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La fertilità degli uccelli dipende dalla loro capacità di immagazzinare una quantità sufficiente di spermatozoi vitali per un periodo prolungato nei tubuli di accumulo dello sperma (SST). Il meccanismo esatto con cui gli spermatozoi entrano, risiedono ed escono dagli SST rimane controverso. Gli spermatozoi delle galline sharkasi hanno mostrato un'elevata tendenza all'agglutinazione, formando fasci filamentosi mobili contenenti molte cellule. Data la difficoltà di osservare la motilità e il comportamento degli spermatozoi in una tuba di Falloppio opaca, abbiamo utilizzato un dispositivo microfluidico con una sezione trasversale del microcanale simile a quella degli spermatozoi per studiare l'agglutinazione e la motilità degli spermatozoi. Questo studio discute come si formano i fasci di spermatozoi, come si muovono e il loro possibile ruolo nel prolungare la permanenza degli spermatozoi negli SST. Abbiamo studiato la velocità e il comportamento reologico degli spermatozoi quando il flusso di fluido veniva generato all'interno di un canale microfluidico mediante pressione idrostatica (portata = 33 µm/s). Gli spermatozoi tendono a nuotare controcorrente (reologia positiva) e la velocità del fascio di spermatozoi è significativamente ridotta rispetto a quella dei singoli spermatozoi. È stato osservato che i fasci di spermatozoi si muovono a spirale e aumentano di lunghezza e spessore man mano che vengono reclutati più spermatozoi singoli. È stato osservato che i fasci di spermatozoi si avvicinavano e aderivano alle pareti laterali dei canali microfluidici per evitare di essere trascinati via da un flusso di fluido con velocità > 33 µm/s. È stato osservato che i fasci di spermatozoi si avvicinavano e aderivano alle pareti laterali dei canali microfluidici per evitare di essere trascinati via da un flusso di fluido con velocità > 33 µm/s. Ho capito bene cosa gli spermatozoi si attaccano e si attaccano al vapore acqueo microfluido canali, cosa scrivere nella sezione со скоростью потока жидкости> 33 мкм / с. È stato osservato che i fasci di spermatozoi si avvicinano e aderiscono alle pareti laterali dei canali microfluidici per evitare di essere trascinati via a velocità di flusso del fluido superiori a 33 µm/s.La velocità di trasferimento è di 33 µm/s.33 µm/s in meno. Ho capito bene cosa gli spermatozoi si attaccano e si attaccano al forno a microonde canale, cosa vedere nella sezione потоком жидкости со скоростью > 33 мкм/с. È stato osservato che i fasci di spermatozoi si avvicinano e aderiscono alle pareti laterali del canale microfluidico per evitare di essere trascinati via dal flusso del fluido a velocità superiori a 33 µm/s.La microscopia elettronica a scansione e a trasmissione ha rivelato che i fasci di spermatozoi erano supportati da un abbondante materiale denso. I dati ottenuti dimostrano l'eccezionale mobilità degli spermatozoi di pollo Sharkazi, nonché la capacità degli spermatozoi di agglutinarsi e formare fasci mobili, il che contribuisce a una migliore comprensione della conservazione a lungo termine degli spermatozoi in SMT.
Per ottenere la fecondazione negli esseri umani e nella maggior parte degli animali, gli spermatozoi e gli ovuli devono arrivare nel sito di fecondazione al momento giusto. Pertanto, l'accoppiamento deve avvenire prima o al momento dell'ovulazione. D'altra parte, alcuni mammiferi, come i cani, così come specie non mammifere, come insetti, pesci, rettili e uccelli, immagazzinano gli spermatozoi nei loro organi riproduttivi per un periodo di tempo prolungato fino a quando i loro ovuli non sono pronti per la fecondazione (fecondazione asincrona 1). Gli uccelli sono in grado di mantenere la vitalità degli spermatozoi capaci di fecondare gli ovuli per 2-10 settimane2.
Questa è una caratteristica unica che distingue gli uccelli dagli altri animali, in quanto garantisce un'alta probabilità di fecondazione dopo una singola inseminazione per diverse settimane, senza necessità di accoppiamento e ovulazione simultanei. L'organo principale di conservazione dello sperma, chiamato tubulo di accumulo dello sperma (SST), si trova nelle pieghe mucose interne a livello della giunzione uterovaginale. Ad oggi, i meccanismi con cui gli spermatozoi entrano, risiedono ed escono dalla banca del seme non sono ancora del tutto chiari. Sulla base di studi precedenti, sono state formulate numerose ipotesi, ma nessuna di esse è stata confermata.
Forman4 ha ipotizzato che gli spermatozoi mantengano la loro permanenza nella cavità SST attraverso un continuo movimento oscillatorio contro la direzione del flusso di fluido attraverso canali proteici situati sulle cellule epiteliali SST (reologia). L'ATP si esaurisce a causa della costante attività flagellare necessaria per mantenere gli spermatozoi nel lume SST e la motilità diminuisce gradualmente fino a quando gli spermatozoi vengono trasportati fuori dalla banca del seme dal flusso di fluido e iniziano un nuovo viaggio lungo la tuba di Falloppio ascendente per fecondare l'ovulo (Forman4). Questo modello di conservazione degli spermatozoi è supportato dal rilevamento, tramite immunocitochimica, delle acquaporine 2, 3 e 9 presenti nelle cellule epiteliali SST. Ad oggi, mancano studi sulla reologia del seme di pollo e sul suo ruolo nella conservazione SST, nella selezione vaginale degli spermatozoi e nella competizione spermatica. Nei polli, gli spermatozoi entrano nella vagina dopo l'accoppiamento naturale, ma oltre l'80% degli spermatozoi viene espulso dalla vagina poco dopo l'accoppiamento. Ciò suggerisce che la vagina sia il sito primario per la selezione degli spermatozoi negli uccelli. Inoltre, è stato riportato che meno dell'1% degli spermatozoi fecondati nella vagina finisce negli SST². Nell'inseminazione artificiale dei pulcini nella vagina, il numero di spermatozoi che raggiungono gli SST tende ad aumentare 24 ore dopo l'inseminazione. Finora, il meccanismo di selezione degli spermatozoi durante questo processo non è chiaro e la motilità spermatica potrebbe svolgere un ruolo importante nell'assorbimento degli spermatozoi da parte degli SST. A causa delle pareti spesse e opache delle tube di Falloppio, è difficile monitorare direttamente la motilità degli spermatozoi nelle tube di Falloppio degli uccelli. Pertanto, ci mancano conoscenze di base su come gli spermatozoi passano agli SST dopo la fecondazione.
La reologia è stata recentemente riconosciuta come un fattore importante nel controllo del trasporto degli spermatozoi nei genitali dei mammiferi. Basandosi sulla capacità degli spermatozoi mobili di migrare in controcorrente, Zaferani et al.8 hanno utilizzato un sistema microfluidico Corra per isolare passivamente gli spermatozoi mobili da campioni di seme raccolti in recinti. Questo tipo di selezione del seme è essenziale per il trattamento medico dell'infertilità e per la ricerca clinica, ed è preferibile ai metodi tradizionali che richiedono molto tempo e manodopera e possono compromettere la morfologia e l'integrità strutturale degli spermatozoi. Tuttavia, ad oggi, non sono stati condotti studi sull'effetto delle secrezioni degli organi genitali dei polli sulla motilità degli spermatozoi.
Indipendentemente dal meccanismo che mantiene lo sperma immagazzinato nell'SST, molti ricercatori hanno osservato che gli spermatozoi residenti si agglutinano testa a testa nell'SST di polli 9, 10, quaglie 2 e tacchini 11 per formare fasci di spermatozoi agglutinati. Gli autori suggeriscono che esista un collegamento tra questa agglutinazione e la conservazione a lungo termine degli spermatozoi nell'SST.
Tingari e Lake¹² hanno riportato una forte associazione tra gli spermatozoi nella ghiandola ricevente lo sperma del pollo e si sono chiesti se gli spermatozoi aviari si agglutinano allo stesso modo degli spermatozoi dei mammiferi. Credono che le profonde connessioni tra gli spermatozoi nel dotto deferente possano essere dovute allo stress causato dalla presenza di un gran numero di spermatozoi in uno spazio ristretto.
Valutando il comportamento degli spermatozoi su vetrini freschi sospesi, si possono osservare segni transitori di agglutinazione, soprattutto ai bordi delle gocce di sperma. Tuttavia, l'agglutinazione era spesso disturbata dall'azione rotatoria associata al movimento continuo, il che spiega la natura transitoria di questo fenomeno. I ricercatori hanno anche notato che, quando veniva aggiunto il diluente allo sperma, comparivano aggregati cellulari allungati "a forma di filo".
I primi tentativi di simulare uno spermatozoo furono effettuati rimuovendo un filo sottile da una goccia sospesa, ottenendo una vescicola allungata simile a uno spermatozoo che sporgeva dalla goccia di sperma. Gli spermatozoi si allineavano immediatamente in modo parallelo all'interno della vescicola, ma l'intera unità scompariva rapidamente a causa della limitazione tridimensionale. Pertanto, per studiare l'agglutinazione degli spermatozoi, è necessario osservare la motilità e il comportamento degli spermatozoi direttamente nei tubuli di accumulo dello sperma isolati, cosa difficile da realizzare. Di conseguenza, è necessario sviluppare uno strumento che simuli gli spermatozoi per supportare gli studi sulla motilità e sul comportamento di agglutinazione degli spermatozoi. Brillard et al.¹³ hanno riportato che la lunghezza media dei tubuli di accumulo dello sperma nei pulcini adulti è di 400-600 µm, ma alcuni tubuli possono raggiungere i 2000 µm. Mero e Ogasawara14 hanno diviso le ghiandole seminifere in tubuli di accumulo dello sperma ingranditi e non ingranditi, entrambi della stessa lunghezza (~500 µm) e larghezza del collo (~38 µm), ma il diametro medio del lume dei tubuli era rispettivamente di 56,6 e 56,6 µm e 11,2 μm. Nel presente studio, abbiamo utilizzato un dispositivo microfluidico con una dimensione del canale di 200 µm × 20 µm (L × A), la cui sezione trasversale è in qualche modo simile a quella dell'SST amplificato. Inoltre, abbiamo esaminato la motilità degli spermatozoi e il comportamento di agglutinazione nel fluido in movimento, il che è coerente con l'ipotesi di Foreman secondo cui il fluido prodotto dalle cellule epiteliali dell'SST mantiene gli spermatozoi nel lume in direzione controcorrente (reologica).
Lo scopo di questo studio era superare i problemi relativi all'osservazione della motilità degli spermatozoi nella tuba di Falloppio ed evitare le difficoltà nello studio della reologia e del comportamento degli spermatozoi in un ambiente dinamico. È stato utilizzato un dispositivo microfluidico che crea pressione idrostatica per simulare la motilità degli spermatozoi nei genitali di un pollo.
Quando una goccia di un campione di sperma diluito (1:40) veniva caricata nel dispositivo a microcanali, si potevano identificare due tipi di motilità spermatica (spermatozoi isolati e spermatozoi legati). Inoltre, gli spermatozoi tendevano a nuotare controcorrente (reologia positiva; video 1, 2). Sebbene i fasci di spermatozoi avessero una velocità inferiore rispetto a quella degli spermatozoi isolati (p < 0,001), hanno aumentato la percentuale di spermatozoi che mostravano reotassi positiva (p < 0,001; Tabella 2). Sebbene i fasci di spermatozoi avessero una velocità inferiore rispetto a quella degli spermatozoi isolati (p < 0,001), hanno aumentato la percentuale di spermatozoi che mostravano reotassi positiva (p < 0,001; Tabella 2). Molti spermatozoi hanno un punteggio più basso, che è uno spermatozoo diverso (p < 0,001), solo gli spermatozoi del professionista, dimostrazione della reazione dimostrativa (p < 0,001; tabella 2). Sebbene i fasci di spermatozoi avessero una velocità inferiore rispetto a quella dei singoli spermatozoi (p < 0,001), hanno aumentato la percentuale di spermatozoi che mostravano reotassi positiva (p < 0,001; Tabella 2).尽管精子束的速度低于孤精子的速度（p < 0,001）, ma non è così: p < 0,001；表2）.尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 （p <0.001） ， 但 增加 了 显示 阳性 流变性 精子百分比 （p <0.001 ； 2。。。。。）））））） Il punteggio degli spermatozoi non è stato elevato, rispetto agli spermatozoi differenziati (p < 0,001) professionista spermatozoi s положительной реологией (p < 0,001; tabella 2). Sebbene la velocità dei fasci di spermatozoi fosse inferiore a quella dei singoli spermatozoi (p < 0,001), essi hanno aumentato la percentuale di spermatozoi con reologia positiva (p < 0,001; Tabella 2).La reologia positiva per i singoli spermatozoi e per i ciuffi spermatici è stimata rispettivamente intorno al 53% e all'85%.
È stato osservato che gli spermatozoi dei polli Sharkasi, subito dopo l'eiaculazione, formano fasci lineari composti da decine di individui. Questi ciuffi aumentano di lunghezza e spessore nel tempo e possono rimanere in vitro per diverse ore prima di dissolversi (video 3). Questi fasci filamentosi hanno la forma degli spermatozoi di echidna che si formano all'estremità dell'epididimo. È stato riscontrato che il seme di gallina Sharkasi ha un'elevata tendenza ad agglutinarsi e a formare un fascio reticolato in meno di un minuto dalla raccolta. Questi fasci sono dinamici e in grado di aderire a qualsiasi parete vicina o oggetto statico. Sebbene i fasci di spermatozoi riducano la velocità degli spermatozoi, è chiaro che macroscopicamente ne aumentano la linearità. La lunghezza dei fasci varia a seconda del numero di spermatozoi raccolti. Sono state isolate due parti del fascio: la parte iniziale, che include la testa libera dello spermatozoo agglutinato, e la parte terminale, che include la coda e l'intera estremità distale dello spermatozoo. Utilizzando una telecamera ad alta velocità (950 fps), sono state osservate teste libere di spermatozoi agglutinati nella parte iniziale del fascio, responsabili del movimento del fascio grazie al loro moto oscillatorio, trascinando i rimanenti nel fascio con un movimento elicoidale (Video 4). Tuttavia, nei ciuffi lunghi, è stato osservato che alcune teste di spermatozoi libere aderenti al corpo e alla porzione terminale del ciuffo agiscono come pale per aiutare a spingere il ciuffo.
In un flusso lento di fluido, i fasci di spermatozoi si muovono parallelamente l'uno all'altro; tuttavia, iniziano a sovrapporsi e ad aderire a qualsiasi superficie immobile, per non essere trascinati via dalla corrente man mano che la velocità del flusso aumenta. I fasci si formano quando un piccolo gruppo di spermatozoi si avvicina, inizia a muoversi in sincronia e ad avvolgersi l'uno intorno all'altro, aderendo poi a una sostanza appiccicosa. Le figure 1 e 2 mostrano come gli spermatozoi si avvicinano, formando una giunzione con le code che si avvolgono l'una intorno all'altra.
I ricercatori hanno applicato pressione idrostatica per creare un flusso di fluido in un microcanale al fine di studiare la reologia degli spermatozoi. È stato utilizzato un microcanale di dimensioni pari a 200 µm × 20 µm (larghezza × altezza) e una lunghezza di 3,6 µm. I microcanali sono stati utilizzati tra contenitori con siringhe inserite alle estremità. È stato utilizzato del colorante alimentare per rendere i canali più visibili.
Fissare i cavi di interconnessione e gli accessori alla parete. Il video è stato girato con un microscopio a contrasto di fase. Per ogni immagine, vengono presentate immagini di microscopia a contrasto di fase e immagini di mappatura. (A) La connessione tra due flussi resiste al flusso a causa del movimento elicoidale (freccia rossa). (B) La connessione tra il fascio di tubi e la parete del canale (frecce rosse), contemporaneamente sono collegati ad altri due fasci (frecce gialle). (C) I fasci di spermatozoi nel canale microfluidico iniziano a connettersi tra loro (frecce rosse), formando una rete di fasci di spermatozoi. (D) Formazione di una rete di fasci di spermatozoi.
Quando una goccia di sperma diluito è stata caricata nel dispositivo microfluidico e si è creato un flusso, si è osservato che il fascio di spermatozoi si muoveva contro la direzione del flusso. I fasci aderiscono perfettamente alle pareti dei microcanali e le teste libere nella parte iniziale dei fasci vi aderiscono (video 5). Aderiscono anche a qualsiasi particella stazionaria sul loro percorso, come detriti, per resistere all'essere trascinati via dalla corrente. Nel tempo, questi ciuffi diventano lunghi filamenti che intrappolano altri spermatozoi singoli e ciuffi più corti (video 6). Quando il flusso inizia a rallentare, lunghe file di spermatozoi iniziano a formare una rete di linee di spermatozoi (video 7; figura 2).
Ad alta velocità di flusso (V > 33 µm/s), i movimenti a spirale dei filamenti aumentano nel tentativo di catturare molti singoli spermatozoi, formando fasci che resistono meglio alla forza di deriva del flusso. Ad alta velocità di flusso (V > 33 µm/s), i movimenti a spirale dei filamenti aumentano nel tentativo di catturare molti singoli spermatozoi, formando fasci che resistono meglio alla forza di deriva del flusso. Quando la corrente è alta (V > 33 cm/s) la doppia spirale non viene utilizzata, perché si accende ottenere moltissime informazioni spermatozoi, spruzzi d'acqua che traggono vantaggio da un'altra pentola. Ad alte velocità di flusso (V > 33 µm/s), i movimenti elicoidali dei filamenti aumentano nel tentativo di catturare molti singoli spermatozoi, formando fasci in grado di resistere meglio alla forza di deriva del flusso.在高流速(V > 33 µm/s)时, 螺纹的螺旋运动增加, 以试图捕捉许多形成束的单个精子,从而更好地抵抗流动的漂移力.在 高 流速 (v> 33 µm/s) 时 ， 的 螺旋 运动 增加 ， 以 试图 许多 形成 束 单 个 精子 ， 从而 更 地抵抗 的 漂移力。。。。。。。。。 Con un'elevata potenza di scarico (V > 33 cm/s) la doppia spirale non si accende nella fase di scarico molti altri spermatozoi, spermatozoi, che amano trarre vantaggio dal silama di un'altra bevanda. Ad alte velocità di flusso (V > 33 µm/s), il movimento elicoidale dei filamenti aumenta nel tentativo di catturare molti spermatozoi individuali, formando fasci per resistere meglio alle forze di deriva del flusso.Hanno anche tentato di fissare dei microcanali alle pareti laterali.
I fasci di spermatozoi sono stati identificati come ammassi di teste di spermatozoi e code arricciate mediante microscopia ottica (LM). I fasci di spermatozoi con vari aggregati sono stati identificati anche come teste ritorte e aggregati flagellari, code di spermatozoi multiple fuse, teste di spermatozoi attaccate a una coda e teste di spermatozoi con nuclei piegati come nuclei multipli fusi. microscopia elettronica a trasmissione (TEM). La microscopia elettronica a scansione (SEM) ha mostrato che i fasci di spermatozoi erano aggregati rivestiti di teste di spermatozoi e gli aggregati di spermatozoi mostravano una rete attaccata di code avvolte.
La morfologia e l'ultrastruttura degli spermatozoi, nonché la formazione di fasci di spermatozoi, sono state studiate mediante microscopia ottica (sezioni parziali), microscopia elettronica a scansione (SEM) e microscopia elettronica a trasmissione (TEM); i preparati di sperma sono stati colorati con arancio di acridina ed esaminati mediante microscopia a epifluorescenza.
La colorazione dello striscio di sperma con arancio di acridina (Fig. 3B) ha mostrato che le teste degli spermatozoi erano attaccate tra loro e ricoperte di materiale secretorio, il che ha portato alla formazione di grandi ciuffi (Fig. 3D). I fasci di spermatozoi erano costituiti da aggregati di spermatozoi con una rete di code attaccate (Fig. 4A-C). I fasci di spermatozoi sono composti dalle code di molti spermatozoi attaccati insieme (Fig. 4D). Le secrezioni (Fig. 4E,F) ricoprivano le teste dei fasci di spermatozoi.
Formazione del fascio di spermatozoi. Utilizzando la microscopia a contrasto di fase e strisci di sperma colorati con arancio di acridina, è stato dimostrato che le teste degli spermatozoi aderiscono tra loro. (A) La formazione iniziale del ciuffo di spermatozoi inizia con uno spermatozoo (cerchio bianco) e tre spermatozoi (cerchio giallo), con la spirale che parte dalla coda e termina alla testa. (B) Microfotografia di uno striscio di sperma colorato con arancio di acridina che mostra le teste degli spermatozoi aderenti (frecce). La secrezione copre la/le testa/e. Ingrandimento × 1000. (C) Sviluppo di un grande fascio trasportato dal flusso in un canale microfluidico (utilizzando una telecamera ad alta velocità a 950 fps). (D) Micrografia di uno striscio di sperma colorato con arancio di acridina che mostra grandi ciuffi (frecce). Ingrandimento: ×200.
Micrografia elettronica a scansione di un fascio di spermatozoi e di uno striscio di sperma colorato con arancio di acridina. (A, B, D, E) sono micrografie elettroniche a scansione a colori digitali di spermatozoi, mentre C e F sono micrografie di strisci di sperma colorati con arancio di acridina che mostrano l'adesione di più spermatozoi che avvolgono la membrana caudale. (AC) Gli aggregati di spermatozoi sono mostrati come una rete di code attaccate (frecce). (D) Adesione di diversi spermatozoi (con sostanza adesiva, contorno rosa, freccia) che avvolgono la coda. (E e F) Aggregati di teste di spermatozoi (indicatori) ricoperti di materiale adesivo (indicatori). Gli spermatozoi formavano fasci con diverse strutture a vortice (F). (C) Ingrandimenti ×400 e (F) ×200.
Utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione, abbiamo scoperto che i fasci di spermatozoi avevano code attaccate (Fig. 6A, C), teste attaccate alle code (Fig. 6B) o teste attaccate alle code (Fig. 6D). Le teste degli spermatozoi nel fascio sono curve e presentano in sezione due regioni nucleari (Fig. 6D). Nel fascio dell'incisione, gli spermatozoi avevano una testa contorta con due regioni nucleari e molteplici regioni flagellari (Fig. 5A).
Micrografia elettronica digitale a colori che mostra le code di collegamento nel fascio di spermatozoi e il materiale agglutinante che collega le teste degli spermatozoi. (A) Coda attaccata di un gran numero di spermatozoi. Si noti l'aspetto della coda sia in proiezione verticale (freccia) che orizzontale (freccia). (B) La testa (freccia) dello spermatozoo è collegata alla coda (freccia). (C) Diverse code di spermatozoi (frecce) sono attaccate. (D) Il materiale agglutinante (AS, blu) collega quattro teste di spermatozoi (viola).
La microscopia elettronica a scansione è stata utilizzata per rilevare le teste degli spermatozoi in fasci di spermatozoi ricoperti da secrezioni o membrane (Figura 6B), indicando che i fasci di spermatozoi erano ancorati da materiale extracellulare. Il materiale agglutinato era concentrato nella testa dello spermatozoo (struttura simile alla testa di una medusa; Fig. 5B) e si espandeva distalmente, conferendo un brillante aspetto giallo alla microscopia a fluorescenza dopo colorazione con arancio di acridina (Fig. 6C). Questa sostanza è chiaramente visibile al microscopio a scansione ed è considerata un legante. Sezioni semifini (Fig. 5C) e strisci di spermatozoi colorati con arancio di acridina hanno mostrato fasci di spermatozoi contenenti teste densamente impacchettate e code arricciate (Fig. 5D).
Diverse microfotografie che mostrano l'aggregazione delle teste degli spermatozoi e delle code ripiegate utilizzando vari metodi. (A) Micrografia elettronica a trasmissione digitale a colori in sezione trasversale di un fascio di spermatozoi che mostra una testa di spermatozoo arrotolata con un nucleo in due parti (blu) e diverse parti flagellari (verde). (B) Micrografia elettronica a scansione digitale a colori che mostra un gruppo di teste di spermatozoi simili a meduse (frecce) che sembrano essere ricoperte. (C) Sezione semifine che mostra teste di spermatozoi aggregate (frecce) e code arricciate (frecce). (D) Micrografia di uno striscio di sperma colorato con arancio di acridina che mostra aggregati di teste di spermatozoi (frecce) e code aderenti arricciate (frecce). Si noti che una sostanza appiccicosa (S) ricopre la testa dello spermatozoo. (D) Ingrandimento × 1000.
Utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione (Fig. 7A), si è inoltre notato che le teste degli spermatozoi erano ritorte e i nuclei avevano una forma a spirale, come confermato dagli strisci di sperma colorati con arancio di acridina ed esaminati mediante microscopia a fluorescenza (Fig. 7B).
(A) Micrografia elettronica a trasmissione a colori digitale e (B) striscio di sperma colorato con arancio di acridina che mostra teste arrotolate e l'attaccamento delle teste e delle code degli spermatozoi (frecce). (B) Ingrandimento × 1000.
Un dato interessante emerso dalla ricerca è che gli spermatozoi di Sharkazi si aggregano formando fasci filamentosi mobili. Le proprietà di questi fasci ci permettono di comprendere il loro possibile ruolo nell'assorbimento e nell'immagazzinamento degli spermatozoi nel SST.
Dopo l'accoppiamento, gli spermatozoi entrano nella vagina e subiscono un intenso processo di selezione, che determina l'ingresso di un numero limitato di spermatozoi nel SST15,16. Ad oggi, i meccanismi con cui gli spermatozoi entrano ed escono dal SST non sono chiari. Nel pollame, gli spermatozoi vengono immagazzinati nel SST per un periodo prolungato da 2 a 10 settimane, a seconda della specie6. Rimangono controversie sulle condizioni del seme durante la conservazione nel SST. Sono in movimento o a riposo? In altre parole, come fanno gli spermatozoi a mantenere la loro posizione nel SST per così tanto tempo?
Forman4 ha suggerito che la permanenza e l'espulsione degli spermatozoi nell'SST potrebbero essere spiegate in termini di motilità spermatica. Gli autori ipotizzano che gli spermatozoi mantengano la loro posizione nuotando contro il flusso del fluido creato dall'epitelio dell'SST e che vengano espulsi dall'SST quando la loro velocità scende al di sotto del punto in cui iniziano a muoversi all'indietro per mancanza di energia. Zaniboni5 ha confermato la presenza di acquaporine 2, 3 e 9 nella porzione apicale delle cellule epiteliali dell'SST, il che potrebbe supportare indirettamente il modello di conservazione degli spermatozoi di Foreman. Nel presente studio, abbiamo scoperto che quasi la metà degli spermatozoi di Sharkashi mostra una reologia positiva nel fluido in movimento e che i fasci di spermatozoi agglutinati aumentano il numero di spermatozoi che mostrano una reologia positiva, sebbene l'agglutinazione li rallenti. Il modo in cui gli spermatozoi risalgono la tuba di Falloppio dell'uccello fino al sito di fecondazione non è ancora del tutto chiaro. Nei mammiferi, il fluido follicolare attrae chimicamente gli spermatozoi. Tuttavia, si ritiene che i chemoattrattori indirizzino gli spermatozoi verso lunghe distanze7. Pertanto, altri meccanismi sono responsabili del trasporto degli spermatozoi. La capacità degli spermatozoi di orientarsi e fluire contro il fluido della tuba di Falloppio rilasciato dopo l'accoppiamento è stata segnalata come un fattore importante nel targeting degli spermatozoi nei topi. Parker 17 ha suggerito che gli spermatozoi attraversano le tube di Falloppio nuotando contro la corrente ciliare negli uccelli e nei rettili. Sebbene non sia stato dimostrato sperimentalmente negli uccelli, Adolphi18 è stato il primo a scoprire che gli spermatozoi aviari danno risultati positivi quando si crea un sottile strato di liquido tra un vetrino coprioggetti e un vetrino portaoggetti con una striscia di carta da filtro. Reologia. Hino e Yanagimachi [19] hanno posizionato un complesso ovaio-tubarico-uterino di topo in un anello di perfusione e hanno iniettato 1 µl di inchiostro nell'istmo per visualizzare il flusso di fluido nelle tube di Falloppio. Hanno notato un movimento molto attivo di contrazione e rilassamento nella tuba di Falloppio, in cui tutte le sfere di inchiostro si muovevano costantemente verso l'ampolla della tuba di Falloppio. Gli autori sottolineano l'importanza del flusso del fluido tubarico dalle tube di Falloppio inferiori a quelle superiori per il sollevamento degli spermatozoi e la fecondazione. Brillard20 ha riportato che nei polli e nei tacchini, gli spermatozoi migrano con un movimento attivo dall'ingresso vaginale, dove vengono immagazzinati, alla giunzione utero-vaginale, dove vengono immagazzinati. Tuttavia, questo movimento non è necessario tra la giunzione utero-vaginale e l'infundibolo perché gli spermatozoi vengono trasportati per spostamento passivo. Conoscendo queste precedenti raccomandazioni e i risultati ottenuti nel presente studio, si può presumere che la capacità degli spermatozoi di muoversi controcorrente (reologia) sia una delle proprietà su cui si basa il processo di selezione. Ciò determina il passaggio degli spermatozoi attraverso la vagina e il loro ingresso nel tubulo contorto prossimale per l'immagazzinamento. Come suggerito da Forman4, ciò potrebbe anche facilitare il processo di ingresso degli spermatozoi nell'SST e nel suo habitat per un certo periodo di tempo, per poi uscirne quando la loro velocità inizia a diminuire.
D'altra parte, Matsuzaki e Sasanami 21 hanno suggerito che gli spermatozoi aviari subiscono cambiamenti di motilità, passando dalla dormienza alla motilità, nei tratti riproduttivi maschili e femminili. L'inibizione della motilità degli spermatozoi residenti nel SST è stata proposta per spiegare il lungo tempo di conservazione degli spermatozoi e il successivo ringiovanimento dopo aver lasciato il SST. In condizioni di ipossia, Matsuzaki et al. 1 hanno riportato un'elevata produzione e rilascio di lattato nel SST, che può portare all'inibizione della motilità degli spermatozoi residenti. In questo caso, l'importanza della reologia degli spermatozoi si riflette nella selezione e nell'assorbimento degli spermatozoi, e non nella loro conservazione.
Il modello di agglutinazione degli spermatozoi è considerato una spiegazione plausibile per il lungo periodo di conservazione degli spermatozoi nel SST, poiché questo è un modello comune di ritenzione degli spermatozoi nel pollame2,22,23. Bakst et al. 2 hanno osservato che la maggior parte degli spermatozoi aderiva l'uno all'altro, formando aggregati fascicolati, e che i singoli spermatozoi erano raramente trovati nel CCM delle quaglie. D'altra parte, Wen et al. 24 hanno osservato più spermatozoi dispersi e meno ciuffi di spermatozoi nel lume del SST nei polli. Sulla base di queste osservazioni, si può presumere che la propensione all'agglutinazione degli spermatozoi differisca tra gli uccelli e tra gli spermatozoi nello stesso eiaculato. Inoltre, Van Krey et al. 9 hanno suggerito che la dissociazione casuale degli spermatozoi agglutinati sia responsabile della graduale penetrazione degli spermatozoi nel lume della tuba di Falloppio. Secondo questa ipotesi, gli spermatozoi con minore capacità di agglutinazione dovrebbero essere espulsi per primi dal SST. In questo contesto, la capacità degli spermatozoi di agglutinarsi potrebbe essere un fattore che influenza l'esito della competizione spermatica negli uccelli sporchi. Inoltre, più a lungo gli spermatozoi agglutinati rimangono dissociati, più a lungo viene mantenuta la fertilità.
Sebbene l'aggregazione degli spermatozoi e la loro formazione in fasci siano state osservate in diversi studi2,22,24, non sono state descritte in dettaglio a causa della complessità della loro osservazione cinematica all'interno del sistema SST. Sono stati effettuati diversi tentativi di studiare l'agglutinazione degli spermatozoi in vitro. Un'aggregazione estesa ma transitoria è stata osservata quando il filo sottile è stato rimosso dalla goccia di seme sospesa. Ciò porta alla formazione di una bolla allungata che sporge dalla goccia, imitando la ghiandola seminale. A causa delle limitazioni 3D e dei brevi tempi di asciugatura per gocciolamento, l'intero blocco si è rapidamente deteriorato9. Nel presente studio, utilizzando polli Sharkashi e chip microfluidici, siamo stati in grado di descrivere come si formano questi ciuffi e come si muovono. I fasci di spermatozoi si sono formati immediatamente dopo la raccolta del seme e si è scoperto che si muovono a spirale, mostrando una reologia positiva quando presenti nel flusso. Inoltre, osservati macroscopicamente, i fasci di spermatozoi hanno mostrato un aumento della linearità della motilità rispetto agli spermatozoi isolati. Ciò suggerisce che l'agglutinazione degli spermatozoi possa verificarsi prima della penetrazione del SST e che la produzione di spermatozoi non sia limitata a una piccola area a causa dello stress, come precedentemente ipotizzato (Tingari e Lake12). Durante la formazione del ciuffo, gli spermatozoi nuotano in sincronia fino a formare una giunzione, quindi le loro code si avvolgono l'una intorno all'altra e la testa dello spermatozoo rimane libera, ma la coda e la parte distale dello spermatozoo aderiscono tra loro grazie a una sostanza appiccicosa. Pertanto, la testa libera del legamento è responsabile del movimento, trascinando il resto del legamento. La microscopia elettronica a scansione dei fasci di spermatozoi ha mostrato teste di spermatozoi attaccate e ricoperte da una grande quantità di materiale appiccicoso, suggerendo che le teste degli spermatozoi fossero attaccate nei fasci a riposo, cosa che potrebbe essere avvenuta dopo aver raggiunto il sito di stoccaggio (SST).
Quando uno striscio di sperma viene colorato con arancio di acridina, al microscopio a fluorescenza è possibile osservare il materiale adesivo extracellulare che circonda gli spermatozoi. Questa sostanza permette agli ammassi di spermatozoi di aderire e rimanere attaccati a qualsiasi superficie o particella circostante, impedendo loro di essere trascinati dalla corrente. Pertanto, le nostre osservazioni dimostrano il ruolo dell'adesione degli spermatozoi sotto forma di ammassi mobili. La loro capacità di nuotare controcorrente e di aderire alle superfici vicine permette agli spermatozoi di rimanere più a lungo nella SST.
Rothschild25 ha utilizzato una telecamera emocitometrica per studiare la distribuzione del liquido seminale bovino in una goccia di sospensione, scattando microfotografie attraverso una telecamera con asse ottico sia verticale che orizzontale del microscopio. I risultati hanno mostrato che gli spermatozoi erano attratti dalla superficie della camera. Gli autori suggeriscono che potrebbero esserci interazioni idrodinamiche tra gli spermatozoi e la superficie. Tenendo conto di ciò, insieme alla capacità del liquido seminale dei pulcini Sharkashi di formare ciuffi appiccicosi, potrebbe aumentare la probabilità che il liquido seminale aderisca alla parete del contenitore SST e venga conservato per lunghi periodi di tempo.
Bccetti e Afzeliu26 hanno riportato che il glicocalice dello sperma è necessario per il riconoscimento e l'agglutinazione dei gameti. Forman10 ha osservato che l'idrolisi dei legami α-glicosidici nei rivestimenti glicoproteici-glicolipidici mediante il trattamento del seme aviario con neuraminidasi ha comportato una riduzione della fertilità senza influenzare la motilità degli spermatozoi. Gli autori suggeriscono che l'effetto della neuraminidasi sul glicocalice compromette il sequestro degli spermatozoi a livello della giunzione utero-vaginale, riducendo così la fertilità. Le loro osservazioni non possono ignorare la possibilità che il trattamento con neuraminidasi possa ridurre il riconoscimento tra spermatozoi e ovociti. Forman e Engel10 hanno scoperto che la fertilità era ridotta quando le galline venivano inseminate per via intravaginale con seme trattato con neuraminidasi. Tuttavia, la fecondazione in vitro con sperma trattato con neuraminidasi non ha influenzato la fertilità rispetto ai polli di controllo. Gli autori hanno concluso che le modifiche al rivestimento glicoproteico-glicolipidico attorno alla membrana dello spermatozoo riducono la capacità dello spermatozoo di fecondare compromettendo il sequestro dello spermatozoo a livello della giunzione utero-vaginale, il che a sua volta aumenta la perdita di spermatozoi a causa della velocità di transito a livello della giunzione utero-vaginale, ma non influisce sul riconoscimento tra spermatozoo e ovulo.
Nei tacchini Bakst e Bauchan 11 hanno trovato piccole vescicole e frammenti di membrana nel lume del tratto seminale singolo (SST) e hanno osservato che alcuni di questi granuli si erano fusi con la membrana dello spermatozoo. Gli autori suggeriscono che queste relazioni possano contribuire alla conservazione a lungo termine degli spermatozoi nel SST. Tuttavia, i ricercatori non hanno specificato la fonte di queste particelle, se siano secrete dalle cellule epiteliali del CCT, prodotte e secrete dal sistema riproduttivo maschile o prodotte dallo spermatozoo stesso. Inoltre, queste particelle sono responsabili dell'agglutinazione. Grützner et al27 hanno riportato che le cellule epiteliali dell'epididimo producono e secernono una proteina specifica necessaria per la formazione dei tratti seminali a poro singolo. Gli autori riportano anche che la dispersione di questi fasci dipende dall'interazione delle proteine ​​epididimali. Nixon et al28 hanno scoperto che gli annessi secernono una proteina, l'osteonectina acida ricca di cisteina; SPARC è coinvolto nella formazione dei ciuffi di spermatozoi nelle echidne dal becco corto e negli ornitorinchi. La dispersione di questi fasci è associata alla perdita di questa proteina.
Nel presente studio, l'analisi ultrastrutturale mediante microscopia elettronica ha mostrato che gli spermatozoi aderivano a una grande quantità di materiale denso. Si ritiene che queste sostanze siano responsabili dell'agglutinazione che si condensa tra e intorno alle teste aderenti, ma a concentrazioni inferiori nella regione della coda. Ipotizziamo che questa sostanza agglutinante venga escreta dal sistema riproduttivo maschile (epididimo o dotto deferente) insieme al liquido seminale, poiché osserviamo spesso la separazione del liquido seminale dalla linfa e dal plasma seminale durante l'eiaculazione. È stato riportato che, quando gli spermatozoi aviari attraversano l'epididimo e il dotto deferente, subiscono cambiamenti legati alla maturazione che supportano la loro capacità di legare proteine ​​e acquisire glicoproteine ​​associate alla lemma plasmatica. La persistenza di queste proteine ​​sulle membrane degli spermatozoi residenti nel SST suggerisce che queste proteine ​​possano influenzare l'acquisizione della stabilità della membrana spermatica 30 e determinarne la fertilità 31. Ahammad et al.32 hanno riportato che gli spermatozoi ottenuti da varie parti del sistema riproduttivo maschile (dai testicoli al dotto deferente distale) mostravano un aumento progressivo della vitalità in condizioni di conservazione liquida, indipendentemente dalla temperatura di conservazione, e la vitalità nei polli aumenta anche nelle tube di Falloppio dopo l'inseminazione artificiale.
I ciuffi di spermatozoi del pollo Sharkashi presentano caratteristiche e funzioni diverse rispetto a quelle di altre specie come echidne, ornitorinchi, topi selvatici, ratti cervo e porcellini d'India. Nei polli Sharkashi, la formazione di fasci di spermatozoi ha ridotto la loro velocità di nuoto rispetto ai singoli spermatozoi. Tuttavia, questi fasci hanno aumentato la percentuale di spermatozoi reologicamente positivi e la capacità degli spermatozoi di stabilizzarsi in un ambiente dinamico. Pertanto, i nostri risultati confermano l'ipotesi precedente secondo cui l'agglutinazione degli spermatozoi in SST è associata alla conservazione a lungo termine degli spermatozoi. Ipotizziamo inoltre che la propensione degli spermatozoi a formare ciuffi possa controllare il tasso di perdita di spermatozoi in SST, il che potrebbe alterare l'esito della competizione spermatica. Secondo questa ipotesi, gli spermatozoi con bassa capacità di agglutinazione rilasciano per primi l'SST, mentre gli spermatozoi con alta capacità di agglutinazione producono la maggior parte della prole. La formazione di fasci di spermatozoi a poro singolo è vantaggiosa e influenza il rapporto genitore-figlio, ma utilizza un meccanismo diverso. Nelle echidne e negli ornitorinchi, gli spermatozoi sono disposti parallelamente tra loro per aumentare la velocità di avanzamento del fascio. I fasci di spermatozoi nelle echidne si muovono circa tre volte più velocemente dei singoli spermatozoi. Si ritiene che la formazione di tali ciuffi di spermatozoi nelle echidne sia un adattamento evolutivo per mantenere il dominio, poiché le femmine sono promiscue e di solito si accoppiano con diversi maschi. Pertanto, gli spermatozoi provenienti da eiaculati diversi competono ferocemente per la fecondazione dell'ovulo.
Gli spermatozoi agglutinati dei polli sharkasi sono facili da visualizzare utilizzando la microscopia a contrasto di fase, che è considerata vantaggiosa perché consente un facile studio del comportamento degli spermatozoi in vitro. Il meccanismo con cui la formazione del ciuffo spermatico promuove la riproduzione nei polli sharkasi è anche diverso da quello osservato in alcuni mammiferi placentati che rappresentano un comportamento spermatico cooperativo come i topi selvatici, dove alcuni spermatozoi raggiungono gli ovuli, aiutando altri individui imparentati a raggiungere e danneggiare i loro ovuli. per dimostrare il proprio valore. comportamento altruistico. Autofecondazione 34. Un altro esempio di comportamento cooperativo negli spermatozoi è stato trovato nei topi cervini, dove gli spermatozoi sono stati in grado di identificare e combinarsi con gli spermatozoi geneticamente più correlati e formare gruppi cooperativi per aumentare la loro velocità rispetto agli spermatozoi non imparentati35.
I risultati ottenuti in questo studio non contraddicono la teoria di Foman sulla conservazione a lungo termine degli spermatozoi nel SST. I ricercatori riportano che gli spermatozoi continuano a muoversi nel flusso delle cellule epiteliali che rivestono il SST per un periodo di tempo prolungato e, dopo un certo periodo, le riserve energetiche degli spermatozoi si esauriscono, con conseguente diminuzione della velocità, che consente l'espulsione di sostanze a basso peso molecolare. L'energia degli spermatozoi viene trasferita dal lume del SST alla cavità della tuba di Falloppio. Nel presente studio, abbiamo osservato che metà dei singoli spermatozoi ha mostrato la capacità di nuotare controcorrente e la loro adesione nel fascio ha aumentato la loro capacità di mostrare una reologia positiva. Inoltre, i nostri dati sono coerenti con quelli di Matsuzaki et al. 1 che hanno riportato che un'aumentata secrezione di lattato nel SST può inibire la motilità degli spermatozoi residenti. Tuttavia, i nostri risultati descrivono la formazione di legamenti di motilità spermatica e il loro comportamento reologico in presenza di un ambiente dinamico all'interno di un microcanale, nel tentativo di chiarirne il comportamento in SST. La ricerca futura potrebbe concentrarsi sulla determinazione della composizione chimica e dell'origine dell'agente agglutinante, il che senza dubbio aiuterà i ricercatori a sviluppare nuovi metodi per conservare il seme liquido e aumentare la durata della fertilità.
Quindici maschi di sharkasi dal collo nudo (omozigoti dominanti; Na Na) di 30 settimane sono stati selezionati come donatori di sperma per lo studio. Gli uccelli sono stati allevati presso l'allevamento avicolo sperimentale della Facoltà di Agraria dell'Università di Ashit, nel Governatorato di Ashit, in Egitto. Gli uccelli erano alloggiati in gabbie individuali (30 x 40 x 40 cm), sottoposti a un programma di illuminazione (16 ore di luce e 8 ore di buio) e alimentati con una dieta contenente 160 g di proteina grezza, 2800 kcal di energia metabolizzabile, 35 g di calcio e 5 grammi di fosforo disponibile per chilogrammo di mangime.
Secondo i dati 36, ​​37, il seme è stato raccolto da maschi mediante massaggio addominale. Un totale di 45 campioni di seme sono stati raccolti da 15 uomini in 3 giorni. Il seme (n = 15/giorno) è stato immediatamente diluito 1:1 (v:v) con Belsville Poultry Semen Diluent, che contiene difosfato di potassio (1,27 g), glutammato monosodico monoidrato (0,867 g), fruttosio (0,5 d), acetato di sodio anidro (0,43 g), tris(idrossimetil)amminometano (0,195 g), citrato di potassio monoidrato (0,064 g), monofosfato di potassio (0,065 g), cloruro di magnesio (0,034 g) e H2O (100 ml), pH = 7, 5, osmolarità 333 mOsm/kg38. I campioni di sperma diluito sono stati inizialmente esaminati al microscopio ottico per verificarne la buona qualità (umidità) e successivamente conservati in un bagno termostatico a 37 °C fino al momento dell'utilizzo, entro mezz'ora dalla raccolta.
La cinematica e la reologia degli spermatozoi sono descritte utilizzando un sistema di dispositivi microfluidici. I campioni di sperma sono stati ulteriormente diluiti a 1:40 in Beltsville Avian Semen Diluent, caricati in un dispositivo microfluidico (vedi sotto) e i parametri cinetici sono stati determinati utilizzando un sistema di analisi computerizzata dello sperma (CASA) precedentemente sviluppato per la caratterizzazione microfluidica. sulla mobilità degli spermatozoi in mezzi liquidi (Dipartimento di Ingegneria Meccanica, Facoltà di Ingegneria, Università di Assiut, Egitto). Il plugin può essere scaricato da: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39. Sono state misurate la velocità di curva (VCL, μm/s), la velocità lineare (VSL, μm/s) e la velocità media della traiettoria (VAP, μm/s). I video degli spermatozoi sono stati acquisiti utilizzando un microscopio a contrasto di fase invertito Optika XDS-3 (con obiettivo 40x) collegato a una telecamera Tucson ISH1000 a 30 fps per 3 s. È stato utilizzato il software CASA per studiare almeno tre aree e 500 traiettorie di spermatozoi per campione. Il video registrato è stato elaborato utilizzando un sistema CASA autocostruito. La definizione di motilità nel plug-in CASA si basa sulla velocità di nuoto degli spermatozoi rispetto alla velocità del flusso e non include altri parametri come il movimento laterale, poiché quest'ultimo si è dimostrato più affidabile nel flusso di fluidi. Il moto reologico è descritto come il movimento degli spermatozoi contro la direzione del flusso del fluido. Gli spermatozoi con proprietà reologiche sono stati divisi per il numero di spermatozoi mobili; gli spermatozoi a riposo e quelli in movimento convettivo sono stati esclusi dal conteggio.
Tutti i prodotti chimici utilizzati sono stati ottenuti da Elgomhoria Pharmaceuticals (Il Cairo, Egitto), salvo diversa indicazione. Il dispositivo è stato fabbricato come descritto da El-sherry et al. 40 con alcune modifiche. I materiali utilizzati per la fabbricazione dei microcanali includevano lastre di vetro (Howard Glass, Worcester, MA), resist negativo SU-8-25 (MicroChem, Newton, CA), alcol diacetonico (Sigma Aldrich, Steinheim, Germania) e poliacetone (-184, Dow Corning, Midland, Michigan). I microcanali sono fabbricati mediante soft litografia. In primo luogo, una maschera protettiva trasparente con il disegno dei microcanali desiderato è stata stampata su una stampante ad alta risoluzione (Prismatic, Il Cairo, Egitto e Pacific Arts and Design, Markham, ON). Gli stampi sono stati realizzati utilizzando lastre di vetro come substrati. Le lastre sono state pulite in acetone, isopropanolo e acqua deionizzata e quindi rivestite con uno strato di 20 µm di SU8-25 mediante spin coating (3000 rpm, 1 min). Gli strati di SU-8 sono stati quindi delicatamente asciugati (65 °C, 2 min e 95 °C, 10 min) ed esposti a radiazioni UV per 50 s. Cottura post-esposizione a 65 °C e 95 °C per 1 min e 4 min per reticolare gli strati di SU-8 esposti, seguita da sviluppo in alcol diacetonico per 6,5 min. Cottura intensa dei waffle (200 °C per 15 min) per solidificare ulteriormente lo strato di SU-8.
Il PDMS è stato preparato miscelando il monomero e l'indurente in un rapporto ponderale di 10:1, quindi degassato in un essiccatore sottovuoto e versato sul supporto principale in SU-8. Il PDMS è stato polimerizzato in forno (120 °C, 30 min), quindi i canali sono stati ritagliati, separati dallo stampo e perforati per consentire il fissaggio dei tubi all'ingresso e all'uscita del microcanale. Infine, i microcanali in PDMS sono stati fissati in modo permanente ai vetrini da microscopio utilizzando un processore a corona portatile (Electro-Technic Products, Chicago, IL) come descritto altrove. Il microcanale utilizzato in questo studio misura 200 µm × 20 µm (L × A) ed è lungo 3,6 cm.
Il flusso di fluido indotto dalla pressione idrostatica all'interno del microcanale si ottiene mantenendo il livello del fluido nel serbatoio di ingresso al di sopra della differenza di altezza Δh39 nel serbatoio di uscita (Fig. 1).
dove f è il coefficiente di attrito, definito come f = C/Re per il flusso laminare in un canale rettangolare, dove C è una costante dipendente dal rapporto d'aspetto del canale, L è la lunghezza del microcanale, Vav è la velocità media all'interno del microcanale, Dh è il diametro idraulico del canale, g è l'accelerazione di gravità. Utilizzando questa equazione, la velocità media del canale può essere calcolata utilizzando la seguente equazione: