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조류의 번식력은 정자 저장관(SST)에 충분한 양의 생존 가능한 정자를 장기간 저장하는 능력에 달려 있습니다. 정자가 SST에 들어가고, 머무르고, 나가는 정확한 기전은 여전히 ​​논란의 여지가 있습니다. 샤르카시 암탉의 정자는 응집 경향이 강하여 많은 세포를 포함하는 움직이는 섬유 다발을 형성하는 것으로 나타났습니다. 불투명한 나팔관 내에서 정자의 운동성과 행동을 관찰하기 어렵기 때문에, 본 연구에서는 정자의 응집 및 운동성을 연구하기 위해 정자의 단면과 유사한 미세 채널 단면을 가진 미세유체 장치를 사용했습니다. 본 연구에서는 정자 다발이 어떻게 형성되고, 어떻게 이동하며, SST 내 정자 체류 시간 연장에 어떤 역할을 하는지 고찰합니다. 정수압(유속 = 33 µm/s)을 이용하여 미세유체 채널 내에 유체 흐름을 발생시켰을 때 정자의 속도와 유변학적 거동을 조사했습니다. 정자는 흐름에 역행하여 헤엄치는 경향이 있으며(양의 유변학적 특성), 정자 다발의 속도는 단일 정자에 비해 현저히 감소합니다. 정자 다발은 나선형으로 움직이며, 더 많은 단일 정자가 모일수록 길이와 두께가 증가하는 것으로 관찰되었습니다. 정자 다발은 유체 흐름 속도가 33µm/s를 초과하는 경우 유체에 휩쓸리지 않도록 미세유체 채널의 측벽에 접근하여 달라붙는 것이 관찰되었다. 정자 다발은 유체 흐름 속도가 33µm/s를 초과하는 경우 유체에 휩쓸리지 않도록 미세유체 채널의 측벽에 접근하여 달라붙는 것이 관찰되었다. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаутся и прилипаут к боковым стенкам микрофлуидных каналов, чтобы избежать сметания со скоростьу потока жидкости> 33 мкм / с. 유체 유속이 33µm/s를 초과할 때 정자 다발이 유체 채널의 측벽에 접근하여 부착되는 현상이 관찰되었습니다.观察到精子束接近并粘附에서통통한유동으로유동하는경우> 33 µm/s 扫过.33 µm/s 扫过。 Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаутся и прилипаут к боковым стенкам микрожидкостного канала, чтобы избежать сметания потоком жидкости со скоростьù > 33 мкм/с. 정자 덩어리는 33µm/s 이상의 유체 흐름에 휩쓸리지 않기 위해 미세유체 채널의 측벽에 접근하여 부착되는 것이 관찰되었습니다.주사전자현미경과 투과전자현미경 관찰 결과, 정자 다발은 풍부하고 조밀한 물질에 의해 지지되고 있는 것으로 나타났다. 이러한 데이터는 샤르카지 닭 정자의 독특한 운동성과 정자가 응집하여 이동성 다발을 형성하는 능력을 보여주며, 이는 SMT(정자 저장 시스템)에서 정자의 장기 저장에 대한 이해를 높이는 데 기여한다.
인간과 대부분의 동물에서 수정이 이루어지려면 정자와 난자가 적절한 시기에 수정 부위에 도달해야 합니다. 따라서 짝짓기는 배란 전이나 배란 시기에 이루어져야 합니다. 반면에 개와 같은 일부 포유류와 곤충, 어류, 파충류, 조류와 같은 비포유류 종은 난자가 수정 준비가 될 때까지 정자를 생식 기관에 장기간 저장합니다(비동시적 수정¹). 조류는 난자를 수정시킬 수 있는 정자의 생존력을 2~10주 동안 유지할 수 있습니다².
이는 다른 동물과 구별되는 독특한 특징으로, 교미와 배란이 동시에 일어나지 않아도 단 한 번의 인공수정으로 수주 동안 높은 수정 확률을 유지할 수 있게 해줍니다. 정자 저장 기관인 정자 저장관(SST)은 자궁질 접합부의 내부 점막 주름에 위치합니다. 현재까지 정자가 정자 저장관으로 들어가고, 머물고, 빠져나가는 기전은 완전히 밝혀지지 않았습니다. 이전 연구들을 바탕으로 여러 가설이 제시되었지만, 어느 것도 확증되지는 못했습니다.
Forman4는 정자가 SST 상피 세포에 위치한 단백질 채널(유변학)을 통해 유체 흐름 방향에 반하는 지속적인 진동 운동을 하면서 SST 공동에 머무른다고 가설을 세웠습니다. 정자를 SST 내강에 유지하기 위해 필요한 지속적인 편모 활동으로 인해 ATP가 소모되고, 결국 운동성이 감소하여 유체 흐름에 의해 정자 저장소에서 나와 나팔관을 따라 올라가 난자를 수정시키기 위한 새로운 여정을 시작합니다(Forman4). 이 정자 저장 모델은 SST 상피 세포에 존재하는 아쿠아포린 2, 3, 9의 면역세포화학적 검출에 의해 뒷받침됩니다. 현재까지 닭 정액의 유변학과 SST 저장, 질 내 정자 선택, 정자 경쟁에서의 역할에 대한 연구는 부족합니다. 닭에서 정자는 자연 교미 후 질로 들어가지만, 정자의 80% 이상이 교미 직후 질 밖으로 배출됩니다. 이는 질이 조류에서 정자 선택의 주요 부위임을 시사합니다. 또한, 질에서 수정된 정자의 1% 미만이 정관외수정관(SST)에 도달한다는 보고가 있습니다. 병아리의 질 인공수정 시, 수정 후 24시간이 지나면 SST에 도달하는 정자의 수가 증가하는 경향을 보입니다. 그러나 이 과정에서 정자 선택 기전은 아직 명확히 밝혀지지 않았으며, 정자 운동성이 SST로의 정자 이동에 중요한 역할을 할 것으로 추정됩니다. 조류의 나팔관은 벽이 두껍고 불투명하여 나팔관 내에서 정자 운동성을 직접 관찰하기 어렵습니다. 따라서 수정 후 정자가 SST로 이동하는 기전에 대한 기본적인 이해가 부족한 실정입니다.
최근 유체역학은 포유류 생식기에서 정자 이동을 조절하는 중요한 요소로 인식되고 있습니다. 운동성 정자가 역류 방향으로 이동하는 능력을 이용하여 Zaferani 등8은 Corra 미세유체 시스템을 사용하여 사육된 정액 샘플에서 운동성 정자를 수동적으로 분리했습니다. 이러한 정액 선별법은 불임 치료 및 임상 연구에 필수적이며, 시간과 노동력이 많이 소요되고 정자의 형태 및 구조적 완전성을 손상시킬 수 있는 기존 방법보다 선호됩니다. 그러나 현재까지 닭의 생식기 분비물이 정자 운동성에 미치는 영향에 대한 연구는 수행되지 않았습니다.
정자가 SST에 저장되는 메커니즘이 무엇이든 간에, 많은 연구자들은 닭(9, 10), 메추리(2), 칠면조(11)의 SST에서 정자들이 서로 머리를 맞대고 응집하여 정자 덩어리를 형성하는 것을 관찰했습니다. 저자들은 이러한 응집과 SST 내 정자의 장기 저장 사이에 연관성이 있다고 제안합니다.
Tingari와 Lake12는 닭의 정자 수용샘에서 정자들 간의 강한 연관성을 보고했으며, 조류 정자가 포유류 정자와 같은 방식으로 응집되는지에 대해 의문을 제기했습니다. 그들은 정관 내 정자들 사이의 깊은 연결이 좁은 공간에 많은 수의 정자가 존재함으로써 발생하는 스트레스 때문일 수 있다고 생각합니다.
신선한 정자를 매달아 놓은 유리 슬라이드에서 정자의 행동을 관찰했을 때, 특히 정액 방울의 가장자리에서 일시적인 응집 현상이 나타났습니다. 그러나 지속적인 움직임과 관련된 회전 작용으로 인해 응집이 자주 방해를 받았고, 이는 이러한 현상이 일시적인 이유를 설명해 줍니다. 연구진은 또한 정액에 희석액을 첨가했을 때 길쭉한 실 모양의 세포 응집체가 나타나는 것을 발견했습니다.
정자를 모방하려는 초기 시도는 매달린 정액 방울에서 가는 철사를 제거하는 방식으로 이루어졌는데, 그 결과 정액 방울에서 길쭉한 정자 모양의 소포가 돌출되었습니다. 정자는 소포 안에서 즉시 평행하게 배열되었지만, 3차원적 한계로 인해 전체 단위가 곧 사라졌습니다. 따라서 정자 응집을 연구하기 위해서는 분리된 정자 저장관에서 정자의 운동성과 행동을 직접 관찰해야 하는데, 이는 달성하기 어렵습니다. 그러므로 정자의 운동성과 응집 행동 연구를 지원하기 위해 정자를 모방하는 기기를 개발할 필요가 있습니다. Brillard 등13은 성체 병아리의 정자 저장관 평균 길이가 400~600µm이지만, 일부 정자 저장관은 2000µm에 달할 수 있다고 보고했습니다. Mero와 Ogasawara14는 정세관을 확장된 정자 저장관과 확장되지 않은 정자 저장관으로 나누었는데, 두 저장관 모두 길이(~500 µm)와 목 너비(~38 µm)는 동일했지만, 평균 내강 직경은 각각 56.6 µm와 11.2 µm였다. 본 연구에서는 채널 크기가 200 µm × 20 µm(가로 × 세로)인 미세유체 장치를 사용했는데, 이 장치의 단면적은 확장된 정자 저장관의 단면적과 다소 유사하다. 또한, 유동 유체 내에서 정자의 운동성과 응집 거동을 조사했는데, 이는 정자 저장관 상피세포에서 생성된 유체가 정자를 내강 내에서 역류(유변학적) 방향으로 유지시킨다는 Foreman의 가설과 일치한다.
본 연구의 목적은 나팔관 내 정자 운동성 관찰의 어려움을 극복하고, 역동적인 환경에서 정자의 유동학적 특성과 행동을 연구하는 데 따르는 난점을 해결하는 것이었다. 이를 위해 닭의 생식기 내 정자 운동성을 모사하기 위해 정수압을 발생시키는 미세유체 장치를 사용하였다.
희석된 정자 시료(1:40) 한 방울을 미세채널 장치에 넣었을 때, 두 가지 유형의 정자 운동성(분리된 정자와 결합된 정자)을 확인할 수 있었다. 또한, 정자는 유속에 반하여 헤엄치는 경향을 보였다(양성 유동학; 비디오 1, 2). 정자 다발은 단일 정자보다 속도가 느렸지만(p < 0.001), 양성 유향성을 보이는 정자의 비율을 증가시켰다(p < 0.001; 표 2). 정자 다발은 단일 정자보다 속도가 느렸지만(p < 0.001), 양성 유향성을 보이는 정자의 비율을 증가시켰다(p < 0.001; 표 2). Хотя пучки сперматозоидов имели более низкуу скорость, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), они увеличивали процент сперматозоидов, демонстрируших положительный реотаксис (p < 0,001; 표 2). 정자 다발의 속도는 단일 정자보다 낮았지만(p < 0.001), 양성 유향성을 보이는 정자의 비율을 증가시켰다(p < 0.001; 표 2).尽管子의 속도는 低于孤独精子의 속도(p < 0.001), 但它们增加了显示阳性流变性 精子百分比(p < 0.001表2)입니다.尽管 精子束 的 速titude 低于 孤独 的 速degree （p <0.001) , 但 增加 了 显示 阳性 流变性 精子 百分比 （p <0.001 ; 2。。。。。。)))))) Хотя скорость пучков сперматозоидов была ниже, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), они увеличивали процент сперматозоидов с положительной реологией (p < 0,001; 표 2). 정자 다발의 속도는 단일 정자의 속도보다 낮았지만(p < 0.001), 양성 유동학적 특성을 보이는 정자의 비율을 증가시켰다(p < 0.001; 표 2).단일 정자와 정자 다발의 양성 유동학적 특성은 각각 약 53%와 85%로 추정됩니다.
샤르카시 닭의 정자는 사정 직후 수십 개의 개체로 이루어진 선형 다발을 형성하는 것이 관찰되었습니다. 이러한 다발은 시간이 지남에 따라 길이와 두께가 증가하며, 시험관 내에서 수 시간 동안 유지되다가 소멸됩니다(비디오 3). 이 실 모양의 다발은 부고환 끝부분에서 형성되는 가시두더지 정자와 유사한 형태를 하고 있습니다. 샤르카시 암탉의 정액은 채취 후 1분 이내에 응집되어 그물 모양의 다발을 형성하는 경향이 매우 높은 것으로 나타났습니다. 이러한 다발은 역동적이며 주변 벽이나 고정된 물체에 달라붙을 수 있습니다. 정자 다발은 정자의 속도를 감소시키지만, 육안으로 관찰했을 때 정자의 직선성을 증가시키는 것이 분명합니다. 다발의 길이는 다발에 포함된 정자의 수에 따라 다릅니다. 다발은 두 부분으로 분리되었습니다. 하나는 응집된 정자의 자유로운 머리 부분을 포함하는 초기 부분이고, 다른 하나는 꼬리와 정자의 전체 말단 부분을 포함하는 말단 부분입니다. 고속 카메라(950fps)를 사용하여 관찰한 결과, 응집된 정자의 자유로운 머리 부분이 다발의 앞부분에서 진동 운동을 하며 다발을 움직이게 하고, 나선형 운동으로 나머지 정자들을 다발 안으로 끌어들이는 역할을 하는 것이 확인되었습니다(비디오 4). 그러나 긴 다발에서는 일부 자유로운 정자 머리가 몸체와 다발의 끝부분에 부착되어 마치 날개처럼 작용하여 다발을 추진하는 데 도움을 주는 것으로 관찰되었습니다.
유체의 흐름이 느릴 때는 정자 덩어리가 서로 평행하게 움직이지만, 유속이 빨라지면 서로 겹치고 정지해 있는 모든 것에 달라붙어 흐름에 휩쓸리지 않게 됩니다. 정자 덩어리는 소수의 정자들이 서로 접근하여 동시에 움직이기 시작하고 서로 감싸면서 끈적한 물질에 달라붙을 때 형성됩니다. 그림 1과 2는 정자들이 서로 접근하여 꼬리가 서로 감싸면서 접합부를 형성하는 모습을 보여줍니다.
연구진은 정자의 유동학적 특성을 연구하기 위해 미세 채널에 정수압을 가하여 유체 흐름을 생성했습니다. 사용된 미세 채널은 가로 200µm, 세로 20µm, 길이 3.6µm였습니다. 주사기가 양쪽 끝에 장착된 용기 사이에 미세 채널을 설치했습니다. 채널을 더 잘 보이게 하기 위해 식용 색소를 사용했습니다.
상호 연결 케이블과 부속품을 벽에 고정하십시오. 이 영상은 위상차 현미경으로 촬영되었습니다. 각 이미지에는 위상차 현미경 이미지와 매핑 이미지가 함께 제시됩니다. (A) 두 흐름 사이의 연결 부위는 나선형 운동(빨간색 화살표)으로 인해 흐름에 저항을 일으킵니다. (B) 튜브 다발과 채널 벽 사이의 연결 부위(빨간색 화살표)는 동시에 다른 두 개의 다발(노란색 화살표)과도 연결되어 있습니다. (C) 미세유체 채널 내의 정자 다발들이 서로 연결되기 시작하여(빨간색 화살표) 정자 다발 그물망을 형성합니다. (D) 정자 다발 네트워크의 형성.
희석된 정자 한 방울을 미세유체 장치에 넣고 흐름을 생성했을 때, 정자 다발이 흐름 방향과 반대 방향으로 움직이는 것이 관찰되었습니다. 정자 다발은 미세 채널의 벽에 밀착되었고, 다발 앞부분의 자유로운 정자 머리들도 벽에 밀착되었습니다(비디오 5). 또한, 흐름에 휩쓸리지 않도록 경로에 있는 정지된 입자(예: 파편)에 달라붙었습니다. 시간이 지남에 따라 이러한 정자 다발은 다른 단일 정자와 더 짧은 다발을 포획하는 긴 필라멘트가 되었습니다(비디오 6). 흐름 속도가 느려지기 시작하면 긴 정자 선들이 정자 선들의 네트워크를 형성하기 시작합니다(비디오 7; 그림 2).
유속이 높을수록(V > 33 µm/s) 실의 나선형 움직임이 증가하는데, 이는 많은 개별 정자를 포착하여 뭉쳐 흐름의 표류력에 더 잘 저항하려는 시도입니다. 유속이 높을수록(V > 33 µm/s) 실의 나선형 움직임이 증가하는데, 이는 많은 개별 정자를 포착하여 뭉쳐 흐름의 표류력에 더 잘 저항하려는 시도입니다. При высокой скорости потока (V > 33 мкм/с) спиралевидные движения нитей усиливаутся, поскольку они пытавится поймать множество отдельных сперматозоидов, образуких пучки, которые лучше противостоят дрейфуушей силе потока. 유속이 높을수록(V > 33 µm/s) 가닥의 나선형 움직임이 증가하는데, 이는 가닥들이 개별 정자를 포착하여 흐름의 표류력에 더 잘 저항할 수 있는 다발을 형성하려고 하기 때문입니다.높은 전류 속도(V > 33 µm/s)로 인해 더 많은 형태의 에너지를 얻을 수 있습니다.높은 유속(v> 33 µm/s)에서 , 的 螺旋 运动 增加 , 以 试图 许多 TYPE 束 单 个 精子 , 从而 更 地 抵抗 的漂移력。。。。。。。。。 При высоких скоростях потока (V > 33 мкм/с) спиральное движение нитей увеличивается в попытке захватить множество отдельных сперматозоидов, образууших пучки, чтобы лучше сопротивляться силам дрейфа потока. 유속이 높을수록(V > 33 µm/s) 필라멘트의 나선형 운동이 증가하여 많은 개별 정자를 포획하여 묶음을 형성함으로써 흐름의 표류력에 더 잘 저항하려고 합니다.그들은 또한 측벽에 미세 채널을 부착하려고 시도했습니다.
광학 현미경(LM)을 사용하여 정자 다발을 정자 머리와 말려 올라간 꼬리가 모여 있는 형태로 관찰하였다. 또한, 다양한 형태의 정자 다발이 뒤틀린 머리와 편모가 모여 있는 형태, 여러 개의 꼬리가 융합된 형태, 꼬리에 정자 머리가 붙어 있는 형태, 그리고 핵이 구부러진 정자 머리와 여러 개의 핵이 융합된 형태 등으로 확인되었다. 투과 전자 현미경(TEM)과 주사 전자 현미경(SEM)을 통해 정자 다발이 정자 머리가 피막으로 둘러싸인 응집체이며, 정자 응집체는 감싸인 꼬리들이 연결된 네트워크를 형성하고 있음을 관찰하였다.
정자의 형태 및 미세구조, 정자 다발 형성 과정은 광학 현미경(반단면), 주사 전자 현미경(SEM), 투과 전자 현미경(TEM)을 이용하여 연구하였고, 정자 도말 표본은 아크리딘 오렌지로 염색하여 형광 현미경으로 관찰하였다.
아크리딘 오렌지 염색을 이용한 정자 도말 표본 관찰(그림 3B)에서 정자 머리들이 서로 뭉쳐 분비물질로 덮여 큰 덩어리를 형성하고 있는 것이 확인되었다(그림 3D). 정자 덩어리는 꼬리들이 서로 연결된 정자 집합체로 이루어져 있었다(그림 4A-C). 또한, 정자 덩어리는 여러 정자의 꼬리가 서로 붙어 있는 형태로 구성되어 있다(그림 4D). 분비물질(그림 4E,F)이 정자 덩어리의 머리 부분을 덮고 있었다.
위상차 현미경과 아크리딘 오렌지로 염색한 정자 도말 표본을 이용하여 정자 다발 형성 과정을 관찰한 결과, 정자의 머리 부분이 서로 붙어 있는 것을 확인할 수 있었다. (A) 초기 정자 다발 형성은 정자 하나(흰색 원)와 세 개의 정자(노란색 원)로 시작되며, 나선형 구조는 꼬리에서 시작하여 머리 부분에서 끝난다. (B) 아크리딘 오렌지로 염색한 정자 도말 표본의 현미경 사진으로, 정자 머리가 서로 붙어 있는 모습(화살표)을 보여준다. 분비액이 머리 부분을 덮고 있다. 배율: ×1000. (C) 미세유체 채널 내 흐름에 의해 이동하는 큰 빔의 발달 과정(초당 950프레임의 고속 카메라 사용). (D) 아크리딘 오렌지로 염색한 정자 도말 표본의 현미경 사진으로, 큰 정자 다발(화살표)을 보여준다. 배율: ×200.
정자 덩어리와 아크리딘 오렌지로 염색한 정자 도말 표본의 주사 전자 현미경 사진. (A, B, D, E)는 정자의 디지털 컬러 주사 전자 현미경 사진이고, C와 F는 아크리딘 오렌지로 염색한 정자 도말 표본의 사진으로, 꼬리 부분을 감싸고 있는 여러 정자의 부착을 보여준다. (AC) 정자 응집체는 부착된 꼬리(화살표)의 네트워크 형태로 나타난다. (D) 여러 정자(접착 물질, 분홍색 윤곽선, 화살표)가 꼬리를 감싸고 있는 모습. (E와 F) 접착 물질(포인터)로 덮인 정자 머리 응집체(포인터). 정자들은 여러 개의 소용돌이 모양 구조를 가진 다발을 형성한다(F). (C)는 400배, (F)는 200배 확대 사진이다.
투과 전자 현미경을 사용하여 정자 다발이 꼬리가 붙어 있는 경우(그림 6A, C), 머리가 꼬리에 붙어 있는 경우(그림 6B), 또는 머리가 꼬리에 붙어 있는 경우(그림 6D)를 관찰했습니다. 다발 내 정자의 머리는 구부러져 있으며, 단면에서 두 개의 핵 영역을 보여줍니다(그림 6D). 절개된 다발의 정자는 두 개의 핵 영역과 여러 개의 편모 영역을 가진 뒤틀린 머리를 가지고 있었습니다(그림 5A).
디지털 컬러 전자 현미경 사진으로 정자 다발을 연결하는 꼬리와 정자 머리를 연결하는 응집 물질을 보여줍니다. (A) 다수의 정자에 붙어 있는 꼬리. 세로 방향(화살표)과 가로 방향(화살표)에서 꼬리의 모양을 확인할 수 있습니다. (B) 정자의 머리(화살표)가 꼬리(화살표)에 연결되어 있습니다. (C) 여러 개의 정자 꼬리(화살표)가 붙어 있습니다. (D) 응집 물질(AS, 파란색)이 네 개의 정자 머리(보라색)를 연결합니다.
주사전자현미경을 이용하여 분비물이나 막으로 덮인 정자 다발에서 정자 머리를 관찰한 결과(그림 6B), 정자 다발이 세포외 물질에 의해 고정되어 있음을 알 수 있었다. 응집된 물질은 정자 머리 부분에 집중되어 있었고(해파리 머리 모양 구조; 그림 5B), 말단으로 퍼져나가 아크리딘 오렌지로 염색했을 때 형광현미경에서 선명한 노란색을 나타냈다(그림 6C). 이 물질은 주사현미경으로 관찰했을 때 명확하게 보이며, 결합제로 여겨진다. 반박절편(그림 5C)과 아크리딘 오렌지로 염색한 정자 도말 표본에서는 정자 머리가 빽빽하게 모여 있고 꼬리가 말려 있는 정자 다발이 관찰되었다(그림 5D).
다양한 방법을 사용하여 정자 머리의 응집과 접힌 꼬리를 보여주는 여러 현미경 사진. (A) 정자 다발의 단면 디지털 컬러 투과 전자 현미경 사진으로, 두 부분으로 나뉜 핵(파란색)과 여러 개의 편모(녹색)를 가진 나선형 정자 머리를 보여준다. (B) 디지털 컬러 주사 전자 현미경 사진으로, 해파리처럼 생긴 정자 머리(화살표)들이 덮여 있는 것처럼 보이는 것을 보여준다. (C) 반박절편으로, 응집된 정자 머리(화살표)와 말려 올라간 꼬리(화살표)를 보여준다. (D) 아크리딘 오렌지로 염색한 정자 도말 표본의 현미경 사진으로, 정자 머리(화살표)의 응집체와 말려 올라간 채 부착된 꼬리(화살표)를 보여준다. 정자 머리에는 끈적한 물질(S)이 덮여 있는 것을 알 수 있다. (D) 1000배 확대.
투과 전자 현미경(그림 7A)을 사용하여 정자 머리가 꼬여 있고 핵이 나선형 모양을 하고 있음을 확인했으며, 아크리딘 오렌지로 염색한 정자 도말 표본을 형광 현미경으로 관찰한 결과(그림 7B)도 이를 뒷받침했습니다.
(A) 디지털 컬러 투과 전자 현미경 사진 및 (B) 아크리딘 오렌지로 염색한 정자 도말 표본에서 나선형으로 감긴 정자 머리와 정자 머리 및 꼬리의 부착(화살표)이 보인다. (B) 1000배 확대 사진.
흥미로운 발견은 샤르카지의 정자가 응집하여 이동 가능한 실 모양의 다발을 형성한다는 점입니다. 이러한 다발의 특성을 통해 우리는 SST에서 정자의 흡수 및 저장에 있어 이들이 어떤 역할을 할 수 있는지 이해할 수 있습니다.
짝짓기 후 정자는 질로 들어가 집중적인 선별 과정을 거쳐 소수의 정자만이 정낭(SST)에 도달하게 됩니다.^15,16 현재까지 정자가 정낭에 들어가고 나오는 기전은 명확히 밝혀지지 않았습니다. 가금류의 경우, 정자는 종에 따라 2주에서 10주까지 정낭에 장기간 저장됩니다.⁶ 정낭에 저장되는 동안 정자의 상태에 대해서는 여전히 논란이 있습니다. 정자는 움직이는 상태일까요, 아니면 정지 상태일까요? 다시 말해, 정자는 어떻게 그렇게 오랫동안 정낭에서 위치를 유지하는 것일까요?
Forman4는 SST(난관 내피 세포)의 체류 및 방출이 정자의 운동성으로 설명될 수 있다고 제안했습니다. 저자들은 정자가 SST 상피 세포에 의해 생성된 유체 흐름에 역행하여 헤엄치면서 위치를 유지하고, 에너지 부족으로 인해 역방향으로 움직이기 시작하는 지점 이하로 속도가 떨어지면 SST에서 방출된다고 가정했습니다. Zaniboni5는 SST 상피 세포의 첨단 부분에서 아쿠아포린 2, 3, 9의 존재를 확인했으며, 이는 Foreman의 정자 저장 모델을 간접적으로 뒷받침할 수 있습니다. 본 연구에서는 Sharkashi의 정자 중 거의 절반이 흐르는 유체에서 양성 유동학적 특성을 보였으며, 응집된 정자 덩어리는 양성 유동학적 특성을 보이는 정자의 수를 증가시키지만 응집은 속도를 늦추는 것으로 나타났습니다. 조류의 나팔관을 따라 정자가 수정 부위까지 이동하는 경로는 아직 완전히 밝혀지지 않았습니다. 포유류에서는 난포액이 정자를 화학적으로 유인합니다. 그러나 화학유인물질은 정자가 장거리를 이동하도록 유도하는 것으로 여겨집니다.7 따라서 정자 이동에는 다른 메커니즘이 관여합니다. 교미 후 분비되는 나팔관액에 맞서 방향을 잡고 흐르는 정자의 능력은 생쥐에서 정자 표적화의 주요 요인으로 보고되었습니다. Parker17는 조류와 파충류에서 정자가 섬모 운동을 거슬러 헤엄쳐 난관을 통과한다고 제안했습니다. 조류에서는 실험적으로 입증되지는 않았지만, Adolphi18는 커버슬립과 슬라이드 사이에 여과지 조각으로 얇은 액체층을 만들었을 때 조류 정자가 양성 반응을 보인다는 것을 처음으로 발견했습니다. 유체역학. Hino와 Yanagimachi[19]는 생쥐의 난소-나팔관-자궁 복합체를 관류 고리에 넣고 나팔관 협부에 1µl의 잉크를 주입하여 나팔관 내 유체 흐름을 시각화했습니다. 연구진은 나팔관에서 매우 활발한 수축과 이완 운동을 관찰했으며, 모든 잉크 알갱이가 나팔관 팽대부를 향해 꾸준히 이동하는 것을 확인했습니다. 저자들은 정자 상승 및 수정에 있어 하부 나팔관에서 상부 나팔관으로의 나팔관액 흐름의 중요성을 강조합니다. Brillard20는 닭과 칠면조에서 정자가 질 입구(저장된 곳)에서 자궁질 접합부(저장된 곳)까지 능동적으로 이동한다고 보고했습니다. 그러나 자궁질 접합부와 누두부 사이에서는 정자가 수동적으로 이동하기 때문에 이러한 능동적인 이동이 필요하지 않습니다. 이러한 기존 연구 결과와 본 연구 결과를 종합해 볼 때, 정자의 상류 이동 능력(유변학적 특성)은 정자 선택 과정의 중요한 요소 중 하나라고 추정할 수 있습니다. 이는 정자가 질을 통과하여 자궁관에 저장되는 것을 결정합니다. Forman4가 제안한 것처럼, 이는 정자가 SST와 그 서식지에 일정 시간 동안 머물다가 속도가 느려지기 시작하면 빠져나가는 과정을 용이하게 할 수도 있습니다.
한편, Matsuzaki와 Sasanami는 조류 정자가 수컷과 암컷 생식관에서 휴면 상태에서 운동성 상태로 운동성 변화를 겪는다고 제안했습니다. 정자의 장기간 저장과 정자 저장 후 재활성화는 정자 저장고(SST)에 존재하는 정자의 운동성 억제로 설명될 수 있습니다. Matsuzaki 등1은 저산소 조건에서 정자 저장고 내 젖산 생성 및 방출이 증가하며, 이는 정자 운동성 억제로 이어질 수 있다고 보고했습니다. 따라서 정자의 유동학적 특성은 정자 저장보다는 정자의 선택 및 흡수에 중요한 역할을 합니다.
정자 응집 패턴은 가금류에서 흔히 관찰되는 정자 잔류 패턴으로, 정자가 난관 내강에 장기간 머무르는 이유를 설명하는 타당한 근거로 여겨집니다.2,22,23 Bakst 등2은 메추리의 정액에서 대부분의 정자가 서로 응집하여 다발성 응집체를 형성하고 단일 정자는 거의 발견되지 않는다고 보고했습니다. 반면, Wen 등24은 닭의 난관 내강에서 정자가 흩어져 있고 정자 덩어리는 더 적게 관찰되었다고 보고했습니다. 이러한 관찰 결과를 바탕으로, 정자 응집 경향은 조류마다, 그리고 동일한 사정액 내에서도 정자마다 다를 수 있다고 추정할 수 있습니다. 또한, Van Krey 등9은 응집된 정자의 무작위적인 해리가 정자가 나팔관 내강으로 점진적으로 침투하는 데 기여한다고 제안했습니다. 이 가설에 따르면, 응집 능력이 낮은 정자가 정자낭에서 먼저 배출되어야 합니다. 이러한 맥락에서, 정자의 응집 능력은 오염된 조류에서 정자 경쟁 결과에 영향을 미치는 요인이 될 수 있습니다. 또한, 응집된 정자가 분리되는 시간이 길수록 수정 능력이 더 오래 유지됩니다.
여러 연구에서 정자의 응집 및 다발 형성이 관찰되었지만2,22,24, SST(정자 응집 시스템) 내에서의 운동학적 관찰의 복잡성으로 인해 자세한 설명은 이루어지지 않았습니다. 시험관 내에서 정자 응집을 연구하려는 시도가 여러 차례 있었습니다. 매달린 정액 방울에서 가는 철사를 제거했을 때 광범위하지만 일시적인 응집이 관찰되었습니다. 이로 인해 정액 방울에서 길쭉한 기포가 돌출되어 정낭을 모방하는 현상이 나타났습니다. 그러나 3차원적 한계와 짧은 건조 시간으로 인해 전체 블록이 빠르게 손상되었습니다9. 본 연구에서는 샤르카시 닭과 미세유체 칩을 이용하여 이러한 정자 덩어리가 어떻게 형성되고 이동하는지 설명할 수 있었습니다. 정자 다발은 정액 채취 직후 형성되었으며, 유체 흐름 속에서 나선형으로 이동하며 양의 유변학적 특성을 보였습니다. 또한, 육안으로 관찰했을 때 정자 다발은 개별 정자에 비해 운동성의 직선성을 증가시키는 것으로 나타났습니다. 이는 정자 응집이 SST 침투 이전에 발생할 수 있으며, 정자 생산이 이전에 제안되었던 것처럼 스트레스로 인해 좁은 영역에 국한되지 않는다는 것을 시사합니다(Tingari and Lake12). 정자 다발 형성 과정에서 정자들은 동기화되어 헤엄치다가 접합부를 형성한 후 꼬리가 서로 감싸고 정자 머리는 자유로운 상태로 남지만 꼬리와 정자의 말단 부분은 점액질로 서로 붙어 있습니다. 따라서, 자유롭게 움직이는 정자 머리 부분이 나머지 부분을 끌어당기면서 운동을 담당합니다. 정자 다발의 주사 전자 현미경 관찰 결과, 부착된 정자 머리가 많은 점액질로 덮여 있는 것이 관찰되었는데, 이는 정자 머리가 저장 부위(SST)에 도달한 후 휴면 다발 형태로 부착되어 있었음을 시사합니다.
정자 도말 표본을 아크리딘 오렌지로 염색하면 형광 현미경으로 정자 세포 주변의 세포외 접착 물질을 관찰할 수 있습니다. 이 물질은 정자 다발이 주변 표면이나 입자에 달라붙어 주변 흐름에 따라 떠내려가지 않도록 합니다. 따라서 우리의 관찰 결과는 이동성 다발 형태의 정자 접착력이 중요한 역할을 한다는 것을 보여줍니다. 정자는 흐름을 거슬러 헤엄치고 주변 표면에 달라붙는 능력을 통해 해류에 더 오래 머무를 수 있습니다.
Rothschild25는 혈구계측 카메라를 사용하여 현탁액 방울 내 소 정액의 부유 분포를 연구하고, 현미경의 수직 및 수평 광축을 모두 가진 카메라를 통해 사진을 촬영했습니다. 그 결과 정자가 용기 표면에 끌리는 것을 확인했습니다. 저자들은 정자와 표면 사이에 유체역학적 상호작용이 있을 수 있다고 제안했습니다. 이러한 점과 샤르카시 처리된 닭 정액이 끈적한 덩어리를 형성하는 특성을 고려할 때, 정액이 SST 벽에 부착되어 장기간 보관될 가능성이 높아질 수 있습니다.
Bccetti와 Afzeliu26은 정자 당피막이 배우자 인식 및 응집에 필수적이라고 보고했습니다. Forman10은 조류 정액을 뉴라미니다아제로 처리하여 당단백질-당지질 코팅의 α-글리코시드 결합을 가수분해한 결과, 정자 운동성에는 영향을 미치지 않으면서 수정률이 감소하는 것을 관찰했습니다. 저자들은 뉴라미니다아제가 당피막에 미치는 영향이 자궁-질 접합부에서의 정자 격리를 저해하여 수정률을 감소시킨다고 제안했습니다. 이러한 관찰 결과는 뉴라미니다아제 처리가 정자와 난자의 인식을 저해할 가능성을 배제할 수 없습니다. Forman과 Engel10은 뉴라미니다아제로 처리한 정액을 암탉에 질내 수정했을 때 수정률이 감소하는 것을 발견했습니다. 그러나 뉴라미니다아제로 처리한 정자를 이용한 체외 수정은 대조군 닭과 비교했을 때 수정률에 영향을 미치지 않았습니다. 저자들은 정자막 주변의 당단백질-당지질 코팅 변화가 자궁질 접합부에서 정자 격리를 저해하여 정자의 수정 능력을 감소시키고, 결과적으로 자궁질 접합부의 통과 속도로 인해 정자 손실이 증가하지만, 정자와 난자 인식에는 영향을 미치지 않는다고 결론지었다.
칠면조에서 Bakst와 Bauchan은 SST 내강에서 작은 소포와 막 조각을 발견했으며, 이러한 과립 중 일부가 정자 막과 융합된 것을 관찰했습니다. 저자들은 이러한 관계가 SST에서 정자의 장기 저장에 기여할 수 있다고 제안했습니다. 그러나 연구자들은 이러한 입자의 출처, 즉 CCT 상피 세포에서 분비되는 것인지, 남성 생식계에서 생성 및 분비되는 것인지, 또는 정자 자체에서 생성되는 것인지를 명확히 밝히지 않았습니다. 또한, 이러한 입자는 응집을 유발합니다. Grützner 등27은 부고환 상피 세포가 단일 구멍 정관 형성에 필요한 특정 단백질을 생성 및 분비한다고 보고했습니다. 저자들은 또한 이러한 다발의 분산이 부고환 단백질의 상호 작용에 따라 달라진다고 보고했습니다. Nixon 등28은 부속기관이 산성 시스테인 풍부 오스테오넥틴이라는 단백질을 분비한다는 것을 발견했습니다. SPARC는 가시두더지와 오리너구리의 정자 덩어리 형성에 관여합니다. 이 단백질의 손실은 정자 빔의 산란과 관련이 있습니다.
본 연구에서 전자 현미경을 이용한 초미세 구조 분석 결과, 정자가 다량의 고밀도 물질에 부착되어 있는 것이 관찰되었다. 이러한 물질은 정자 머리 부분 사이와 주변에 응집을 일으키는 원인으로 추정되지만, 꼬리 부분에서는 농도가 더 낮았다. 사정 시 정액이 림프액 및 정장액과 분리되는 현상이 흔히 관찰되므로, 이러한 응집 물질은 정액과 함께 수컷 생식기관(부고환 또는 정관)에서 배출되는 것으로 추정된다. 조류 정자가 부고환과 정관을 통과하면서 단백질 결합 능력 및 세포막 관련 당단백질 획득과 관련된 성숙 변화를 겪는다는 보고가 있다. 정자 세포막에 이러한 단백질이 지속적으로 존재하는 것은 정자막 안정성 획득에 영향을 미치고 30 정자의 수정 능력을 결정하는 요인이 될 수 있음을 시사한다. 31 Ahammad et al32는 남성 생식계의 다양한 부분(고환에서 정관 말단까지)에서 얻은 정자가 저장 온도와 관계없이 액체 저장 조건에서 생존력이 점진적으로 증가했으며 닭의 경우 인공 수정 후 나팔관에서도 생존력이 증가한다고 보고했습니다.
샤르카시 닭의 정자 덩어리는 가시두더지, 오리너구리, 숲쥐, 사슴쥐, 기니피그 등 다른 종과는 다른 특성과 기능을 가지고 있습니다. 샤르카시 닭에서 정자 덩어리 형성은 단일 정자에 비해 유영 속도를 감소시켰습니다. 그러나 이러한 덩어리는 유동학적으로 양성인 정자의 비율을 증가시키고 역동적인 환경에서 정자가 스스로 안정화되는 능력을 향상시켰습니다. 따라서 본 연구 결과는 정자 덩어리 형성이 정자 저장 기간 연장과 관련이 있다는 기존 가설을 뒷받침합니다. 또한, 정자의 덩어리 형성 경향이 정자 저장 중 정자 손실률을 조절하여 정자 경쟁의 결과를 바꿀 수 있다는 가설을 제시합니다. 이 가설에 따르면, 응집력이 낮은 정자는 정자 저장 중 먼저 방출되고, 응집력이 높은 정자는 대부분의 자손을 생산합니다. 단일 정자 덩어리 형성은 유익하며 부모-자식 비율에 영향을 미치지만, 그 기전은 다릅니다. 가시두더지와 오리너구리에서는 정자들이 서로 평행하게 배열되어 전진 속도를 높입니다. 가시두더지의 정자 덩어리는 단일 정자보다 약 3배 빠르게 이동합니다. 이러한 정자 덩어리 형성은 암컷이 여러 수컷과 짝짓기를 하는 난혼성 동물이기 때문에 우위를 유지하기 위한 진화적 적응으로 여겨집니다. 따라서 서로 다른 사정액에서 나온 정자들은 난자 수정을 위해 치열하게 경쟁합니다.
샤르카시 닭의 응집된 정자는 위상차 현미경을 사용하여 쉽게 관찰할 수 있는데, 이는 시험관 내에서 정자의 행동을 쉽게 연구할 수 있다는 점에서 유리합니다. 샤르카시 닭에서 정자 덩어리 형성이 번식을 촉진하는 기전은 일부 태반 포유류, 예를 들어 우드쥐와 같은 동물에서 볼 수 있는 협력적인 정자 행동과는 다릅니다. 우드쥐에서는 일부 정자가 난자에 도달하여 다른 관련 개체가 난자에 도달하여 손상시키는 것을 돕습니다. 이는 이타적인 행동이며, 자가수정을 통해 이루어집니다. 34. 정자의 협력적 행동의 또 다른 예는 사슴쥐에서 발견되었는데, 사슴쥐의 정자는 유전적으로 가장 가까운 정자를 식별하고 결합하여 협력 집단을 형성함으로써 관련 없는 정자에 비해 속도를 높일 수 있습니다.35
본 연구에서 얻은 결과는 정자가 SWS(자궁경부액)에 장기간 저장된다는 포먼(Foman)의 이론과 모순되지 않습니다. 연구자들은 정자가 SST(자궁경부액)를 둘러싼 상피세포의 흐름 속에서 장기간 운동을 지속하다가 일정 시간이 지나면 에너지 저장량이 고갈되어 속도가 감소하고, 그 결과 저분자량 물질을 방출하게 된다고 보고했습니다. 즉, 정자는 SST 내강에서 나팔관 내부로 흐르는 유체의 흐름 속에서 에너지를 얻는다는 것입니다. 본 연구에서는 정자 절반이 유체 흐름에 저항하여 헤엄치는 능력을 보였으며, 정자들이 뭉쳐서 움직일 때 양성 유동학적 특성을 나타내는 능력이 증가하는 것을 관찰했습니다. 또한, 본 연구 결과는 SST에서 젖산 분비가 증가하면 정자의 운동성이 저하될 수 있다고 보고한 마쓰자키(Matsuzaki) 등¹의 연구 결과와 일치합니다. 그러나 본 연구 결과는 정자 운동성 인대의 형성과 미세 채널 내 동적 환경에서의 유동학적 거동을 설명함으로써 SST(정액 저장)에서의 그 특성을 규명하고자 했습니다. 향후 연구에서는 응집제의 화학적 조성과 기원을 밝히는 데 집중할 수 있으며, 이는 액체 정액을 보관하고 가임 기간을 연장하는 새로운 방법을 개발하는 데 도움이 될 것입니다.
본 연구에서는 30주령의 털 없는 수컷 샤르카시(동형접합 우성; Na Na) 15마리를 정자 공여체로 선정하였다. 닭들은 이집트 아시트 주 아시트 대학교 농학부 연구 가금류 농장에서 사육되었다. 닭들은 개별 케이지(30 x 40 x 40 cm)에 수용되었고, 16시간 조명과 8시간 암흑의 광주기 조건에 노출되었으며, 조단백질 160g, 대사 에너지 2800kcal, 칼슘 35g, 이용 가능한 인 5g을 함유한 사료를 급여받았다.
자료 36, 37에 따르면, 남성의 정액은 복부 마사지를 통해 채취되었다. 3일 동안 15명의 남성으로부터 총 45개의 정액 샘플을 채취하였다. 채취한 정액(n = 15/일)은 즉시 Belsville 가금류 정액 희석액(인산이칼륨 1.27g, 글루탐산나트륨 일수화물 0.867g, 과당 0.5g, 무수 아세트산나트륨 0.43g, 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄 0.195g, 구연산칼륨 일수화물 0.064g, 인산일칼륨 0.065g, 염화마그네슘 0.034g, 물 100ml 함유, pH 7.5, 삼투압 333mOsm/kg38)으로 1:1(v:v) 희석하였다. 희석된 정액 샘플은 먼저 광학 현미경으로 검사하여 정액의 질(수분 함량)이 양호한지 확인한 후, 채취 후 30분 이내에 사용하기 전까지 37°C의 수조에 보관했습니다.
정자의 운동학 및 유변학적 특성은 미세유체 장치 시스템을 이용하여 분석하였다. 정액 샘플을 Beltsville 조류 정액 희석액으로 1:40으로 추가 희석한 후 미세유체 장치(아래 참조)에 넣고, 이전에 액체 매질에서 정자의 이동성을 분석하기 위해 개발된 컴퓨터화된 정액 분석(CASA) 시스템을 이용하여 운동학적 매개변수를 측정하였다(이집트 아시우트 대학교 공과대학 기계공학과). 해당 플러그인은 http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39에서 다운로드할 수 있다. 곡선 속도(VCL, μm/s), 직선 속도(VSL, μm/s) 및 평균 궤적 속도(VAP, μm/s)를 측정하였다. 정자 영상은 Optika XDS-3 역상 현미경(40배율 대물렌즈 사용)과 Tucson ISH1000 카메라를 연결하여 초당 30프레임, 3초 동안 촬영했습니다. CASA 소프트웨어를 사용하여 샘플당 최소 3개 영역과 500개의 정자 궤적을 분석했습니다. 녹화된 영상은 자체 제작한 CASA 프로그램을 사용하여 처리했습니다. CASA 플러그인에서 운동성은 유속에 대한 정자의 수영 속도를 기준으로 정의하며, 유체 흐름에서 더 신뢰할 수 있는 것으로 알려진 좌우 운동과 같은 다른 매개변수는 포함하지 않습니다. 유변학적 운동은 정자가 유체 흐름 방향에 반하여 움직이는 것을 의미합니다. 유변학적 특성을 보이는 정자의 수를 운동성 정자 수로 나누었으며, 정지 상태의 정자와 대류 운동을 하는 정자는 계산에서 제외했습니다.
달리 명시되지 않은 모든 화학 물질은 Elgomhoria Pharmaceuticals(이집트 카이로)에서 구입했습니다. 장치는 El-sherry et al.40에 설명된 방법을 일부 수정하여 제작했습니다. 마이크로채널 제작에 사용된 재료는 유리판(Howard Glass, Worcester, MA), SU-8-25 네거티브 레지스트(MicroChem, Newton, CA), 디아세톤 알코올(Sigma Aldrich, Steinheim, Germany) 및 폴리아세톤-184(Dow Corning, Midland, Michigan)입니다. 마이크로채널은 소프트 리소그래피를 사용하여 제작했습니다. 먼저, 원하는 마이크로채널 디자인이 인쇄된 투명 보호 마스크를 고해상도 프린터(Prismatic, Cairo, Egypt 및 Pacific Arts and Design, Markham, ON)로 인쇄했습니다. 마스터는 유리판을 기판으로 사용하여 제작했습니다. 유리판은 아세톤, 이소프로판올 및 탈이온수로 세척한 후 스핀 코팅(3000 rpm, 1분)을 통해 20 µm 두께의 SU8-25 층으로 코팅했습니다. SU-8 층을 65°C에서 2분, 95°C에서 10분 동안 부드럽게 건조시킨 후 50초 동안 자외선에 노출시켰습니다. 노출 후 65°C와 95°C에서 각각 1분과 4분 동안 베이킹하여 노출된 SU-8 층을 가교시키고, 이어서 디아세톤 알코올 용액에서 6.5분 동안 발색시켰습니다. 마지막으로 와플을 200°C에서 15분 동안 고온 베이킹하여 SU-8 층을 더욱 고화시켰습니다.
PDMS는 단량체와 경화제를 10:1의 중량비로 혼합하여 제조한 후, 진공 건조기에서 탈기시키고 SU-8 주 프레임에 부었습니다. PDMS는 오븐에서 120°C로 30분간 경화시킨 후, 채널을 절단하고 주 프레임에서 분리한 다음, 마이크로채널의 입구와 출구에 튜브를 부착할 수 있도록 천공했습니다. 마지막으로, PDMS 마이크로채널은 휴대용 코로나 프로세서(Electro-Technic Products, Chicago, IL)를 사용하여 현미경 슬라이드에 영구적으로 부착했습니다. 본 연구에 사용된 마이크로채널의 크기는 가로 200 µm, 세로 20 µm이며 길이는 3.6 cm입니다.
마이크로채널 내부의 정수압에 의해 유도되는 유체 흐름은 입구 저장소의 유체 수위를 출구 저장소의 높이 차이 Δh39 이상으로 유지함으로써 달성됩니다(그림 1).
여기서 f는 마찰 계수이며, 직사각형 채널에서 층류 흐름의 경우 f = C/Re로 정의됩니다. 여기서 C는 채널의 종횡비에 따라 달라지는 상수이고, L은 마이크로채널의 길이, Vav는 마이크로채널 내부의 평균 속도, Dh는 채널의 수력 직경, g는 중력 가속도입니다. 이 식을 이용하여 다음 공식으로 평균 채널 속도를 계산할 수 있습니다.