Vă mulțumim că ați vizitat Nature.com. Versiunea browserului pe care o utilizați are suport limitat pentru CSS. Pentru o experiență optimă, vă recomandăm să utilizați un browser actualizat (sau să dezactivați Modul de compatibilitate în Internet Explorer). Între timp, pentru a asigura asistență continuă, vom reda site-ul fără stiluri și JavaScript.
Fertilitatea păsărilor depinde de capacitatea lor de a stoca suficient spermă viabilă pentru o perioadă extinsă de timp în tuburile de stocare a spermei (SST). Mecanismul exact prin care spermatozoizii intră, se află în și părăsesc SST rămâne controversat. Spermatozoizii de găini sharkasis au prezentat o tendință ridicată la aglutinare, formând fascicule filamentoase mobile care conțin multe celule. Datorită dificultății de a observa motilitatea și comportamentul spermatozoizilor într-o trompă uterină opacă, am utilizat un dispozitiv microfluidic cu o secțiune transversală a microcanalului similară cu cea a spermatozoizilor pentru a studia aglutinarea și motilitatea spermatozoizilor. Acest studiu discută modul în care se formează fasciculele de spermatozoizi, cum se mișcă și posibilul lor rol în extinderea rezidenței spermatozoizilor în SST. Am investigat viteza spermatozoizilor și comportamentul reologic atunci când fluxul de fluid a fost generat într-un canal microfluidic prin presiune hidrostatică (debit = 33 µm/s). Spermatozoizii tind să înoate împotriva curentului (reologie pozitivă), iar viteza fasciculului de spermatozoizi este semnificativ redusă în comparație cu spermatozoizii individuali. S-a observat că fasciculele de spermatozoizi se mișcă în spirală și cresc în lungime și grosime pe măsură ce sunt recrutați mai mulți spermatozoizi individuali. S-au observat fascicule de spermatozoizi apropiindu-se și aderând la pereții laterali ai canalelor microfluidice pentru a evita să fie măturate cu o viteză de curgere a fluidului > 33 µm/s. S-au observat fascicule de spermatozoizi apropiindu-se și aderând la pereții laterali ai canalelor microfluidice pentru a evita să fie măturate cu o viteză de curgere a fluidului > 33 µm/s. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенюкам стенкам стенидов приближаются каналов, чтобы избежать сметания со скоростью потока жидкости> 33 мкм / с. S-a observat că fasciculele de spermatozoizi se apropie și aderă la pereții laterali ai canalelor microfluidice pentru a evita să fie măturate la debite de fluid >33 µm/s.观察到精子束接近并粘附在微流体通道的侧壁上，以避免被流体流速在微流体通道的侧壁上，以避免被流体流速> 33 怫m/s 怫m/s33 µm/s 扫过。 Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стендокрам стентокрам замечено канала, чтобы избежать сметания потоком жидкости со скоростью > 33 мкм/с. S-a observat că fasciculele de spermatozoizi se apropie și aderă la pereții laterali ai canalului microfluidic pentru a evita să fie măturate de fluxul de fluid la o viteză >33 µm/s.Microscopia electronică cu scanare și transmisie a relevat că fasciculele de spermatozoizi erau susținute de un material dens abundent. Datele obținute demonstrează mobilitatea unică a spermatozoizilor de pui Sharkazi, precum și capacitatea spermatozoizilor de a aglutina și de a forma fascicule mobile, ceea ce contribuie la o mai bună înțelegere a depozitării pe termen lung a spermatozoizilor în SMT.
Pentru a realiza fertilizarea la oameni și la majoritatea animalelor, spermatozoizii și ovulele trebuie să ajungă la locul fertilizării la momentul potrivit. Prin urmare, împerecherea trebuie să aibă loc înainte sau în momentul ovulației. Pe de altă parte, unele mamifere, cum ar fi câinii, precum și specii non-mamifere, cum ar fi insectele, peștii, reptilele și păsările, stochează spermatozoizii în organele lor reproducătoare pentru o perioadă lungă de timp, până când ovulele lor sunt gata pentru fertilizare (fertilizare asincronă1). Păsările sunt capabile să mențină viabilitatea spermatozoizilor capabili să fertilizeze ovulele timp de 2-10 săptămâni2.
Aceasta este o caracteristică unică ce distinge păsările de alte animale, deoarece oferă o probabilitate mare de fertilizare după o singură inseminare timp de câteva săptămâni, fără împerechere și ovulație simultane. Principalul organ de stocare a spermei, numit tubul de stocare a spermei (SST), este situat în pliurile mucoase interne de la joncțiunea uterovaginală. Până în prezent, mecanismele prin care spermatozoizii intră, staționează și ies din banca de spermă nu sunt pe deplin înțelese. Pe baza studiilor anterioare, au fost emise multe ipoteze, dar niciuna dintre ele nu a fost confirmată.
Forman4 a emis ipoteza că spermatozoizii își mențin rezidența în cavitatea SST printr-o mișcare oscilatorie continuă, în sens invers direcției fluxului de fluid prin canalele proteice situate pe celulele epiteliale SST (reologie). ATP-ul este epuizat din cauza activității flagelare constante necesare pentru a menține spermatozoizii în lumenul SST, iar motilitatea scade în cele din urmă până când spermatozoizii sunt transportați din banca de spermă prin fluxul de fluid și încep o nouă călătorie pe trompa uterină ascendentă pentru a fertiliza spermatozoizii. Ovul (Forman4). Acest model de stocare a spermatozoizilor este susținut de detectarea prin imunocitochimie a aquaporinelor 2, 3 și 9 prezente în celulele epiteliale SST. Până în prezent, studiile privind reologia spermei de pui și rolul acesteia în stocarea SST, selecția vaginală a spermatozoizilor și competiția spermatozoizilor sunt insuficiente. La pui, spermatozoizii intră în vagin după împerecherea naturală, dar peste 80% dintre spermatozoizi sunt ejectați din vagin la scurt timp după împerechere. Acest lucru sugerează că vaginul este principalul loc pentru selecția spermatozoizilor la păsări. În plus, s-a raportat că mai puțin de 1% dintre spermatozoizii fertilizați în vagin ajung în SST2. În inseminarea artificială a puilor în vagin, numărul de spermatozoizi care ating SST tinde să crească la 24 de ore după inseminare. Până în prezent, mecanismul de selecție a spermatozoizilor în timpul acestui proces este neclar, iar motilitatea spermatozoizilor poate juca un rol important în absorbția spermatozoizilor prin SST. Datorită pereților groși și opaci ai trompelor uterine, este dificil să se monitorizeze direct motilitatea spermatozoizilor în trompele uterine la păsări. Prin urmare, ne lipsesc cunoștințele de bază despre modul în care spermatozoizii trec la SST după fertilizare.
Reologia a fost recent recunoscută ca un factor important care controlează transportul spermatozoizilor în organele genitale ale mamiferelor. Bazându-se pe capacitatea spermatozoizilor mobili de a migra în contracurent, Zaferani și colab.8 au utilizat un sistem microfluidic corra pentru a izola pasiv spermatozoizii mobili din probele de spermă conservate în țarc. Acest tip de sortare a spermei este esențial pentru tratamentul medical al infertilității și cercetarea clinică și este preferat metodelor tradiționale care necesită mult timp și muncă și pot compromite morfologia și integritatea structurală a spermatozoizilor. Cu toate acestea, până în prezent, nu au fost efectuate studii privind efectul secrețiilor din organele genitale ale puilor asupra motilității spermatozoizilor.
Indiferent de mecanismul care menține stocarea spermatozoizilor în SST, mulți cercetători au observat că spermatozoizii rezidenți se aglutinează cap la cap în SST-ul puilor 9, 10, prepelițelor 2 și curcanilor 11 pentru a forma fascicule de spermatozoizi aglutinați. Autorii sugerează că există o legătură între această aglutinare și stocarea pe termen lung a spermatozoizilor în SST.
Tingari și Lake12 au raportat o asociere puternică între spermatozoizii din glanda receptoare de spermă a puiului și au pus sub semnul întrebării dacă spermatozoizii aviari se aglutinează în același mod ca spermatozoizii mamiferelor. Aceștia cred că legăturile profunde dintre spermatozoizii din canalul deferent se pot datora stresului cauzat de prezența unui număr mare de spermatozoizi într-un spațiu mic.
La evaluarea comportamentului spermatozoizilor pe lame de sticlă proaspete, se pot observa semne tranzitorii de aglutinare, în special la marginile picăturilor de spermă. Cu toate acestea, aglutinarea a fost adesea perturbată de acțiunea de rotație asociată cu mișcarea continuă, ceea ce explică natura tranzitorie a acestui fenomen. Cercetătorii au observat, de asemenea, că atunci când diluantul a fost adăugat în spermă, au apărut agregate celulare alungite, „asemănătoare firelor”.
Primele încercări de a imita un spermatozoid au fost făcute prin îndepărtarea unui fir subțire dintr-o picătură suspendată, ceea ce a dus la o veziculă alungită, asemănătoare unui spermatozoid, care ieșea din picătura de spermă. Spermatozoizii s-au aliniat imediat paralel în interiorul veziculei, dar întreaga unitate a dispărut rapid din cauza limitării 3D. Prin urmare, pentru a studia aglutinarea spermatozoizilor, este necesar să se observe motilitatea și comportamentul spermatozoizilor direct în tubulii izolați de stocare a spermatozoizilor, ceea ce este dificil de realizat. Prin urmare, este necesar să se dezvolte un instrument care să imite spermatozoizii pentru a susține studiile privind motilitatea spermatozoizilor și comportamentul de aglutinare. Brillard și colab.13 au raportat că lungimea medie a tubulilor de stocare a spermatozoizilor la puii adulți este de 400-600 µm, dar unele suprafețe subțiri ale corpului (SST) pot avea o lungime de până la 2000 µm. Mero și Ogasawara14 au împărțit glandele seminifere în tubuli de stocare a spermei, măriți și nemăriți, ambii având aceeași lungime (~500 µm) și lățime a gâtului (~38 µm), dar diametrul mediu al lumenului tubulilor a fost de 56,6 și 56,6 µm, respectiv 11,2 μm. În studiul actual, am utilizat un dispozitiv microfluidic cu o dimensiune a canalului de 200 µm × 20 µm (l × H), a cărui secțiune transversală este oarecum apropiată de cea a SST amplificat. În plus, am examinat motilitatea spermatozoizilor și comportamentul de aglutinare în fluidul curgător, ceea ce este în concordanță cu ipoteza lui Foreman conform căreia fluidul produs de celulele epiteliale SST menține spermatozoizii în lumen într-o direcție în contracurent (reologică).
Scopul acestui studiu a fost de a depăși problemele legate de observarea motilității spermatozoizilor în trompele uterine și de a evita dificultățile studierii reologiei și comportamentului spermatozoizilor într-un mediu dinamic. A fost utilizat un dispozitiv microfluidic care creează presiune hidrostatică pentru a simula motilitatea spermatozoizilor în organele genitale ale unei găini.
Când o picătură de probă de spermă diluată (1:40) a fost încărcată în dispozitivul cu microcanal, au putut fi identificate două tipuri de motilitate a spermatozoizilor (sperma izolată și spermatozoizi legați). În plus, spermatozoizii aveau tendința de a înota împotriva curentului (reologie pozitivă; videoclipuri 1, 2). Deși fasciculele de spermatozoizi au avut o viteză mai mică decât cea a spermatozoizilor izolați (p < 0,001), acestea au crescut procentul de spermatozoizi care au prezentat reotaxie pozitivă (p < 0,001; Tabelul 2). Deși fasciculele de spermatozoizi au avut o viteză mai mică decât cea a spermatozoizilor izolați (p < 0,001), acestea au crescut procentul de spermatozoizi care au prezentat reotaxie pozitivă (p < 0,001; Tabelul 2). Хотя пучки сперматозоидов имели более низкую скорость, чем у одиночных сперматозох сперматозо1 (), < 0, низкую скорость увеличивали процент сперматозоидов, демонстрирующих положительный реотаксис (p < 0,001; цтал). Deși fasciculele de spermatozoizi au avut o viteză mai mică decât cea a spermatozoizilor individuali (p < 0,001), acestea au crescut procentul de spermatozoizi care au prezentat reotaxie pozitivă (p < 0,001; Tabelul 2).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度（p < 0,001），但它们增加了显示阳性流变性的精子百分比（p < 0,001；表2）。尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 （p <0,001） ， 但 增加 了 显瀾 昳怏 昳怏 昳怏百分比 （p <0,001 ； 2。。。。。。）））））） Хотя скорость пучков сперматозоидов была ниже, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), процент сперматозоидов с положительной реологией (p < 0,001; таблица 2). Deși viteza fasciculelor de spermatozoizi a fost mai mică decât cea a spermatozoizilor individuali (p < 0,001), aceștia au crescut procentul de spermatozoizi cu reologie pozitivă (p < 0,001; Tabelul 2).Reologia pozitivă pentru spermatozoizii individuali și smocuri este estimată la aproximativ 53%, respectiv 85%.
S-a observat că spermatozoizii găinilor Sharkashi, imediat după ejaculare, formează fascicule liniare, formate din zeci de indivizi. Aceste smocuri cresc în lungime și grosime în timp și pot rămâne in vitro timp de câteva ore înainte de a se disipa (video 3). Aceste fascicule filamentoase au forma spermatozoizilor de echidna care se formează la capătul epididimului. S-a constatat că sperma de găină Sharkashi are o tendință ridicată de aglutinare și de a forma un fascicul reticulat în mai puțin de un minut de la colectare. Aceste fascicule sunt dinamice și capabile să se lipească de orice pereți din apropiere sau obiecte statice. Deși fasciculele de spermatozoizi reduc viteza celulelor spermatozoizilor, este clar că macroscopic le cresc liniaritatea. Lungimea fasciculelor variază în funcție de numărul de spermatozoizi colectați în fascicule. Au fost izolate două părți ale fasciculului: partea inițială, care include capul liber al spermatozoidului aglutinat, și partea terminală, care include coada și întregul capăt distal al spermatozoidului. Folosind o cameră de mare viteză (950 fps), în partea inițială a fasciculului s-au observat capete libere de spermatozoizi aglutinați, responsabili de mișcarea fasciculului datorită mișcării lor oscilatorii, trăgându-i pe cei rămași în fascicul cu o mișcare elicoidală (Video 4). Cu toate acestea, în cazul smocurilor lungi, s-a observat că unele capete libere de spermatozoizi au aderat la corp, iar porțiunea terminală a smocului acționează ca niște palete pentru a ajuta la propulsarea smocului.
În timp ce se află într-un flux lent de fluid, fasciculele de spermatozoizi se mișcă paralel unul cu celălalt, însă încep să se suprapună și să se lipească de tot ceea ce este nemișcat, pentru a nu fi spălate de curent pe măsură ce viteza fluxului crește. Fasciculele se formează atunci când o mână de spermatozoizi se apropie unul de celălalt, încep să se miște sincron și să se înfășoare unul în jurul celuilalt, apoi se lipesc de o substanță lipicioasă. Figurile 1 și 2 arată cum spermatozoizii se apropie unul de celălalt, formând o joncțiune pe măsură ce cozile se înfășoară una în jurul celeilalte.
Cercetătorii au aplicat presiune hidrostatică pentru a crea un flux de fluid într-un microcanal pentru a studia reologia spermatozoizilor. A fost utilizat un microcanal cu o dimensiune de 200 µm × 20 µm (l × H) și o lungime de 3,6 µm. S-au folosit microcanale între recipiente cu seringi montate la capete. S-a folosit colorant alimentar pentru a face canalele mai vizibile.
Legați cablurile de interconectare și accesoriile de perete. Videoclipul a fost filmat cu un microscop cu contrast de fază. Fiecare imagine prezintă imagini de microscopie cu contrast de fază și cartografiere. (A) Conexiunea dintre două fluxuri opune rezistență curgerii datorită mișcării elicoidale (săgeată roșie). (B) Conexiunea dintre fasciculul de tuburi și peretele canalului (săgeți roșii), în același timp acestea sunt conectate la alte două fascicule (săgeți galbene). (C) Fasciculele de spermatozoizi din canalul microfluidic încep să se conecteze între ele (săgeți roșii), formând o plasă de fascicule de spermatozoizi. (D) Formarea unei rețele de fascicule de spermatozoizi.
Când o picătură de spermă diluată a fost încărcată în dispozitivul microfluidic și s-a creat un flux, s-a observat că fasciculul de spermă se mișcă împotriva direcției fluxului. Fasciculele se potrivesc perfect cu pereții microcanalelor, iar capetele libere din partea inițială a fasciculelor se potrivesc perfect cu acestea (video 5). De asemenea, acestea se lipesc de orice particule staționare din calea lor, cum ar fi resturile, pentru a rezista la a fi măturate de curent. În timp, aceste smocuri devin filamente lungi care captează alți spermatozoizi individuali și smocuri mai scurte (Video 6). Pe măsură ce fluxul începe să încetinească, linii lungi de spermatozoizi încep să formeze o rețea de linii spermatozoizi (Video 7; Figura 2).
La viteze mari de curgere (V > 33 µm/s), mișcările spiralate ale firelor sunt crescute, în încercarea de a prinde mai mulți spermatozoizi individuali care formează fascicule, pentru a rezista mai bine forței de derivă a fluxului. La viteze mari de curgere (V > 33 µm/s), mișcările spiralate ale firelor sunt crescute, în încercarea de a prinde mai mulți spermatozoizi individuali care formează fascicule, pentru a rezista mai bine forței de derivă a fluxului. При высокой скорости потока (V > 33 мкм/с) спиралевидные движения нитей усиливаются, постонььпыстоньпы поймать множество отдельных сперматозоидов, образующих пучки, которые лучше перматозоидов силе потока. La debite mari (V > 33 µm/s), mișcările elicoidale ale firelor cresc pe măsură ce acestea încearcă să prindă mulți spermatozoizi individuali, formând fascicule care sunt mai capabile să reziste mai bine forței de derivă a fluxului.在高流速(V > 33 µm/s)时，螺纹的螺旋运动增加，以试图捕捉许多形成束的单个精子，从而更好地抵抗流动的漂移力。在 高 流速 (v> 33 µm/s) 时 ， 的 螺旋 运动 增加 ， 以 试图 许多 形成 束 形成 束 形成 束 动 增加 ，从而 更 地 抵抗 的 漂移力。。。。。。。。。。 При высоких скоростях потока (V > 33 мкм/с) спиральное движение нитей увеличивается в потатхтка множество отдельных сперматозоидов, образующих пучки, чтобы лучше сопротивлше сопротивлятьай маспя. La debite mari (V > 33 µm/s), mișcarea elicoidală a filamentelor crește în încercarea de a capta mulți spermatozoizi individuali care formează fascicule pentru a rezista mai bine forțelor de derivă ale fluxului.De asemenea, au încercat să atașeze microcanale pe pereții laterali.
Fasciculele de spermatozoizi au fost identificate ca grupuri de capete de spermatozoizi și cozi ondulate folosind microscopia optică (LM). Fasciculele de spermatozoizi cu diverse agregate au fost, de asemenea, identificate ca capete răsucite și agregate flagelare, cozi multiple de spermatozoizi fuzionate, capete de spermatozoizi atașate de o coadă și capete de spermatozoizi cu nuclei îndoiți ca nuclei multipli fuzionați. microscopia electronică de transmisie (TEM). Microscopia electronică de scanare (SEM) a arătat că fasciculele de spermatozoizi erau agregate învelite de capete de spermatozoizi, iar agregatele de spermatozoizi prezentau o rețea atașată de cozi înfășurate.
Morfologia și ultrastructura spermatozoizilor, formarea fasciculelor de spermatozoizi au fost studiate utilizând microscopia optică (semi-secțiune), microscopia electronică de scanare (SEM) și microscopia electronică de transmisie (TEM), frotiurile de spermă au fost colorate cu portocaliu de acridină și examinate utilizând microscopia epifluorescență.
Colorația frotiului de spermă cu portocaliu de acridină (Fig. 3B) a arătat că capetele spermatozoizilor erau lipite între ele și acoperite cu material secretor, ceea ce a dus la formarea unor smocuri mari (Fig. 3D). Fasciculele de spermatozoizi erau formate din agregate de spermatozoizi cu o rețea de cozi atașate (Fig. 4A-C). Fasciculele de spermatozoizi sunt compuse din cozile multor spermatozoizi lipite între ele (Fig. 4D). Capetele fasciculelor de spermatozoizi erau acoperite de secretoare (Fig. 4E,F).
Formarea fasciculului de spermatozoizi. Folosind microscopia cu contrast de fază și frotiuri de spermă colorate cu portocaliu de acridină, s-a arătat că capetele spermatozoizilor se lipesc între ele. (A) Formarea timpurie a smocului de spermatozoizi începe cu un spermatozoid (cerc alb) și trei spermatozoizi (cerc galben), spirala începând de la coadă și terminându-se la cap. (B) Microfotografie a unui frotiu de spermă colorat cu portocaliu de acridină, care prezintă capetele spermatozoizilor aderenți (săgeți). Descărcarea acoperă capul/capetele. Mărire × 1000. (C) Dezvoltarea unui fascicul mare transportat prin flux într-un canal microfluidic (folosind o cameră de mare viteză la 950 fps). (D) Micrografie a unui frotiu de spermă colorat cu portocaliu de acridină, care prezintă smocuri mari (săgeți). Mărire: ×200.
Micrografie electronică cu scanare a unui fascicul de spermatozoizi și a unui frotiu de spermatozoizi colorat cu portocaliu de acridină. (A, B, D, E) sunt micrografii electronice digitale color cu scanare ale spermatozoizilor, iar C și F sunt micrografii ale unor frotiuri de spermatozoizi colorate cu portocaliu de acridină, care arată atașarea mai multor spermatozoizi care înfășoară rețeaua caudală. (AC) Agregatele de spermatozoizi sunt prezentate ca o rețea de cozi atașate (săgeți). (D) Aderența mai multor spermatozoizi (cu substanță adezivă, contur roz, săgeată) care se înfășoară în jurul cozii. (E și F) Agregate ale capului spermatozoizilor (indicatori) acoperite cu material adeziv (indicatori). Spermatozoizii au format fascicule cu mai multe structuri asemănătoare vortexurilor (F). (C) Măriri ×400 și (F) Măriri ×200.
Folosind microscopia electronică de transmisie, am constatat că fasciculele de spermatozoizi aveau cozi atașate (Fig. 6A, C), capete atașate de cozi (Fig. 6B) sau capete atașate de cozi (Fig. 6D). Capetele spermatozoizilor din fascicul sunt curbate, prezentând în secțiune două regiuni nucleare (Fig. 6D). În fasciculul incizionat, spermatozoizii aveau un cap răsucit cu două regiuni nucleare și multiple regiuni flagelare (Fig. 5A).
Micrografie electronică color digitală care prezintă cozile de legătură din fasciculul de spermatozoizi și materialul aglutinant care leagă capetele spermatozoizilor. (A) Coada atașată a unui număr mare de spermatozoizi. Observați cum arată coada atât în ​​proiecția portret (săgeată), cât și în cea peisaj (săgeată). (B) Capul (săgeată) spermatozoidului este conectat la coadă (săgeată). (C) Sunt atașate mai multe cozi de spermatozoizi (săgeți). (D) Materialul de aglutinare (AS, albastru) conectează patru capete de spermatozoizi (violet).
Microscopia electronică cu scanare a fost utilizată pentru a detecta capetele spermatozoizilor în fasciculele de spermatozoizi acoperite cu secreții sau membrane (Figura 6B), indicând faptul că fasciculele de spermatozoizi erau ancorate de material extracelular. Materialul aglutinat a fost concentrat în capul spermatozoizilor (ansamblul asemănător unui cap de meduză; Fig. 5B) și s-a extins distal, dând un aspect galben strălucitor la microscopia cu fluorescență atunci când a fost colorat cu portocaliu de acridină (Fig. 6C). Această substanță este clar vizibilă la microscopul cu scanare și este considerată un liant. Secțiunile semi-subțiri (Fig. 5C) și frotiurile de spermă colorate cu portocaliu de acridină au arătat fascicule de spermatozoizi conținând capete dens împachetate și cozi ondulate (Fig. 5D).
Diverse microfotografii care prezintă agregarea capetelor spermatozoizilor și a cozilor pliate folosind diverse metode. (A) Micrografie electronică cu transmisie digitală color, în secțiune transversală, a unui fascicul de spermatozoizi, care prezintă un cap de spermatozoizi încolăcit cu un nucleu bipartit (albastru) și mai multe părți flagelare (verde). (B) Micrografie electronică cu scanare digitală color, care prezintă un grup de capete de spermatozoizi asemănătoare meduzelor (săgeți) care par a fi acoperite. (C) Secțiune semi-subțire care prezintă capete de spermatozoizi agregate (săgeți) și cozi curbate (săgeți). (D) Micrografie a unui frotiu de spermatozoizi colorat cu portocaliu de acridină, care prezintă agregate de capete de spermatozoizi (săgeți) și cozi aderente curbate (săgeți). Rețineți că o substanță lipicioasă (S) acoperă capul spermatozoizilor. (D) Mărire × 1000.
Folosind microscopia electronică de transmisie (Fig. 7A), s-a observat, de asemenea, că capetele spermatozoizilor erau răsucite, iar nucleii aveau o formă spiralată, fapt confirmat de frotiurile de spermă colorate cu portocaliu de acridină și examinate prin microscopie cu fluorescență (Fig. 7B).
(A) Micrografie electronică cu transmisie digitală color și (B) Frotiu de spermă colorat cu portocaliu de acridină, care prezintă capetele spiralate și atașarea capetelor și cozilor spermatozoizilor (săgeți). (B) Mărire × 1000.
O descoperire interesantă este că spermatozoizii lui Sharkazi se agregă pentru a forma fascicule filamentoase mobile. Proprietățile acestor fascicule ne permit să înțelegem posibilul lor rol în absorbția și depozitarea spermatozoizilor în suprafața suprafeței subcutanate (SST).
După împerechere, spermatozoizii intră în vagin și trec printr-un proces intens de selecție, rezultând doar un număr limitat de spermatozoizi care intră în SST15,16. Până în prezent, mecanismele prin care spermatozoizii intră și ies din SST sunt neclare. La păsările de curte, spermatozoizii sunt depozitați în SST pentru o perioadă extinsă de 2 până la 10 săptămâni, în funcție de specie6. Controverse rămân cu privire la starea spermei în timpul depozitării în SST. Sunt în mișcare sau în repaus? Cu alte cuvinte, cum își mențin spermatozoizii poziția în SST atât de mult timp?
Forman4 a sugerat că rezidența și ejecția SST-ului ar putea fi explicate în termeni de motilitate a spermatozoizilor. Autorii emit ipoteza că spermatozoizii își mențin poziția înotând împotriva fluxului de fluid creat de epiteliul SST și că spermatozoizii sunt ejectați din SST atunci când viteza lor scade sub punctul în care încep să se miște înapoi din cauza lipsei de energie. Zaniboni5 a confirmat prezența aquaporinelor 2, 3 și 9 în porțiunea apicală a celulelor epiteliale SST, ceea ce poate susține indirect modelul de stocare a spermatozoizilor al lui Foreman. În studiul actual, am descoperit că aproape jumătate dintre spermatozoizii lui Sharkashi prezintă reologie pozitivă în fluidul care curge și că fasciculele de spermatozoizi aglutinați cresc numărul de spermatozoizi care prezintă reologie pozitivă, deși aglutinarea îi încetinește. Modul în care spermatozoizii călătoresc în sus prin trompa uterină a păsării până la locul fertilizării nu este pe deplin înțeles. La mamifere, lichidul folicular chemoatrage spermatozoizii. Cu toate acestea, se crede că substanțele chemoatractante direcționează spermatozoizii să se apropie pe distanțe lungi7. Prin urmare, alte mecanisme sunt responsabile pentru transportul spermatozoizilor. Capacitatea spermatozoizilor de a se orienta și de a curge împotriva lichidului din trompele uterine eliberat după împerechere a fost raportată ca fiind un factor major în direcționarea spermatozoizilor la șoareci. Parker 17 a sugerat că spermatozoizii traversează oviductele înotând împotriva curentului ciliar la păsări și reptile. Deși nu a fost demonstrat experimental la păsări, Adolphi 18 a fost primul care a descoperit că sperma aviară dă rezultate pozitive atunci când un strat subțire de lichid între o lamelă și o lamă este creat cu o bandă de hârtie de filtru. Reologie. Hino și Yanagimachi [19] au plasat un complex ovar-tubar-uterin de șoarece într-un inel de perfuzie și au injectat 1 µl de cerneală în istm pentru a vizualiza fluxul de fluid în trompele uterine. Aceștia au observat o mișcare foarte activă de contracție și relaxare în trompele uterine, în care toate bilele de cerneală se deplasau constant spre ampula trompei uterine. Autorii subliniază importanța fluxului de lichid tubar de la trompele uterine inferioare la cele superioare pentru ridicarea și fertilizarea spermatozoizilor. Brillard20 a raportat că la pui și curcani, spermatozoizii migrează prin mișcare activă de la intrarea vaginală, unde sunt depozitați, la joncțiunea utero-vaginală, unde sunt depozitați. Cu toate acestea, această mișcare nu este necesară între joncțiunea utero-vaginală și infundibul, deoarece spermatozoizii sunt transportați prin deplasare pasivă. Cunoscând aceste recomandări anterioare și rezultatele obținute în studiul actual, se poate presupune că capacitatea spermatozoizilor de a se deplasa în amonte (reologia) este una dintre proprietățile pe care se bazează procesul de selecție. Aceasta determină trecerea spermatozoizilor prin vagin și intrarea lor în CCT pentru depozitare. Așa cum a sugerat Forman4, acest lucru poate facilita, de asemenea, procesul de intrare a spermatozoizilor în SST și habitatul său pentru o perioadă de timp și apoi ieșirea lor atunci când viteza lor începe să încetinească.
Pe de altă parte, Matsuzaki și Sasanami 21 au sugerat că spermatozoizii aviari suferă modificări ale motilității de la starea de repaus la motilitate în tractul reproducător masculin și feminin. Inhibarea motilității spermatozoizilor rezidenți în SST a fost propusă pentru a explica timpul lung de depozitare a spermatozoizilor și apoi reîntinerirea după părăsirea SST. În condiții hipoxice, Matsuzaki și colab. 1 au raportat o producție și eliberare ridicată de lactat în SST, ceea ce poate duce la inhibarea motilității spermatozoizilor rezidenți. În acest caz, importanța reologiei spermatozoizilor se reflectă în selecția și absorbția spermatozoizilor, și nu în depozitarea lor.
Modelul de aglutinare a spermatozoizilor este considerat o explicație plauzibilă pentru perioada lungă de depozitare a spermatozoizilor în SST, deoarece acesta este un model comun de retenție a spermatozoizilor la păsările de curte2,22,23. Bakst și colab. 2 au observat că majoritatea spermatozoizilor aderau unii la alții, formând agregate fasciculare, iar spermatozoizii singulari au fost rareori găsiți în CCM-ul de prepeliță. Pe de altă parte, Wen și colab. 24 au observat spermatozoizi mai împrăștiați și mai puține smocuri de spermatozoizi în lumenul SST la pui. Pe baza acestor observații, se poate presupune că tendința pentru aglutinarea spermatozoizilor diferă între păsări și între spermatozoizii din același ejaculat. În plus, Van Krey și colab. 9 au sugerat că disocierea aleatorie a spermatozoizilor aglutinați este responsabilă pentru penetrarea treptată a spermatozoizilor în lumenul trompelor uterine. Conform acestei ipoteze, spermatozoizii cu o capacitate de aglutinare mai mică ar trebui expulzați mai întâi din SST. În acest context, capacitatea spermatozoizilor de a aglutina poate fi un factor care influențează rezultatul competiției spermatozoizilor la păsările care reproduc. În plus, cu cât spermatozoizii aglutinați se disociază mai mult, cu atât fertilitatea se menține mai mult timp.
Deși agregarea spermatozoizilor și agregarea lor în fascicule au fost observate în mai multe studii2,22,24, acestea nu au fost descrise în detaliu din cauza complexității observării lor cinematice în cadrul SST. Au fost făcute mai multe încercări de a studia aglutinarea spermatozoizilor in vitro. A fost observată o agregare extinsă, dar tranzitorie, atunci când firul subțire a fost îndepărtat de la picătura de semințe suspendată. Acest lucru duce la faptul că o bulă alungită iese din picătură, imitând glanda seminală. Din cauza limitărilor 3D și a timpilor scurți de uscare prin picurare, întregul bloc s-a deteriorat rapid9. În studiul actual, folosind pui Sharkashi și cipuri microfluidice, am putut descrie cum se formează aceste smocuri și cum se mișcă. Fasciculele de spermatozoizi s-au format imediat după colectarea spermei și s-a constatat că se mișcă în spirală, prezentând o reologie pozitivă atunci când sunt prezente în flux. În plus, atunci când sunt privite macroscopic, s-a observat că fasciculele de spermatozoizi cresc liniaritatea motilității în comparație cu spermatozoizii izolați. Acest lucru sugerează că aglutinarea spermatozoizilor poate avea loc înainte de penetrarea SST și că producția de spermatozoizi nu este limitată la o zonă mică din cauza stresului, așa cum s-a sugerat anterior (Tingari și Lake12). În timpul formării smocurilor, spermatozoizii înoată în sincron până când formează o joncțiune, apoi cozile lor se înfășoară una în jurul celeilalte, iar capul spermatozoidului rămâne liber, dar coada și partea distală a spermatozoidului se lipesc împreună cu o substanță lipicioasă. Prin urmare, capul liber al ligamentului este responsabil pentru mișcare, trăgând restul ligamentului. Microscopia electronică cu scanare a fasciculelor de spermatozoizi a arătat capete de spermatozoizi atașate, acoperite cu mult material lipicios, sugerând că acestea erau atașate în fascicule de repaus, ceea ce s-ar fi putut produce după atingerea locului de stocare (SST).
Când un frotiu de spermă este colorat cu portocaliu de acridină, materialul adeziv extracelular din jurul spermatozoizilor poate fi observat la microscopul fluorescent. Această substanță permite fasciculelor de spermatozoizi să adere și să se lipească de orice suprafețe sau particule înconjurătoare, astfel încât să nu se deplaseze odată cu fluxul din jur. Astfel, observațiile noastre arată rolul aderenței spermatozoizilor sub formă de fascicule mobile. Capacitatea lor de a înota împotriva curentului și de a se lipi de suprafețele din apropiere permite spermatozoizilor să rămână mai mult timp în SST.
Rothschild25 a utilizat o cameră de hemocitometrie pentru a studia distribuția plutitoare a spermei bovine într-o picătură de suspensie, realizând microfotografii printr-o cameră cu axă optică atât verticală, cât și orizontală a microscopului. Rezultatele au arătat că spermatozoizii au fost atrași de suprafața camerei. Autorii sugerează că pot exista interacțiuni hidrodinamice între spermatozoizi și suprafață. Având în vedere acest lucru, împreună cu capacitatea spermei de pui Sharkashi de a forma smocuri lipicioase, ar putea crește probabilitatea ca sperma să adere la peretele SST și să fie stocată pentru perioade lungi de timp.
Bccetti și Afzeliu26 au raportat că glicocalixul spermatozoizilor este necesar pentru recunoașterea și aglutinarea gameților. Forman10 a observat că hidroliza legăturilor α-glicozidice din învelișurile glicoproteină-glicolipide prin tratarea spermei aviare cu neuraminidază a dus la o fertilitate redusă fără a afecta motilitatea spermatozoizilor. Autorii sugerează că efectul neuraminidazei asupra glicocalixului afectează sechestrarea spermatozoizilor la joncțiunea utero-vaginală, reducând astfel fertilitatea. Observațiile lor nu pot ignora posibilitatea ca tratamentul cu neuraminidază să reducă recunoașterea spermatozoizilor și a ovocitelor. Forman și Engel10 au descoperit că fertilitatea a fost redusă atunci când găinile au fost inseminate intravaginal cu spermă tratată cu neuraminidază. Cu toate acestea, fertilizarea in vitro cu spermă tratată cu neuraminidază nu a afectat fertilitatea în comparație cu puii de control. Autorii au concluzionat că modificările învelișului glicoprotein-glicolipidic din jurul membranei spermatozoizilor au redus capacitatea spermatozoizilor de a fertiliza prin afectarea sechestrării spermatozoizilor la joncțiunea utero-vaginală, ceea ce, la rândul său, a crescut pierderea de spermatozoizi din cauza vitezei joncțiunii utero-vaginale, dar nu a afectat recunoașterea spermatozoizilor și a ovulelor.
La curcani, Bakst și Bauchan 11 au descoperit vezicule mici și fragmente de membrană în lumenul tubului subcutanat de suprafață (SST) și au observat că unele dintre aceste granule s-au contopit cu membrana spermatozoizilor. Autorii sugerează că aceste relații pot contribui la depozitarea pe termen lung a spermatozoizilor în SST. Cu toate acestea, cercetătorii nu au specificat sursa acestor particule, fie că sunt secretate de celulele epiteliale CCT, produse și secretate de sistemul reproducător masculin sau produse de spermatozoid în sine. De asemenea, aceste particule sunt responsabile de aglutinare. Grützner și colab. 27 au raportat că celulele epiteliale epididimale produc și secretă o proteină specifică necesară pentru formarea tracturilor seminale cu un singur por. Autorii raportează, de asemenea, că dispersia acestor fascicule depinde de interacțiunea proteinelor epididimale. Nixon și colab. 28 au descoperit că anexele secretă o proteină, osteonectina acidă bogată în cisteină; SPARC este implicat în formarea smocurilor de spermatozoizi la echidne și ornitorinci cu cioc scurt. Împrăștierea acestor fascicule este asociată cu pierderea acestei proteine.
În studiul actual, analiza ultrastructurală utilizând microscopia electronică a arătat că spermatozoizii au aderat la o cantitate mare de material dens. Se consideră că aceste substanțe sunt responsabile pentru aglutinarea care se condensează între și în jurul capetelor aderente, dar la concentrații mai mici în regiunea cozii. Presupunem că această substanță aglutinantă este excretată din sistemul reproducător masculin (epididim sau canal deferent) împreună cu sperma, deoarece observăm adesea separarea sperma de limfă și plasma seminală în timpul ejaculării. S-a raportat că, pe măsură ce spermatozoizii aviari trec prin epididim și canal deferent, aceștia suferă modificări legate de maturare care le susțin capacitatea de a lega proteinele și de a dobândi glicoproteine ​​asociate lemei plasmatice. Persistența acestor proteine ​​pe membranele spermatozoizilor rezidente în SST sugerează că aceste proteine ​​pot influența dobândirea stabilității membranei spermatozoizilor30 și pot determina fertilitatea acestora31. Ahammad și colab.32 au raportat că spermatozoizii obținuți din diferite părți ale sistemului reproducător masculin (de la testicule până la canalul deferent distal) au prezentat o creștere progresivă a viabilității în condiții de depozitare în lichide, indiferent de temperatura de depozitare, iar viabilitatea la pui crește și în trompele uterine după inseminarea artificială.
Smocuri de spermă de pui Sharkashi au caracteristici și funcții diferite față de alte specii, cum ar fi echidne, ornitorinchi, șoareci de pădure, șobolani-cerbi și cobai. La puii Sharkashi, formarea fasciculelor de spermatozoizi le-a redus viteza de înot în comparație cu spermatozoizii individuali. Cu toate acestea, aceste fascicule au crescut procentul de spermatozoizi reologic pozitivi și au crescut capacitatea spermatozoizilor de a se stabiliza într-un mediu dinamic. Astfel, rezultatele noastre confirmă sugestia anterioară conform căreia aglutinarea spermatozoizilor în SST este asociată cu stocarea pe termen lung a spermatozoizilor. De asemenea, emitem ipoteza că tendința spermatozoizilor de a forma smocuri poate controla rata de pierdere a spermatozoizilor în SST, ceea ce poate altera rezultatul competiției spermatozoizilor. Conform acestei presupuneri, spermatozoizii cu capacitate scăzută de aglutinare eliberează mai întâi SST, în timp ce spermatozoizii cu capacitate mare de aglutinare produc majoritatea urmașilor. Formarea fasciculelor de spermatozoizi cu un singur por este benefică și afectează raportul părinte-copil, dar utilizează un mecanism diferit. La echidne și ornitorinci, spermatozoizii sunt aranjați paralel unul cu celălalt pentru a crește viteza de avans a fasciculului. Fasciculele de echidne se mișcă de aproximativ trei ori mai repede decât spermatozoizii individuali. Se crede că formarea unor astfel de smocuri de spermatozoizi la echidne este o adaptare evolutivă pentru menținerea dominanței, deoarece femelele sunt promiscue și se împerechează de obicei cu mai mulți masculi. Prin urmare, spermatozoizii din diferite ejaculate concurează aprig pentru fertilizarea ovulului.
Spermatozoizii aglutinați ai găinilor sharkasi sunt ușor de vizualizat folosind microscopia cu contrast de fază, ceea ce este considerat avantajos deoarece permite studierea ușoară a comportamentului spermatozoizilor in vitro. Mecanismul prin care formarea smocurilor de spermatozoizi promovează reproducerea la găinile sharkasi este, de asemenea, diferit de cel observat la unele mamifere placentare care reprezintă comportamentul cooperativ al spermatozoizilor, cum ar fi șoarecii de lemn, unde unii spermatozoizi ajung la ovule, ajutând alți indivizi înrudiți să ajungă și să le deterioreze. pentru a te dovedi. comportament altruist. autofertilizare 34. Un alt exemplu de comportament cooperativ la spermatozoizi a fost găsit la șoarecii cerbi, unde spermatozoizii au fost capabili să identifice și să se combine cu spermatozoizii cei mai înrudiți genetic și să formeze grupuri cooperative pentru a-și crește viteza în comparație cu spermatozoizii neînrudiți35.
Rezultatele obținute în acest studiu nu contrazic teoria lui Foman privind stocarea pe termen lung a spermatozoizilor în SWS. Cercetătorii raportează că spermatozoizii continuă să se miște în fluxul celulelor epiteliale care căptușesc SST pentru o perioadă extinsă de timp, iar după o anumită perioadă de timp, rezervele de energie ale spermatozoizilor se epuizează, rezultând o scădere a vitezei, ceea ce permite expulzarea substanțelor cu greutate moleculară mică. Energia spermatozoizilor odată cu fluxul de fluid din lumenul SST, cavitatea trompelor uterine. În studiul actual, am observat că jumătate dintre spermatozoizii singulari au demonstrat capacitatea de a înota împotriva fluidelor care curg, iar aderența lor în fascicul le-a crescut capacitatea de a prezenta o reologie pozitivă. Mai mult, datele noastre sunt în concordanță cu cele ale lui Matsuzaki și colab. 1, care au raportat că o secreție crescută de lactat în SST poate inhiba motilitatea spermatozoizilor rezidenți. Cu toate acestea, rezultatele noastre descriu formarea ligamentelor mobile ale spermatozoizilor și comportamentul lor reologic în prezența unui mediu dinamic în cadrul unui microcanal, în încercarea de a elucida comportamentul lor în SST. Cercetările viitoare s-ar putea concentra pe determinarea compoziției chimice și a originii agentului aglutinant, ceea ce va ajuta, fără îndoială, cercetătorii să dezvolte noi modalități de stocare a spermei lichide și de creștere a duratei fertilității.
Cincisprezece masculi sharkasi (homozigoți dominanți; Na Na), cu gâtul gol, în vârstă de 30 de săptămâni, au fost selectați ca donatori de spermă în cadrul studiului. Păsările au fost crescute la Ferma de Cercetare Avicolă a Facultății de Agricultură, Universitatea Ashit, Guvernoratul Ashit, Egipt. Păsările au fost adăpostite în cuști individuale (30 x 40 x 40 cm), supuse unui program de lumină (16 ore de lumină și 8 ore de întuneric) și hrănite cu o dietă care conținea 160 g de proteină brută, 2800 kcal de energie metabolizabilă și 35 g de calciu fiecare. 5 grame de fosfor disponibil per kilogram de dietă.
Conform datelor 36, 37, sperma a fost colectată de la bărbați prin masaj abdominal. Un total de 45 de probe de spermă au fost colectate de la 15 bărbați pe parcursul a 3 zile. Sperma (n = 15/zi) a fost imediat diluată 1:1 (v:v) cu Belsville Poultry Semen Diluent, care conține difosfat de potasiu (1,27 g), glutamat monosodic monohidrat (0,867 g), fructoză (0,5 d), acetat de sodiu anhidru (0,43 g), tris(hidroximetil)aminometan (0,195 g), citrat de potasiu monohidrat (0,064 g), monofosfat de potasiu (0,065 g), clorură de magneziu (0,034 g) și H2O (100 ml), pH = 7,5, osmolaritate 333 mOsm/kg38. Probele de spermă diluate au fost examinate mai întâi la microscop optic pentru a asigura o bună calitate a spermei (umiditate) și apoi depozitate într-o baie de apă la 37°C până la utilizare în decurs de o jumătate de oră de la recoltare.
Cinematica și reologia spermatozoizilor sunt descrise folosind un sistem de dispozitive microfluidice. Probele de spermă au fost diluate în continuare la 1:40 în diluant de spermă aviară Beltsville, încărcate într-un dispozitiv microfluidic (vezi mai jos), iar parametrii cinetici au fost determinați folosind un sistem de analiză computerizată a spermei (CASA) dezvoltat anterior pentru caracterizarea microfluidică. Studii privind mobilitatea spermatozoizilor în medii lichide (Departamentul de Inginerie Mecanică, Facultatea de Inginerie, Universitatea Assiut, Egipt). Pluginul poate fi descărcat de la: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39. Au fost măsurate viteza curbei (VCL, μm/s), viteza liniară (VSL, μm/s) și viteza medie a traiectoriei (VAP, μm/s). Înregistrările video ale spermatozoizilor au fost realizate folosind un microscop inversat Optika XDS-3 cu contrast de fază (cu obiectiv 40x) conectat la o cameră Tucson ISH1000 la 30 fps timp de 3 s. Utilizați software-ul CASA pentru a studia cel puțin trei zone și 500 de traiectorii de spermatozoizi per probă. Videoclipul înregistrat a fost procesat folosind un instrument CASA creat special. Definiția motilității în plugin-ul CASA se bazează pe viteza de înot a spermatozoizilor în comparație cu debitul și nu include alți parametri, cum ar fi mișcarea laterală, deoarece s-a constatat că aceasta este mai fiabilă în fluxul de fluide. Mișcarea reologică este descrisă ca mișcarea spermatozoizilor împotriva direcției de curgere a fluidului. Spermatozoizii cu proprietăți reologice au fost împărțiți la numărul de spermatozoizi mobili; spermatozoizii care erau în repaus și care se mișcau convectiv au fost excluși din numărare.
Toate substanțele chimice utilizate au fost obținute de la Elgomhoria Pharmaceuticals (Cairo, Egipt), cu excepția cazului în care se specifică altfel. Dispozitivul a fost fabricat conform descrierii de El-sherry și colab. 40, cu unele modificări. Materialele utilizate pentru fabricarea microcanalelor au inclus plăci de sticlă (Howard Glass, Worcester, MA), rezist negativ SU-8-25 (MicroChem, Newton, CA), alcool diacetonic (Sigma Aldrich, Steinheim, Germania) și poliacetonă. -184, Dow Corning, Midland, Michigan). Microcanalele sunt fabricate folosind litografie moale. Mai întâi, o mască facială de protecție transparentă cu designul dorit al microcanalului a fost imprimată pe o imprimantă de înaltă rezoluție (Prismatic, Cairo, Egipt și Pacific Arts and Design, Markham, ON). Masterele au fost realizate folosind plăci de sticlă ca substraturi. Plăcile au fost curățate în acetonă, izopropanol și apă deionizată și apoi acoperite cu un strat de 20 µm de SU8-25 prin centrifugare (3000 rpm, 1 minut). Straturile SU-8 au fost apoi uscate ușor (65°C, 2 min și 95°C, 10 min) și expuse la radiații UV timp de 50 de secunde. Coacerea post-expunere la 65°C și 95°C timp de 1 minut și 4 min pentru a reticula straturile SU-8 expuse, urmată de developare în alcool diacetonic timp de 6,5 min. Vafele au fost coapte la temperatură înaltă (200°C timp de 15 min) pentru a solidifica în continuare stratul SU-8.
PDMS a fost preparat prin amestecarea monomerului și a întăritorului într-un raport de greutate de 10:1, apoi degazat într-un desicator în vid și turnat pe cadrul principal SU-8. PDMS a fost întărit într-un cuptor (120°C, 30 min), apoi canalele au fost decupate, separate de master și perforate pentru a permite atașarea tuburilor la intrarea și ieșirea microcanalului. În final, microcanalele PDMS au fost atașate permanent la lamele de microscop folosind un procesor corona portabil (Electro-Technic Products, Chicago, IL), așa cum este descris în altă parte. Microcanalul utilizat în acest studiu măsoară 200 µm × 20 µm (l × H) și are o lungime de 3,6 cm.
Curgerea fluidului indusă de presiunea hidrostatică în interiorul microcanalului se realizează prin menținerea nivelului fluidului în rezervorul de intrare peste diferența de înălțime Δh39 în rezervorul de ieșire (Fig. 1).
unde f este coeficientul de frecare, definit ca f = C/Re pentru fluxul laminar într-un canal dreptunghiular, unde C este o constantă care depinde de raportul de aspect al canalului, L este lungimea microcanalului, Vav este viteza medie în interiorul microcanalului, Dh este diametrul hidraulic al canalului, g – accelerația gravitațională. Folosind această ecuație, viteza medie a canalului poate fi calculată folosind următoarea ecuație: