákból. Ez a fajta spermaválogatás elengedhetetlen az orvosi meddőségi kezeléshez és a klinikai kutatáshoz, és előnyben részesítik a hagyományos, idő- és munkaigényes módszerekkel szemben, amelyek veszélyeztethetik a spermiumok morfológiáját és szerkezeti integritását. A mai napig azonban nem végeztek vizsgálatokat a csirkék nemi szerveiből származó váladékoknak a spermiumok motilitására gyakorolt ​​hatásáról.
Függetlenül attól, hogy milyen mechanizmus tartja fenn a spermiumokat az SST-ben való tárolás során, számos kutató megfigyelte, hogy a rezidens spermiumok fej-fej mellett agglutinálódnak a csirkék 9, 10, fürjek 2 és pulykák 11 SST-jében, agglutinált spermiumkötegeket képezve. A szerzők szerint összefüggés van ezen agglutináció és a spermiumok hosszú távú tárolása között az SST-ben.
Tingari és Lake12 szoros összefüggést találtak a tyúkok spermium-befogadó mirigyében található spermiumok között, és megkérdőjelezték, hogy a madarak spermiumai ugyanúgy agglutinálnak-e, mint az emlősök spermiumai. Úgy vélik, hogy a spermiumok közötti mély kapcsolatok az ondóvezetékben a nagyszámú spermium kis térben való jelenléte által okozott stressznek tudhatók be.
A spermiumok frissen függő üveglemezeken való viselkedésének értékelésekor átmeneti agglutináció jelei figyelhetők meg, különösen az ondócseppek szélein. Az agglutinációt azonban gyakran zavarta a folyamatos mozgással járó forgó hatás, ami magyarázza a jelenség átmeneti jellegét. A kutatók azt is észrevették, hogy amikor a hígítószert az ondóhoz adták, megnyúlt, „fonalszerű” sejtaggregátumok jelentek meg.
A spermiumok utánzására irányuló korai kísérletek egy vékony drót eltávolításával történtek egy függő cseppből, aminek eredményeként egy megnyúlt, spermiumszerű vezikulumot hoztak létre, amely kiállt az ondócseppből. A spermiumok azonnal párhuzamosan rendeződtek el a vezikulában, de a teljes egység gyorsan eltűnt a 3D-s korlát miatt. Ezért a spermiumok agglutinációjának vizsgálatához szükséges a spermiumok motilitásának és viselkedésének megfigyelése közvetlenül az izolált spermiumtároló tubulusokban, ami nehéz elérni. Ezért szükséges egy olyan eszköz kifejlesztése, amely utánozza a spermiumokat, hogy támogassa a spermiumok motilitásának és agglutinációs viselkedésének vizsgálatát. Brillard és munkatársai13 arról számoltak be, hogy a felnőtt csirkék spermiumtároló tubulusainak átlagos hossza 400–600 µm, de egyes SST-k akár 2000 µm hosszúak is lehetnek. Mero és Ogasawara14 a csíramirigyeket megnagyobbodott és nem megnagyobbodott spermiumtároló tubulusokra osztotta, amelyek hossza (~500 µm) és nyakszélessége (~38 µm) azonos volt, de a tubulusok átlagos lumenátmérője 56,6, illetve 56,6 µm, azaz 11,2 μm volt. Jelen vizsgálatunkban egy 200 µm × 20 µm (Sz × M) csatornaméretű mikrofluidikai eszközt használtunk, amelynek keresztmetszete némileg közel áll az amplifikált SST keresztmetszetéhez. Ezenkívül megvizsgáltuk a spermiumok motilitását és agglutinációs viselkedését áramló folyadékban, ami összhangban van Foreman hipotézisével, miszerint az SST hámsejtjei által termelt folyadék ellenáramú (reológiai) irányban tartja a spermiumokat a lumenben.
A tanulmány célja a spermiumok petevezetékben történő motilitásának megfigyelésével kapcsolatos problémák leküzdése, valamint a spermiumok reológiájának és viselkedésének dinamikus környezetben történő tanulmányozásával járó nehézségek elkerülése volt. Egy mikrofluidikai eszközt alkalmaztak, amely hidrosztatikai nyomást hoz létre a spermiumok motilitásának szimulálására csirke nemi szerveiben.
Amikor egy csepp hígított spermamintát (1:40 arányban) töltöttek a mikrocsatornás eszközbe, kétféle spermium-motilitást lehetett azonosítani (izolált spermiumok és kötött spermiumok). Ezenkívül a spermiumok hajlamosak voltak az áramlattal szemben úszni (pozitív reológia; 1., 2. videó). Bár a spermiumkötegek sebessége alacsonyabb volt, mint a magányos spermiumoké (p < 0,001), növelték a pozitív reotaxist mutató spermiumok százalékos arányát (p < 0,001; 2. táblázat). Bár a spermiumkötegek sebessége alacsonyabb volt, mint a magányos spermiumoké (p < 0,001), növelték a pozitív reotaxist mutató spermiumok százalékos arányát (p < 0,001; 2. táblázat). Хотя пучки сперматозоидов имели более низкую скорость, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), валоичу01 процент сперматозоидов, демонстрирующих положительный реотаксис (p < 0,001; таблица 2). Bár a spermiumkötegek sebessége alacsonyabb volt, mint az egyes spermiumoké (p < 0,001), növelték a pozitív reotaxist mutató spermiumok százalékos arányát (p < 0,001; 2. táblázat).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度（p < 0,001），但它们增加了显示阳性流变性的精子百分比（p < 0,001；表2）.尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 （p <0,001） ， 但 增加 束 昧 显羺百分比 (p <0,001 ； 2。。。。。。)））））） Хотя скорость пучков сперматозоидов была ниже, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), они уверматозоидов они увелинччем сперматозоидов с положительной реологией (p < 0,001; таблица 2). Bár a spermiumkötegek sebessége lassabb volt, mint az egyes spermiumok esetében (p < 0,001), növelték a pozitív reológiával rendelkező spermiumok százalékos arányát (p < 0,001; 2. táblázat).Az egyes spermiumok és a csomók pozitív reológiája a becslések szerint körülbelül 53%, illetve 85%.
