Dziękujemy za odwiedzenie Nature.com. Używana przez Ciebie wersja przeglądarki ma ograniczoną obsługę CSS. Aby zapewnić Ci najlepsze wrażenia, zalecamy korzystanie z nowszej wersji przeglądarki (lub wyłączenie trybu zgodności w Internet Explorerze). W międzyczasie, aby zapewnić ciągłą obsługę, będziemy renderować witrynę bez stylów i JavaScriptu.
Płodność ptaków zależy od ich zdolności do magazynowania wystarczającej ilości żywotnych plemników przez dłuższy czas w kanalikach spichrzeniowych plemników (SST). Dokładny mechanizm, za pomocą którego plemniki wnikają, przebywają w kanalikach SST i opuszczają je, pozostaje kontrowersyjny. Plemniki kur rasy sharkasi wykazywały wysoką tendencję do aglutynacji, tworząc ruchliwe, nitkowate wiązki zawierające wiele komórek. Ze względu na trudności w obserwacji ruchliwości i zachowania plemników w nieprzezroczystym jajowodzie, do badania aglutynacji i ruchliwości plemników wykorzystaliśmy urządzenie mikroprzepływowe o przekroju mikrokanalika podobnym do plemników. W niniejszym badaniu omówiono sposób powstawania wiązek plemników, ich ruch oraz ich możliwą rolę w wydłużaniu czasu przebywania plemników w kanalikach SST. Zbadaliśmy prędkość i właściwości reologiczne plemników, gdy przepływ płynu w kanaliku mikroprzepływowym był generowany przez ciśnienie hydrostatyczne (prędkość przepływu = 33 µm/s). Plemniki mają tendencję do płynięcia pod prąd (reologia dodatnia), a prędkość wiązek plemników jest znacznie mniejsza w porównaniu z pojedynczymi plemnikami. Zaobserwowano, że wiązka plemników porusza się spiralnie i zwiększa swoją długość i grubość w miarę rekrutacji kolejnych pojedynczych plemników. Zaobserwowano, że pęczki plemników zbliżały się do ścianek bocznych kanałów mikroprzepływowych i przylegały do ​​nich, aby uniknąć porwania przez prędkość przepływu płynu > 33 µm/s. Zaobserwowano, że pęczki plemników zbliżały się do ścianek bocznych kanałów mikroprzepływowych i przylegały do ​​nich, aby uniknąć porwania przez prędkość przepływu płynu > 33 µm/s. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам micрофлюидных каналов, чтобы избежать сметания со скоростью потока жидкости> 33 мкм / с. Zaobserwowano, że pęczki plemników zbliżają się do ścianek bocznych kanałów mikroprzepływowych i przylegają do nich, aby uniknąć ich zmycia przy szybkości przepływu płynu >33 µm/s.观察到精子束接近并粘附在微流体通道的侧壁上，以避免被流体流速> 33 µm/s 扫过.33 µm/s Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам micрожидкостного канала, чтобы избежать сметания потоком жидкости со скоростью > 33 мкм/с. Zaobserwowano, że pęczki plemników zbliżają się do ścianek bocznych kanału mikroprzepływowego i przylegają do nich, aby uniknąć porwania przez przepływ płynu z prędkością >33 µm/s.Mikroskopia skaningowa i transmisyjna elektronowa ujawniła, że ​​wiązka plemników była podtrzymywana przez obfity, gęsty materiał. Uzyskane dane dowodzą wyjątkowej ruchliwości plemników kur Sharkazi, a także ich zdolności do aglutynacji i tworzenia ruchomych wiązek, co przyczynia się do lepszego zrozumienia długotrwałego przechowywania plemników w mikroskopie elektronowym SMT.
Aby doszło do zapłodnienia u ludzi i większości zwierząt, plemniki i komórki jajowe muszą dotrzeć do miejsca zapłodnienia we właściwym czasie. Dlatego kopulacja musi nastąpić przed owulacją lub w jej trakcie. Z drugiej strony, niektóre ssaki, takie jak psy, a także gatunki inne niż ssaki, takie jak owady, ryby, gady i ptaki, przechowują plemniki w narządach rozrodczych przez dłuższy czas, aż komórki jajowe będą gotowe do zapłodnienia (zapłodnienie asynchroniczne1). Ptaki są w stanie utrzymać żywotność plemników zdolnych do zapłodnienia komórki jajowej przez 2–10 tygodni2.
Jest to unikalna cecha, która wyróżnia ptaki spośród innych zwierząt, ponieważ zapewnia wysokie prawdopodobieństwo zapłodnienia po pojedynczej inseminacji przez kilka tygodni bez jednoczesnego krycia i owulacji. Główny narząd do przechowywania plemników, zwany kanalikiem spichrzowym plemników (SST), znajduje się w wewnętrznych fałdach błony śluzowej w miejscu połączenia maciczno-pochwowego. Do tej pory mechanizmy, za pomocą których plemniki wnikają, przebywają i opuszczają bank nasienia, nie są w pełni poznane. Na podstawie wcześniejszych badań wysunięto wiele hipotez, ale żadna z nich nie została potwierdzona.
Forman4 postawił hipotezę, że plemniki utrzymują swoją obecność w jamie nasienia SST poprzez ciągły ruch oscylacyjny w kierunku przeciwnym do przepływu płynu przez kanały białkowe zlokalizowane w komórkach nabłonka SST (reologia). ATP ulega wyczerpaniu z powodu ciągłej aktywności wici niezbędnej do utrzymania plemników w świetle SST, a ich ruchliwość ostatecznie spada, aż plemniki zostaną wyniesione z banku nasienia przez przepływ płynu i rozpoczną nową podróż w dół jajowodu wstępującego, aby je zapłodnić. Komórka jajowa (Forman4). Ten model przechowywania plemników jest wspierany przez wykrycie immunocytochemiczne akwaporyn 2, 3 i 9 obecnych w komórkach nabłonka SST. Do tej pory brakuje badań nad reologią nasienia kurcząt i jej rolą w przechowywaniu SST, selekcji plemników przez pochwę i konkurencji plemników. U kurcząt plemniki przedostają się do pochwy po naturalnym kryciu, ale ponad 80% plemników jest wydalane z pochwy wkrótce po kryciu. Sugeruje to, że pochwa jest głównym miejscem selekcji plemników u ptaków. Ponadto doniesiono, że mniej niż 1% plemników zapłodnionych w pochwie trafia do SST2. W przypadku sztucznego zapłodnienia piskląt w pochwie, liczba plemników docierających do SST ma tendencję do wzrostu 24 godzin po inseminacji. Jak dotąd mechanizm selekcji plemników podczas tego procesu jest niejasny, a ruchliwość plemników może odgrywać istotną rolę w wychwycie plemników przez SST. Ze względu na grube i nieprzezroczyste ściany jajowodów, bezpośrednie monitorowanie ruchliwości plemników w jajowodach ptaków jest trudne. W związku z tym brakuje nam podstawowej wiedzy na temat tego, jak plemniki przechodzą do SST po zapłodnieniu.
Reologia została niedawno uznana za ważny czynnik kontrolujący transport plemników w narządach płciowych ssaków. Opierając się na zdolności ruchliwych plemników do migracji przeciwprądowej, Zaferani i wsp.8 zastosowali mikroprzepływowy system Corra do biernej izolacji ruchliwych plemników z próbek nasienia pobranych w kojcach. Ten rodzaj sortowania nasienia jest niezbędny w leczeniu niepłodności i badaniach klinicznych i jest preferowany w porównaniu z tradycyjnymi metodami, które są czasochłonne i pracochłonne oraz mogą wpływać na morfologię i integralność strukturalną plemników. Jednak do tej pory nie przeprowadzono badań dotyczących wpływu wydzielin z narządów płciowych kurcząt na ruchliwość plemników.
Niezależnie od mechanizmu, który utrzymuje plemniki przechowywane w SST, wielu badaczy zaobserwowało, że plemniki rezydentne aglutynują się „głowa w głowę” w SST kurcząt 9, 10, przepiórek 2 i indyków 11, tworząc zlepione wiązki plemników. Autorzy sugerują, że istnieje związek między tą aglutynacją a długotrwałym przechowywaniem plemników w SST.
Tingari i Lake12 donieśli o silnym związku między plemnikami w gruczole nasiennym kury i zakwestionowali, czy plemniki ptaków aglutynują się w taki sam sposób jak plemniki ssaków. Uważają, że głębokie połączenia między plemnikami w nasieniowodzie mogą wynikać ze stresu spowodowanego obecnością dużej liczby plemników w małej przestrzeni.
Oceniając zachowanie plemników na świeżych, wiszących szkiełkach mikroskopowych, można zaobserwować przejściowe oznaki aglutynacji, szczególnie na krawędziach kropel nasienia. Jednak aglutynacja była często zakłócana przez ruch obrotowy związany z ciągłym ruchem, co wyjaśnia przejściowy charakter tego zjawiska. Naukowcy zauważyli również, że po dodaniu rozcieńczalnika do nasienia pojawiały się wydłużone, „nitkowate” agregaty komórkowe.
Wczesne próby naśladowania plemnika podejmowano poprzez usunięcie cienkiego drucika z wiszącej kropli, co skutkowało powstaniem wydłużonego pęcherzyka przypominającego plemnik, wystającego z kropli nasienia. Plemniki natychmiast ustawiły się równolegle w pęcherzyku, ale cała jednostka szybko zanikła z powodu ograniczenia trójwymiarowości. Dlatego, aby zbadać aglutynację plemników, konieczna jest obserwacja ich ruchliwości i zachowania bezpośrednio w izolowanych kanalikach spichrzowych, co jest trudne do osiągnięcia. Dlatego konieczne jest opracowanie instrumentu imitującego plemniki, który wspierałby badania ruchliwości i zachowania plemników podczas aglutynacji. Brillard i wsp.13 podali, że średnia długość kanalików spichrzowych plemników u dorosłych piskląt wynosi 400–600 µm, ale niektóre SST mogą osiągać długość nawet 2000 µm. Mero i Ogasawara14 podzielili gruczoły nasienne na powiększone i niepowiększone kanaliki magazynujące plemniki, z których oba miały taką samą długość (~500 µm) i szerokość szyjki (~38 µm), ale średnia średnica światła kanalików wynosiła odpowiednio 56,6 i 56,6 µm. . , odpowiednio 11,2 µm. W obecnym badaniu użyliśmy urządzenia mikroprzepływowego o rozmiarze kanału 200 µm × 20 µm (szer. × wys.), którego przekrój poprzeczny jest w pewnym stopniu zbliżony do przekroju wzmocnionego SST. Ponadto zbadaliśmy ruchliwość plemników i zachowanie aglutynacji w przepływającym płynie, co jest zgodne z hipotezą Foremana, że ​​płyn wytwarzany przez komórki nabłonkowe SST utrzymuje plemniki w świetle w kierunku przeciwprądowym (reologicznym).
Celem niniejszego badania było pokonanie problemów związanych z obserwacją ruchliwości plemników w jajowodzie oraz uniknięcie trudności związanych z badaniem reologii i zachowania plemników w środowisku dynamicznym. Zastosowano urządzenie mikroprzepływowe, które wytwarza ciśnienie hydrostatyczne, symulując ruchomość plemników w narządach płciowych kurczaka.
Po wprowadzeniu kropli rozcieńczonej próbki plemników (1:40) do mikrokanalika, można było zidentyfikować dwa rodzaje ruchliwości plemników (plemniki izolowane i plemniki związane). Ponadto plemniki miały tendencję do pływania pod prąd (dodatnia reologia; wideo 1, 2). Chociaż wiązka plemników miała niższą prędkość niż plemniki samotne (p < 0,001), zwiększyła ona odsetek plemników wykazujących dodatnią reotaksję (p < 0,001; Tabela 2). Chociaż wiązka plemników miała niższą prędkość niż plemniki samotne (p < 0,001), zwiększyła ona odsetek plemników wykazujących dodatnią reotaksję (p < 0,001; Tabela 2). Хотя пучки сперматозоидов имели более низкую скорость, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), они увеличивали процент сперматозоидов, демонстрирующих положительный реотаксис (p < 0,001; таблица 2). Mimo że pęczki plemników miały niższą prędkość niż pojedyncze plemniki (p < 0,001), zwiększyły one odsetek plemników wykazujących dodatnią reotaksję (p < 0,001; Tabela 2).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度(p < 0,001），但它们增加了显示阳性流变性的精子百分比（p < 0,001；表2）。尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 （p <0.001） ， 但 增加 了 显示 阳性 流变性 精子百分比 （p <0,001 ； 2。。。。。。）））））) Хотя скорость пучков сперматозоидов была ниже, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), они увеличивали процент сперматозоидов с положительной реологией (p < 0,001; таблица 2). Mimo że prędkość przemieszczania się wiązek plemników była niższa niż pojedynczych plemników (p < 0,001), zwiększyły one odsetek plemników o dodatniej reologii (p < 0,001; Tabela 2).Szacuje się, że dodatnia reologia pojedynczych plemników i kępek wynosi odpowiednio około 53% i 85%.
Zaobserwowano, że plemniki kur rasy sharkashi bezpośrednio po ejakulacji tworzą liniowe wiązki, składające się z kilkudziesięciu osobników. Te kępki z czasem zwiększają swoją długość i grubość i mogą pozostawać in vitro przez kilka godzin przed rozproszeniem (film 3). Te nitkowate wiązki mają kształt plemników kolczatki, które tworzą się na końcu najądrza. Stwierdzono, że nasienie kur rasy sharkashi ma wysoką tendencję do aglutynacji i tworzenia siateczkowatych wiązek w czasie krótszym niż jedna minuta po pobraniu. Wiązki te są dynamiczne i mogą przylegać do wszelkich pobliskich ścian lub obiektów statycznych. Chociaż wiązki plemników zmniejszają prędkość plemników, makroskopowo wyraźnie widać, że zwiększają ich liniowość. Długość wiązek zmienia się w zależności od liczby plemników zebranych w wiązkach. Wyizolowano dwie części wiązki: część początkową, obejmującą wolną główkę aglutynowanego plemnika, oraz część końcową, obejmującą witkę i cały dystalny koniec plemnika. Za pomocą kamery szybkoobrotowej (950 kl./s) zaobserwowano wolne główki zlepionych plemników w początkowej części pęczka, odpowiedzialne za ruch pęczka poprzez ich ruch oscylacyjny, wciągając pozostałe plemniki do pęczka ruchem śrubowym (wideo 4). Jednak w długich kępkach zaobserwowano, że niektóre wolne główki plemników przylegają do ciała, a końcowa część pęczka działa jak łopatki, wspomagając jego ruch.
W powolnym przepływie płynu wiązka plemników porusza się równolegle do siebie, jednak zaczyna na siebie nachodzić i przylegać do wszystkiego, co jest nieruchome, aby nie zostać zmyte przez prąd płynący wraz ze wzrostem prędkości przepływu. Wiązki tworzą się, gdy garstka plemników zbliża się do siebie, zaczynają się poruszać synchronicznie i owijać wokół siebie, a następnie przylegają do lepkiej substancji. Rysunki 1 i 2 pokazują, jak plemniki zbliżają się do siebie, tworząc połączenie, gdy witki owijają się wokół siebie.
Naukowcy zastosowali ciśnienie hydrostatyczne, aby wywołać przepływ płynu w mikrokanale, który posłużył do badania reologii plemników. Wykorzystano mikrokanał o wymiarach 200 µm × 20 µm (szer. × wys.) i długości 3,6 µm. Zastosowano mikrokanaliki między pojemnikami, zakończone strzykawkami. Aby zwiększyć widoczność kanalików, zastosowano barwnik spożywczy.
Przymocuj kable połączeniowe i akcesoria do ściany. Film został nagrany za pomocą mikroskopu fazowo-kontrastowego. Na każdym zdjęciu przedstawiono obraz z mikroskopu fazowo-kontrastowego i obraz mapujący. (A) Połączenie między dwoma strumieniami stawia opór przepływowi z powodu ruchu śrubowego (czerwona strzałka). (B) Połączenie między wiązką rurek a ścianą kanału (czerwone strzałki), w tym samym czasie, gdy są one połączone z dwoma innymi wiązkami (żółte strzałki). (C) Wiązki plemników w kanale mikroprzepływowym zaczynają się łączyć ze sobą (czerwone strzałki), tworząc siatkę wiązek plemników. (D) Tworzenie sieci wiązek plemników.
Po wprowadzeniu kropli rozcieńczonego nasienia do mikroprzepływowego urządzenia i wytworzeniu przepływu, zaobserwowano, że strumień plemników porusza się w kierunku przeciwnym do przepływu. Wiązki ściśle przylegają do ścianek mikrokanalików, a wolne główki w początkowej części wiązek ściśle do nich przylegają (film 5). Przyklejają się one również do wszelkich nieruchomych cząstek na swojej drodze, takich jak zanieczyszczenia, aby nie zostać porwanymi przez prąd. Z czasem te kępki przekształcają się w długie włókna, zatrzymując inne pojedyncze plemniki i krótsze kępki (film 6). Wraz ze zmniejszaniem się przepływu, długie linie plemników zaczynają tworzyć sieć linii plemników (film 7; rysunek 2).
Przy dużej prędkości przepływu (V > 33 µm/s) spiralne ruchy nici ulegają nasileniu, ponieważ próbują one uchwycić wiele pojedynczych wiązek plemników, aby lepiej oprzeć się sile unoszenia przepływu. Przy dużej prędkości przepływu (V > 33 µm/s) spiralne ruchy nici ulegają nasileniu, ponieważ próbują one uchwycić wiele pojedynczych wiązek plemników, aby lepiej oprzeć się sile unoszenia przepływu. При высокой скорости потока (V > 33 мкм/с) спиралевидные движения нитей усиливаются, поскольку они пытаются поймать множество отдельных сперматозоидов, образующих пучки, которые лучше противостоят дрейфующей силе потока. Przy dużych szybkościach przepływu (V > 33 µm/s) śrubowe ruchy nici zwiększają się, gdyż próbują one złapać wiele pojedynczych plemników i utworzyć wiązki, które są w stanie lepiej oprzeć się sile unoszenia przepływu.在高流速(V > 33 µm/s)时,螺纹的螺旋运动增加,以试图捕捉许多形成束的单个精子,从而更好地抵抗流动的漂移力.在 高 流速 (v> 33 µm/s) 时 ， 的 螺旋 运动 增加 ， 以 试图 许多 形成 束 单 个 精子 ，从而 更 地 抵抗 的 漂移力。。。。。。。。。。 При высоких скоростях потока (V > 33 мкм/с) спиральное движение нитей увеличивается в попытке захватить множество отдельных сперматозоидов, образующих пучки, чтобы лучше сопротивляться силам дрейфа потока. Przy wysokich szybkościach przepływu (V > 33 µm/s) zwiększa się śrubowy ruch włókien, co ma na celu uchwycenie wielu pojedynczych plemników tworzących wiązki, dzięki czemu mogą one lepiej opierać się siłom unoszenia podczas przepływu.Próbowali również przymocować mikrokanaliki do ścian bocznych.
Wiązki plemników zidentyfikowano jako skupiska główek plemników i zakręconych witek za pomocą mikroskopii świetlnej (LM). Wiązki plemników z różnymi agregatami zidentyfikowano również jako skręcone główki i agregaty wici, liczne zrośnięte witki plemników, główki plemników przyczepione do witki oraz główki plemników z zagiętymi jądrami jako liczne zrośnięte jądra. Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM). Skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) wykazała, że ​​wiązki plemników były osłoniętymi agregatami główek plemników, a agregaty plemników wykazywały połączoną sieć zwiniętych witek.
Morfologię i ultrastrukturę plemników oraz tworzenie wiązek plemników badano za pomocą mikroskopii świetlnej (połowa przekroju), mikroskopii skaningowej (SEM) oraz transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM). Rozmazy plemników barwiono oranżem akrydynowym i badano za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej.
Barwienie rozmazu nasienia oranżem akrydyny (ryc. 3B) wykazało, że główki plemników były zlepione i pokryte substancją wydzielniczą, co prowadziło do tworzenia dużych kępek (ryc. 3D). Wiązki plemników składały się z agregatów plemników połączonych siecią witek (ryc. 4A-C). Wiązki plemników zbudowane są z witek wielu plemników zlepionych ze sobą (ryc. 4D). Główki wijąnek plemników pokryte są wydzielinami (ryc. 4E, F).
Tworzenie wiązki plemników Za pomocą mikroskopii fazowo-kontrastowej i rozmazów plemników barwionych oranżem akrydyny wykazano, że główki plemników sklejają się ze sobą. (A) Wczesne formowanie się kępki plemników rozpoczyna się od plemnika (białe kółko) i trzech plemników (żółte kółko), przy czym spirala zaczyna się od witki i kończy na główce. (B) Mikrofotografia rozmazu plemników barwionego oranżem akrydyny, ukazująca przylegające główki plemników (strzałki). Wydzielina pokrywa główkę(i). Powiększenie × 1000. (C) Rozwój dużej wiązki transportowanej przez przepływ w kanale mikroprzepływowym (za pomocą kamery szybkoobrotowej przy 950 fps). (D) Mikrofotografia rozmazu plemników barwionego oranżem akrydyny, ukazująca duże kępki (strzałki). Powiększenie: × 200.
Mikrofotografia elektronowa ze skaningowego mikroskopu elektronowego wiązki plemników i rozmazu plemników barwionego oranżem akrydynowym. (A, B, D, E) to cyfrowe kolorowe mikroskopy elektronowe ze skaningowego mikroskopu elektronowego plemników, a C i F to mikrofotografie rozmazów plemników barwionych oranżem akrydynowym, ukazujące przyleganie wielu plemników do błony ogonowej. (AC) Agregaty plemników przedstawione jako sieć przyczepionych witek (strzałki). (D) Adhezja kilku plemników (z substancją klejącą, różowym konturem, strzałka) owijających się wokół witki. (E i F) Agregaty główek plemników (wskaźniki) pokryte substancją klejącą (wskaźniki). Plemniki utworzyły pęczki z kilkoma strukturami przypominającymi wiry (F). Powiększenia (C) ×400 i (F) ×200.
Za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej stwierdziliśmy, że wiązka plemników miała przyczepione witki (ryc. 6A, C), główki przyczepione do witek (ryc. 6B) lub główki przyczepione do witek (ryc. 6D). Główki plemników w wiązce są zakrzywione, prezentując na przekroju dwa obszary jądrowe (ryc. 6D). W wiązce nacięcia plemniki miały skręconą główkę z dwoma obszarami jądrowymi i wieloma obszarami wiciowymi (ryc. 5A).
Cyfrowe kolorowe zdjęcie z mikroskopu elektronowego przedstawiające witki łączące w wiązce plemników oraz materiał aglutynacyjny łączący główki plemników. (A) Przyczepiona witka dużej liczby plemników. Zwróć uwagę na wygląd witki w projekcji pionowej (strzałka) i poziomej (strzałka). (B) Główka plemnika (strzałka) jest połączona z witką (strzałka). (C) Kilka witek plemników (strzałki) jest przyczepionych. (D) Materiał aglutynacyjny (AS, niebieski) łączy cztery główki plemników (fioletowy).
Mikroskopia elektronowa skaningowa została użyta do wykrycia główek plemników w wiązkach plemników pokrytych wydzieliną lub błonami (ryc. 6B), co wskazuje na zakotwiczenie wiązek plemników w materiale pozakomórkowym. Zlepiony materiał koncentrował się w główce plemnika (zespół przypominający głowę meduzy; ryc. 5B) i rozszerzał się dystalnie, nadając jaskrawożółty kolor pod mikroskopem fluorescencyjnym po barwieniu oranżem akrydyny (ryc. 6C). Substancja ta jest wyraźnie widoczna pod mikroskopem skaningowym i jest uważana za substancję wiążącą. W półcienkich skrawkach (ryc. 5C) i rozmazach plemników barwionych oranżem akrydyny widoczne były wiązka plemników zawierająca gęsto upakowane główki i zawinięte witki (ryc. 5D).
Różne fotomikrofotografie przedstawiające agregację główek plemników i zwiniętych witek, wykonane różnymi metodami. (A) Cyfrowe, kolorowe zdjęcie przekrojowe z mikroskopu elektronowego transmisyjnego wiązek plemników, ukazujące zwiniętą główkę plemnika z dwuczęściowym jądrem (niebieskim) i kilkoma wiciami (zielonym). (B) Cyfrowe, kolorowe zdjęcie z mikroskopu elektronowego skaningowego, ukazujące skupisko meduzopodobnych główek plemników (strzałki), które wydają się być przykryte. (C) Półcienki przekrój ukazujący skupiska główek plemników (strzałki) i zwinięte witki (strzałki). (D) Mikrofotografia rozmazu plemników barwionego oranżem akrydyny, ukazująca skupiska główek plemników (strzałki) i zwinięte, przylegające witki (strzałki). Należy zauważyć, że główka plemnika pokryta jest lepką substancją (S). (D) Powiększenie × 1000.
Za pomocą mikroskopii elektronowej transmisyjnej (ryc. 7A) zauważono również, że główki plemników były skręcone, a jądra miały kształt spiralny, co potwierdziły rozmazy plemników barwione oranżem akrydyny i badane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (ryc. 7B).
(A) Cyfrowe kolorowe zdjęcie mikroskopowe z transmisyjnego mikroskopu elektronowego i (B) Rozmaz plemników barwiony akrydyną pomarańczową, ukazujący zwinięte główki plemników oraz ich połączenia (strzałki). (B) Powiększenie × 1000.
Interesującym odkryciem jest to, że plemniki Sharkaziego skupiają się, tworząc ruchome, nitkowate wiązki. Właściwości tych wiązek pozwalają nam zrozumieć ich potencjalną rolę w absorpcji i przechowywaniu plemników w SST.
Po kopulacji plemniki przedostają się do pochwy i przechodzą intensywny proces selekcji, w wyniku którego tylko ograniczona liczba plemników przedostaje się do SST15,16. Do tej pory mechanizmy, za pomocą których plemniki przedostają się do i z SST, nie są jasne. U drobiu plemniki są przechowywane w SST przez dłuższy okres od 2 do 10 tygodni, w zależności od gatunku6. Nadal istnieją kontrowersje dotyczące stanu nasienia podczas przechowywania w SST. Czy jest ono w ruchu, czy w spoczynku? Innymi słowy, w jaki sposób plemniki utrzymują swoją pozycję w SST przez tak długi czas?
Forman4 zasugerował, że pobyt i wyrzut plemników SST można wyjaśnić ruchliwością plemników. Autorzy stawiają hipotezę, że plemniki utrzymują swoją pozycję, płynąc pod prąd płynu wytwarzanego przez nabłonek SST, a plemniki są wyrzucane z SST, gdy ich prędkość spada poniżej punktu, w którym zaczynają się cofać z powodu braku energii. Zaniboni5 potwierdził obecność akwaporyn 2, 3 i 9 w części wierzchołkowej komórek nabłonka SST, co może pośrednio potwierdzać model magazynowania plemników Foremana. W niniejszym badaniu stwierdziliśmy, że prawie połowa plemników Sharkashiego wykazuje dodatnią reologię w przepływającym płynie, a aglutynowane wiązki plemników zwiększają liczbę plemników wykazujących dodatnią reologię, chociaż aglutynacja je spowalnia. Sposób, w jaki plemniki przemieszczają się jajowodem ptaka do miejsca zapłodnienia, nie jest w pełni poznany. U ssaków płyn pęcherzykowy chemoatraktuje plemniki. Uważa się jednak, że chemoatraktanty kierują plemniki na duże odległości7. Dlatego za transport plemników odpowiadają inne mechanizmy. Zdolność plemników do orientowania się i przepływu wbrew płynowi jajowodowemu uwalnianemu po kopulacji jest uznawana za główny czynnik w ukierunkowywaniu plemników u myszy. Parker17 zasugerował, że plemniki przekraczają jajowody, płynąc wbrew prądowi rzęskowemu u ptaków i gadów. Chociaż nie wykazano tego eksperymentalnie u ptaków, Adolphi18 jako pierwszy odkrył, że plemniki ptaków dają pozytywne wyniki, gdy cienka warstwa płynu między szkiełkiem nakrywkowym a szkiełkiem podstawowym zostanie utworzona za pomocą paska bibuły filtracyjnej. Reologia. Hino i Yanagimachi [19] umieścili kompleks jajnik-jajnik-macica myszy w pierścieniu perfuzyjnym i wstrzyknęli 1 µl tuszu do cieśni, aby uwidocznić przepływ płynu w jajowodach. Zauważyli bardzo aktywny ruch skurczu i rozkurczu w jajowodzie, w którym wszystkie kulki atramentowe stale przemieszczały się w kierunku bańki jajowodu. Autorzy podkreślają znaczenie przepływu płynu jajowodowego z dolnego do górnego jajowodu dla uniesienia plemników i zapłodnienia. Brillard20 doniósł, że u kur i indyków plemniki migrują poprzez aktywny ruch od wejścia do pochwy, gdzie są przechowywane, do połączenia maciczno-pochwowego, gdzie są przechowywane. Jednakże ten ruch nie jest wymagany pomiędzy połączeniem maciczno-pochwowym a lejkiem, ponieważ plemniki są transportowane poprzez bierne przemieszczenie. Znając te wcześniejsze zalecenia i wyniki uzyskane w niniejszym badaniu, można założyć, że zdolność plemników do przemieszczania się w górę rzeki (reologia) jest jedną z właściwości, na których opiera się proces selekcji. To determinuje przejście plemników przez pochwę i ich wejście do CCT w celu przechowywania. Jak zasugerował Forman4, może to również ułatwić plemnikom wnikanie do SST i ich siedliska na pewien czas, a następnie wychodzenie z niego, gdy ich prędkość zaczyna spadać.
Z drugiej strony, Matsuzaki i Sasanami [21] zasugerowali, że plemniki ptaków przechodzą zmiany ruchliwości ze stanu uśpienia do ruchu w męskich i żeńskich drogach rozrodczych. Zaproponowano, że zahamowanie ruchliwości plemników rezydentnych w SST wyjaśnia długi czas ich przechowywania, a następnie odmłodzenie po opuszczeniu SST. W warunkach niedotlenienia Matsuzaki i wsp. [1] zaobserwowali wysoką produkcję i uwalnianie mleczanu w SST, co może prowadzić do zahamowania ruchliwości plemników rezydentnych. W tym przypadku znaczenie reologii plemników znajduje odzwierciedlenie w selekcji i absorpcji plemników, a nie w ich przechowywaniu.
Wzór aglutynacji plemników jest uważany za prawdopodobne wyjaśnienie długiego okresu przechowywania plemników w ejakulacie SST, ponieważ jest to powszechny wzór retencji plemników u drobiu2,22,23. Bakst i in. 2 zaobserwowali, że większość plemników przylegała do siebie, tworząc agregaty wiązkowe, a pojedyncze plemniki rzadko znajdowano w CCM przepiórek. Z drugiej strony, Wen i in. 24 zaobserwowali bardziej rozproszone plemniki i mniej kępek plemników w świetle ejakulatu SST u kur. Na podstawie tych obserwacji można założyć, że skłonność do aglutynacji plemników różni się między ptakami i między plemnikami w tym samym ejakulacie. Ponadto Van Krey i in. 9 zasugerowali, że losowa dysocjacja aglutynowanych plemników jest odpowiedzialna za stopniową penetrację plemników do światła jajowodu. Zgodnie z tą hipotezą, plemniki o niższej zdolności aglutynacji powinny być najpierw wydalane z SST. W tym kontekście zdolność plemników do aglutynacji może być czynnikiem wpływającym na wynik konkurencji plemników u ptaków z owrzodzeniami. Ponadto, im dłużej aglutynowane plemniki ulegają dysocjacji, tym dłużej utrzymuje się płodność.
Chociaż agregacja plemników i ich tworzenie pęczków obserwowano w kilku badaniach2,22,24, nie zostały one szczegółowo opisane ze względu na złożoność ich kinematycznej obserwacji w SST. Podjęto kilka prób zbadania aglutynacji plemników in vitro. Obserwowano rozległą, ale przejściową agregację po usunięciu cienkiego drucika z wiszącej kropli nasienia. Prowadzi to do tego, że z kropli wystaje wydłużony pęcherzyk, imitujący gruczoł nasienny. Z powodu ograniczeń 3D i krótkiego czasu suszenia kroplowego, cały blok szybko popadł w ruinę9. W niniejszym badaniu, wykorzystując kury Sharkashi i mikrochipy, udało nam się opisać, jak powstają te pęczki i jak się poruszają. Pęczki plemników formowały się natychmiast po pobraniu nasienia i stwierdzono, że poruszały się spiralnie, wykazując dodatnią reologię, gdy były obecne w przepływie. Ponadto, w obserwacji makroskopowej zaobserwowano, że pęczki plemników wykazują większą liniowość ruchliwości w porównaniu z plemnikami izolowanymi. Sugeruje to, że aglutynacja plemników może wystąpić przed penetracją SST i że produkcja plemników nie jest ograniczona do małego obszaru z powodu stresu, jak sugerowano wcześniej (Tingari i Lake12). Podczas formowania kępki plemniki pływają synchronicznie, aż utworzą połączenie, następnie ich witki owijają się wokół siebie, a główka plemnika pozostaje wolna, ale witka i dystalna część plemnika sklejają się lepką substancją. Zatem wolna główka więzadła jest odpowiedzialna za ruch, ciągnąc za sobą resztę więzadła. Skaningowa mikroskopia elektronowa wiązek plemników wykazała, że ​​przyczepione główki plemników pokryte są dużą ilością lepkiej substancji, co sugeruje, że główki plemników były przyczepione w spoczynkowych wiązkach, co mogło nastąpić po dotarciu do miejsca magazynowania (SST).
Po zabarwieniu rozmazu nasienia oranżem akrydyny, pod mikroskopem fluorescencyjnym można zobaczyć zewnątrzkomórkowy materiał adhezyjny wokół plemników. Substancja ta umożliwia plemnikom przyleganie i przywieranie do otaczających powierzchni lub cząstek, zapobiegając ich unoszeniu się wraz z otaczającym je strumieniem. Nasze obserwacje wskazują zatem na rolę adhezji plemników w postaci ruchomych wiązek. Ich zdolność do płynięcia pod prąd i przylegania do pobliskich powierzchni pozwala plemnikom dłużej pozostać w płynie powierzchniowym (SST).
Rothschild25 użył kamery hemocytometrycznej do badania unoszenia się nasienia bydła w kropli zawiesiny, wykonując mikrofotografie kamerą z pionową i poziomą osią optyczną mikroskopu. Wyniki wykazały, że plemniki były przyciągane do powierzchni komory. Autorzy sugerują, że mogą istnieć oddziaływania hydrodynamiczne między plemnikami a powierzchnią. Biorąc to pod uwagę, a także zdolność nasienia kurcząt Sharkashi do tworzenia lepkich kępek, może to zwiększyć prawdopodobieństwo przylegania nasienia do ściany SST i jego długotrwałego przechowywania.
Bccetti i Afzeliu26 donieśli, że glikokaliks plemników jest niezbędny do rozpoznawania i aglutynacji gamet. Forman10 zaobserwował, że hydroliza wiązań α-glikozydowych w otoczkach glikoproteinowo-glikolipidowych poprzez działanie neuraminidazą na nasienie ptaków powodowała zmniejszenie płodności bez wpływu na ruchliwość plemników. Autorzy sugerują, że wpływ neuraminidazy na glikokaliks upośledza sekwestrację plemników w połączeniu maciczno-pochwowym, zmniejszając tym samym płodność. Ich obserwacje nie mogą ignorować możliwości, że leczenie neuraminidazą może osłabiać rozpoznawanie plemników i oocytów. Forman i Engel10 stwierdzili, że płodność była zmniejszona, gdy kury były inseminowane dopochwowo nasieniem poddanym działaniu neuraminidazy. Jednakże zapłodnienie in vitro z nasieniem poddanym działaniu neuraminidazy nie miało wpływu na płodność w porównaniu z kurami kontrolnymi. Autorzy doszli do wniosku, że zmiany w powłoce glikoproteinowo-glikolipidowej wokół błony plemnika zmniejszają zdolność plemników do zapłodnienia poprzez upośledzenie sekwestracji plemników na połączeniu maciczno-pochwowym, co z kolei zwiększa utratę plemników ze względu na szybkość połączenia maciczno-pochwowego, ale nie wpływa na rozpoznawanie plemników i komórek jajowych.
U indyków Bakst i Bauchan 11 znaleźli małe pęcherzyki i fragmenty błony w świetle SST i zaobserwowali, że niektóre z tych granulek połączyły się z błoną plemnika. Autorzy sugerują, że te relacje mogą przyczyniać się do długotrwałego przechowywania plemników w SST. Jednak naukowcy nie określili źródła tych cząstek, czy są one wydzielane przez komórki nabłonkowe CCT, produkowane i wydzielane przez męski układ rozrodczy, czy też produkowane przez same plemniki. Ponadto, te cząstki są odpowiedzialne za aglutynację. Grützner i wsp. 27 donieśli, że komórki nabłonkowe najądrza produkują i wydzielają specyficzne białko, które jest niezbędne do tworzenia jednoporowych dróg nasiennych. Autorzy donoszą również, że rozproszenie tych wiązek zależy od interakcji białek najądrza. Nixon i wsp. 28 odkryli, że przydatki wydzielają białko, kwaśną osteonektynę bogatą w cysteinę; SPARC bierze udział w tworzeniu kępek plemników u kolczatek krótkodziobych i dziobaków. Rozproszenie tych wiązek jest związane z utratą tego białka.
W niniejszym badaniu analiza ultrastrukturalna z wykorzystaniem mikroskopii elektronowej wykazała, że ​​plemniki przylegały do ​​dużej ilości gęstego materiału. Uważa się, że substancje te odpowiadają za aglutynację, która kondensuje się pomiędzy i wokół przylegających główek, ale w niższych stężeniach w okolicy witki. Zakładamy, że ta substancja aglutynująca jest wydalana z męskiego układu rozrodczego (najądrza lub nasieniowodu) wraz z nasieniem, ponieważ często obserwujemy oddzielanie się nasienia od limfy i osocza nasiennego podczas ejakulacji. Donoszono, że plemniki ptaków, gdy przechodzą przez najądrza i nasieniowody, przechodzą zmiany związane z dojrzewaniem, które wspierają ich zdolność do wiązania białek i nabywania glikoprotein związanych z lemmą plazmową. Trwałość tych białek na błonach plemników rezydentnych w SST sugeruje, że białka te mogą wpływać na uzyskanie stabilności błony plemników30 i determinować ich płodność31. Ahammad i wsp.32 podali, że plemniki pobrane z różnych części męskiego układu rozrodczego (od jąder do dystalnego odcinka nasieniowodu) wykazują stopniowo zwiększoną żywotność w warunkach przechowywania w stanie płynnym, niezależnie od temperatury przechowywania, a żywotność u kurcząt zwiększa się również w jajowodach po sztucznej inseminacji.
Kępki plemników u kur Sharkashi mają inne cechy i funkcje niż u innych gatunków, takich jak kolczatki, dziobaki, myszy leśne, szczury jelenie i świnki morskie. U kur Sharkasi tworzenie wiązek plemników zmniejszało ich prędkość pływania w porównaniu z pojedynczymi plemnikami. Jednakże, te wiązeczki zwiększały odsetek plemników reologicznie dodatnich i zwiększały zdolność plemników do stabilizacji w dynamicznym środowisku. Zatem nasze wyniki potwierdzają wcześniejszą sugestię, że aglutynacja plemników w SST jest związana z długotrwałym przechowywaniem plemników. Stawiamy również hipotezę, że skłonność plemników do tworzenia kępek może kontrolować tempo utraty plemników w SST, co może wpływać na wynik konkurencji plemników. Zgodnie z tym założeniem, plemniki o niskiej zdolności aglutynacji uwalniają SST jako pierwsze, podczas gdy plemniki o wysokiej zdolności aglutynacji produkują większość potomstwa. Tworzenie się wiązek plemników z pojedynczym porem jest korzystne i wpływa na stosunek rodzic-dziecko, ale wykorzystuje inny mechanizm. U kolczatek i dziobaków plemniki są ułożone równolegle do siebie, aby zwiększyć prędkość wiązki. Wiązki plemników u kolczatek poruszają się około trzy razy szybciej niż pojedyncze plemniki. Uważa się, że tworzenie się takich wiązek plemników u kolczatek jest ewolucyjną adaptacją mającą na celu utrzymanie dominacji, ponieważ samice są rozwiązłe i zazwyczaj łączą się z kilkoma samcami. Dlatego plemniki z różnych ejakulatów zaciekle konkurują o zapłodnienie komórki jajowej.
Aglutynowane plemniki kurcząt sharkasi są łatwe do uwidocznienia za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym, co jest uważane za korzystne, ponieważ umożliwia łatwe badanie zachowania plemników in vitro. Mechanizm, dzięki któremu formowanie się kępek plemników sprzyja rozmnażaniu u kurcząt sharkasi, różni się również od mechanizmu obserwowanego u niektórych ssaków łożyskowych, reprezentujących zachowania kooperacyjne plemników, takie jak myszy leśne, gdzie niektóre plemniki docierają do jaj, pomagając innym spokrewnionym osobnikom dotrzeć do jaj i je uszkodzić. Aby udowodnić swoją wartość, należy zachować się altruistycznie. Samozapłodnienie 34. Inny przykład zachowań kooperacyjnych u plemników zaobserwowano u myszy jeleniowatych, gdzie plemniki były w stanie identyfikować się i łączyć z plemnikami najbardziej spokrewnionymi genetycznie, tworząc grupy kooperacyjne, co zwiększa ich szybkość w porównaniu z plemnikami niespokrewnionymi 35.
Wyniki uzyskane w tym badaniu nie przeczą teorii Fomana dotyczącej długotrwałego przechowywania plemników w SWS. Naukowcy donoszą, że plemniki nadal poruszają się w strumieniu komórek nabłonkowych wyściełających SST przez dłuższy okres czasu, a po pewnym czasie magazyny energii plemników ulegają wyczerpaniu, co powoduje spadek prędkości, co umożliwia wydalanie substancji o małej masie cząsteczkowej. energia plemników z przepływem płynu ze światła SST Jamy jajowodu. W obecnym badaniu zaobserwowaliśmy, że połowa pojedynczych plemników wykazała zdolność do pływania pod prąd przepływających płynów, a ich adhezja w pęczku zwiększyła ich zdolność do wykazywania pozytywnej reologii. Ponadto nasze dane są zgodne z danymi Matsuzaki i in. 1, którzy donieśli, że zwiększone wydzielanie mleczanu w SST może hamować ruchliwość rezydentnych plemników. Jednakże nasze wyniki opisują powstawanie ruchomych więzadeł plemników i ich zachowanie reologiczne w obecności dynamicznego środowiska wewnątrz mikrokanalika, co stanowi próbę wyjaśnienia ich zachowania w warunkach SST. Przyszłe badania mogą skupić się na określeniu składu chemicznego i pochodzenia czynnika aglutynującego, co niewątpliwie pomoże naukowcom opracować nowe metody przechowywania nasienia płynnego i wydłużyć czas trwania płodności.
Piętnaście 30-tygodniowych samców sharkasi z gołą szyją (homozygota dominująca; Na Na) wybrano jako dawców nasienia do badania. Ptaki były hodowane na fermie drobiu badawczego Wydziału Rolnictwa Uniwersytetu Ashit w prowincji Ashit w Egipcie. Ptaki trzymano w indywidualnych klatkach (30 x 40 x 40 cm), poddano programowi świetlnemu (16 godzin światła i 8 godzin ciemności) i karmiono dietą zawierającą 160 g białka surowego, 2800 kcal energii przyswajalnej i 35 g wapnia. 5 gramów przyswajalnego fosforu na kilogram diety.
Zgodnie z danymi 36, 37, nasienie pobrano od samców poprzez masaż brzucha. Łącznie pobrano 45 próbek nasienia od 15 mężczyzn w ciągu 3 dni. Nasienie (n = 15/dzień) zostało natychmiast rozcieńczone w stosunku 1:1 (v:v) rozcieńczalnikiem Belsville Poultry Semen Diluent, który zawiera difosforan potasu (1,27 g), monohydrat glutaminianu monosodowego (0,867 g), fruktozę (0,5 d), bezwodny octan sodu (0,43 g), tris(hydroksymetylo)aminometan (0,195 g), monohydrat cytrynianu potasu (0,064 g), monofosforan potasu (0,065 g), chlorek magnezu (0,034 g) i wodę (100 ml). pH = 7,5, osmolarność 333 mOsm/kg38. Rozcieńczone próbki nasienia najpierw badano pod mikroskopem świetlnym, aby upewnić się, że nasienie ma dobrą jakość (wilgotność), a następnie przechowywano je w łaźni wodnej w temperaturze 37°C do momentu użycia w ciągu pół godziny od pobrania.
Kinematyka i reologia plemników zostały opisane za pomocą systemu urządzeń mikroprzepływowych. Próbki nasienia rozcieńczono do 1:40 w rozcieńczalniku Beltsville Avian Semen Diluent, załadowano do urządzenia mikroprzepływowego (patrz poniżej), a parametry kinetyczne określono za pomocą systemu komputerowej analizy nasienia (CASA) opracowanego wcześniej do charakteryzacji mikroprzepływowej. Badania nad ruchliwością plemników w środowisku ciekłym (Wydział Mechaniczny, Wydział Inżynierii, Uniwersytet Assiut, Egipt) można pobrać ze strony: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39. Zmierzono prędkość krzywej (VCL, μm/s), prędkość liniową (VSL, μm/s) oraz średnią prędkość trajektorii (VAP, μm/s). Filmy plemników zostały wykonane przy użyciu odwróconego mikroskopu fazowo-kontrastowego Optika XDS-3 (z obiektywem 40x) podłączonego do kamery Tucson ISH1000 przy 30 kl./s przez 3 s. Użyj oprogramowania CASA do zbadania co najmniej trzech obszarów i 500 trajektorii plemników na próbkę. Nagranie zostało przetworzone przy użyciu domowej roboty oprogramowania CASA. Definicja ruchliwości we wtyczce CASA opiera się na prędkości pływania plemników w porównaniu do szybkości przepływu i nie obejmuje innych parametrów, takich jak ruch na boki, ponieważ stwierdzono, że jest to bardziej wiarygodne w przepływie płynu. Ruch reologiczny jest opisany jako ruch plemników w kierunku przeciwnym do kierunku przepływu płynu. Plemniki o właściwościach reologicznych podzielono przez liczbę ruchliwych plemników; plemniki w spoczynku i plemniki poruszające się konwekcyjnie wyłączono z liczenia.
Wszystkie użyte substancje chemiczne uzyskano z Elgomhoria Pharmaceuticals (Kair, Egipt), o ile nie zaznaczono inaczej. Urządzenie zostało wyprodukowane zgodnie z opisem El-sherry i in. 40 z pewnymi modyfikacjami. Materiały użyte do wytworzenia mikrokanałów obejmowały płytki szklane (Howard Glass, Worcester, MA), negatywową warstwę ochronną SU-8-25 (MicroChem, Newton, CA), alkohol diacetonowy (Sigma Aldrich, Steinheim, Niemcy) oraz poliaceton (-184, Dow Corning, Midland, Michigan). Mikrokanały wytwarza się metodą miękkiej litografii. Najpierw, na drukarce o wysokiej rozdzielczości (Prismatic, Kair, Egipt i Pacific Arts and Design, Markham, ON) wydrukowano przezroczystą maskę ochronną z pożądanym wzorem mikrokanałów. Matryce wykonano, używając szklanych płyt jako podłoża. Płytki oczyszczono w acetonie, izopropanolu i wodzie dejonizowanej, a następnie pokryto 20 µm warstwą SU8-25 metodą wirowania (3000 obr./min, 1 min). Warstwy SU-8 delikatnie wysuszono (65°C, 2 min i 95°C, 10 min) i wystawiono na działanie promieniowania UV przez 50 s. Po naświetleniu wypalono w temperaturze 65°C i 95°C przez 1 min i 4 min w celu usieciowania odsłoniętych warstw SU-8, a następnie wywoływano w alkoholu diacetonowym przez 6,5 min. Wypalono wafle w temperaturze 200°C przez 15 min, aby dodatkowo zestalić warstwę SU-8.
PDMS przygotowano poprzez zmieszanie monomeru i utwardzacza w stosunku wagowym 10:1, a następnie odgazowano w eksykatorze próżniowym i wylano na ramę główną SU-8. PDMS utwardzono w piecu (120°C, 30 min), po czym wycięto kanały, oddzielono je od matrycy i perforowano, aby umożliwić podłączenie rurek na wlocie i wylocie mikrokanalika. Na koniec mikrokanaliki PDMS na stałe przymocowano do szkiełek mikroskopowych za pomocą przenośnego procesora koronowego (Electro-Technic Products, Chicago, IL), jak opisano w innym miejscu. Mikrokanaliki użyte w tym badaniu mają wymiary 200 µm × 20 µm (szer. × wys.) i 3,6 cm długości.
Przepływ cieczy wywołany ciśnieniem hydrostatycznym wewnątrz mikrokanału uzyskuje się dzięki utrzymywaniu poziomu cieczy w zbiorniku wlotowym powyżej różnicy wysokości Δh39 w zbiorniku wylotowym (rys. 1).
gdzie f to współczynnik tarcia, zdefiniowany jako f = C/Re dla przepływu laminarnego w kanale prostokątnym, gdzie C to stała zależna od współczynnika kształtu kanału, L to długość mikrokanału, Vav to średnia prędkość wewnątrz mikrokanału, Dh to średnica hydrauliczna kanału, g – przyspieszenie ziemskie. Korzystając z tego równania, średnią prędkość kanału można obliczyć za pomocą następującego równania: