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조류의 생식력은 정자 저장 세관(SST)에 충분한 생존 가능한 정자를 장기간 저장할 수 있는 능력에 달려 있습니다. 정자가 SST에 들어가고, 머물고, SST에서 나오는 정확한 기전은 아직 논란의 여지가 있습니다. 샤카시 암탉의 정자는 응집 경향이 강하여 많은 세포를 포함하는 이동성 필라멘트 다발을 형성했습니다. 불투명한 나팔관에서 정자의 운동성과 거동을 관찰하는 것이 어렵기 때문에, 정자의 응집과 운동성을 연구하기 위해 정자와 유사한 미세채널 단면을 가진 미세유체 장치를 사용했습니다. 본 연구에서는 정자 다발이 어떻게 형성되고, 어떻게 움직이는지, 그리고 SST에서 정자의 체류 시간을 늘리는 데 있어 정자의 역할에 대해 논의합니다. 정수압(유속 = 33 µm/s)에 의해 미세유체 채널 내에서 유체 흐름이 생성될 때 정자의 속도와 유변학적 거동을 조사했습니다. 정자는 해류에 반항하는 경향(양성 유동학)을 보이며, 정자 다발의 속도는 단일 정자에 비해 현저히 감소합니다. 정자 다발은 나선형으로 움직이며, 단일 정자가 더 많이 유입될수록 길이와 두께가 증가하는 것으로 관찰되었습니다. 정자 묶음은 유체 흐름 속도가 33µm/s를 초과하여 쓸려가는 것을 피하기 위해 미세유체 채널의 측벽에 접근하고 달라붙는 것이 관찰되었습니다. 정자 묶음은 유체 흐름 속도가 33µm/s를 초과하여 쓸려가는 것을 피하기 위해 미세유체 채널의 측벽에 접근하고 달라붙는 것이 관찰되었습니다. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаутся и прилипаут к боковым стенкам микрофлуидных каналов, чтобы избежать сметания со скоростьу потока жидкости> 33 мкм / с. 정자 묶음은 유체 흐름 속도가 33µm/s를 초과할 때 휩쓸려 가는 것을 피하기 위해 미세유체 채널의 측벽에 접근하여 달라붙는 것으로 관찰되었습니다.观察到精子束接近并粘附에서통통한유동으로유동하는경우> 33 µm/s 扫过.33 µm/s 扫过。 Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаутся и прилипаѕт к боковым стенкам микрожидкостного канала, чтобы избежать сметания потоком жидкости со скоростьù > 33 мкм/с. 정자 묶음은 33µm/s 이상의 유체 흐름에 휩쓸려가는 것을 피하기 위해 미세유체 채널의 측벽에 접근하여 달라붙는 것으로 관찰되었습니다.주사 및 투과 전자 현미경 검사 결과, 정자 다발이 풍부하고 밀도가 높은 물질에 의해 지지되는 것으로 나타났습니다. 얻어진 데이터는 샤카지 닭 정자의 독특한 이동성과 정자가 응집하여 이동성 다발을 형성하는 능력을 보여주며, 이는 SMT에서 정자의 장기 보관에 대한 더 나은 이해를 제공합니다.
인간과 대부분의 동물에서 수정이 이루어지려면 정자와 난자가 적절한 시기에 수정 장소에 도착해야 합니다. 따라서 교미는 배란 전이나 배란 시점에 이루어져야 합니다. 반면, 개와 같은 일부 포유류와 곤충, 어류, 파충류, 조류와 같은 비포유류는 난자가 수정될 준비가 될 때까지 생식 기관에 정자를 장기간 저장합니다(비동기 수정 1 ). 조류는 난자를 수정할 수 있는 정자의 생존력을 2~10주 동안 유지할 수 있습니다.2
이는 새를 다른 동물과 구별하는 독특한 특징으로, 짝짓기와 배란이 동시에 일어나지 않고도 몇 주 동안 단 한 번의 수정만으로도 수정될 확률이 높다는 점입니다. 정자 저장 세관(SST)이라고 하는 주요 정자 저장 기관은 자궁-질 접합부의 내점막 주름에 위치합니다. 현재까지 정자가 정자 은행에 들어가고, 머물고, 빠져나가는 기전은 완전히 밝혀지지 않았습니다. 이전 연구를 바탕으로 많은 가설이 제시되었지만, 아직 확인된 것은 없습니다.
Forman4는 정자가 SST 상피 세포에 위치한 단백질 채널을 통해 유체 흐름 방향과 반대로 지속적인 진동 운동을 통해 SST 강에 머무르는 것으로 가정했습니다(유변학). 정자를 SST 내강에 유지하는 데 필요한 지속적인 편모 활동으로 인해 ATP가 고갈되고, 정자가 유체 흐름에 의해 정자 은행에서 나와 상행 나팔관을 통해 수정을 위한 새로운 여정을 시작할 때까지 운동성이 결국 감소합니다. (Forman4). 이러한 정자 저장 모델은 SST 상피 세포에 존재하는 아쿠아포린 2, 3, 9의 면역세포화학 분석 결과에서 뒷받침됩니다. 현재까지 닭 정액의 유변학 및 SST 저장, 질 내 정자 선택, 그리고 정자 경쟁에서의 역할에 대한 연구는 부족합니다. 닭의 경우, 정자는 자연 교미 후 질로 유입되지만, 정자의 80% 이상이 교미 직후 질에서 배출됩니다. 이는 질이 조류의 정자 선택의 주요 장소임을 시사합니다. 또한, 질 내에서 수정된 정자 중 1% 미만이 SST2로 전환되는 것으로 보고되었습니다. 병아리의 질 내 인공수정 시, SST에 도달하는 정자의 수는 수정 후 24시간 후에 증가하는 경향이 있습니다. 현재까지 이 과정에서 정자 선택 기전은 명확하지 않으며, 정자 운동성이 SST 정자 흡수에 중요한 역할을 할 것으로 예상됩니다. 조류의 나팔관은 두껍고 불투명한 벽으로 인해 정자 운동성을 직접 모니터링하기 어렵습니다. 따라서 수정 후 정자가 어떻게 SST로 전환되는지에 대한 기본적인 지식이 부족합니다.
최근 유변학은 포유류 생식기에서 정자 이동을 제어하는 ​​중요한 요인으로 인식되고 있습니다. 운동성 정자가 역류 방향으로 이동할 수 있다는 점에 착안하여, Zaferani 외(8)는 코라 미세유체 시스템을 사용하여 펜에 담긴 정액 샘플에서 운동성 정자를 수동적으로 분리했습니다. 이러한 정액 분류는 의학적 불임 치료 및 임상 연구에 필수적이며, 시간과 노동력이 많이 소요되고 정자의 형태와 구조적 무결성을 손상시킬 수 있는 기존 방법보다 선호됩니다. 그러나 현재까지 닭 생식기 분비물이 정자 운동성에 미치는 영향에 대한 연구는 수행된 바 없습니다.
정자가 해수면 온도(SST)에 저장되는 기전과는 관계없이, 많은 연구자들은 닭 9마리, 10마리, 메추라기 2마리, 칠면조 11마리의 해수면 온도(SST)에서 정자가 머리끼리 맞대고 응집하여 응집된 정자 다발을 형성하는 것을 관찰했습니다. 저자들은 이러한 응집과 해수면 온도(SST) 내 정자의 장기 저장 사이에 연관성이 있다고 제안합니다.
Tingari와 Lake12는 닭의 정자 수용선에 있는 정자 사이에 강한 연관성이 있다고 보고했으며, 조류의 정자가 포유류의 정자와 같은 방식으로 응집하는지에 대한 의문을 제기했습니다. 그들은 정관 내 정자 간의 깊은 결합이 좁은 공간에 많은 정자가 존재하여 발생하는 스트레스 때문일 수 있다고 생각합니다.
신선한 유리 슬라이드에 매달린 정자의 행동을 평가할 때, 특히 정액 방울 가장자리에서 일시적인 응집 징후를 볼 수 있습니다. 그러나 응집은 지속적인 움직임과 관련된 회전 작용에 의해 종종 교란되었으며, 이는 이 현상의 일시적인 특성을 설명합니다. 연구진은 또한 희석액을 정액에 첨가했을 때 길쭉한 "실 모양"의 세포 응집체가 나타나는 것을 발견했습니다.
정자를 모방하려는 초기 시도는 매달린 물방울에서 얇은 철사를 제거하는 방식으로 이루어졌는데, 그 결과 정자와 유사한 길쭉한 소포가 정액 방울에서 튀어나왔습니다. 정자는 소포 내에서 즉시 평행하게 정렬되었지만, 3차원적 한계로 인해 전체 단위가 빠르게 사라졌습니다. 따라서 정자 응집을 연구하려면 분리된 정자 저장 세관에서 정자의 운동성과 행동을 직접 관찰해야 하는데, 이는 달성하기 어렵습니다. 따라서 정자 운동성과 응집 행동 연구를 뒷받침하기 위해 정자를 모방하는 기구를 개발해야 합니다. Brillard et al13은 성체 병아리의 정자 저장 세관의 평균 길이가 400~600µm이지만, 일부 SST는 2000µm에 달할 수 있다고 보고했습니다. Mero와 Ogasawara14는 정자샘을 확장된 정자 저장 세관과 확장되지 않은 정자 저장 세관으로 나누었는데, 두 세관 모두 길이(~500 µm)와 목 너비(~38 µm)가 같았지만 세관의 평균 루멘 직경은 각각 56.6과 56.6 µm, 11.2 µm였습니다. 현재 연구에서 우리는 200 µm × 20 µm(W × H) 채널 크기를 가진 미세유체 장치를 사용했는데, 그 단면은 증폭된 SST의 단면과 다소 비슷합니다. 또한, 우리는 흐르는 유체에서 정자 운동성과 응집 행동을 조사했는데, 이는 SST 상피 세포에서 생성된 유체가 루멘에서 정자를 역류(유변학적) 방향으로 유지한다는 Foreman의 가설과 일치합니다.
본 연구의 목적은 나팔관 내 정자 운동성 관찰의 어려움을 극복하고, 역동적인 환경에서 정자의 유동학적 특성과 거동을 연구하는 데 따르는 어려움을 피하는 것이었다. 닭의 생식기 내 정자 운동성을 시뮬레이션하기 위해 정수압을 생성하는 미세유체 장치를 사용하였다.
희석된 정자 샘플 한 방울(1:40)을 마이크로채널 장치에 주입했을 때, 두 가지 유형의 정자 운동성(분리된 정자와 결합된 정자)을 확인할 수 있었습니다. 또한, 정자는 전류에 반하여 유영하는 경향을 보였습니다(양성 유변학; 비디오 1, 2). 정자 묶음은 단독 정자보다 속도가 느렸지만(p < 0.001), 양성 유주성을 보이는 정자의 비율이 증가했습니다(p < 0.001; 표 2). 정자 묶음은 단독 정자보다 속도가 느렸지만(p < 0.001), 양성 유주성을 보이는 정자의 비율이 증가했습니다(p < 0.001; 표 2). Хотя пучки сперматозоидов имели более низкуу скорость, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), они увеличивали процент сперматозоидов, демонстрируших положительный реотаксис (p < 0,001; 표 2). 정자 묶음은 단일 정자보다 속도가 느렸지만(p < 0.001), 양성 유주성을 보이는 정자의 비율이 증가했습니다(p < 0.001; 표 2).尽管子의 속도는 低于孤独精子의 속도(p < 0.001), 但它们增加了显示阳性流变性 精子百分比(p < 0.001表2)입니다.尽管 精子束 的 速titude 低于 孤独 的 速degree （p <0.001) , 但 增加 了 显示 阳性 流变性 精子 百分比 （p <0.001 ; 2。。。。。。)))))) Хотя скорость пучков сперматозоидов была ниже, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), они увеличивали процент сперматозоидов с положительной реологией (p < 0,001; 표 2). 정자 다발의 속도는 단일 정자보다 느렸지만(p < 0.001), 양성 유동학적 특성을 보이는 정자의 비율이 증가했다(p < 0.001; 표 2).단일 정자와 정자 덩어리의 양성 유동학적 특성은 각각 약 53%와 85%로 추산됩니다.
샤카시 닭의 사정 직후 정자는 수십 개의 개체로 구성된 선형 다발을 형성하는 것으로 관찰되었습니다. 이 다발은 시간이 지남에 따라 길이와 두께가 증가하고 체외에서 몇 시간 동안 남아 있다가 사라집니다(동영상 3). 이 필라멘트 다발은 부고환 끝부분에 형성되는 바늘두더지 정자와 같은 모양입니다. 샤카시 닭의 정액은 수집 후 1분 이내에 응집되어 망상 다발을 형성하는 경향이 높은 것으로 나타났습니다. 이 빔은 동적이어서 근처의 벽이나 고정된 물체에 달라붙을 수 있습니다. 정자 다발은 정자 세포의 속도를 감소시키지만, 거시적으로는 선형성을 증가시키는 것이 분명합니다. 다발의 길이는 다발에 수집된 정자의 수에 따라 달라집니다. 다발의 두 부분을 분리했습니다. 응집된 정자의 자유로운 머리를 포함하는 초기 부분과 꼬리와 정자의 말단 전체를 포함하는 말단 부분입니다. 고속 카메라(950fps)를 이용하여, 정자 다발의 초기 부분에서 응집된 정자의 자유두(free head)를 관찰했습니다. 이 자유두는 진동 운동을 통해 다발의 움직임을 담당하고, 나머지 정자들은 나선형 운동을 통해 다발 안으로 끌어당깁니다(동영상 4). 그러나 긴 다발에서는 일부 자유정자두가 정자 몸체에 부착되어 있고, 다발의 끝부분이 날개처럼 작용하여 다발을 추진하는 것이 관찰되었습니다.
유체의 느린 흐름 속에서 정자 다발은 서로 평행하게 움직이지만, 흐름 속도가 증가함에 따라 흐름에 휩쓸려 나가지 않도록 서로 겹치고 고정된 모든 것에 달라붙기 시작합니다. 정자 다발은 소수의 정자 세포가 서로 접근하여 동시에 움직이기 시작하고 서로를 감싸 안은 후 끈적끈적한 물질에 달라붙으면서 형성됩니다. 그림 1과 2는 정자가 서로 접근하여 꼬리가 서로 감싸 안으면서 접합부를 형성하는 모습을 보여줍니다.
연구진은 정자의 유변학을 연구하기 위해 마이크로채널에 정수압을 가하여 유체 흐름을 생성했습니다. 200µm × 20µm(가로 × 세로) 크기에 3.6µm 길이의 마이크로채널을 사용했습니다. 용기 사이에 마이크로채널을 만들고, 양 끝에 주사기를 장착했습니다. 채널을 더 잘 보이게 하기 위해 식용 색소를 사용했습니다.
상호 연결 케이블과 액세서리를 벽에 고정합니다. 이 영상은 위상차 현미경으로 촬영했습니다. 각 이미지에는 위상차 현미경과 매핑 이미지가 함께 제시됩니다. (A) 두 흐름 사이의 연결은 나선형 운동으로 인해 흐름에 저항합니다(빨간색 화살표). (B) 관 다발과 채널 벽 사이의 연결(빨간색 화살표)은 동시에 다른 두 다발(노란색 화살표)에 연결됩니다. (C) 미세유체 채널 내 정자 다발이 서로 연결되기 시작하여(빨간색 화살표) 정자 다발의 그물망을 형성합니다. (D) 정자 다발 네트워크 형성.
희석된 정자 한 방울을 미세유체 장치에 넣고 유동을 생성했을 때, 정자 빔이 유동 방향과 반대로 움직이는 것이 관찰되었습니다. 정자 다발은 미세채널 벽에 꼭 맞물렸고, 다발 초기 부분의 자유 헤드 또한 미세채널 벽에 꼭 맞물렸습니다(동영상 5). 또한, 정자 다발은 전류에 휩쓸려 나가지 않도록 경로에 있는 이물질과 같은 고정된 입자에 달라붙습니다. 시간이 지남에 따라, 이러한 다발은 다른 단일 정자와 더 짧은 다발을 가두는 긴 필라멘트가 됩니다(동영상 6). 유동이 느려지기 시작하면, 긴 정자 행렬이 정자 행렬 네트워크를 형성하기 시작합니다(동영상 7; 그림 2).
높은 유속(V > 33 µm/s)에서는 실의 나선형 운동이 증가하여 많은 개별 정자 묶음을 형성하여 흐름의 표류력을 더 잘 견뎌냅니다. 높은 유속(V > 33 µm/s)에서는 실의 나선형 운동이 증가하여 많은 개별 정자 묶음을 형성하여 흐름의 표류력을 더 잘 견뎌냅니다. При высокой скорости потока (V > 33 мкм/с) спиралевидные движения нитей усиливаутся, поскольку они пытавится поймать множество отдельных сперматозоидов, образуких пучки, которые лучше противостоят дрейфуушей силе потока. 높은 유속(V > 33 µm/s)에서는 가닥이 개별 정자를 많이 잡아서 흐름의 표류력을 더 잘 견딜 수 있는 묶음을 형성하려고 하기 때문에 나선 운동이 증가합니다.높은 전류 속도(V > 33 µm/s)로 인해 더 많은 형태의 에너지를 얻을 수 있습니다.높은 유속(v> 33 µm/s)에서 , 的 螺旋 运动 增加 , 以 试图 许多 TYPE 束 单 个 精子 , 从而 更 地 抵抗 的漂移력。。。。。。。。。 При высоких скоростях потока (V > 33 мкм/с) спиральное движение нитей увеличивается в попытке захватить множество отдельных сперматозоидов, образууших пучки, чтобы лучше сопротивляться силам дрейфа потока. 높은 유속(V > 33 µm/s)에서는 필라멘트의 나선형 운동이 증가하여 개별 정자 묶음을 형성하여 흐름의 표류력을 더 잘 견뎌내려는 시도가 이루어집니다.그들은 또한 측벽에 마이크로채널을 부착하려고 시도했습니다.
정자 다발은 광학 현미경(LM)을 이용하여 정자 머리와 꼬리가 말려 있는 덩어리로 확인되었습니다. 다양한 응집체를 가진 정자 다발은 꼬인 머리와 편모 응집체, 여러 개의 융합된 정자 꼬리, 꼬리에 붙은 정자 머리, 그리고 핵이 휘어진 정자 머리가 여러 개의 융합된 핵으로 확인되었습니다. 투과 전자 현미경(TEM)을 이용하여 관찰했습니다. 주사 전자 현미경(SEM)을 이용하여 관찰한 결과, 정자 다발은 정자 머리가 뭉쳐진 덩어리였으며, 정자 응집체는 감겨진 꼬리가 연결된 망상 구조를 보였습니다.
정자의 형태와 미세구조, 정자 다발의 형성은 광학 현미경(반쪽 단면), 주사 전자 현미경(SEM), 투과 전자 현미경(TEM)을 사용하여 연구하였고, 정자 도말은 아크리딘 오렌지로 염색하고 형광 현미경을 사용하여 검사하였다.
아크리딘 오렌지를 이용한 정자 도말 염색(그림 3B) 결과, 정자 머리가 서로 붙어 있고 분비 물질로 덮여 있어 큰 정자 다발(그림 3D)을 형성하는 것으로 나타났습니다. 정자 다발은 꼬리가 연결된 망상 구조를 가진 정자 응집체로 구성되었습니다(그림 4A-C). 정자 다발은 여러 정자의 꼬리가 서로 붙어 있는 형태로 이루어져 있습니다(그림 4D). 분비 물질(그림 4E, F)이 정자 다발의 머리를 덮고 있었습니다.
정자 다발의 형성 위상차 현미경과 아크리딘 오렌지로 염색한 정자 도말 표본을 사용하여 정자의 머리가 서로 붙어 있음을 보여주었습니다. (A) 초기 정자 다발 형성은 정자 하나(흰색 원)와 세 개의 정자(노란색 원)로 시작하며, 나선은 꼬리에서 시작하여 머리에서 끝납니다. (B) 부착된 정자 머리(화살표)를 보여주는 아크리딘 오렌지로 염색한 정자 도말 표본의 현미경 사진입니다. 분비물이 머리를 덮고 있습니다. 배율 × 1000. (C) 미세유체 채널에서 흐름에 의해 운반되는 큰 빔의 발생(950fps의 고속 카메라 사용). (D) 큰 다발(화살표)을 보여주는 아크리딘 오렌지로 염색한 정자 도말 표본의 현미경 사진입니다. 배율: ×200.
정자 빔과 아크리딘 오렌지로 염색한 정자 도말 표본의 주사 전자 현미경 사진. (A, B, D, E)는 정자의 디지털 컬러 주사 전자 현미경 사진이고, C와 F는 아크리딘 오렌지로 염색한 정자 도말 표본의 현미경 사진으로, 꼬리 부분을 감싸고 있는 여러 정자의 부착을 보여준다. (AC) 정자 응집체는 부착된 꼬리(화살표)의 네트워크 형태로 표시되어 있다. (D) 꼬리를 감싸고 있는 여러 정자(접착 물질, 분홍색 윤곽선, 화살표)의 접착. (E와 F) 접착 물질(포인터)로 덮인 정자 머리 응집체(포인터). 정자는 여러 개의 소용돌이 모양 구조(F)로 묶인 다발을 형성했다. (C) ×400 및 (F) ×200 배율.
투과전자현미경을 이용하여 정자 다발에 꼬리가 붙어 있거나(그림 6A, C), 머리가 꼬리에 붙어 있거나(그림 6B), 머리가 꼬리에 붙어 있는(그림 6D) 것을 확인했습니다. 다발 내 정자의 머리는 굽어 있으며, 단면에서는 두 개의 핵 영역이 보입니다(그림 6D). 절개된 정자 다발에서 정자는 두 개의 핵 영역과 여러 개의 편모 영역을 가진 꼬인 머리를 가지고 있었습니다(그림 5A).
정자 다발의 연결 꼬리와 정자 머리를 연결하는 응집 물질을 보여주는 디지털 컬러 전자 현미경 사진. (A) 다수의 정자가 붙어 있는 꼬리. 세로(화살표)와 가로(화살표) 투사에서 꼬리가 어떻게 보이는지 주목하십시오. (B) 정자의 머리(화살표)가 꼬리(화살표)에 연결되어 있습니다. (C) 여러 개의 정자 꼬리(화살표)가 붙어 있습니다. (D) 응집 물질(AS, 파란색)이 네 개의 정자 머리(보라색)를 연결합니다.
주사전자현미경을 이용하여 분비물이나 막으로 덮인 정자 다발에서 정자 머리를 검출했습니다(그림 6B). 이는 정자 다발이 세포외 물질에 의해 고정되어 있음을 시사합니다. 응집된 물질은 정자 머리(해파리 머리 모양 조립체, 그림 5B)에 농축되어 원위부로 확장되어 아크리딘 오렌지 염색 시 형광 현미경 하에서 선명한 노란색을 띠었습니다(그림 6C). 이 물질은 주사현미경에서 명확하게 관찰되며 결합제로 간주됩니다. 반박막 절편(그림 5C)과 아크리딘 오렌지 염색 정자 도말 검사에서 정자 머리가 빽빽하게 뭉쳐 있고 꼬리가 말려 있는 정자 다발이 관찰되었습니다(그림 5D).
다양한 방법을 사용하여 정자 머리와 접힌 꼬리가 응집된 모습을 보여주는 다양한 현미경 사진. (A) 두 부분으로 구성된 핵(파란색)과 여러 개의 편모 부분(녹색)으로 이루어진 나선형 정자 머리를 보여주는 정자 다발의 단면 디지털 컬러 투과 전자 현미경 사진. (B) 해파리와 같은 정자 머리(화살표)가 모여 덮여 있는 모습을 보여주는 디지털 컬러 주사 전자 현미경 사진. (C) 응집된 정자 머리(화살표)와 말린 꼬리(화살표)를 보여주는 반박편. (D) 아크리딘 오렌지로 염색한 정자 도말 사진으로 정자 머리(화살표)와 말린 부착 꼬리(화살표)가 응집된 모습을 보여준다. 끈적끈적한 물질(S)이 정자의 머리를 덮고 있음에 주목한다. (D) × 1000 배율.
투과 전자 현미경(그림 7A)을 사용하여 정자 머리가 꼬여 있고 핵이 나선형인 것도 확인되었는데, 이는 아크리딘 오렌지로 염색한 정자 도말을 통해 확인되었으며 형광 현미경(그림 7B)을 사용하여 검사했습니다.
(A) 디지털 컬러 투과 전자 현미경 사진 및 (B) 아크리딘 오렌지 염색 정자 도말 표본. 나선형의 머리와 정자 머리와 꼬리의 부착(화살표). (B) × 1000 배율.
흥미로운 발견은 샤르카지의 정자가 응집되어 이동성 필라멘트 다발을 형성한다는 것입니다. 이 다발의 특성을 통해 SST에서 정자의 흡수 및 저장에 있어 정자의 역할을 이해할 수 있습니다.
교미 후 정자는 질 내로 들어가 강렬한 선별 과정을 거치게 되며, 그 결과 제한된 수의 정자만 SST에 들어갑니다.15,16 현재까지 정자가 SST에 출입하는 기전은 명확하지 않습니다. 가금류의 경우, 정자는 종에 따라 2주에서 10주까지 장기간 SST에 저장됩니다.6 SST에 보관되는 동안 정액의 상태에 대해서는 여전히 논란이 있습니다. 정자는 움직이고 있는 것일까요, 아니면 정지해 있는 것일까요? 다시 말해, 정자 세포는 어떻게 SST에서 그렇게 오랫동안 위치를 유지하는 것일까요?
Forman4는 SST의 체류 및 배출이 정자 운동성으로 설명될 수 있다고 제안했습니다. 저자들은 정자가 SST 상피세포가 생성하는 유체 흐름에 맞서 유영함으로써 위치를 유지하며, 에너지 부족으로 인해 속도가 뒤로 이동하기 시작하는 지점 아래로 떨어지면 SST에서 배출된다고 가설을 세웠습니다. Zaniboni5는 SST 상피세포의 정단부에 아쿠아포린 2, 3, 9가 존재한다는 것을 확인했는데, 이는 Foreman의 정자 저장 모델을 간접적으로 뒷받침할 수 있습니다. 이번 연구에서는 샤카시 정자의 거의 절반이 유체 흐름에서 양성 유변학을 보이며, 응집된 정자 다발은 양성 유변학을 보이는 정자의 수를 증가시키지만 응집은 정자의 이동 속도를 감소시킨다는 것을 발견했습니다. 정자 세포가 새의 나팔관을 따라 수정 장소까지 이동하는 과정은 아직 완전히 밝혀지지 않았습니다. 포유류에서는 난포액이 정자를 화학 유인합니다. 그러나 화학 유인제는 정자가 먼 거리에 접근하도록 유도하는 것으로 여겨진다7. 따라서 다른 메커니즘이 정자 운반에 책임이 있다. 짝짓기 후 방출된 나팔관 액체에 대해 정자가 방향을 잡고 흐를 수 있는 능력은 쥐에서 정자를 표적으로 삼는 주요 요인으로 보고되었다. Parker17는 정자가 새와 파충류에서 섬모 전류에 반하여 수영하여 난관을 통과한다고 제안했다. 새에서 실험적으로 입증되지는 않았지만 Adolphi18는 여과지 스트립으로 커버슬립과 슬라이드 사이에 얇은 액체 층을 만들 때 조류 정자가 양성 결과를 보인다는 것을 처음으로 발견했다. 유변학. Hino와 Yanagimachi[19]는 관류 링에 쥐의 난소-나팔관-자궁 복합체를 넣고 나팔관의 액체 흐름을 시각화하기 위해 1µl의 잉크를 협부에 주입했다. 그들은 나팔관에서 매우 활발한 수축과 이완 운동을 관찰했는데, 모든 잉크 공이 나팔관 팽대부를 향해 꾸준히 움직이는 것을 발견했습니다. 저자들은 정자 상승 및 수정을 위해 하부 나팔관에서 상부 나팔관으로의 나팔관액 흐름의 중요성을 강조합니다. Brillard20은 닭과 칠면조에서 정자가 저장되는 질 입구에서 저장되는 자궁-질 접합부로 활발한 이동을 통해 이동한다고 보고했습니다. 그러나 정자는 수동적인 변위로 이동하기 때문에 자궁-질 접합부와 누두부 사이에서는 이러한 이동이 필요하지 않습니다. 이러한 이전의 권장 사항과 현재 연구에서 얻은 결과를 고려하면, 정자가 상류로 이동할 수 있는 능력(유동학)이 선별 과정의 기반이 되는 특성 중 하나라고 추정할 수 있습니다. 이는 정자가 질을 통과하여 저장을 위해 정관(CCT)으로 들어가는 것을 결정합니다. Forman4가 제안한 대로, 이는 정자가 SST와 그 서식지에 일정 시간 동안 들어간 다음 속도가 느려지기 시작하면 나오는 과정을 용이하게 할 수도 있습니다.
반면, 마츠자키(Matsuzaki)와 사사나미(Sasanami)[21]는 조류 정자가 수컷과 암컷 생식기에서 휴면 상태에서 운동성으로 변화한다고 제안했습니다. SST(수면정자) 내 정자 운동성 억제는 정자가 SST를 떠난 후 오랜 시간 동안 저장되었다가 다시 활성화되는 현상을 설명하는 것으로 제시되었습니다. 저산소 조건에서 마츠자키(Matsuzaki) 등은 SST에서 젖산의 높은 생성 및 방출을 보고했는데, 이는 정자 운동성 억제로 이어질 수 있다고 밝혔습니다. 이 경우, 정자 유동학의 중요성은 정자의 저장이 아닌 정자의 선택 및 흡수에 반영됩니다.
정자 응집 패턴은 가금류에서 정자 보유의 일반적인 패턴이기 때문에 SST에서 정자가 장기간 보관되는 것에 대한 그럴듯한 설명으로 간주됩니다.2,22,23. Bakst et al.2는 대부분의 정자가 서로 부착하여 다발 응집체를 형성하고 단일 정자가 메추라기 CCM에서 거의 발견되지 않는다는 것을 관찰했습니다. 반면 Wen et al.24는 닭의 SST 루멘에서 더 많은 흩어진 정자와 더 적은 정자 다발을 관찰했습니다. 이러한 관찰을 바탕으로 정자 응집 경향은 새와 같은 사정액의 정자 간에 다르다고 추정할 수 있습니다. 또한 Van Krey et al.9는 응집된 정자의 무작위 해리가 정자가 나팔관 루멘으로 점진적으로 침투하는 원인이라고 제안했습니다. 이 가설에 따르면, 응집력이 낮은 정자는 먼저 SST에서 배출되어야 합니다. 이러한 맥락에서, 정자의 응집 능력은 더러운 새의 정자 경쟁 결과에 영향을 미치는 요인일 수 있습니다. 또한, 응집된 정자가 분리되는 시간이 길어질수록 수정 능력은 더 오래 유지됩니다.
정자의 응집 및 다발 형성은 여러 연구에서 관찰되었지만,2,22,24 해수면 온도(SST) 내에서의 운동학적 관찰의 복잡성으로 인해 자세히 기술되지 않았습니다. 시험관 내에서 정자 응집을 연구하려는 여러 시도가 있었습니다. 매달린 정자 방울에서 얇은 와이어를 제거했을 때 광범위하지만 일시적인 응집이 관찰되었습니다. 이로 인해 정낭을 모방한 길쭉한 기포가 방울에서 돌출됩니다. 3차원적 한계와 짧은 드립 건조 시간으로 인해 전체 블록이 빠르게 손상되었습니다.9 본 연구에서는 샤카시 닭과 미세유체 칩을 사용하여 이러한 다발이 어떻게 형성되고 이동하는지 설명할 수 있었습니다. 정자 다발은 정액 채취 직후 형성되었으며 나선형으로 움직이는 것으로 나타났으며, 흐름에 존재할 경우 양성 유변학적 특성을 보였습니다. 또한, 거시적으로 관찰했을 때, 정자 다발은 분리된 정자에 비해 운동성의 선형성을 증가시키는 것으로 관찰되었습니다. 이는 정자 응집이 SST 침투 이전에 발생할 수 있으며, 정자 생성이 이전에 제안된 것처럼 스트레스로 인해 작은 영역에 국한되지 않음을 시사합니다(Tingari and Lake12). 정자 다발 형성 과정에서 정자는 동기적으로 유영하여 접합부를 형성한 후, 꼬리가 서로 감싸고 정자의 머리는 자유롭게 움직이지만 꼬리와 정자의 원위부는 끈적끈적한 물질로 서로 달라붙습니다. 따라서 인대의 자유로운 머리가 움직임을 담당하여 나머지 인대를 끌어당깁니다. 정자 다발을 주사 전자 현미경으로 관찰한 결과, 끈적끈적한 물질로 덮인 정자 머리가 부착되어 있었는데, 이는 정자 머리가 저장 장소(SST)에 도달한 후 휴지 다발 형태로 부착되었음을 시사합니다.
정자 도말 표본을 아크리딘 오렌지로 염색하면 형광 현미경으로 정자 세포 주변의 세포외 접착 물질을 볼 수 있습니다. 이 물질은 정자 다발이 주변 표면이나 입자에 부착되어 주변 흐름에 따라 떠다니지 않도록 합니다. 따라서 본 관찰 결과는 이동성 다발 형태로 정자 접착이 어떤 역할을 하는지 보여줍니다. 해류를 거슬러 유영하고 주변 표면에 달라붙는 정자 다발의 능력은 정자가 해수면 온도(SST)에 더 오래 머물 수 있도록 합니다.
Rothschild25는 혈구계측 카메라를 사용하여 현탁액 한 방울 내 소 정액의 부유 분포를 연구하고, 현미경의 수직 및 수평 광축을 모두 가진 카메라를 통해 현미경 사진을 촬영했습니다. 그 결과, 정자가 챔버 표면에 끌리는 것을 확인했습니다. 저자들은 정자와 표면 사이에 유체역학적 상호작용이 있을 가능성을 시사합니다. 이러한 점과 샤카시 병아리 정액이 끈적끈적한 덩어리를 형성하는 능력을 고려할 때, 정액이 해수면 온도(SST) 벽에 부착되어 장기간 보관될 가능성이 높아질 수 있습니다.
Bccetti와 Afzeliu26는 정자 당단백질(glycocalyx)이 생식세포 인식 및 응집에 필수적이라고 보고했습니다. Forman10은 조류 정액에 뉴라미니다제를 처리하여 당단백질-당지질 코팅의 α-글리코시드 결합을 가수분해했을 때 정자 운동성에는 영향을 미치지 않으면서 생식력이 감소함을 관찰했습니다. 저자들은 뉴라미니다제가 당단백질에 미치는 영향이 자궁-질 접합부에서 정자의 격리를 저해하여 생식력을 감소시킨다고 제안합니다. 그들의 관찰 결과는 뉴라미니다제 처리가 정자와 난자 인식을 감소시킬 가능성을 무시할 수 없습니다. Forman과 Engel10은 뉴라미니다제를 처리한 정액으로 암탉을 질내 수정했을 때 생식력이 감소함을 발견했습니다. 그러나 뉴라미니다제를 처리한 정자를 이용한 체외 수정은 대조군 닭과 비교하여 생식력에 영향을 미치지 않았습니다. 저자들은 정자막 주위의 당단백질-당지질 코팅의 변화가 자궁-질 접합부에서 정자를 격리하는 것을 방해하여 정자의 수정 능력을 감소시키고, 이로 인해 자궁-질 접합부의 속도로 인해 정자 손실이 증가하지만 정자와 난자 인식에는 영향을 미치지 않는다는 결론을 내렸습니다.
칠면조에서 Bakst와 Bauchan11은 SST의 루멘에서 작은 소포와 막 조각을 발견했고 이 과립 중 일부가 정자 막과 융합되었음을 관찰했습니다.저자들은 이러한 관계가 SST에서 정자의 장기간 저장에 기여할 수 있다고 제안합니다.그러나 연구자들은 이러한 입자의 출처, CCT 상피 세포에서 분비되는지, 남성 생식계에서 생성 및 분비되는지 또는 정자 자체에서 생성되는지를 명시하지 않았습니다.또한 이러한 입자는 응집을 담당합니다.Grützner et al27은 부고환 상피 세포가 단일 구멍 정관 형성에 필요한 특정 단백질을 생성하고 분비한다고 보고했습니다.저자들은 또한 이러한 묶음의 분산이 부고환 단백질의 상호 작용에 따라 달라진다고 보고했습니다.Nixon et al28은 부속기가 산성 시스테인이 풍부한 오스테오넥틴이라는 단백질을 분비한다는 것을 발견했습니다. SPARC는 짧은부리바늘두더지와 오리너구리의 정자 다발 형성에 관여합니다. 이러한 정자 빔의 산란은 이 단백질의 손실과 관련이 있습니다.
현재 연구에서 전자 현미경을 이용한 초미세 구조 분석 결과 정자가 다량의 고밀도 물질에 부착되어 있음을 보여주었습니다. 이러한 물질은 부착된 머리 부분과 주변에서 응축되는 응집의 원인으로 여겨지지만 꼬리 부분에서는 농도가 낮습니다. 사정 중 정액이 림프와 정액에서 분리되는 것을 자주 관찰하기 때문에 이 응집 물질이 정액과 함께 남성 생식계(부고환 또는 정관)에서 배출된다고 추정합니다. 조류 정자가 부고환과 정관을 통과하면서 성숙 관련 변화를 겪게 되는데, 이는 단백질과 결합하고 혈장 레마 관련 당단백질을 획득하는 능력을 뒷받침합니다. 해수면 온도(SST)에서 상주하는 정자막에 이러한 단백질이 지속적으로 존재하는 것은 이러한 단백질이 정자막 안정성 획득에 영향을 미치고30, 생식력을 결정할 수 있음을 시사합니다31. Ahammad et al32은 남성 생식 기관의 다양한 부분(고환에서 말단 정관까지)에서 채취한 정자는 보관 온도에 관계없이 액체 보관 조건에서 생존력이 점진적으로 증가하는 것으로 나타났으며, 인공 수정 후 닭의 나팔관에서도 생존력이 증가한다고 보고했습니다.
샤카시 닭의 정자 다발은 바늘두더지, 오리너구리, 나무쥐, 사슴쥐, 기니피그와 같은 다른 종과는 다른 특성과 기능을 가지고 있습니다. 샤카시 닭에서 정자 다발의 형성은 단일 정자보다 유영 속도를 감소시켰습니다. 그러나 이러한 다발은 유변학적으로 양성인 정자의 비율을 증가시키고 역동적인 환경에서 정자가 스스로 안정화되는 능력을 증가시켰습니다. 따라서 본 연구 결과는 SST에서 정자 응집이 장기 정자 저장과 관련이 있다는 기존 가설을 뒷받침합니다. 또한 정자가 다발을 형성하는 경향이 SST에서 정자 손실 속도를 조절하여 정자 경쟁의 결과에 영향을 미칠 수 있다는 가설을 세웠습니다. 이 가정에 따르면, 응집 능력이 낮은 정자는 SST를 먼저 방출하는 반면, 응집 능력이 높은 정자는 대부분의 자손을 생산합니다. 단일공 정자 다발의 형성은 유익하며 부모-자식 비율에 영향을 미치지만, 다른 메커니즘을 사용합니다. 바늘두더지와 오리너구리의 정자는 빔의 진행 속도를 높이기 위해 서로 평행하게 배열됩니다. 바늘두더지 다발은 단일 정자보다 약 세 배 더 빠르게 움직입니다. 바늘두더지에서 이러한 정자 다발의 형성은 우위를 유지하기 위한 진화적 적응의 결과라고 여겨지는데, 암컷은 난잡하게 교미하고 대개 여러 수컷과 교미하기 때문입니다. 따라서 서로 다른 사정에서 나온 정자들은 난자의 수정을 위해 치열한 경쟁을 벌입니다.
샤카시 닭의 응집된 정자는 위상차 현미경을 사용하여 쉽게 시각화할 수 있으며, 이는 시험관 내에서 정자의 행동을 쉽게 연구할 수 있다는 점에서 유리한 것으로 간주됩니다. 샤카시 닭에서 정자 다발 형성이 생식을 촉진하는 기전은 나무쥐와 같이 협력적인 정자 행동을 보이는 일부 태반 포유류에서 관찰되는 기전과도 다릅니다. 나무쥐는 일부 정자가 난자에 도달하여 다른 친척 개체가 난자에 도달하고 손상하도록 돕습니다. 자신을 증명하기 위해. 이타적인 행동. 자가수정 34. 정자의 협력적 행동의 또 다른 예는 사슴쥐에서 발견되었는데, 사슴쥐의 정자는 유전적으로 가장 가까운 정자를 식별하고 결합하며 협력적인 집단을 형성하여 친척이 아닌 정자보다 속도를 높였습니다.35.
이 연구에서 얻은 결과는 SWS에서 정자의 장기 보관에 대한 Foman의 이론과 모순되지 않습니다. 연구자들은 정자 세포가 SST를 둘러싼 상피 세포의 흐름 속에서 장시간 동안 계속 움직이고, 일정 시간이 지나면 정자 세포의 에너지 저장소가 고갈되어 속도가 감소하여 분자량이 작은 물질을 배출할 수 있다고 보고합니다. SST의 루멘에서 유체가 흐르면서 정자의 에너지가 나팔관의 공동으로 흐릅니다. 현재 연구에서 우리는 단일 정자의 절반이 흐르는 유체에 맞서 수영하는 능력을 보였고 묶음에서의 접착력이 양성 유동학을 나타내는 능력을 증가시켰음을 관찰했습니다. 나아가 우리의 데이터는 SST에서 젖산 분비가 증가하면 상주 정자 운동성이 억제될 수 있다고 보고한 Matsuzaki et al. 1의 데이터와 일치합니다. 그러나 본 연구 결과는 미세채널 내 역동적인 환경에서 정자 운동성 인대의 형성과 유변학적 거동을 설명함으로써 SST에서의 정자 운동성 인대의 거동을 규명하고자 합니다. 향후 연구에서는 응집제의 화학적 조성과 유래를 규명하는 데 집중할 것이며, 이는 연구자들이 액상 정액을 보관하고 가임 기간을 연장하는 새로운 방법을 개발하는 데 분명 도움이 될 것입니다.
본 연구에서는 30주령의 수컷 벌거벗은목 샤카시(동형접합 우성; Na Na) 15마리를 정자 기증자로 선정했습니다. 이들은 이집트 아시트 주 아시트 대학교 농업학부 산하 연구용 가금류 농장에서 사육되었습니다. 각 닭장(30 x 40 x 40cm)에 각각 사육되었으며, 조명 프로그램(16시간 점등, 8시간 소등)을 시행하고, 조단백질 160g, 대사 가능 에너지 2,800kcal, 칼슘 35g을 함유한 사료를 급여했습니다. 사료 1kg당 유효인 5g을 섭취했습니다.
데이터 36, 37에 따르면, 복부 마사지를 통해 수컷의 정액을 채취했습니다. 3일 동안 15명의 남성에게서 총 45개의 정액 샘플을 채취했습니다. 정액(n = 15/day)은 인산칼륨(1.27g), 글루탐산나트륨 일수화물(0.867g), 과당(0.5일) 무수 아세트산나트륨(0.43g), 트리스(히드록시메틸)아미노메탄(0.195g), 구연산칼륨 일수화물(0.064g), 인산칼륨(0.065g), 염화마그네슘(0.034g) 및 H2O(100ml)를 함유한 Belsville Poultry Semen Diluent로 1:1(v:v) 비율로 즉시 희석했습니다. pH = 7, 5, 삼투압 333 mOsm/kg38. 희석된 정자 샘플은 먼저 광학 현미경으로 검사하여 정자의 품질(수분)이 좋은지 확인한 다음, 채취 후 30분 이내에 사용하기 전까지 37°C의 수조에 보관했습니다.
정자의 운동학 및 유변학은 미세유체 장치 시스템을 이용하여 설명되었습니다. 정액 샘플을 벨츠빌 조류 정액 희석액(Beltsville Avian Semen Diluent)에 1:40 비율로 추가 희석하여 미세유체 장치(아래 참조)에 주입하고, 이전에 미세유체 특성 분석을 위해 개발된 컴퓨터 정액 분석(Computerized Semen Analysis, CASA) 시스템을 사용하여 운동학적 매개변수를 측정했습니다. 이 연구는 액체 매체에서 정자의 이동성에 관한 연구(이집트 아시우트 대학교 공과대학 기계공학과)에서 수행되었습니다. 해당 플러그인은 http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39에서 다운로드할 수 있습니다. 곡선 속도(VCL, μm/s), 선 속도(VSL, μm/s), 평균 궤적 속도(VAP, μm/s)를 측정했습니다. 정자 비디오는 Tucson ISH1000 카메라에 연결된 도립 Optika XDS-3 위상차 현미경(40배 대물렌즈)을 사용하여 3초 동안 30fps로 촬영했습니다. CASA 소프트웨어를 사용하여 샘플당 최소 3개 영역과 500개 정자 궤적을 연구합니다. 녹화된 비디오는 자체 제작한 CASA를 사용하여 처리했습니다. CASA 플러그인에서 운동성의 정의는 흐름 속도와 비교한 정자의 수영 속도를 기반으로 하며, 유체 흐름에서 더 신뢰할 수 있는 것으로 밝혀진 좌우 운동과 같은 다른 매개변수를 포함하지 않습니다. 유변학적 운동은 유체 흐름 방향에 반하는 정자 세포의 움직임으로 설명됩니다. 유변학적 특성을 가진 정자는 운동성 정자의 수로 나누었습니다. 정지 상태인 정자와 대류적으로 이동하는 정자는 계산에서 제외했습니다.
달리 언급하지 않는 한, 사용된 모든 화학물질은 Elgomhoria Pharmaceuticals(이집트 카이로)에서 구입했습니다. 이 장치는 El-sherry 등이 설명한 대로 약간의 수정을 거쳐 제조했습니다. 마이크로채널을 제작하는 데 사용된 재료는 유리판(Howard Glass, 매사추세츠주 우스터), SU-8-25 네거티브 레지스트(MicroChem, 캘리포니아주 뉴턴), 디아세톤 알코올(Sigma Aldrich, 독일 슈타인하임), 폴리아세톤-184, Dow Corning, 미시간주 미들랜드)입니다. 마이크로채널은 소프트 리소그래피를 사용하여 제작합니다. 먼저, 원하는 마이크로채널 디자인이 있는 투명한 보호용 마스크를 고해상도 프린터(Prismatic, 이집트 카이로 및 Pacific Arts and Design, 온타리오주 마컴)에 인쇄했습니다. 유리판을 기판으로 사용하여 마스터를 만들었습니다. 판을 아세톤, 이소프로판올, 탈이온수로 세척한 다음 스핀 코팅(3000rpm, 1분)으로 20µm 두께의 SU8-25 층으로 코팅했습니다. SU-8 층을 부드럽게 건조(65°C에서 2분, 95°C에서 10분)하고 자외선에 50초간 노출시켰습니다. 노출 후 65°C와 95°C에서 각각 1분과 4분씩 구워 노출된 SU-8 층을 가교시킨 후, 디아세톤 알코올에서 6.5분간 현상했습니다. 와플을 200°C에서 15분간 구워 SU-8 층을 더욱 굳혔습니다.
PDMS는 단량체와 경화제를 10:1의 중량비로 혼합하여 제조한 후, 진공 데시케이터에서 탈기하고 SU-8 메인 프레임에 부었습니다. PDMS를 오븐(120°C, 30분)에서 경화시킨 후, 채널을 잘라내고 마스터에서 분리한 후, 마이크로채널의 입구와 출구에 튜브를 부착할 수 있도록 구멍을 뚫었습니다. 마지막으로, PDMS 마이크로채널을 휴대용 코로나 프로세서(Electro-Technic Products, Chicago, IL)를 사용하여 다른 곳에서 설명한 바와 같이 현미경 슬라이드에 영구적으로 부착했습니다. 본 연구에 사용된 마이크로채널의 크기는 200 µm x 20 µm(W x H)이며, 길이는 3.6cm입니다.
미세채널 내부의 정수압에 의해 유도되는 유체 흐름은 유입 저수조의 유체 수위를 유출 저수조의 높이 차이 Δh39보다 높게 유지함으로써 달성됩니다(그림 1).
여기서 f는 마찰 계수로, 직사각형 채널의 층류에 대해 f = C/Re로 정의됩니다. 여기서 C는 채널의 종횡비에 따라 달라지는 상수이고, L은 미세채널의 길이이며, Vav는 미세채널 내부의 평균 속도이고, Dh는 채널의 수력 직경이며, g는 중력 가속도입니다. 이 방정식을 사용하면 평균 채널 속도는 다음 방정식을 통해 계산할 수 있습니다.