Megfigyelték, hogy a sharkasi csirkék spermái az ejakuláció után azonnal lineáris kötegeket alkotnak, amelyek több tucat egyedből állnak. Ezek a kötegek idővel hosszukban és vastagságukban is növekedhetnek, és in vitro több órán át is maradhatnak, mielőtt szétszóródnának (3. videó). Ezek a fonalas kötegek az echidna spermiumokhoz hasonló alakúak, amelyek a mellékhere végén képződnek. A sharkasi tyúk spermájáról kimutatták, hogy a gyűjtés után kevesebb mint egy percen belül hajlamos az agglutinációra és hálózatos köteg kialakítására. Ezek a sugarak dinamikusak, és képesek bármilyen közeli falhoz vagy statikus tárgyhoz tapadni. Bár a spermiumkötegek csökkentik a spermiumok sebességét, makroszkopikusan egyértelmű, hogy növelik azok linearitását. A kötegek hossza a kötegekben gyűjtött spermiumok számától függően változik. A köteg két részét izolálták: a kezdeti részt, amely magában foglalja az agglutinált spermium szabad fejét, és a terminális részt, amely magában foglalja a farkát és a spermium teljes disztális végét. Nagysebességű kamera (950 fps) segítségével agglutinált spermiumok szabad fejeit figyelték meg a köteg kezdeti részében, amelyek oszcilláló mozgásuknak köszönhetően felelősek a köteg mozgásáért, és a maradékokat spirális mozgással húzzák a kötegbe (4. videó). Hosszú kötegeknél azonban megfigyelték, hogy néhány szabad spermiumfej a testhez tapadt, és a köteg végrésze lapátként működik, segítve a köteg előrehaladását.
Lassú folyadékáramlás közben a spermiumkötegek párhuzamosan mozognak egymással, azonban elkezdenek átfedni egymást, és mindenhez hozzátapadnak, ami mozdulatlan, hogy az áramlási sebesség növekedésével ne mossa el őket az áramlás. A kötegek akkor alakulnak ki, amikor egy maroknyi spermiumsejt közeledik egymáshoz, szinkronban mozogni kezdenek, és egymás köré tekerednek, majd egy ragadós anyaghoz tapadnak. Az 1. és 2. ábra azt mutatja, hogyan közelednek egymáshoz a spermiumok, és hogyan alkotnak csomópontot, ahogy a farkaik egymás köré tekerednek.
A kutatók hidrosztatikus nyomást alkalmaztak folyadékáramlás létrehozására egy mikrocsatornában a spermiumok reológiájának vizsgálata érdekében. Egy 200 µm × 20 µm (Sz × M) méretű és 3,6 µm hosszú mikrocsatornát használtak. A tartályok között mikrocsatornákat használtak, amelyek végére fecskendőket illesztettek. Ételszínezéket használtak a csatornák láthatóbbá tételéhez.
Rögzítse az összekötő kábeleket és tartozékokat a falhoz. A videót fáziskontraszt mikroszkóppal rögzítették. Minden képhez fáziskontraszt mikroszkópos és térképezési képek is tartoznak. (A) Két áramlás közötti kapcsolat a spirális mozgás miatt ellenáll az áramlásnak (piros nyíl). (B) A csőköteg és a csatorna fala közötti kapcsolat (piros nyilak), ugyanakkor két másik köteghez is kapcsolódnak (sárga nyilak). (C) A mikrofluidikai csatornában lévő spermiumkötegek elkezdenek összekapcsolódni egymással (piros nyilak), spermiumkötegek hálóját alkotva. (D) Spermiumkötegek hálózatának kialakulása.
Amikor egy csepp hígított spermiumot töltöttek a mikrofluidikai eszközbe, és áramlás jött létre, megfigyelték, hogy a spermiumnyaláb az áramlás irányával ellentétesen mozog. A kötegek szorosan illeszkednek a mikrocsatornák falához, és a kötegek kezdeti részében lévő szabad fejek szorosan illeszkednek hozzájuk (5. videó). A kötegek az útjukba kerülő álló részecskékhez, például a törmelékhez is hozzátapadnak, hogy ellenálljanak az áram általi elsodorásának. Idővel ezek a kötegek hosszú szálakká válnak, amelyek csapdába ejtik a többi spermiumot és a rövidebb kötegeket (6. videó). Ahogy az áramlás lassulni kezd, a spermiumok hosszú sorai elkezdenek spermiumvonalak hálózatát alkotni (7. videó; 2. ábra).
Nagy áramlási sebességnél (V > 33 µm/s) a szálak spirális mozgása fokozódik, mivel megpróbálnak sok egyedi spermiumot alkotó köteget elkapni, hogy jobban ellenálljanak az áramlás sodródási erejének. Nagy áramlási sebességnél (V > 33 µm/s) a szálak spirális mozgása fokozódik, mivel megpróbálnak sok egyedi spermiumot alkotó köteget elkapni, hogy jobban ellenálljanak az áramlás sodródási erejének. При высокой скорости потока (V > 33 мкм/с) спиралевидные движения нитей усиливаются, поскольку они пытаются отдельных сперматозоидов, образующих пучки, которые лучше противостоят дрейфующей силе потока. Magas áramlási sebességnél (V > 33 µm/s) a szálak helikális mozgása fokozódik, mivel megpróbálnak sok egyedi spermiumot elkapni, olyan kötegeket alkotva, amelyek jobban képesek ellenállni az áramlás sodródási erejének.在高流速 (V > 33 µm/s)时，螺纹的螺旋运动增加，以试图捕捉许多形成束的单个精子，从而更好地抵抗流动的漂移力.在 高 流速 (v> 33 µm/s) 时 ， 的 螺旋 运动 增加 ， 以 试图 箭多 形成 束 束从而 更 地 抵抗 的 漂移力。。。。。。。。。. При высоких скоростях потока (V > 33 мкм/с) спиральное движение нитей увеличивается в попытке захватить захноватить сперматозоидов, образующих пучки, чтобы лучше сопротивляться силам дрейфа потока. Magas áramlási sebességnél (V > 33 µm/s) a filamentumok helikális mozgása fokozódik, hogy megpróbáljanak sok egyedi spermiumot képezni, amelyek kötegeket alkotnak, és jobban ellenálljanak az áramlás sodródási erőinek.Megpróbáltak mikrocsatornákat is rögzíteni az oldalfalakhoz.
Fénymikroszkópia (LM) segítségével a spermiumkötegeket spermiumfejek és göndörödő farkak csoportjaiként azonosították. Különböző aggregátumokat tartalmazó spermiumkötegeket csavart fejekként és ostoros aggregátumokként, többszörös, összeforrt spermiumfarkakként, farokhoz tapadt spermiumfejekként, valamint többszörös, összeforrt magként görbült spermiumfejekként is azonosítottak. Transzmissziós elektronmikroszkópia (TEM). A pásztázó elektronmikroszkópia (SEM) kimutatta, hogy a spermiumkötegeket spermiumfejek burkolt aggregátumai alkotják, és a spermiumaggregátumok egymáshoz tekeredő farkak hálózatát mutatták.
A spermiumok morfológiáját és ultrastruktúráját, a spermiumkötegek képződését fénymikroszkópiával (félmetszet), pásztázó elektronmikroszkópiával (SEM) és transzmissziós elektronmikroszkópiával (TEM) vizsgálták, a spermiumkeneteket akridinnaranccsal festették és epifluoreszcens mikroszkóppal vizsgálták.
Az akridinnaranccsal festve a spermiumkenetből (3B. ábra) kiderült, hogy a spermiumfejek összetapadtak és váladékkal voltak borítva, ami nagy csomók kialakulásához vezetett (3D. ábra). A spermiumkötegek spermium-aggregátumokból és egymáshoz tapadt farkak hálózatából álltak (4A-C. ábra). A spermiumkötegek számos spermium összetapadt farkaiból állnak (4D. ábra). A spermiumkötegek fejét váladék (4E., F. ábra) borította.
A spermiumköteg kialakulása Fáziskontráz-mikroszkópia és akridinnaranccsal festett spermiumkenetek segítségével kimutatható, hogy a spermiumok fejei összeragadnak. (A) A korai spermiumcsomók kialakulása egy spermiummal (fehér kör) és három spermiummal (sárga kör) kezdődik, a spirál a faroknál kezdődik és a fejnél végződik. (B) Akridinnaranccsal festett spermiumkenet mikroszkópos felvétele, amelyen az összetapadt spermiumfejek (nyilak) láthatók. A váladék befedi a fejet/fejeket. Nagyítás × 1000. (C) Egy nagy nyaláb kialakulása áramlással egy mikrofluidikai csatornában (nagysebességű kamerával, 950 fps sebességgel). (D) Akridinnaranccsal festett spermiumkenet mikroképe, amelyen nagy csomók (nyilak) láthatók. Nagyítás: × 200.
Egy spermiumnyaláb és egy akridinnaranccsal festett spermiumkenet pásztázó elektronmikroszkópos felvétele. (A, B, D, E) spermiumok digitális színes pásztázó elektronmikroszkópos felvételei, míg a C és F akridinnaranccsal festett spermiumkenetek mikroszkópos felvételei, amelyek több spermium tapadását mutatják a farokháló körül. (AC) A spermiumaggregátumok összetapadt farkak hálózataként láthatók (nyilak). (D) Több spermium tapadása (ragasztóanyaggal, rózsaszín körvonal, nyíl) a farok köré tekerve. (E és F) Ragasztóanyaggal bevont spermiumfej-aggregátumok (pointerek). A spermiumok több örvényszerű szerkezettel rendelkező kötegeket alkottak (F). (C) ×400 és (F) ×200 nagyítások.
Transzmissziós elektronmikroszkópia segítségével azt tapasztaltuk, hogy a spermiumkötegek összenőtt farkakkal (6A., C. ábra), farkakhoz kapcsolódó fejekkel (6B. ábra) vagy farkakhoz kapcsolódó fejekkel (6D. ábra) rendelkeztek. A kötegben lévő spermiumok fejei görbültek, a metszetben két nukleáris régió látható (6D. ábra). A bemetszéson lévő kötegben a spermiumok csavart fejjel rendelkeztek két nukleáris régióval és több ostoros régióval (5A. ábra).
Digitális színes elektronmikroszkópos felvétel, amelyen a spermiumköteg összekötő farkak és a spermiumfejeket összekötő agglutinációs anyag látható. (A) Nagyszámú spermium tapadt farka. Figyeljük meg, hogyan néz ki a farok álló (nyíl) és fekvő (nyíl) vetületben. (B) A spermium feje (nyíl) kapcsolódik a farokhoz (nyíl). (C) Több spermiumfarok (nyilak) kapcsolódik össze. (D) Az agglutinációs anyag (AS, kék) négy spermiumfejet köt össze (lila).
Pásztázó elektronmikroszkópiát alkalmaztak a spermiumfejek kimutatására a váladékkal vagy membránnal borított spermiumkötegekben (6B. ábra), ami azt jelzi, hogy a spermiumkötegeket extracelluláris anyag rögzítette. Az agglutinált anyag a spermiumfejben koncentrálódott (medúzafej-szerű szerkezet; 5B. ábra), és disztálisan kitágult, fluoreszcens mikroszkóppal festve ragyogó sárga megjelenést kölcsönözve akridinnarancsnal (6C. ábra). Ez az anyag pásztázó mikroszkóp alatt jól látható, és kötőanyagnak tekinthető. A félvékony metszetek (5C. ábra) és az akridinnarancssal festett spermiumkenetek sűrűn elhelyezkedő fejeket és felkunkorodott farkakat tartalmazó spermiumkötegeket mutattak (5D. ábra).
Különböző mikroszkópos felvételek, amelyek spermiumfejek és összehajtott farkak aggregációját mutatják különböző módszerekkel. (A) Egy spermiumköteg keresztmetszeti digitális színes transzmissziós elektronmikroszkópos felvétele, amelyen egy feltekeredett spermiumfej látható két részből álló sejtmaggal (kék) és több ostoros résszel (zöld). (B) Digitális színes pásztázó elektronmikroszkópos felvétel, amelyen egy medúzaszerű spermiumfejek csoportja (nyilak) látható, amelyek látszólag be vannak fedve. (C) Félvékony metszet, amelyen az aggregált spermiumfejek (nyilak) és a felkunkorodott farkak (nyilak) láthatók. (D) Akridinnaranccsal festett spermiumkenet mikrográfiája, amelyen spermiumfejek aggregációi (nyilak) és felkunkorodott, tapadó farkak (nyilak) láthatók. Figyeljük meg, hogy egy ragadós anyag (S) borítja a spermium fejét. (D) × 1000-es nagyítás.
Transzmissziós elektronmikroszkópia (7A. ábra) segítségével azt is megfigyelték, hogy a spermiumok fejei csavarodtak, a sejtmagok pedig spirális alakúak, amit az akridinnaranccsal festett és fluoreszcens mikroszkóppal vizsgált spermiumkenetek is megerősítettek (7B. ábra).
(A) Digitális színes transzmissziós elektronmikroszkópos felvétel és (B) Akridin-narancsra festett spermiumkenet, amelyen láthatóak a feltekeredett fejek, valamint a spermiumfejek és -farkak tapadása (nyilak). (B) × 1000-es nagyítás.
Érdekes felfedezés, hogy Sharkazi spermái mozgékony fonalas kötegekké aggregálódnak. Ezen kötegek tulajdonságai segítenek megérteni a spermiumok felszívódásában és tárolásában betöltött lehetséges szerepüket a SST-ben.
Párzás után a spermiumok bejutnak a hüvelybe, és intenzív szelekciós folyamaton mennek keresztül, aminek eredményeként csak korlátozott számú spermium jut be a SST-be15,16. A mai napig nem tisztázott, hogy a spermiumok hogyan jutnak be és ki a SST-ből. Baromfinál a spermiumokat fajtól függően 2-10 hétig tárolják az SST-ben6. Továbbra is vita folyik a sperma állapotáról a SST-ben történő tárolás során. Mozgásban vannak vagy nyugalmi állapotban? Más szóval, hogyan tartják meg a spermiumok ilyen sokáig a helyüket az SST-ben?
Forman4 azt feltételezte, hogy a tüszőfolyadékban (SST) való tartózkodás és kilökődés a spermiumok motilitásával magyarázható. A szerzők azt feltételezik, hogy a spermiumok az SST hámja által létrehozott folyadékáramlással szemben úszva tartják meg pozíciójukat, és hogy a spermiumok kilökődnek az SST-ből, amikor sebességük az alá a pont alá esik, ahol energiahiány miatt hátrafelé kezdenek mozogni. Zaniboni5 megerősítette az akvaporinok 2, 3 és 9 jelenlétét az SST hámsejtjeinek apikális részében, ami közvetve alátámaszthatja Foreman spermatárolási modelljét. Jelen tanulmányunkban azt találtuk, hogy Sharkashi spermiumainak közel fele pozitív reológiát mutat az áramló folyadékban, és hogy az agglutinált spermiumkötegek növelik a pozitív reológiát mutató spermiumok számát, bár az agglutináció lelassítja őket. Az, hogy a spermiumok hogyan jutnak fel a madár petevezetékén a megtermékenyítés helyére, még nem teljesen ismert. Emlősöknél a tüszőfolyadék kemoattrakciós hatással van a spermiumokra. Úgy vélik azonban, hogy a kemoattraktánsok a spermiumokat nagy távolságokra irányítják7. Ezért más mechanizmusok felelősek a spermiumok transzportjáért. A spermiumok azon képessége, hogy a párzás után felszabaduló petevezetékfolyadékkal szemben orientálódjanak és áramoljanak, egerek spermiumainak célbavételében fő tényezőnek bizonyult. Parker17 azt feltételezte, hogy a spermiumok madaraknál és hüllőknél a sugáráramlással szemben úszva kelnek át a petevezetékeken. Bár madaraknál kísérletileg nem igazolták, Adolphi18 volt az első, aki felfedezte, hogy a madársperma pozitív eredményt ad, ha egy szűrőpapírcsíkkal vékony folyadékréteget hoznak létre a fedőlemez és a tárgylemez között. Reológia. Hino és Yanagimachi [19] egy egér petefészek-petevezeték-méh komplexumot helyeztek egy perfúziós gyűrűbe, és 1 µl tintát injektáltak a szűkületbe, hogy vizualizálják a folyadékáramlást a petevezetékekben. Nagyon aktív összehúzódási és relaxációs mozgást észleltek a petevezetékben, amelyben az összes tintagolyó egyenletesen mozogott a petevezeték ampullája felé. A szerzők hangsúlyozzák a petevezeték folyadékáramlásának fontosságát az alsó petevezetékből a felső petevezetékbe a spermiumok felemelkedése és megtermékenyítése szempontjából. Brillard20 arról számolt be, hogy csirkékben és pulykákban a spermiumok aktív mozgással vándorolnak a hüvelybejárattól, ahol tárolódnak, a méh-hüvely átmenetig, ahol tárolódnak. Ez a mozgás azonban nem szükséges a méh-hüvely átmenet és az infundibulum között, mivel a spermiumok passzív elmozdulással szállítódnak. Ezen korábbi ajánlások és a jelenlegi vizsgálatban kapott eredmények ismeretében feltételezhető, hogy a spermiumok áramlási sebessége (reológia) az egyik olyan tulajdonság, amelyen a szelekciós folyamat alapul. Ez határozza meg a spermiumok hüvelyen keresztüli áthaladását és a CCT-be való bejutását tárolás céljából. Ahogy Forman4 javasolta, ez elősegítheti a spermiumok SST-be és élőhelyére való bejutását egy ideig, majd a kilépést, amikor a sebességük lassulni kezd.
Másrészt Matsuzaki és Sasanami21 azt feltételezték, hogy a madárspermiumok motilitása a hím és női reproduktív traktusokban a nyugalmi állapotból a motilitásba változik. A rezidens spermiumok motilitásának gátlását a SST-ben (spermiumok tenyészetében) javasolták a spermiumok hosszú tárolási idejének, majd az SST-ből való távozás utáni megfiatalodásnak a magyarázataként. Hipoxiás körülmények között Matsuzaki és munkatársai1 magas laktáttermelésről és -felszabadulásról számoltak be az SST-ben, ami a rezidens spermiumok motilitásának gátlásához vezethet. Ebben az esetben a spermiumok reológiájának fontossága a spermiumok szelekciójában és felszívódásában, nem pedig a tárolásukban tükröződik.
A spermiumok agglutinációs mintázatát valószínű magyarázatnak tekintik a spermiumok hosszú tárolási idejére a petevezeték lumenében, mivel ez a baromfiak spermium-visszatartásának gyakori mintázata2,22,23. Bakst és munkatársai2 megfigyelték, hogy a legtöbb spermium egymáshoz tapadt, fascikuláris aggregátumokat alkotva, és a fürj CCM-ben ritkán találtak egyetlen spermiumot. Másrészt Wen és munkatársai24 több szétszórt spermiumot és kevesebb spermiumcsomót figyeltek meg a csirkék SST lumenében. Ezen megfigyelések alapján feltételezhető, hogy a spermiumok agglutinációjára való hajlam madarak és ugyanazon ejakulátumban lévő spermiumok között eltérő. Ezenkívül Van Krey és munkatársai9 azt feltételezték, hogy az agglutinált spermiumok véletlenszerű disszociációja felelős a spermiumok fokozatos behatolásáért a petevezeték lumenébe. E hipotézis szerint az alacsonyabb agglutinációs képességű spermiumokat kell először eltávolítani az SST-ből. Ebben az összefüggésben a spermiumok agglutinációs képessége befolyásolhatja a spermiumverseny kimenetelét a szennyezett madarakban. Ezenkívül minél tovább disszociál az agglutinált spermium, annál tovább marad fenn a termékenység.
Bár a spermiumok agglutinációját és kötegekbe történő aggregációját számos tanulmányban megfigyelték2,22,24, ezeket a SST-n belüli kinematikai megfigyelésük összetettsége miatt nem írták le részletesen. Számos kísérlet történt a spermiumok agglutinációjának in vitro vizsgálatára. Kiterjedt, de átmeneti aggregációt figyeltek meg, amikor a vékony drótot eltávolították a lógó magcseppről. Ez oda vezetett, hogy egy hosszúkás buborék áll ki a cseppből, utánozva az ondómirigyet. A 3D-s korlátok és a rövid csepegtetési szárítási idők miatt a teljes blokk gyorsan romossá vált9. A jelenlegi vizsgálatban Sharkashi csirkék és mikrofluidikai chipek segítségével le tudtuk írni, hogyan alakulnak ki ezek a kötegek és hogyan mozognak. A spermiumkötegek közvetlenül a spermagyűjtés után alakultak ki, és spirálisan mozogtak, pozitív reológiát mutatva, amikor jelen voltak az áramlásban. Továbbá makroszkopikus vizsgálat során a spermiumkötegek motilitásának linearitását figyelték meg az izolált spermiumokhoz képest. Ez arra utal, hogy a spermiumok agglutinációja az SST penetrációja előtt történhet, és hogy a spermiumtermelés nem korlátozódik egy kis területre a stressz miatt, ahogy azt korábban feltételezték (Tingari és Lake12). A kötegképződés során a spermiumok szinkronban úsznak, amíg egy csomópontot nem alkotnak, majd farkuk egymás köré tekeredik, és a spermium feje szabad marad, de a spermium farka és disztális része ragadós anyaggal összetapad. Ezért a szalag szabad feje felelős a mozgásért, magával húzva a szalag többi részét. A spermiumkötegek pásztázó elektronmikroszkópos vizsgálata összetapadt spermiumfejeket mutatott, amelyeket sok ragadós anyag borított, ami arra utal, hogy a spermiumfejek nyugalmi kötegekben tapadtak össze, ami a tárolóhely (SST) elérése után történhetett.
Amikor egy spermiumkenetet akridin-narancssal festenek, fluoreszcens mikroszkóp alatt láthatóvá válik a spermiumok körüli extracelluláris ragasztóanyag. Ez az anyag lehetővé teszi, hogy a spermiumkötegek a környező felületekhez vagy részecskékhez tapadjanak és rátapadjanak, így nem sodródnak a környező áramlással. Megfigyeléseink tehát a spermiumok adhéziójának szerepét mutatják a mozgó kötegek formájában. Az áramlattal szembeni úszásuk és a közeli felületekhez való tapadásuk képessége lehetővé teszi, hogy a spermiumok hosszabb ideig a sejtmembránban (SST) maradjanak.
Rothschild25 hemocitometriás kamerát használt a szarvasmarha-sperma lebegő eloszlásának vizsgálatára egy csepp szuszpenzióban, mikroszkópos felvételeket készítve egy olyan kamerán keresztül, amelynek függőleges és vízszintes optikai tengelye is volt. Az eredmények azt mutatták, hogy a spermiumokat vonzotta a kamra felülete. A szerzők arra utalnak, hogy hidrodinamikai kölcsönhatások lehetnek a sperma és a felület között. Ezt figyelembe véve, valamint a Sharkashi csirke sperma ragadós csomók képzésére való képességével együtt, növelhető annak valószínűsége, hogy a sperma a SST falához tapad, és hosszú ideig tárolódik.
Bccetti és Afzeliu26 arról számoltak be, hogy a spermium glikokalixa szükséges az ivarsejtek felismeréséhez és agglutinációjához. Forman10 megfigyelte, hogy a glikoprotein-glikolipid bevonatok α-glikozidos kötéseinek hidrolízise a madársperma neuraminidázzal történő kezelésével a termékenység csökkenéséhez vezetett a spermiumok motilitásának befolyásolása nélkül. A szerzők szerint a neuraminidáz glikokalixra gyakorolt ​​hatása rontja a spermiumok szekvestrációját a méh-hüvely átmeneténél, ezáltal csökkentve a termékenységet. Megfigyeléseik nem hagyhatják figyelmen kívül annak a lehetőségét, hogy a neuraminidáz kezelés csökkentheti a spermiumok és a petesejtek felismerését. Forman és Engel10 azt találták, hogy a termékenység csökkent, amikor a tyúkokat intravaginálisan termékenyítették neuraminidázzal kezelt spermával. A neuraminidázzal kezelt spermával végzett IVF azonban nem befolyásolta a termékenységet a kontroll csirkékhez képest. A szerzők arra a következtetésre jutottak, hogy a spermiummembrán körüli glikoprotein-glikolipid bevonat változásai csökkentették a spermiumok megtermékenyítési képességét azáltal, hogy rontották a spermiumok szekvestrációját a méh-hüvely átmenetnél, ami viszont növelte a spermiumveszteséget a méh-hüvely átmenet sebessége miatt, de nem befolyásolta a spermiumok és a petesejtek felismerését.
Pulykáknál Bakst és Bauchan 11 apró vezikulákat és membrántöredékeket találtak az SST lumenében, és megfigyelték, hogy ezek közül a granulátumok közül néhány összeolvadt a spermium membránjával. A szerzők szerint ezek a kapcsolatok hozzájárulhatnak a spermiumok hosszú távú tárolásához az SST-ben. A kutatók azonban nem határozták meg ezen részecskék forrását, hogy azokat a CCT hámsejtjei választják-e ki, a hím reproduktív rendszer termeli és választja ki, vagy maga a spermium termeli-e azokat. Ezek a részecskék felelősek az agglutinációért is. Grützner és munkatársai 27 arról számoltak be, hogy a mellékhere hámsejtjei egy specifikus fehérjét termelnek és választanak ki, amely az egypórusú ondóvezetékek kialakulásához szükséges. A szerzők azt is beszámolják, hogy ezeknek a kötegeknek a diszperziója a mellékhere fehérjék kölcsönhatásától függ. Nixon és munkatársai 28 azt találták, hogy a függelékek egy fehérjét, a savas, ciszteinben gazdag oszteonektint választanak ki; a SPARC részt vesz a spermiumcsomók kialakulásában a rövid csőrű hangyászsünökben és a kacsacsőrű emlősökben. Ezen sugarak szórása a fehérje elvesztésével jár.
A jelenlegi vizsgálatban az elektronmikroszkópos ultrastrukturális elemzés kimutatta, hogy a spermiumok nagy mennyiségű sűrű anyaghoz tapadtak. Úgy gondolják, hogy ezek az anyagok felelősek az összetapadt fejek között és körülöttük kondenzálódó agglutinációért, de alacsonyabb koncentrációban a farok régiójában. Feltételezzük, hogy ez az agglutináló anyag a hím reproduktív rendszerből (mellékhere vagy ondóvezeték) ürül ki az ondóval együtt, mivel gyakran megfigyelhetjük az ondó elválását a nyirok- és az ondóplazmától az ejakuláció során. Jelentések szerint, amikor a madár spermiumok áthaladnak a mellékherén és az ondóvezetéken, érési folyamattal kapcsolatos változásokon mennek keresztül, amelyek támogatják a fehérjékhez való kötődés és a plazma lemma-asszociált glikoproteinek megszerzésének képességét. Ezen fehérjék perzisztenciája a rezidens spermiummembránokon az SST-ben arra utal, hogy ezek a fehérjék befolyásolhatják a spermiummembrán stabilitásának megszerzését30 és meghatározhatják termékenységüket31. Ahammad és munkatársai32 arról számoltak be, hogy a hím reproduktív rendszer különböző részeiből (a heréktől a disztális ondóvezetékig) nyert spermiumok életképessége folyékony tárolási körülmények között fokozatosan nőtt, függetlenül a tárolási hőmérséklettől, és a csirkék életképessége a petevezetékekben is növekszik mesterséges megtermékenyítés után.
A Sharkashi csirke spermacsomói eltérő tulajdonságokkal és funkciókkal rendelkeznek, mint más fajok, például a hangyászsünök, a kacsacsőrű emlősök, az erdei egerek, a szarvaspatkányok és a tengerimalacok. A sharkashi csirkéknél a spermiumkötegek képződése csökkentette az úszási sebességüket az egyetlen spermiumhoz képest. Ezek a kötegek azonban növelték a reológiailag pozitív spermiumok százalékos arányát, és fokozták a spermiumok azon képességét, hogy dinamikus környezetben stabilizálódjanak. Így eredményeink megerősítik a korábbi feltételezést, miszerint a spermiumok agglutinációja az SST-ben összefügg a hosszú távú spermiumtárolással. Azt is feltételezzük, hogy a spermiumok kötegképzési hajlama szabályozhatja a spermiumveszteség sebességét az SST-ben, ami megváltoztathatja a spermiumverseny kimenetelét. E feltételezés szerint az alacsony agglutinációs kapacitású spermiumok először az SST-t szabadítják fel, míg a magas agglutinációs kapacitású spermiumok az utódok nagy részét hozzák létre. Az egypórusú spermiumkötegek kialakulása előnyös, és befolyásolja a szülő-gyermek arányt, de más mechanizmust alkalmaz. A hangyászsünöknél és a kacsacsőrű emlősöknél a spermiumok egymással párhuzamosan helyezkednek el, hogy növeljék a sugár előrehaladási sebességét. A hangyászsün-kötegek körülbelül háromszor gyorsabban mozognak, mint az egyes spermiumok. Úgy vélik, hogy az ilyen spermiumcsomók kialakulása a hangyászsünöknél evolúciós alkalmazkodás a dominancia fenntartása érdekében, mivel a nőstények szabadosak, és általában több hímmel párosodnak. Ezért a különböző ejakulátumokból származó spermiumok hevesen versengenek a petesejt megtermékenyítéséért.
A sharkasi csirkék agglutinált spermiumai könnyen láthatók fáziskontraszt mikroszkóppal, ami előnyösnek tekinthető, mivel lehetővé teszi a spermiumok viselkedésének egyszerű in vitro tanulmányozását. A mechanizmus, amellyel a spermiumcsomók képződése elősegíti a szaporodást a sharkasi csirkéknél, eltér attól, amit egyes méhlepényes emlősöknél megfigyelnek, amelyek a kooperatív spermiumviselkedést képviselik, mint például az erdei egereknél, ahol egyes spermiumok elérik a petéket, segítve más rokon egyedeket a petesejtek elérésében és károsításában. hogy bizonyítsd magad. Altruista viselkedés. Önmegtermékenyítés 34. A spermiumok kooperatív viselkedésének egy másik példáját szarvas egerekben találták, ahol a spermiumok képesek voltak azonosítani és egyesülni a genetikailag legrokonabb spermiumokkal, és kooperatív csoportokat alkotni, hogy növeljék sebességüket a nem rokon spermiumokhoz képest 35.
A jelen tanulmányban kapott eredmények nem mondanak ellent Foman elméletének a spermiumok SWS-ben történő hosszú távú tárolásáról. A kutatók arról számolnak be, hogy a spermiumok hosszabb ideig mozognak az SST-t bélelő hámsejtek áramlásában, majd egy bizonyos idő elteltével a spermiumok energiaraktárai kimerülnek, ami a sebesség csökkenéséhez vezet, ami lehetővé teszi a kis molekulatömegű anyagok kilökődését. A spermiumok energiájának a folyadékáramlással együtt történő elvezetését a SST lumenéből a petevezeték üregébe. Jelen vizsgálatunkban azt figyeltük meg, hogy az egyes spermiumok fele képes volt az áramló folyadékkal szemben úszni, és a kötegben való tapadásuk növelte a pozitív reológiai tulajdonságok mutatására való képességüket. Továbbá adataink összhangban vannak Matsuzaki és munkatársai1 adataival, akik arról számoltak be, hogy a fokozott laktátszekréció SST-ben gátolhatja a rezidens spermiumok motilitását. Eredményeink azonban a spermiumok mozgó szalagjainak kialakulását és reológiai viselkedésüket írják le egy dinamikus környezet jelenlétében egy mikrocsatornán belül, hogy megvilágítsák viselkedésüket SST-ben. A jövőbeli kutatások az agglutinálószer kémiai összetételének és eredetének meghatározására összpontosíthatnak, ami kétségtelenül segíteni fogja a kutatókat a folyékony sperma tárolásának új módszereinek kidolgozásában és a termékenység időtartamának növelésében.
A vizsgálatban tizenöt, 30 hetes, csupasznyakú hím sharkasi (homozigóta domináns; Na Na) került kiválasztásra spermadonorként. A madarakat az egyiptomi Ashit kormányzóságban található Ashit Egyetem Mezőgazdasági Karának Kutató Baromfifarmján nevelték. A madarakat egyedi ketrecekben (30 x 40 x 40 cm) helyezték el, fényprogramnak (16 óra világos és 8 óra sötét) vetették alá, és 160 g nyersfehérjét, 2800 kcal metabolizálható energiát és 35 g kalciumot tartalmazó takarmánnyal etették, amely kilogrammonként 5 gramm hasznosítható foszfort tartalmazott.
A 36., 37. adatok szerint a spermát hasi masszázzsal gyűjtötték hím egyedektől. Összesen 45 spermamintát gyűjtöttek 15 férfitól 3 nap alatt. A spermát (n = 15/nap) azonnal 1:1 arányban (v:v) hígították Belsville Poultry Semen Diluent oldattal, amely kálium-difoszfátot (1,27 g), nátrium-glutamát-monohidrátot (0,867 g), fruktózt (0,5 d), vízmentes nátrium-acetátot (0,43 g), trisz(hidroximetil)aminometánt (0,195 g), kálium-citrát-monohidrátot (0,064 g), kálium-monofoszfátot (0,065 g), magnézium-kloridot (0,034 g) és H2O-t (100 ml) tartalmazott, pH = 7,5, ozmolaritás 333 mOsm/kg38. A hígított spermamintákat először fénymikroszkóp alatt vizsgálták meg a sperma minőségének (nedvességtartalmának) biztosítása érdekében, majd 37°C-os vízfürdőben tárolták a gyűjtést követő fél órán belüli felhasználásig.
A spermiumok kinematikáját és reológiáját mikrofluidikai eszközök rendszerével írták le. A spermamintákat tovább hígították 1:40 arányban Beltsville madársperma-hígítóban, majd egy mikrofluidikai eszközbe töltötték (lásd alább), és a kinetikai paramétereket egy korábban mikrofluidikai jellemzésre kifejlesztett számítógépes spermaelemző (CASA) rendszerrel határozták meg. a spermiumok folyékony közegben való mobilitásáról (Gépészmérnöki Tanszék, Műszaki Kar, Assiut Egyetem, Egyiptom). A plugin letölthető a következő címről: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39. Görbületi sebességet (VCL, μm/s), lineáris sebességet (VSL, μm/s) és átlagos pályasebességet (VAP, μm/s) mértek. A spermiumokról videókat készítettek egy inverz Optika XDS-3 fáziskontraszt mikroszkóppal (40x objektívvel), amely egy Tucson ISH1000 kamerához volt csatlakoztatva, 30 fps sebességgel, 3 másodpercig. A CASA szoftver segítségével legalább három területet és mintánként 500 spermium pályáját vizsgáltuk. A rögzített videót egy házilag készített CASA szoftverrel dolgoztuk fel. A CASA bővítményben a motilitás definíciója a spermiumok úszási sebességén alapul, összehasonlítva az áramlási sebességgel, és nem tartalmazza az olyan egyéb paramétereket, mint az oldalirányú mozgás, mivel ez megbízhatóbbnak bizonyult a folyadékáramlásban. A reológiai mozgást a spermiumok folyadékáramlási irányával ellentétes mozgásaként írjuk le. A reológiai tulajdonságokkal rendelkező spermiumokat elosztottuk a mozgó spermiumok számával; a nyugalmi állapotban lévő és a konvektíven mozgó spermiumokat kizártuk a számlálásból.
Minden felhasznált vegyszert az Elgomhoria Pharmaceuticals-tól (Kairó, Egyiptom) szereztünk be, hacsak másképp nem jelezzük. Az eszközt El-sherry és munkatársai által leírtak szerint gyártották40, némi módosítással. A mikrocsatornák előállításához használt anyagok a következők voltak: üveglapok (Howard Glass, Worcester, MA), SU-8-25 negatív reziszt (MicroChem, Newton, CA), diaceton-alkohol (Sigma Aldrich, Steinheim, Németország) és poliaceton 0,-184, Dow Corning, Midland, Michigan). A mikrocsatornákat lágylitográfiával állítják elő. Először egy átlátszó védőmaszkot nyomtatnak a kívánt mikrocsatorna-kialakítással nagy felbontású nyomtatón (Prismatic, Kairó, Egyiptom és Pacific Arts and Design, Markham, ON). A mestermintákat üveglapok felhasználásával készítik. A lemezeket acetonban, izopropanolban és ioncserélt vízben tisztítják, majd centrifugális bevonattal (3000 fordulat/perc, 1 perc) 20 µm vastag SU8-25 réteggel vonják be. Az SU-8 rétegeket ezután óvatosan szárítottuk (65°C, 2 perc és 95°C, 10 perc), majd 50 másodpercig UV-sugárzásnak tettük ki. Az expozíció utáni időszakban 65°C-on és 95°C-on 1 percig, illetve 4 percig sütöttük a megvilágított SU-8 rétegek térhálósítása érdekében, majd 6,5 percig diaceton-alkoholban fejlesztettük ki. A gofrikat keményre sütöttük (200°C, 15 perc), hogy az SU-8 réteg tovább szilárduljon.
A PDMS-t úgy állították elő, hogy a monomert és a keményítőt 10:1 tömegarányban összekeverték, majd vákuum-exszikkátorban gáztalanították, és az SU-8 fő keretre öntötték. A PDMS-t kemencében (120°C, 30 perc) térhálósították, majd a csatornákat kivágták, elválasztották a mesterrétegtől, és perforálták, hogy a csöveket a mikrocsatorna bemenetéhez és kimenetéhez lehessen csatlakoztatni. Végül a PDMS mikrocsatornákat hordozható koronaprocesszor (Electro-Technic Products, Chicago, IL) segítségével véglegesen rögzítették a mikroszkóp tárgylemezeihez, a korábban leírtak szerint. A vizsgálatban használt mikrocsatorna mérete 200 µm × 20 µm (Sz × M), hossza pedig 3,6 cm.
A mikrocsatornán belüli hidrosztatikai nyomás által indukált folyadékáramlást úgy érik el, hogy a folyadékszintet a bemeneti tartályban a kimeneti tartályban lévő Δh39 magasságkülönbség felett tartják (1. ábra).
ahol f a súrlódási együttható, amelyet f = C/Re-ként definiálunk lamináris áramlás esetén egy téglalap alakú csatornában, ahol C a csatorna oldalviszonyától függő állandó, L a mikrocsatorna hossza, Vav az átlagsebesség a mikrocsatornán belül, Dh a csatorna hidraulikus átmérője, g a nehézségi gyorsulás. Ezzel az egyenlettel az átlagos csatornasebesség a következő egyenlettel számítható ki: