Terima kasih kerana melayari Nature.com. Versi pelayar yang anda gunakan mempunyai sokongan CSS yang terhad. Untuk pengalaman terbaik, kami mengesyorkan agar anda menggunakan pelayar yang dikemas kini (atau melumpuhkan Mod Keserasian dalam Internet Explorer). Sementara itu, untuk memastikan sokongan berterusan, kami akan memaparkan laman web tanpa gaya dan JavaScript.
Kesuburan burung bergantung pada keupayaan mereka untuk menyimpan sperma yang mencukupi untuk tempoh masa yang lama di dalam tubul simpanan sperma (SST). Mekanisme tepat bagaimana spermatozoa masuk, berada di dalam, dan keluar dari SST masih kontroversi. Sperma ayam sharkasi menunjukkan kecenderungan yang tinggi untuk aglutinasi, membentuk berkas filamen mudah alih yang mengandungi banyak sel. Disebabkan oleh kesukaran untuk memerhatikan motiliti dan tingkah laku spermatozoa dalam tiub fallopio legap, kami menggunakan peranti mikrofluidik dengan keratan rentas mikrosaluran yang serupa dengan spermatozoa untuk mengkaji aglutinasi dan motiliti spermatozoa. Kajian ini membincangkan bagaimana berkas sperma terbentuk, bagaimana ia bergerak, dan kemungkinan peranannya dalam melanjutkan residensi sperma dalam SST. Kami mengkaji halaju sperma dan tingkah laku reologi apabila aliran bendalir dijana dalam saluran mikrofluidik oleh tekanan hidrostatik (kadar aliran = 33 µm/s). Spermatozoa cenderung berenang melawan arus (reologi positif) dan halaju berkas spermatozoon berkurangan dengan ketara berbanding spermatozoa tunggal. Bundelan sperma telah diperhatikan bergerak dalam lingkaran dan bertambah panjang serta tebal apabila lebih banyak sperma tunggal direkrut. Berkas sperma diperhatikan menghampiri dan melekat pada dinding sisi saluran mikrofluidik untuk mengelakkan daripada dihanyutkan dengan halaju aliran bendalir > 33 µm/s. Berkas sperma diperhatikan menghampiri dan melekat pada dinding sisi saluran mikrofluidik untuk mengelakkan daripada dihanyutkan dengan halaju aliran bendalir > 33 µm/s. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрофлюитодных каналбожв сметания со скоростью потока жидкости> 33 мкм / с. Berkas sperma telah diperhatikan menghampiri dan melekat pada dinding sisi saluran mikrofluidik untuk mengelakkan daripada dihanyutkan pada kadar aliran bendalir >33 µm/s.观察到精子束接近并粘附在微流体通道的侧壁上，以避免被流体流速> 33 µm/s。33 µm/s 扫过。 Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрожидкостногочять кабнала, потоком жидкости со скоростью > 33 мкм/с. Berkas sperma telah diperhatikan menghampiri dan melekat pada dinding sisi saluran mikrofluidik untuk mengelakkan daripada dihanyutkan oleh aliran bendalir pada >33 µm/s.Mikroskopi elektron pengimbasan dan penghantaran mendedahkan bahawa berkas sperma disokong oleh bahan padat yang banyak. Data yang diperoleh menunjukkan mobiliti unik spermatozoa ayam Sharkazi, serta keupayaan spermatozoa untuk mengaglutinasi dan membentuk berkas mudah alih, yang menyumbang kepada pemahaman yang lebih baik tentang penyimpanan spermatozoa jangka panjang dalam SMT.
Untuk mencapai persenyawaan pada manusia dan kebanyakan haiwan, sperma dan telur mesti tiba di tempat persenyawaan pada masa yang tepat. Oleh itu, perkahwinan mesti berlaku sebelum atau pada masa ovulasi. Sebaliknya, sesetengah mamalia, seperti anjing, serta spesies bukan mamalia, seperti serangga, ikan, reptilia dan burung, menyimpan sperma dalam organ pembiakan mereka untuk tempoh masa yang lama sehingga telur mereka sedia untuk persenyawaan (persenyawaan tak segerak 1). Burung dapat mengekalkan daya hidup spermatozoa yang mampu mensenyawakan telur selama 2-10 minggu2.
Ini merupakan ciri unik yang membezakan burung daripada haiwan lain, kerana ia memberikan kebarangkalian persenyawaan yang tinggi selepas satu permanian selama beberapa minggu tanpa mengawan dan ovulasi serentak. Organ simpanan sperma utama, yang dipanggil tubul simpanan sperma (SST), terletak di lipatan mukosa dalaman di simpang uterovaginal. Sehingga kini, mekanisme sperma masuk, berada, dan keluar dari bank sperma masih belum difahami sepenuhnya. Berdasarkan kajian terdahulu, banyak hipotesis telah dikemukakan, tetapi tiada satu pun daripadanya yang disahkan.
Forman4 membuat hipotesis bahawa spermatozoa mengekalkan kediaman mereka di rongga SST melalui pergerakan berayun berterusan melawan arah aliran bendalir melalui saluran protein yang terletak pada sel epitelium SST (reologi). ATP berkurangan disebabkan oleh aktiviti flagellar berterusan yang diperlukan untuk memastikan sperma berada dalam lumen SST dan motilitas akhirnya menurun sehingga sperma dibawa keluar dari bank sperma melalui aliran bendalir dan memulakan perjalanan baharu menuruni tiub fallopio menaik untuk menyuburkan sperma. Telur (Forman4). Model penyimpanan sperma ini disokong oleh pengesanan melalui imunositokimia akuaporin 2, 3 dan 9 yang terdapat dalam sel epitelium SST. Sehingga kini, kajian tentang reologi air mani ayam dan peranannya dalam penyimpanan SST, pemilihan sperma faraj dan persaingan sperma masih kurang. Pada ayam, sperma memasuki faraj selepas mengawan secara semula jadi, tetapi lebih daripada 80% spermatozoa dikeluarkan dari faraj sejurus selepas mengawan. Ini menunjukkan bahawa faraj adalah tapak utama untuk pemilihan sperma pada burung. Di samping itu, telah dilaporkan bahawa kurang daripada 1% spermatozoa yang disenyawakan di dalam faraj berakhir dalam SST2. Dalam permanian beradas anak ayam di dalam faraj, bilangan spermatozoa yang mencapai SST cenderung meningkat 24 jam selepas permanian. Setakat ini, mekanisme pemilihan sperma semasa proses ini tidak jelas, dan motiliti sperma mungkin memainkan peranan penting dalam pengambilan sperma SST. Disebabkan dinding tiub fallopio yang tebal dan legap, adalah sukar untuk memantau secara langsung motiliti sperma dalam tiub fallopio burung. Oleh itu, kita kekurangan pengetahuan asas tentang bagaimana spermatozoa beralih kepada SST selepas persenyawaan.
Reologi baru-baru ini telah diiktiraf sebagai faktor penting yang mengawal pengangkutan sperma dalam alat kelamin mamalia. Berdasarkan keupayaan spermatozoa motil untuk berhijrah secara lawan arus, Zaferani et al8 menggunakan sistem mikrofluidik corra untuk mengasingkan spermatozoa motil secara pasif daripada sampel air mani yang dikurung. Jenis pengasingan air mani ini adalah penting untuk rawatan kemandulan perubatan dan penyelidikan klinikal, dan lebih diutamakan berbanding kaedah tradisional yang memerlukan masa dan tenaga yang banyak serta boleh menjejaskan morfologi sperma dan integriti struktur. Walau bagaimanapun, setakat ini, tiada kajian telah dijalankan mengenai kesan rembesan daripada organ genital ayam terhadap motiliti sperma.
Terlepas dari mekanisme yang mengekalkan sperma yang disimpan dalam SST, ramai penyiasat telah memerhatikan bahawa spermatozoa yang menetap akan beraglutinasi secara kepala ke kepala dalam SST ayam 9, 10, puyuh 2, dan ayam belanda 11 untuk membentuk berkas sperma yang teraglutinasi. Penulis mencadangkan bahawa terdapat kaitan antara aglutinasi ini dan penyimpanan spermatozoa jangka panjang dalam SST.
Tingari dan Lake12 melaporkan hubungan yang kuat antara spermatozoa dalam kelenjar penerima sperma ayam dan mempersoalkan sama ada spermatozoa burung menggumpalkan diri dengan cara yang sama seperti spermatozoa mamalia. Mereka percaya bahawa hubungan yang mendalam antara sperma dalam vas deferens mungkin disebabkan oleh tekanan yang disebabkan oleh kehadiran sejumlah besar sperma dalam ruang yang kecil.
Apabila menilai tingkah laku spermatozoa pada slaid kaca yang baru digantung, tanda-tanda aglutinasi sementara dapat dilihat, terutamanya di tepi titisan air mani. Walau bagaimanapun, aglutinasi sering terganggu oleh tindakan putaran yang berkaitan dengan pergerakan berterusan, yang menjelaskan sifat sementara fenomena ini. Para penyelidik juga mendapati bahawa apabila pengencer ditambah ke dalam air mani, agregat sel "seperti benang" yang memanjang muncul.
Percubaan awal untuk meniru spermatozoon telah dibuat dengan menanggalkan dawai nipis daripada titisan gantung, yang mengakibatkan vesikel seperti sperma memanjang yang terkeluar dari titisan air mani. Spermatozoa serta-merta berbaris secara selari di dalam vesikel, tetapi keseluruhan unit dengan cepat hilang disebabkan oleh batasan 3D. Oleh itu, untuk mengkaji aglutinasi spermatozoa, adalah perlu untuk memerhatikan motiliti dan tingkah laku spermatozoa secara langsung dalam tubul simpanan sperma yang terpencil, yang sukar dicapai. Oleh itu, adalah perlu untuk membangunkan instrumen yang meniru spermatozoa untuk menyokong kajian tentang motiliti sperma dan tingkah laku aglutinasi. Brillard et al13 melaporkan bahawa purata panjang tubul simpanan sperma pada anak ayam dewasa ialah 400–600 µm, tetapi sesetengah SST boleh sepanjang 2000 µm. Mero dan Ogasawara14 membahagikan kelenjar seminiferus kepada tubul simpanan sperma yang membesar dan tidak membesar, kedua-duanya mempunyai panjang (~500 µm) dan lebar leher (~38 µm) yang sama, tetapi diameter lumen purata tubul ialah 56.6 dan 56.6 µm, masing-masing 11.2 μm. Dalam kajian semasa, kami menggunakan peranti mikrofluidik dengan saiz saluran 200 µm × 20 µm (L × T), yang keratan rentasnya agak hampir dengan SST yang diperkuat. Di samping itu, kami mengkaji motiliti sperma dan tingkah laku aglutinasi dalam bendalir yang mengalir, yang selaras dengan hipotesis Foreman bahawa bendalir yang dihasilkan oleh sel epitelium SST memastikan sperma dalam lumen dalam arah arus lawan (reologi).
Tujuan kajian ini adalah untuk mengatasi masalah pemerhatian pergerakan spermatozoa dalam tiub fallopio dan untuk mengelakkan kesukaran mengkaji reologi dan tingkah laku spermatozoa dalam persekitaran yang dinamik. Peranti mikrofluidik telah digunakan yang menghasilkan tekanan hidrostatik untuk mensimulasikan pergerakan sperma dalam alat kelamin ayam.
Apabila setitik sampel sperma yang dicairkan (1:40) dimasukkan ke dalam peranti mikrosaluran, dua jenis motiliti sperma dapat dikenal pasti (sperma terasing dan sperma terikat). Di samping itu, spermatozoa cenderung berenang melawan arus (reologi positif; video 1, 2). Walaupun berkas sperma mempunyai halaju yang lebih rendah berbanding sperma yang menyendiri (p < 0.001), ia meningkatkan peratusan sperma yang menunjukkan reotaksis positif (p < 0.001; Jadual 2). Walaupun berkas sperma mempunyai halaju yang lebih rendah berbanding sperma yang menyendiri (p < 0.001), ia meningkatkan peratusan sperma yang menunjukkan reotaksis positif (p < 0.001; Jadual 2). Хотя пучки сперматозоидов имели более низкую скорость, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), оливанлиция сперматозоидов, демонстрирующих положительный реотаксис (p < 0,001; таблица 2). Walaupun berkas spermatozoa mempunyai halaju yang lebih rendah berbanding spermatozoa tunggal (p < 0.001), ia meningkatkan peratusan spermatozoa yang menunjukkan reotaksis positif (p < 0.001; Jadual 2).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度（p < 0.001），但它们增加了显示阳性流变性的精子百分比（p < 0.001；表2）。尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 （p <0.001） ， 但 增加 了 显示 阳性 流性 流性百分比 （p <0.001 ； 2。。。。。。）））））） Хотя скорость пучков сперматозоидов была ниже, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), они увеличирдим товеличивали с положительной реологией (p < 0,001; таблица 2). Walaupun kelajuan berkas sperma adalah lebih rendah daripada spermatozoa tunggal (p < 0.001), ia meningkatkan peratusan spermatozoa dengan reologi positif (p < 0.001; Jadual 2).Reologi positif untuk spermatozoa dan gumpalan tunggal dianggarkan masing-masing kira-kira 53% dan 85%.
Telah diperhatikan bahawa spermatozoa ayam sharkasi sejurus selepas ejakulasi membentuk berkas linear, yang terdiri daripada berpuluh-puluh individu. Gumpalan ini bertambah panjang dan tebal dari semasa ke semasa dan mungkin kekal dalam vitro selama beberapa jam sebelum menghilang (video 3). Gumpalan berfilamen ini berbentuk seperti spermatozoa ekidna yang terbentuk di hujung epididimis. Air mani ayam Sharkashi didapati mempunyai kecenderungan yang tinggi untuk mengaglutinasi dan membentuk berkas retikulat dalam masa kurang daripada satu minit selepas pengumpulan. Pancaran ini dinamik dan mampu melekat pada mana-mana dinding berdekatan atau objek statik. Walaupun berkas sperma mengurangkan kelajuan sel sperma, jelas bahawa secara makroskopik ia meningkatkan kelinearannya. Panjang berkas berbeza-beza bergantung pada bilangan sperma yang dikumpulkan dalam berkas. Dua bahagian berkas telah diasingkan: bahagian awal, termasuk kepala bebas sperma yang teraglutinasi, dan bahagian terminal, termasuk ekor dan keseluruhan hujung distal sperma. Menggunakan kamera berkelajuan tinggi (950 fps), kepala spermatozoa yang teraglutinasi bebas diperhatikan di bahagian awal berkas, yang bertanggungjawab untuk pergerakan berkas disebabkan oleh gerakan berayunnya, mengheret baki sperma ke dalam berkas dengan gerakan heliks (Video 4). Walau bagaimanapun, dalam gumpalan panjang, telah diperhatikan bahawa beberapa kepala sperma bebas melekat pada badan dan bahagian terminal gumpalan bertindak sebagai bilah untuk membantu menggerakkan gumpalan.
Semasa dalam aliran bendalir yang perlahan, berkas sperma bergerak selari antara satu sama lain, namun, ia mula bertindih dan melekat pada semua yang tidak bergerak, supaya tidak dihanyutkan oleh aliran arus apabila kelajuan aliran meningkat. Berkas terbentuk apabila segelintir sel sperma menghampiri satu sama lain, ia mula bergerak secara segerak dan melilit antara satu sama lain, dan kemudian melekat pada bahan melekit. Rajah 1 dan 2 menunjukkan bagaimana sperma menghampiri satu sama lain, membentuk simpang apabila ekor melilit antara satu sama lain.
Para penyelidik menggunakan tekanan hidrostatik untuk menghasilkan aliran bendalir dalam mikrosaluran bagi mengkaji reologi sperma. Mikrosaluran dengan saiz 200 µm × 20 µm (L × T) dan panjang 3.6 µm telah digunakan. Gunakan mikrosaluran di antara bekas dengan picagari yang dipasang di hujungnya. Pewarna makanan digunakan untuk menjadikan saluran lebih kelihatan.
Ikat kabel sambung dan aksesori pada dinding. Video diambil dengan mikroskop kontras fasa. Dengan setiap imej, mikroskopi kontras fasa dan imej pemetaan dipaparkan. (A) Sambungan antara dua aliran menentang aliran akibat gerakan heliks (anak panah merah). (B) Sambungan antara berkas tiub dan dinding saluran (anak panah merah), pada masa yang sama ia disambungkan kepada dua berkas lain (anak panah kuning). (C) Berkas sperma dalam saluran mikrofluidik mula bersambung antara satu sama lain (anak panah merah), membentuk jaringan berkas sperma. (D) Pembentukan rangkaian berkas sperma.
Apabila setitik sperma yang dicairkan dimasukkan ke dalam peranti mikrofluidik dan aliran terhasil, pancaran sperma diperhatikan bergerak melawan arah aliran. Bundelan-bundelan itu dipasang rapat pada dinding saluran mikro, dan kepala bebas di bahagian awal berkas juga dipasang rapat padanya (video 5). Ia juga melekat pada sebarang zarah pegun di laluannya, seperti serpihan, untuk menahan diri daripada dihanyutkan oleh arus. Lama-kelamaan, gumpalan-gumpalan ini menjadi filamen panjang yang memerangkap spermatozoa tunggal lain dan gumpalan-gumpalan yang lebih pendek (Video 6). Apabila aliran mula perlahan, barisan sperma yang panjang mula membentuk rangkaian barisan sperma (Video 7; Rajah 2).
Pada halaju aliran yang tinggi (V > 33 µm/s), pergerakan lingkaran benang meningkat sebagai percubaan untuk menangkap banyak berkas pembentuk sperma individu agar dapat menahan daya hanyut aliran dengan lebih baik. Pada halaju aliran yang tinggi (V > 33 µm/s), pergerakan lingkaran benang meningkat sebagai percubaan untuk menangkap banyak berkas pembentuk sperma individu agar dapat menahan daya hanyut aliran dengan lebih baik. При высокой скорости потока (V > 33 мкм/с) спиралевидные движения нитей усиливаются, поскольку они пытаются понмтся отдельных сперматозоидов, образующих пучки, которые лучше противостоят дрейфующей силе потока. Pada kadar aliran yang tinggi (V > 33 µm/s), pergerakan heliks untaian meningkat apabila ia cuba menangkap banyak spermatozoa individu yang membentuk berkas yang lebih mampu menahan daya hanyut aliran.在高流速(V > 33 µm/s)时，螺纹的螺旋运动增加，以试图捕捉许多形成束的单个精子，从而更好地抵犗的。在 高 流速 (v> 33 µm/s) 时 ， 的 螺旋 运动 增加 ， 以 试图 许多 形成 束 单 与 许多 形成 束 单 个 ，地 抵抗 的 漂移力。。。。。。。。。 При высоких скоростях потока (V > 33 мкм/с) спиральное движение нитей увеличивается в попытке захватить множествот сперматозоидов, образующих пучки, чтобы лучше сопротивляться силам дрейфа потока. Pada kadar aliran yang tinggi (V > 33 µm/s), pergerakan heliks filamen meningkat dalam percubaan untuk menangkap banyak berkas pembentukan spermatozoa individu bagi menahan daya hanyutan aliran dengan lebih baik.Mereka juga cuba memasang saluran mikro pada dinding sisi.
Berkas sperma dikenal pasti sebagai kelompok kepala sperma dan ekor yang melengkung menggunakan mikroskop cahaya (LM). Berkas sperma dengan pelbagai agregat juga telah dikenal pasti sebagai kepala berpintal dan agregat flagela, berbilang ekor sperma yang terlakur, kepala sperma yang melekat pada ekor, dan kepala sperma dengan nukleus bengkok sebagai berbilang nukleus yang terlakur. mikroskop elektron penghantaran (TEM). Mikroskopi elektron imbasan (SEM) menunjukkan bahawa berkas sperma adalah agregat kepala sperma yang disalut dan agregat sperma menunjukkan rangkaian ekor yang terbungkus.
Morfologi dan ultrastruktur spermatozoa, pembentukan berkas spermatozoa telah dikaji menggunakan mikroskop cahaya (separuh bahagian), mikroskop elektron imbasan (SEM) dan mikroskop elektron penghantaran (TEM), calitan sperma telah diwarnakan dengan akridin oren dan diperiksa menggunakan mikroskop epifluoresen.
Pewarnaan calitan sperma dengan akridin oren (Rajah 3B) menunjukkan bahawa kepala sperma melekat bersama dan ditutup dengan bahan rembesan, yang menyebabkan pembentukan jambul besar (Rajah 3D). Bundel sperma terdiri daripada agregat sperma dengan rangkaian ekor yang melekat (Rajah 4A-C). Bundel sperma terdiri daripada ekor banyak spermatozoa yang melekat bersama (Rajah 4D). Rahsia (Rajah 4E,F) menutupi kepala berkas spermatozoa.
Pembentukan berkas spermatozoa Menggunakan mikroskopi kontras fasa dan calitan sperma yang diwarnakan dengan akridin oren, menunjukkan bahawa kepala spermatozoa melekat bersama. (A) Pembentukan jambul sperma awal bermula dengan sperma (bulatan putih) dan tiga sperma (bulatan kuning), dengan lingkaran bermula pada ekor dan berakhir di kepala. (B) Fotomikrograf calitan sperma yang diwarnakan dengan akridin oren menunjukkan kepala sperma yang melekat (anak panah). Pelepasan menutupi kepala. Pembesaran × 1000. (C) Perkembangan pancaran besar yang diangkut oleh aliran dalam saluran mikrofluidik (menggunakan kamera berkelajuan tinggi pada 950 fps). (D) Mikrograf calitan sperma yang diwarnakan dengan akridin oren menunjukkan jambul besar (anak panah). Pembesaran: ×200.
Mikrograf elektron imbasan pancaran sperma dan calitan sperma yang diwarnakan dengan akridin oren. (A, B, D, E) ialah mikrograf elektron imbasan warna digital spermatozoa, dan C dan F ialah mikrograf calitan sperma yang diwarnakan dengan akridin oren yang menunjukkan pelekatan berbilang spermatozoa yang membalut jaringan kaudal. (AC) Agregat sperma ditunjukkan sebagai rangkaian ekor yang melekat (anak panah). (D) Lekatan beberapa spermatozoa (dengan bahan pelekat, garis merah jambu, anak panah) yang membalut ekor. (E dan F) Agregat kepala sperma (penunjuk) yang ditutup dengan bahan pelekat (penunjuk). Spermatozoa membentuk berkas dengan beberapa struktur seperti pusaran (F). (C) Pembesaran ×400 dan (F) ×200.
Menggunakan mikroskop elektron penghantaran, kami mendapati bahawa berkas sperma mempunyai ekor yang melekat (Rajah 6A, C), kepala yang melekat pada ekor (Rajah 6B), atau kepala yang melekat pada ekor (Rajah 6D). Kepala spermatozoa dalam berkas melengkung, muncul di kawasan nuklear seksyen dua (Rajah 6D). Dalam berkas hirisan, spermatozoa mempunyai kepala yang berpintal dengan dua kawasan nuklear dan berbilang kawasan flagela (Rajah 5A).
Mikrograf elektron berwarna digital menunjukkan ekor penghubung dalam berkas sperma dan bahan penggumpalan yang menghubungkan kepala sperma. (A) Ekor sebilangan besar spermatozoa yang melekat. Perhatikan rupa ekor dalam kedua-dua unjuran potret (anak panah) dan landskap (anak panah). (B) Kepala (anak panah) sperma disambungkan ke ekor (anak panah). (C) Beberapa ekor sperma (anak panah) melekat. (D) Bahan penggumpalan (AS, biru) menghubungkan empat kepala sperma (ungu).
Mikroskopi elektron imbasan digunakan untuk mengesan kepala sperma dalam berkas sperma yang diliputi dengan rembesan atau membran (Rajah 6B), menunjukkan bahawa berkas sperma ditambat oleh bahan ekstraselular. Bahan yang teraglutinasi tertumpu pada kepala sperma (himpunan seperti kepala obor-obor; Rajah 5B) dan mengembang ke arah distal, memberikan penampilan kuning terang di bawah mikroskopi pendarfluor apabila diwarnakan dengan oren akridin (Rajah 6C). Bahan ini jelas kelihatan di bawah mikroskop imbasan dan dianggap sebagai pengikat. Keratan separa nipis (Rajah 5C) dan calitan sperma yang diwarnakan dengan oren akridin menunjukkan berkas sperma yang mengandungi kepala yang padat dan ekor yang melengkung (Rajah 5D).
Pelbagai fotomikrograf menunjukkan pengagregatan kepala sperma dan ekor yang dilipat menggunakan pelbagai kaedah. (A) Mikrograf elektron penghantaran warna digital keratan rentas bagi berkas sperma yang menunjukkan kepala sperma bergelung dengan nukleus dua bahagian (biru) dan beberapa bahagian flagela (hijau). (B) Mikrograf elektron pengimbasan warna digital menunjukkan gugusan kepala sperma seperti obor-obor (anak panah) yang kelihatan tertutup. (C) Keratan separa nipis menunjukkan kepala sperma yang teragregat (anak panah) dan ekor yang melengkung (anak panah). (D) Mikrograf sapuan sperma yang diwarnakan dengan oren akridin yang menunjukkan agregat kepala sperma (anak panah) dan ekor yang melekat melengkung (anak panah). Perhatikan bahawa bahan melekit (S) menutupi kepala spermatozoon. (D) Pembesaran × 1000.
Menggunakan mikroskop elektron penghantaran (Rajah 7A), juga diperhatikan bahawa kepala sperma berpintal dan nukleus mempunyai bentuk lingkaran, seperti yang disahkan oleh calitan sperma yang diwarnakan dengan akridin oren dan diperiksa menggunakan mikroskop pendarfluor (Rajah 7B).
(A) Mikrograf elektron penghantaran warna digital dan (B) Calitan sperma berwarna oren Akridin yang menunjukkan kepala bergelung dan perlekatan kepala dan ekor sperma (anak panah). (B) Pembesaran × 1000.
Satu penemuan yang menarik ialah sperma Sharkazi beragregat untuk membentuk berkas filamen mudah alih. Sifat-sifat berkas ini membolehkan kita memahami kemungkinan peranannya dalam penyerapan dan penyimpanan spermatozoa dalam SST.
Selepas mengawan, sperma memasuki faraj dan menjalani proses pemilihan yang sengit, mengakibatkan hanya bilangan sperma yang terhad memasuki SST15,16. Sehingga kini, mekanisme sperma masuk dan keluar dari SST masih tidak jelas. Dalam ayam, spermatozoa disimpan dalam SST untuk tempoh yang panjang selama 2 hingga 10 minggu, bergantung pada spesies6. Kontroversi masih wujud mengenai keadaan air mani semasa penyimpanan dalam SST. Adakah ia bergerak atau berehat? Dalam erti kata lain, bagaimana sel sperma mengekalkan kedudukannya dalam SST untuk sekian lama?
Forman4 mencadangkan bahawa kediaman dan pengusiran SST boleh dijelaskan dari segi motiliti sperma. Penulis membuat hipotesis bahawa sperma mengekalkan kedudukan mereka dengan berenang melawan aliran bendalir yang dihasilkan oleh epitelium SST dan sperma dikeluarkan dari SST apabila halaju mereka jatuh di bawah titik di mana mereka mula bergerak ke belakang kerana kekurangan tenaga. Zaniboni5 mengesahkan kehadiran akuaporin 2, 3, dan 9 di bahagian apikal sel epitelium SST, yang secara tidak langsung mungkin menyokong model penyimpanan sperma Foreman. Dalam kajian semasa, kami mendapati bahawa hampir separuh daripada spermatozoa Sharkashi menunjukkan reologi positif dalam bendalir yang mengalir, dan bahawa berkas sperma yang teraglutinasi meningkatkan bilangan spermatozoa yang menunjukkan reologi positif, walaupun aglutinasi memperlahankannya. Bagaimana sel sperma bergerak ke atas tiub fallopio burung ke tempat persenyawaan tidak difahami sepenuhnya. Dalam mamalia, cecair folikel kemoatraktan spermatozoa. Walau bagaimanapun, kemoatraktan dipercayai mengarahkan spermatozoa untuk mendekati jarak jauh7. Oleh itu, mekanisme lain bertanggungjawab untuk pengangkutan sperma. Keupayaan sperma untuk mengorientasikan dan mengalir melawan cecair tiub fallopio yang dilepaskan selepas mengawan telah dilaporkan sebagai faktor utama dalam mensasarkan sperma pada tikus. Parker 17 mencadangkan bahawa spermatozoa melintasi oviduk dengan berenang melawan arus silia pada burung dan reptilia. Walaupun ia belum ditunjukkan secara eksperimen pada burung, Adolphi18 adalah orang pertama yang mendapati bahawa sperma burung memberikan hasil yang positif apabila lapisan cecair nipis di antara penutup dan slaid dicipta dengan jalur kertas penapis. Rheologi. Hino dan Yanagimachi [19] meletakkan kompleks ovari-tiub-rahim tikus dalam cincin perfusi dan menyuntik 1 µl dakwat ke dalam isthmus untuk menggambarkan aliran bendalir dalam tiub fallopio. Mereka melihat pergerakan pengecutan dan pengenduran yang sangat aktif dalam tiub fallopio, di mana semua bebola dakwat bergerak dengan stabil ke arah ampula tiub fallopio. Penulis menekankan kepentingan aliran bendalir tiub dari tiub fallopio bawah ke atas untuk pengangkatan dan persenyawaan sperma. Brillard20 melaporkan bahawa dalam ayam dan ayam belanda, spermatozoa berhijrah melalui pergerakan aktif dari pintu masuk faraj, tempat ia disimpan, ke simpang utero-faraj, tempat ia disimpan. Walau bagaimanapun, pergerakan ini tidak diperlukan antara simpang uterovaginal dan infundibulum kerana spermatozoa diangkut melalui anjakan pasif. Mengetahui cadangan terdahulu ini dan keputusan yang diperoleh dalam kajian semasa, boleh diandaikan bahawa keupayaan spermatozoa untuk bergerak ke hulu (reologi) adalah salah satu sifat yang menjadi asas proses pemilihan. Ini menentukan laluan spermatozoa melalui faraj dan kemasukannya ke dalam CCT untuk penyimpanan. Seperti yang dicadangkan oleh Forman4, ini juga boleh memudahkan proses sperma memasuki SST dan habitatnya untuk tempoh masa tertentu dan kemudian keluar apabila kelajuannya mula perlahan.
Sebaliknya, Matsuzaki dan Sasanami 21 mencadangkan bahawa spermatozoa burung mengalami perubahan motiliti daripada dorman kepada motiliti dalam saluran pembiakan lelaki dan wanita. Perencatan motiliti sperma pemastautin dalam SST telah dicadangkan untuk menjelaskan masa penyimpanan sperma yang lama dan kemudian peremajaan selepas meninggalkan SST. Di bawah keadaan hipoksik, Matsuzaki et al. 1 melaporkan pengeluaran dan pembebasan laktat yang tinggi dalam SST, yang boleh menyebabkan perencatan motiliti sperma pemastautin. Dalam kes ini, kepentingan reologi sperma tercermin dalam pemilihan dan penyerapan spermatozoa, dan bukan dalam penyimpanannya.
Corak aglutinasi sperma dianggap sebagai penjelasan yang munasabah untuk tempoh penyimpanan sperma yang panjang dalam SST, kerana ini adalah corak pengekalan sperma yang biasa dalam ayam2,22,23. Bakst et al. 2 memerhatikan bahawa kebanyakan spermatozoa melekat antara satu sama lain, membentuk agregat fascicular, dan spermatozoa tunggal jarang ditemui dalam CCM puyuh. Sebaliknya, Wen et al. 24 memerhatikan spermatozoa yang lebih berselerak dan lebih sedikit jambul spermatozoa dalam lumen SST dalam ayam. Berdasarkan pemerhatian ini, boleh diandaikan bahawa kecenderungan aglutinasi sperma berbeza antara burung dan antara spermatozoa dalam ejakulasi yang sama. Di samping itu, Van Krey et al. 9 mencadangkan bahawa penceraian rawak spermatozoa yang teraglutinasi bertanggungjawab untuk penembusan spermatozoa secara beransur-ansur ke dalam lumen tiub fallopio. Menurut hipotesis ini, spermatozoa dengan kapasiti aglutinasi yang lebih rendah harus dikeluarkan dari SST terlebih dahulu. Dalam konteks ini, keupayaan spermatozoa untuk mengaglutinasi mungkin merupakan faktor yang mempengaruhi hasil persaingan sperma dalam burung kotor. Di samping itu, semakin lama sperma yang terigutin terpisah, semakin lama kesuburan dikekalkan.
Walaupun pengagregatan dan pengagregatan spermatozoa ke dalam berkas telah diperhatikan dalam beberapa kajian2,22,24, ia tidak diterangkan secara terperinci kerana kerumitan pemerhatian kinematiknya dalam SST. Beberapa percubaan telah dibuat untuk mengkaji aglutinasi sperma secara in vitro. Pengagregatan yang meluas tetapi sementara diperhatikan apabila dawai nipis dikeluarkan daripada titisan benih yang tergantung. Ini membawa kepada fakta bahawa gelembung memanjang menonjol dari titisan, meniru kelenjar mani. Disebabkan oleh batasan 3D dan masa pengeringan titisan yang pendek, keseluruhan blok dengan cepat rosak9. Dalam kajian semasa, menggunakan ayam Sharkashi dan cip mikrofluidik, kami dapat menerangkan bagaimana berkas ini terbentuk dan bagaimana ia bergerak. Berkas sperma terbentuk sejurus selepas pengumpulan air mani dan didapati bergerak dalam lingkaran, menunjukkan reologi positif apabila terdapat dalam aliran. Tambahan pula, apabila dilihat secara makroskopik, berkas sperma telah diperhatikan meningkatkan kelinearan motiliti berbanding spermatozoa terpencil. Ini menunjukkan bahawa aglutinasi sperma mungkin berlaku sebelum penembusan SST dan penghasilan sperma tidak terhad kepada kawasan kecil disebabkan oleh tekanan seperti yang dicadangkan sebelum ini (Tingari dan Lake12). Semasa pembentukan tuft, spermatozoa berenang secara segerak sehingga membentuk simpang, kemudian ekornya melilit antara satu sama lain dan kepala spermatozoon kekal bebas, tetapi ekor dan bahagian distal spermatozoon melekat bersama dengan bahan melekit. Oleh itu, kepala ligamen yang bebas bertanggungjawab untuk pergerakan tersebut, menyeret seluruh ligamen. Mikroskopi elektron imbasan berkas sperma menunjukkan kepala sperma yang melekat dilitupi dengan banyak bahan melekit, menunjukkan bahawa kepala sperma melekat dalam berkas rehat, yang mungkin berlaku selepas sampai ke tapak penyimpanan (SST).
Apabila sapuan sperma diwarnakan dengan akridin oren, bahan pelekat ekstraselular di sekeliling sel sperma boleh dilihat di bawah mikroskop pendarfluor. Bahan ini membolehkan berkas sperma melekat dan berpaut pada mana-mana permukaan atau zarah di sekeliling supaya ia tidak hanyut mengikut aliran di sekeliling. Oleh itu, pemerhatian kami menunjukkan peranan lekatan spermatozoa dalam bentuk berkas mudah alih. Keupayaannya untuk berenang melawan arus dan melekat pada permukaan berdekatan membolehkan sperma tinggal lebih lama di SST.
Rothschild25 menggunakan kamera hemositometri untuk mengkaji taburan terapung air mani lembu dalam setitik ampaian, mengambil fotomikrograf melalui kamera dengan paksi optik menegak dan mendatar mikroskop. Keputusan menunjukkan bahawa spermatozoa tertarik ke permukaan ruang. Penulis mencadangkan bahawa mungkin terdapat interaksi hidrodinamik antara sperma dan permukaan. Dengan mengambil kira perkara ini, bersama-sama dengan keupayaan air mani anak ayam Sharkashi untuk membentuk gumpalan melekit, ia boleh meningkatkan kemungkinan air mani akan melekat pada dinding SST dan disimpan untuk jangka masa yang lama.
Bccetti dan Afzeliu26 melaporkan bahawa glikokaliks sperma diperlukan untuk pengecaman gamet dan aglutinasi. Forman10 memerhatikan bahawa hidrolisis ikatan α-glikosidik dalam lapisan glikoprotein-glikolipid dengan merawat air mani burung dengan neuraminidase mengakibatkan kesuburan yang berkurangan tanpa menjejaskan motiliti sperma. Penulis mencadangkan bahawa kesan neuraminidase pada glikokaliks menjejaskan penyerapan sperma pada persimpangan utero-vagina, sekali gus mengurangkan kesuburan. Pemerhatian mereka tidak boleh mengabaikan kemungkinan bahawa rawatan neuraminidase boleh mengurangkan pengecaman sperma dan oosit. Forman dan Engel10 mendapati bahawa kesuburan berkurangan apabila ayam betina diinseminasi secara intravagina dengan air mani yang dirawat dengan neuraminidase. Walau bagaimanapun, IVF dengan sperma yang dirawat dengan neuraminidase tidak menjejaskan kesuburan berbanding ayam kawalan. Para penulis menyimpulkan bahawa perubahan dalam lapisan glikoprotein-glikolipid di sekitar membran sperma mengurangkan keupayaan sperma untuk bersenyawa dengan menjejaskan penyerapan sperma pada sambungan utero-vagina, yang seterusnya meningkatkan kehilangan sperma disebabkan oleh kelajuan sambungan utero-vagina, tetapi tidak menjejaskan pengecaman sperma dan telur.
Dalam ayam belanda, Bakst dan Bauchan 11 menemui vesikel kecil dan serpihan membran dalam lumen SST dan memerhatikan bahawa sebahagian daripada granul ini telah bergabung dengan membran sperma. Penulis mencadangkan bahawa hubungan ini mungkin menyumbang kepada penyimpanan spermatozoa jangka panjang dalam SST. Walau bagaimanapun, penyelidik tidak menyatakan sumber zarah-zarah ini, sama ada ia dirembeskan oleh sel epitelium CCT, dihasilkan dan dirembeskan oleh sistem pembiakan lelaki, atau dihasilkan oleh sperma itu sendiri. Selain itu, zarah-zarah ini bertanggungjawab untuk aglutinasi. Grützner et al27 melaporkan bahawa sel epitelium epididimis menghasilkan dan merembeskan protein tertentu yang diperlukan untuk pembentukan saluran mani berliang tunggal. Penulis juga melaporkan bahawa penyebaran berkas ini bergantung pada interaksi protein epididimis. Nixon et al28 mendapati bahawa adneksa merembeskan protein, osteonektin kaya sistein berasid; SPARC terlibat dalam pembentukan jambul sperma dalam ekidna dan platipus berparuh pendek. Penyebaran pancaran ini dikaitkan dengan kehilangan protein ini.
Dalam kajian semasa, analisis ultrastruktur menggunakan mikroskop elektron menunjukkan bahawa spermatozoa melekat pada sejumlah besar bahan padat. Bahan-bahan ini dianggap bertanggungjawab untuk aglutinasi yang memeluwap di antara dan di sekitar kepala yang melekat, tetapi pada kepekatan yang lebih rendah di kawasan ekor. Kami menganggap bahawa bahan aglutinasi ini dikumuhkan dari sistem pembiakan lelaki (epididimis atau vas deferens) bersama-sama dengan air mani, kerana kita sering memerhatikan air mani terpisah dari limfa dan plasma mani semasa ejakulasi. Telah dilaporkan bahawa semasa spermatozoa burung melalui epididimis dan vas deferens, mereka mengalami perubahan berkaitan kematangan yang menyokong keupayaan mereka untuk mengikat protein dan memperoleh glikoprotein berkaitan lema plasma. Kegigihan protein ini pada membran sperma yang menetap di SST menunjukkan bahawa protein ini mungkin mempengaruhi pemerolehan kestabilan membran sperma 30 dan menentukan kesuburan mereka 31. Ahammad et al32 melaporkan bahawa spermatozoa yang diperoleh daripada pelbagai bahagian sistem pembiakan lelaki (daripada testis hingga vas deferens distal) menunjukkan peningkatan daya maju secara progresif di bawah keadaan penyimpanan cecair, tanpa mengira suhu penyimpanan, dan daya maju dalam ayam juga meningkat dalam tiub fallopio selepas permanian beradas.
Jambul sperma ayam Sharkashi mempunyai ciri dan fungsi yang berbeza daripada spesies lain seperti ekidna, platipus, tikus kayu, tikus rusa, dan marmut. Dalam ayam Sharkasi, pembentukan berkas spermatozoa mengurangkan kelajuan renang mereka berbanding spermatozoa tunggal. Walau bagaimanapun, berkas ini meningkatkan peratusan spermatozoa positif secara reologi dan meningkatkan keupayaan spermatozoa untuk menstabilkan diri mereka dalam persekitaran yang dinamik. Oleh itu, keputusan kami mengesahkan cadangan sebelumnya bahawa aglutinasi sperma dalam SST dikaitkan dengan penyimpanan sperma jangka panjang. Kami juga membuat hipotesis bahawa kecenderungan sperma untuk membentuk jambul boleh mengawal kadar kehilangan sperma dalam SST, yang boleh mengubah hasil persaingan sperma. Mengikut andaian ini, spermatozoa dengan kapasiti aglutinasi yang rendah melepaskan SST terlebih dahulu, manakala spermatozoa dengan kapasiti aglutinasi yang tinggi menghasilkan kebanyakan anak. Pembentukan berkas sperma liang tunggal adalah bermanfaat dan mempengaruhi nisbah ibu bapa-anak, tetapi menggunakan mekanisme yang berbeza. Dalam ekidna dan platipus, spermatozoa disusun selari antara satu sama lain untuk meningkatkan kelajuan pancaran ke hadapan. Berkas ekidna bergerak kira-kira tiga kali lebih pantas daripada spermatozoa tunggal. Adalah dipercayai bahawa pembentukan jambul sperma sedemikian dalam ekidna merupakan adaptasi evolusi untuk mengekalkan dominasi, memandangkan betina bersifat bebas dan biasanya mengawan dengan beberapa jantan. Oleh itu, spermatozoa daripada ejakulasi yang berbeza bersaing sengit untuk persenyawaan telur.
Spermatozoa terigutin ayam sharkasi mudah divisualisasikan menggunakan mikroskopi kontras fasa, yang dianggap berfaedah kerana ia membolehkan kajian mudah tentang tingkah laku spermatozoa secara in vitro. Mekanisme pembentukan jambul sperma menggalakkan pembiakan dalam ayam sharkasi juga berbeza daripada yang dilihat pada beberapa mamalia plasenta yang mewakili tingkah laku sperma koperatif seperti tikus kayu, di mana beberapa spermatozoa mencapai telur, membantu individu berkaitan lain mencapai dan merosakkan telur mereka. untuk membuktikan diri anda. tingkah laku altruistik. Persenyawaan kendiri 34. Satu lagi contoh tingkah laku koperatif dalam spermatozoa ditemui pada tikus rusa, di mana spermatozoa dapat mengenal pasti dan bergabung dengan spermatozoa yang paling berkaitan secara genetik dan membentuk kumpulan koperatif untuk meningkatkan kelajuan mereka berbanding spermatozoa yang tidak berkaitan35.
Keputusan yang diperoleh dalam kajian ini tidak bercanggah dengan teori Foman tentang penyimpanan spermatozoa jangka panjang dalam SWS. Para penyelidik melaporkan bahawa sel sperma terus bergerak dalam aliran sel epitelium yang melapisi SST untuk jangka masa yang panjang, dan selepas tempoh masa tertentu, simpanan tenaga sel sperma berkurangan, mengakibatkan penurunan kelajuan, yang membolehkan pengusiran bahan berat molekul kecil dengan aliran bendalir dari lumen SST rongga tiub fallopio. Dalam kajian semasa, kami memerhatikan bahawa separuh daripada sperma tunggal menunjukkan keupayaan untuk berenang melawan bendalir yang mengalir, dan lekatannya dalam berkas meningkatkan keupayaannya untuk menunjukkan reologi positif. Tambahan pula, data kami selaras dengan data Matsuzaki et al. 1 yang melaporkan bahawa peningkatan rembesan laktat dalam SST boleh menghalang motiliti sperma yang menetap. Walau bagaimanapun, keputusan kami menerangkan pembentukan ligamen motil sperma dan tingkah laku reologinya dengan kehadiran persekitaran dinamik dalam saluran mikro dalam usaha untuk menjelaskan tingkah laku mereka dalam SST. Kajian masa hadapan mungkin tertumpu pada penentuan komposisi kimia dan asal usul agen penggumpalan, yang pasti akan membantu penyelidik membangunkan cara baharu untuk menyimpan air mani cecair dan meningkatkan tempoh kesuburan.
Lima belas ekor sharkasi jantan berleher kosong (dominan homozigot; Na Na) berumur 30 minggu telah dipilih sebagai penderma sperma dalam kajian ini. Burung-burung tersebut telah diternak di Ladang Penyelidikan Unggas, Fakulti Pertanian, Universiti Ashit, Pentadbiran Ashit, Mesir. Burung-burung tersebut ditempatkan dalam sangkar individu (30 x 40 x 40 cm), tertakluk kepada program pencahayaan (16 jam cahaya dan 8 jam kegelapan) dan diberi makanan yang mengandungi 160 g protein mentah, 2800 kkal tenaga boleh metabolisme, 35 g kalsium setiap satu. 5 gram fosforus tersedia setiap kilogram diet.
Menurut data 36, ​​​​37, air mani telah dikumpulkan daripada lelaki melalui urutan abdomen. Sebanyak 45 sampel air mani telah dikumpulkan daripada 15 lelaki selama 3 hari. Air mani (n = 15/hari) dicairkan serta-merta 1:1 (v:v) dengan Pengencer Air Mani Belsville Poultry, yang mengandungi kalium difosfat (1.27 g), monosodium glutamat monohidrat (0.867 g), fruktosa (0.5 d) natrium anhidrat, asetat (0.43 g), tris(hidroksimetil)aminometana (0.195 g), kalium sitrat monohidrat (0.064 g), kalium monofosfat (0.065 g), magnesium klorida (0.034 g) dan H2O (100 ml), pH = 7, 5, osmolariti 333 mOsm/kg38. Sampel air mani yang dicairkan terlebih dahulu diperiksa di bawah mikroskop cahaya untuk memastikan kualiti air mani (kelembapan) yang baik dan kemudian disimpan dalam mandian air pada suhu 37°C sehingga digunakan dalam masa setengah jam selepas pengumpulan.
Kinematik dan reologi spermatozoa dihuraikan menggunakan sistem peranti mikrofluidik. Sampel air mani dicairkan lagi kepada 1:40 dalam Pencair Air Mani Beltsville, dimuatkan ke dalam peranti mikrofluidik (lihat di bawah), dan parameter kinetik ditentukan menggunakan sistem Analisis Air Mani Berkomputer (CASA) yang sebelum ini dibangunkan untuk pencirian mikrofluidik. Plugin ini boleh dimuat turun di: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39. Halaju lengkung (VCL, μm/s), halaju linear (VSL, μm/s) dan halaju trajektori purata (VAP, μm/s) telah diukur. Video spermatozoa telah diambil menggunakan mikroskop kontras fasa Optika XDS-3 terbalik (dengan objektif 40x) yang disambungkan ke kamera Tucson ISH1000 pada 30 fps selama 3 saat. Gunakan perisian CASA untuk mengkaji sekurang-kurangnya tiga kawasan dan 500 trajektori sperma setiap sampel. Video yang dirakam telah diproses menggunakan CASA buatan sendiri. Takrifan motiliti dalam pemalam CASA adalah berdasarkan kelajuan renang sperma berbanding kadar aliran dan tidak termasuk parameter lain seperti pergerakan sisi ke sisi, kerana ini didapati lebih andal dalam aliran bendalir. Gerakan reologi digambarkan sebagai pergerakan sel sperma melawan arah aliran bendalir. Spermatozoa dengan sifat reologi dibahagikan dengan bilangan spermatozoa motil; spermatozoa yang berehat dan spermatozoa yang bergerak secara perolakan dikecualikan daripada kiraan.
Semua bahan kimia yang digunakan diperoleh daripada Elgomhoria Pharmaceuticals (Kaherah, Mesir) melainkan dinyatakan sebaliknya. Peranti ini dihasilkan seperti yang diterangkan oleh El-sherry et al. 40 dengan beberapa pengubahsuaian. Bahan yang digunakan untuk menghasilkan mikrosaluran termasuk plat kaca (Howard Glass, Worcester, MA), rintangan negatif SU-8-25 (MicroChem, Newton, CA), alkohol diaseton (Sigma Aldrich, Steinheim, Jerman), dan poliaseton. -184, Dow Corning, Midland, Michigan). Mikrosaluran dihasilkan menggunakan litografi lembut. Pertama, topeng muka pelindung jernih dengan reka bentuk mikrosaluran yang diingini dicetak pada pencetak resolusi tinggi (Prismatic, Kaherah, Mesir dan Seni dan Reka Bentuk Pasifik, Markham, ON). Master dihasilkan menggunakan plat kaca sebagai substrat. Plat dibersihkan dalam aseton, isopropanol dan air ternyahion dan kemudian disalut dengan lapisan 20 µm SU8-25 dengan salutan putaran (3000 rpm, 1 min). Lapisan SU-8 kemudiannya dikeringkan perlahan-lahan (65°C, 2 minit dan 95°C, 10 minit) dan didedahkan kepada sinaran UV selama 50 saat. Bakar selepas pendedahan pada suhu 65°C dan 95°C selama 1 minit dan 4 minit untuk menghubungkan silang lapisan SU-8 yang terdedah, diikuti dengan pengembangan dalam alkohol diaseton selama 6.5 minit. Bakar wafel dengan api keras (200°C selama 15 minit) untuk memejalkan lagi lapisan SU-8.
PDMS disediakan dengan mencampurkan monomer dan pengeras dalam nisbah berat 10:1, kemudian dinyahgas dalam desikator vakum dan dituang ke atas bingkai utama SU-8. PDMS dikeringkan dalam ketuhar (120°C, 30 minit), kemudian saluran dipotong, diasingkan daripada induk, dan ditebuk untuk membolehkan tiub dipasang pada saluran masuk dan keluar mikro. Akhir sekali, saluran mikro PDMS dipasang secara kekal pada slaid mikroskop menggunakan pemproses korona mudah alih (Electro-Technic Products, Chicago, IL) seperti yang diterangkan di tempat lain. Saluran mikro yang digunakan dalam kajian ini berukuran 200 µm × 20 µm (L × T) dan panjangnya 3.6 cm.
Aliran bendalir yang disebabkan oleh tekanan hidrostatik di dalam mikrosaluran dicapai dengan mengekalkan paras bendalir dalam takungan masuk di atas perbezaan ketinggian Δh39 dalam takungan keluar (Rajah 1).
di mana f ialah pekali geseran, ditakrifkan sebagai f = C/Re untuk aliran laminar dalam saluran segi empat tepat, di mana C ialah pemalar bergantung pada nisbah aspek saluran, L ialah panjang mikrosaluran, Vav ialah halaju purata di dalam mikrosaluran, Dh ialah diameter hidraulik saluran, g – pecutan graviti. Menggunakan persamaan ini, halaju purata saluran boleh dikira menggunakan persamaan berikut: