Благодарим ви, че посетихте Nature.com. Версията на браузъра, която използвате, има ограничена поддръжка на CSS. За най-добро изживяване ви препоръчваме да използвате актуализиран браузър (или да деактивирате режима на съвместимост в Internet Explorer). Междувременно, за да осигурим непрекъсната поддръжка, ще рендираме сайта без стилове и JavaScript.
Плодовитостта на птиците зависи от способността им да съхраняват достатъчно жизнеспособни сперматозоиди за продължителен период от време в каналчетата за съхранение на сперматозоиди (SST). Точният механизъм, чрез който сперматозоидите влизат, пребивават и напускат SST, остава спорен. Сперматозоидите на кокошките шаркаси показват висока склонност към аглутинация, образувайки подвижни нишковидни снопчета, съдържащи много клетки. Поради трудността при наблюдение на подвижността и поведението на сперматозоидите в непрозрачна фалопиева тръба, използвахме микрофлуидно устройство с напречно сечение на микроканала, подобно на това на сперматозоидите, за да изследваме аглутинацията и подвижността на сперматозоидите. Това проучване обсъжда как се образуват снопчетата сперматозоиди, как се движат и възможната им роля за удължаване на престоя на сперматозоидите в SST. Изследвахме скоростта на сперматозоидите и реологичното поведение, когато потокът от течност се генерира в микрофлуиден канал чрез хидростатично налягане (скорост на потока = 33 µm/s). Сперматозоидите са склонни да плуват срещу течението (положителна реология) и скоростта на снопа сперматозоиди е значително намалена в сравнение с единичните сперматозоиди. Наблюдавано е, че снопчетата сперматозоиди се движат спираловидно и увеличават дължината и дебелината си с привличането на повече единични сперматозоиди. Наблюдавани са снопчета сперматозоиди, които се приближават и прилепват към страничните стени на микрофлуидните канали, за да се избегне поглъщането им със скорост на потока на течността > 33 µm/s. Наблюдавани са снопчета сперматозоиди, които се приближават и прилепват към страничните стени на микрофлуидните канали, за да се избегне поглъщането им със скорост на потока на течността > 33 µm/s. Беше отбелязано, че пучките на сперматозоидите се приближават и прилепват към боковите стенки на микрофлуидните канали, за да се избегне сметаната със скорост на потока течност> 33 mkm / s. Наблюдавано е, че снопчетата сперматозоиди се приближават и прилепват към страничните стени на микрофлуидните канали, за да избегнат отвличането им при скорости на потока >33 µm/s.观察到精子束接近并粘附在微流体通道的侧壁上，以避免被流体流速> 33 µm/s 扫过。33 µm/s 扫过. Беше отбелязано, че пучките на сперматозоидите се приближават и прилепват към боковите стенки на микрожидкостния канал, за да се избегне сметането на течностен поток със скорост > 33 mkm/s. Наблюдавано е, че снопчетата сперматозоиди се приближават и прилепват към страничните стени на микрофлуидния канал, за да избегнат отвличането им от потока на течността >33 µm/s.Сканиращата и трансмисионната електронна микроскопия разкриха, че снопчетата сперматозоиди са поддържани от обилно плътно вещество. Получените данни демонстрират уникалната мобилност на сперматозоидите от пилетата Шаркази, както и способността им да аглутинират и да образуват мобилни снопчета, което допринася за по-добро разбиране на дългосрочното съхранение на сперматозоиди в SMT.
За да се постигне оплождане при хората и повечето животни, сперматозоидите и яйцеклетките трябва да пристигнат на мястото на оплождане в точното време. Следователно, чифтосването трябва да се случи преди или по време на овулацията. От друга страна, някои бозайници, като кучета, както и не-бозайникови видове, като насекоми, риби, влечуги и птици, съхраняват сперматозоидите в репродуктивните си органи за продължителен период от време, докато яйцата им са готови за оплождане (асинхронно оплождане 1 ). Птиците са способни да поддържат жизнеспособността на сперматозоидите, способни да оплодят яйца, в продължение на 2-10 седмици2.
Това е уникална характеристика, която отличава птиците от другите животни, тъй като осигурява висока вероятност за оплождане след еднократно осеменяване в продължение на няколко седмици без едновременно чифтосване и овулация. Основният орган за съхранение на сперматозоиди, наречен каналче за съхранение на сперматозоиди (SST), се намира във вътрешните лигавични гънки на маточно-вагиналния преход. Към днешна дата механизмите, чрез които сперматозоидите влизат, пребивават и излизат от банката за сперма, не са напълно изяснени. Въз основа на предишни изследвания са били изказани много хипотези, но нито една от тях не е потвърдена.
Форман4 предположи, че сперматозоидите поддържат пребиваването си в кухината на SST чрез непрекъснато осцилаторно движение срещу посоката на потока на течността през протеинови канали, разположени върху SST епителни клетки (реология). АТФ се изчерпва поради постоянната флагеларна активност, необходима за задържане на сперматозоидите в лумена на SST, и подвижността в крайна сметка намалява, докато сперматозоидите не бъдат изнесени от банката за сперма чрез поток на течност и не започнат ново пътуване надолу по възходящата фалопиева тръба, за да оплодят сперматозоида. Яйцеклетка (Форман4). Този модел на съхранение на сперматозоиди се подкрепя от откриването чрез имуноцитохимия на аквапорини 2, 3 и 9, присъстващи в SST епителни клетки. Към днешна дата липсват проучвания върху реологията на пилешката сперма и нейната роля в съхранението на SST, вагиналния избор на сперматозоиди и конкуренцията на сперматозоидите. При пилетата сперматозоидите навлизат във вагината след естествено чифтосване, но повече от 80% от сперматозоидите се изхвърлят от вагината малко след чифтосване. Това предполага, че вагината е основното място за селекция на сперматозоиди при птиците. Освен това е съобщено, че по-малко от 1% от сперматозоидите, оплодени във влагалището, попадат в SST2. При изкуствено осеменяване на пилета във влагалището, броят на сперматозоидите, достигащи SST, има тенденция да се увеличава 24 часа след осеменяването. Досега механизмът на селекция на сперматозоиди по време на този процес е неясен и подвижността на сперматозоидите може да играе важна роля в усвояването на сперматозоиди от SST. Поради дебелите и непрозрачни стени на фалопиевите тръби е трудно да се наблюдава директно подвижността на сперматозоидите във фалопиевите тръби на птиците. Следователно, ни липсват основни познания за това как сперматозоидите преминават към SST след оплождане.
Реологията наскоро беше призната за важен фактор, контролиращ транспорта на сперматозоидите в гениталиите на бозайниците. Въз основа на способността на подвижните сперматозоиди да мигрират в противоток, Заферани и др.8 използваха микрофлуидна система Corra, за да изолират пасивно подвижни сперматозоиди от проби от сперма. Този тип сортиране на сперма е от съществено значение за медицинското лечение на безплодие и клиничните изследвания и е за предпочитане пред традиционните методи, които са времеемки и трудоемки и могат да компрометират морфологията и структурната цялост на сперматозоидите. Досега обаче не са провеждани проучвания за ефекта на секретите от гениталните органи на пилетата върху подвижността на сперматозоидите.
Независимо от механизма, който поддържа сперматозоидите съхранени в SST, много изследователи са наблюдавали, че резидентните сперматозоиди аглутинират глава до глава в SST на пилета 9, 10, пъдпъдъци 2 и пуйки 11, за да образуват аглутинирани снопчета сперматозоиди. Авторите предполагат, че има връзка между тази аглутинация и дългосрочното съхранение на сперматозоиди в SST.
Тингари и Лейк12 съобщават за силна връзка между сперматозоидите в жлезата, приемаща сперматозоиди, на пилето и поставят под въпрос дали сперматозоидите на птиците аглутинират по същия начин като сперматозоидите на бозайниците. Те смятат, че дълбоките връзки между сперматозоидите в семепровода може да се дължат на стреса, причинен от наличието на голям брой сперматозоиди в малко пространство.
При оценка на поведението на сперматозоидите върху прясно окачени стъклени слайдове могат да се видят преходни признаци на аглутинация, особено по краищата на капчиците сперма. Аглутинацията обаче често е била нарушавана от ротационното действие, свързано с непрекъснатото движение, което обяснява преходния характер на това явление. Изследователите също така забелязали, че когато разредителят е бил добавен към спермата, са се появили удължени „нишковидни“ клетъчни агрегати.
Ранните опити за имитиране на сперматозоид са правени чрез отстраняване на тънка тел от висяща капка, което е довело до удължена везикула, подобна на сперматозоид, стърчаща от капката сперма. Сперматозоидите веднага се подредили паралелно във везикула, но цялата единица бързо изчезнала поради 3D ограничението. Следователно, за да се изследва аглутинацията на сперматозоидите, е необходимо да се наблюдава подвижността и поведението на сперматозоидите директно в изолирани каналчета за съхранение на сперматозоиди, което е трудно постижимо. Поради това е необходимо да се разработи инструмент, който имитира сперматозоидите, за да се подпомогнат изследванията на подвижността и поведението на аглутинацията на сперматозоидите. Brillard et al13 съобщават, че средната дължина на каналчетата за съхранение на сперматозоиди при възрастни пилета е 400–600 µm, но някои SST могат да бъдат дълги до 2000 µm. Меро и Огасавара14 разделят семенните жлези на уголемени и неуголемени каналчета за съхранение на сперматозоиди, като и двете са с еднаква дължина (~500 µm) и ширина на шийката (~38 µm), но средният диаметър на лумена на каналчетата е съответно 56,6 и 56,6 µm... 11,2 μm. В настоящото изследване използвахме микрофлуидно устройство с размер на канала 200 µm × 20 µm (Ш × В), чието напречно сечение е донякъде близко до това на амплифицирания SST. Освен това изследвахме подвижността на сперматозоидите и поведението на аглутинация в течаща течност, което е в съответствие с хипотезата на Форман, че течността, произведена от епителни клетки на SST, държи сперматозоидите в лумена в противотокова (реологична) посока.
Целта на това проучване беше да се преодолеят проблемите при наблюдение на подвижността на сперматозоидите във фалопиевите тръби и да се избегнат трудностите при изучаване на реологията и поведението на сперматозоидите в динамична среда. Използвано е микрофлуидно устройство, което създава хидростатично налягане, за да симулира подвижността на сперматозоидите в гениталиите на пиле.
Когато капка от разредена проба от сперматозоиди (1:40) беше заредена в микроканалното устройство, бяха идентифицирани два типа подвижност на сперматозоидите (изолирани сперматозоиди и свързани сперматозоиди). Освен това, сперматозоидите имаха склонност да плуват срещу течението (положителна реология; видео 1, 2). Въпреки че снопчетата сперматозоиди имат по-ниска скорост от тази на самотните сперматозоиди (p < 0,001), те увеличават процента на сперматозоидите, показващи положителен реотаксис (p < 0,001; Таблица 2). Въпреки че снопчетата сперматозоиди имат по-ниска скорост от тази на самотните сперматозоиди (p < 0,001), те увеличават процента на сперматозоидите, показващи положителен реотаксис (p < 0,001; Таблица 2). Въпреки че пучките на сперматозоидите имаха по-ниска скорост, отколкото при единични сперматозоиди (p <0,001), те увеличиха процента на сперматозоидите, демонстриращи положителен реотаксис (p <0,001; таблица 2). Въпреки че снопчетата сперматозоиди имат по-ниска скорост от тази на единичните сперматозоиди (p < 0,001), те увеличават процента на сперматозоидите, показващи положителен реотаксис (p < 0,001; Таблица 2).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度（p < 0,001，但它们增加了显示阳性流变性的精子百分比（p < 0,001；表2）。尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 （p <0,001） ， 但 增加 了 显示 阳性 流变性 精子百分比 （p <0,001 ； 2。。。。。。））)）)) Въпреки че скоростта на сперматозоидите беше по-ниска, отколкото при единични сперматозоиди (p <0,001), те увеличиха процента на сперматозоидите с положителна реология (p <0,001; таблица 2). Въпреки че скоростта на снопчетата сперматозоиди е по-ниска от тази на единичните сперматозоиди (p < 0,001), те увеличават процента на сперматозоидите с положителна реология (p < 0,001; Таблица 2).Положителната реология за единични сперматозоиди и снопчета се оценява съответно на приблизително 53% и 85%.
Наблюдавано е, че сперматозоидите на пилетата шаркаши веднага след еякулацията образуват линейни снопчета, състоящи се от десетки индивиди. Тези снопчета се увеличават по дължина и дебелина с течение на времето и могат да останат ин витро в продължение на няколко часа, преди да се разсеят (видео 3). Тези нишковидни снопчета са оформени като сперматозоиди на ехидна, които се образуват в края на епидидимиса. Установено е, че спермата на кокошките шаркаши има висока склонност към аглутинация и образуване на мрежест сноп за по-малко от една минута след събирането. Тези лъчи са динамични и могат да се залепят за всякакви близки стени или статични предмети. Въпреки че снопчетата сперматозоиди намаляват скоростта на сперматозоидите, ясно е, че макроскопски те увеличават тяхната линейност. Дължината на снопчетата варира в зависимост от броя на събраните в снопчета сперматозоиди. Изолирани са две части на снопа: началната част, включваща свободната глава на аглутинирания сперматозоид, и крайната част, включваща опашката и целия дистален край на сперматозоида. С помощта на високоскоростна камера (950 кадъра в секунда) в началната част на снопа са наблюдавани свободни глави на аглутинирани сперматозоиди, отговорни за движението на снопа поради тяхното осцилаторно движение, дърпайки останалите в снопа със спирално движение (Видео 4). Въпреки това, при дългите снопчета е наблюдавано, че някои свободни глави на сперматозоиди са прилепнали към тялото, а крайната част на снопа действа като лопатки, които помагат за задвижването на снопа.
Докато са в бавен поток от течност, снопчетата сперматозоиди се движат успоредно една на друга, но те започват да се припокриват и да се залепват за всичко, което е неподвижно, за да не бъдат отнесени от текущия поток с увеличаване на скоростта му. Снопчетата се образуват, когато шепа сперматозоиди се приближат една към друга, те започват да се движат синхронно и да се увиват една около друга, а след това се залепват за лепкаво вещество. Фигури 1 и 2 показват как сперматозоидите се приближават една към друга, образувайки съединение, докато опашките се увиват една около друга.
Изследователите са приложили хидростатично налягане, за да създадат поток на течност в микроканал, за да изследват реологията на сперматозоидите. Използван е микроканал с размер 200 µm × 20 µm (Ш × В) и дължина 3,6 µm. Използвани са микроканали между контейнери със спринцовки, монтирани в краищата. Използвани са хранителни оцветители, за да направят каналите по-видими.
Завържете свързващите кабели и аксесоарите към стената. Видеото е заснето с фазово-контрастен микроскоп. С всяко изображение са представени изображения от фазово-контрастна микроскопия и картографиране. (A) Връзката между два потока се съпротивлява на потока поради спираловидно движение (червена стрелка). (B) Връзката между тръбния сноп и стената на канала (червени стрелки), като едновременно с това те са свързани с два други снопа (жълти стрелки). (C) Сноповете сперматозоиди в микрофлуидния канал започват да се свързват помежду си (червени стрелки), образувайки мрежа от снопчета сперматозоиди. (D) Образуване на мрежа от снопчета сперматозоиди.
Когато капка разредена сперма беше заредена в микрофлуидното устройство и се създаде поток, се наблюдаваше, че снопът сперматозоиди се движи срещу посоката на потока. Снопчетата прилепват плътно към стените на микроканалите, а свободните глави в началната част на снопчетата прилепват плътно към тях (видео 5). Те също така се прилепват към всякакви неподвижни частици по пътя си, като например отломки, за да устоят на отвличането им от течението. С течение на времето тези снопчета се превръщат в дълги нишки, улавящи други единични сперматозоиди, и по-къси снопчета (видео 6). Когато потокът започне да се забавя, дълги линии от сперматозоиди започват да образуват мрежа от линии от сперматозоиди (видео 7; Фигура 2).
При висока скорост на потока (V > 33 µm/s), спиралните движения на нишките се увеличават, като опит да се уловят много отделни сперматозоиди, образуващи снопове, които по-добре устояват на дрейфовата сила на потока. При висока скорост на потока (V > 33 µm/s), спиралните движения на нишките се увеличават, като опит да се уловят много отделни сперматозоиди, образуващи снопове, които по-добре устояват на дрейфовата сила на потока. При висока скорост на потока (V > 33 mkm/s) спиралевидните движения на нитей се усилват, тъй като те се опитват да поемат множество отделни сперматозоиди, образуващи пъпки, които по-добре противостоят на дрейфуващия поток. При високи скорости на потока (V > 33 µm/s), спиралните движения на нишките се увеличават, тъй като те се опитват да уловят много отделни сперматозоиди, образувайки снопове, които са по-способни да устоят на дрейфовата сила на потока.在高流速 (V > 33 µm/s)时，螺纹的螺旋运动增加，以试图捕捉许多形成束的单个精子，从而更好地抵抗流动的漂移力。在 高 流速 (v> 33 µm/s) 时 ， 的 螺旋 运动 增加 ， 以 试图 许多 形成 束 单 个 精子 ，从而 更 地 抵抗 的 漂移力。。。。。。。。。 При високи скорости на потока (V > 33 mkm/s) спиралното движение на ните се увеличава в опитите за улавяне на множество отделни сперматозоиди, които образуват пръчки, за да се образува по-добре противопоставяне на силата на потока на дрейфа. При високи скорости на потока (V > 33 µm/s), спираловидното движение на нишките се увеличава в опит да се уловят много отделни сперматозоиди, образуващи снопове, за да се противопоставят по-добре на дрейфовите сили на потока.Те също се опитаха да прикрепят микроканали към страничните стени.
С помощта на светлинна микроскопия (LM) снопчетата сперматозоиди бяха идентифицирани като струпвания от глави на сперматозоиди и извити опашки. Снопчета сперматозоиди с различни агрегати също бяха идентифицирани като усукани глави и флагеларни агрегати, множество слети опашки на сперматозоиди, глави на сперматозоиди, прикрепени към опашка, и глави на сперматозоиди с извити ядра като множество слети ядра. Трансмисионна електронна микроскопия (TEM). Сканиращата електронна микроскопия (SEM) показа, че снопчетата сперматозоиди са обвити агрегати от глави на сперматозоиди, а агрегатите на сперматозоидите показват прикрепена мрежа от увити опашки.
Морфологията и ултраструктурата на сперматозоидите, както и образуването на снопчета сперматозоиди, бяха изследвани с помощта на светлинна микроскопия (половин сечение), сканираща електронна микроскопия (SEM) и трансмисионна електронна микроскопия (TEM), сперматозоидни натривки бяха оцветени с акридиново оранжево и изследвани с помощта на епифлуоресцентна микроскопия.
Оцветяването на сперматозоиди с акридиново оранжево (фиг. 3B) показа, че главите на сперматозоидите са слепени една за друга и покрити със секреторен материал, което е довело до образуването на големи кичури (фиг. 3D). Снопчетата сперматозоиди се състоят от агрегати от сперматозоиди с мрежа от прикрепени опашки (фиг. 4A-C). Снопчетата сперматозоиди са съставени от опашките на много сперматозоиди, слепени една за друга (фиг. 4D). Секрети (фиг. 4E,F) покриват главите на снопчетата сперматозоиди.
Образуване на сноп от сперматозоиди. Използването на фазово-контрастна микроскопия и натривки от сперматозоиди, оцветени с акридиново оранжево, показа, че главите на сперматозоидите се слепват. (A) Ранното образуване на снопчета сперматозоиди започва със сперматозоид (бял кръг) и три сперматозоида (жълт кръг), като спиралата започва от опашката и завършва на главата. (B) Фотомикрография на натривка от сперматозоиди, оцветена с акридиново оранжево, показваща прилепнали глави на сперматозоидите (стрелки). Разрядът покрива главата(ите). Увеличение × 1000. (C) Развитие на голям лъч, транспортиран от поток в микрофлуиден канал (с помощта на високоскоростна камера при 950 кадъра в секунда). (D) Микрография на натривка от сперматозоиди, оцветена с акридиново оранжево, показваща големи снопчета (стрелки). Увеличение: ×200.
Сканираща електронна микрография на сперматозоиден лъч и натривка от сперматозоиди, оцветена с акридиново оранжево. (A, B, D, E) са цифрови цветни сканиращи електронни микрографии на сперматозоиди, а C и F са микрографии на натривки от сперматозоиди, оцветени с акридиново оранжево, показващи прикрепването на множество сперматозоиди, обвиващи опашната мрежа. (AC) Агрегатите от сперматозоиди са показани като мрежа от прикрепени опашки (стрелки). (D) Адхезия на няколко сперматозоиди (с адхезивно вещество, розов контур, стрелка), обвиващи се около опашката. (E и F) Агрегати (показатели) на главите на сперматозоидите, покрити с адхезивен материал (показатели). Сперматозоидите образуват снопове с няколко вихроподобни структури (F). (C) ×400 и (F) ×200-кратно увеличение.
С помощта на трансмисионна електронна микроскопия открихме, че снопчетата сперматозоиди имат прикрепени опашки (фиг. 6A, C), глави, прикрепени към опашки (фиг. 6B), или глави, прикрепени към опашки (фиг. 6D). Главите на сперматозоидите в снопа са извити, като в разрез се представят две ядрени области (фиг. 6D). В снопа при разрез сперматозоидите имат усукана глава с две ядрени области и множество флагеларни области (фиг. 5A).
Цифрова цветна електронна микрография, показваща свързващите опашки в снопа сперматозоиди и аглутиниращия материал, свързващ главите на сперматозоидите. (A) Прикрепена опашка на голям брой сперматозоиди. Обърнете внимание как изглежда опашката както в портретна (стрелка), така и в пейзажна (стрелка) проекция. (B) Главата (стрелка) на сперматозоида е свързана с опашката (стрелка). (C) Няколко опашки на сперматозоиди (стрелки) са прикрепени. (D) Аглутиниращ материал (AS, син) свързва четири глави на сперматозоиди (лилаво).
Сканираща електронна микроскопия беше използвана за откриване на глави на сперматозоиди в снопчета сперматозоиди, покрити със секрети или мембрани (Фигура 6B), което показва, че снопчетата сперматозоиди са закотвени от извънклетъчен материал. Аглутинираният материал беше концентриран в главата на сперматозоида (главоподобна структура на медуза; Фиг. 5B) и разширен дистално, придавайки брилянтно жълт вид под флуоресцентна микроскопия, когато е оцветена с акридиново оранжево (Фиг. 6C). Това вещество е ясно видимо под сканиращ микроскоп и се счита за свързващо вещество. Полутънки срези (Фиг. 5C) и сперматозоидни натривки, оцветени с акридиново оранжево, показаха снопчета сперматозоиди, съдържащи плътно опаковани глави и извити опашки (Фиг. 5D).
Различни фотомикрографии, показващи агрегация на глави и сгънати опашки на сперматозоиди, използващи различни методи. (A) Напречно сечение, получено с помощта на цифрова цветна трансмисионна електронна микрография на сноп сперматозоиди, показваща спираловидно навита глава на сперматозоид с двучастно ядро ​​(синьо) и няколко флагеларни части (зелено). (B) Цифрова цветна сканираща електронна микрография, показваща струпване на глави на сперматозоиди, подобни на медузи (стрелки), които изглеждат покрити. (C) Полутънък разрез, показващ агрегирани глави на сперматозоиди (стрелки) и навити опашки (стрелки). (D) Микрография на натривка от сперма, оцветена с акридиново оранжево, показваща агрегати от глави на сперматозоиди (стрелки) и навити прилепнали опашки (стрелки). Обърнете внимание, че лепкаво вещество (S) покрива главата на сперматозоида. (D) × 1000-кратно увеличение.
С помощта на трансмисионна електронна микроскопия (фиг. 7А) беше отбелязано също, че главите на сперматозоидите са усукани, а ядрата имат спирална форма, както е потвърдено от сперматозоидни натривки, оцветени с акридиново оранжево и изследвани с помощта на флуоресцентна микроскопия (фиг. 7B).
(A) Цифрова цветна трансмисионна електронна микрография и (B) Намазка от сперма, оцветена с акридиново оранжево, показваща навити глави и прикрепване на главите и опашките на сперматозоидите (стрелки). (B) × 1000-кратно увеличение.
Интересно откритие е, че сперматозоидите на Шаркази се агрегират, за да образуват подвижни нишковидни снопчета. Свойствата на тези снопчета ни позволяват да разберем възможната им роля в абсорбцията и съхранението на сперматозоиди в SST.
След чифтосване, сперматозоидите навлизат във влагалището и претърпяват интензивен процес на подбор, в резултат на което само ограничен брой сперматозоиди влизат в SST15,16. Към днешна дата механизмите, чрез които сперматозоидите влизат и излизат от SST, са неясни. При домашните птици сперматозоидите се съхраняват в SST за продължителен период от 2 до 10 седмици, в зависимост от вида6. Остават спорове относно състоянието на спермата по време на съхранение в SST. В движение ли са или са в покой? С други думи, как сперматозоидите поддържат позицията си в SST толкова дълго време?
Форман4 предполага, че престоят и изхвърлянето на SST могат да се обяснят с подвижността на сперматозоидите. Авторите предполагат, че сперматозоидите поддържат позицията си, като плуват срещу потока на течността, създаден от епитела на SST, и че сперматозоидите се изхвърлят от SST, когато скоростта им падне под точката, в която започват да се движат назад поради липса на енергия. Занибони5 потвърди наличието на аквапорини 2, 3 и 9 в апикалната част на епителните клетки на SST, което може косвено да подкрепи модела за съхранение на сперматозоиди на Форман. В настоящото проучване открихме, че почти половината от сперматозоидите на Шаркаши показват положителна реология в течащата течност и че аглутинираните снопчета сперматозоиди увеличават броя на сперматозоидите, показващи положителна реология, въпреки че аглутинацията ги забавя. Как сперматозоидите пътуват нагоре по фалопиевата тръба на птицата до мястото на оплождане не е напълно изяснен. При бозайниците фоликуларната течност хемоатрактира сперматозоидите. Смята се обаче, че хемоатрактантите насочват сперматозоидите да се приближават на дълги разстояния7. Следователно, други механизми са отговорни за транспорта на сперматозоидите. Способността на сперматозоидите да се ориентират и да текат срещу течността от фалопиевите тръби, отделена след чифтосване, е установена като основен фактор за насочване към сперматозоидите при мишки. Паркър17 предполага, че сперматозоидите преминават през яйцепроводите, като плуват срещу цилиарния поток при птиците и влечугите. Въпреки че това не е експериментално доказано при птиците, Адолфи18 е първият, който открива, че птичата сперма дава положителни резултати, когато тънък слой течност между покривно стъкло и предметно стъкло се създаде с лента филтърна хартия. Реология. Хино и Янагимачи [19] поставят комплекс от яйчник-тръба-матка на мишка в перфузионен пръстен и инжектират 1 µl мастило в провлака, за да визуализират потока на течност във фалопиевите тръби. Те забелязват много активно движение на свиване и релаксация във фалопиевата тръба, при което всички мастилени топчета се движат постоянно към ампулата на фалопиевата тръба. Авторите подчертават значението на потока на тръбна течност от долната към горната част на фалопиевите тръби за повдигане и оплождане на сперматозоидите. Brillard20 съобщава, че при пилета и пуйки сперматозоидите мигрират чрез активно движение от вагиналния вход, където се съхраняват, до маточно-вагиналния преход, където се съхраняват. Това движение обаче не е необходимо между маточно-вагиналния преход и инфундибулума, тъй като сперматозоидите се транспортират чрез пасивно изместване. Познавайки тези предишни препоръки и резултатите, получени в настоящото проучване, може да се предположи, че способността на сперматозоидите да се движат нагоре по течението (реология) е едно от свойствата, на които се основава процесът на селекция. Това определя преминаването на сперматозоидите през влагалището и навлизането им в CCT за съхранение. Както предположи Forman4, това може също да улесни процеса на навлизане на сперматозоидите в SST и неговата среда за определен период от време и след това излизане, когато скоростта им започне да се забавя.
От друга страна, Мацузаки и Сасанами21 предполагат, че птичите сперматозоиди претърпяват промени в подвижността си от латентност до подвижност в мъжките и женските репродуктивни пътища. Предполага се, че инхибирането на подвижността на резидентните сперматозоиди в SST обяснява дългото време на съхранение на сперматозоидите и след това подмладяването им след напускане на SST. При хипоксични условия Мацузаки и др.1 съобщават за високо производство и освобождаване на лактат в SST, което може да доведе до инхибиране на подвижността на резидентните сперматозоиди. В този случай значението на реологията на сперматозоидите се отразява в селекцията и абсорбцията на сперматозоидите, а не в тяхното съхранение.
Моделът на аглутинация на сперматозоиди се счита за правдоподобно обяснение за дългия период на съхранение на сперматозоидите в SST, тъй като това е често срещан модел на задържане на сперматозоиди при домашните птици2,22,23. Bakst et al.2 наблюдават, че повечето сперматозоиди се прилепват един към друг, образувайки фасцикуларни агрегати, а единични сперматозоиди рядко се откриват в CCM на пъдпъдъци. От друга страна, Wen et al.24 наблюдават повече разпръснати сперматозоиди и по-малко снопчета сперматозоиди в лумена на SST при пилета. Въз основа на тези наблюдения може да се предположи, че склонността към аглутинация на сперматозоиди се различава между птиците и между сперматозоидите в един и същ еякулат. Освен това, Van Krey et al.9 предполагат, че случайната дисоциация на аглутинирани сперматозоиди е отговорна за постепенното проникване на сперматозоиди в лумена на фалопиевата тръба. Според тази хипотеза, сперматозоидите с по-нисък аглутинационен капацитет трябва да бъдат изхвърлени от SST първи. В този контекст, способността на сперматозоидите да аглутинират може да бъде фактор, влияещ върху резултата от конкуренцията между сперматозоидите при „мръсните“ птици. Освен това, колкото по-дълго се дисоциират аглутинираните сперматозоиди, толкова по-дълго се запазва плодовитостта.
Въпреки че агрегацията на сперматозоиди и агрегацията им в снопчета са наблюдавани в няколко проучвания2,22,24, те не са описани подробно поради сложността на тяхното кинематично наблюдение в рамките на SST. Направени са няколко опита за изследване на аглутинацията на сперматозоидите in vitro. Наблюдавана е обширна, но преходна агрегация, когато тънката тел е отстранена от висящата капка семе. Това води до факта, че от капката стърчи удължен мехур, имитиращ семенната жлеза. Поради 3D ограниченията и кратките времена на изсъхване чрез капково изсушаване, целият блок бързо се разпада9. В настоящото проучване, използвайки пилета Шаркаши и микрофлуидни чипове, успяхме да опишем как се образуват тези кичури и как се движат. Снопчетата сперматозоиди се образуват веднага след събирането на сперма и се установява, че се движат спираловидно, показвайки положителна реология, когато присъстват в потока. Освен това, при макроскопско наблюдение е наблюдавано, че снопчетата сперматозоиди увеличават линейността на подвижността в сравнение с изолираните сперматозоиди. Това предполага, че аглутинацията на сперматозоидите може да се случи преди проникването на SST и че производството на сперматозоиди не е ограничено до малка площ поради стрес, както беше предложено по-рано (Tingari and Lake12). По време на образуването на снопчетата, сперматозоидите плуват синхронно, докато образуват съединение, след което опашките им се увиват една около друга и главата на сперматозоида остава свободна, но опашката и дисталната част на сперматозоида се слепват с лепкаво вещество. Следователно, свободната глава на лигамента е отговорна за движението, влачейки останалата част от лигамента. Сканиращата електронна микроскопия на снопчетата сперматозоиди показва прикрепени глави на сперматозоидите, покрити с много лепкав материал, което предполага, че главите на сперматозоидите са били прикрепени в снопчета в покой, което може да се е случило след достигане на мястото за съхранение (SST).
Когато натривка от сперма се оцвети с акридиново оранжево, под флуоресцентен микроскоп може да се види извънклетъчният адхезивен материал около сперматозоидите. Това вещество позволява на снопчетата сперматозоиди да се прилепват и да се залепват за всякакви околни повърхности или частици, така че да не се носят с околния поток. По този начин нашите наблюдения показват ролята на адхезията на сперматозоидите под формата на мобилни снопчета. Способността им да плуват срещу течението и да се прилепват към близки повърхности позволява на сперматозоидите да останат по-дълго в SST.
Ротшилд25 използва хемоцитометрична камера, за да изследва плаващото разпределение на говежда сперма в капка суспензия, като прави фотомикрографии чрез камера с вертикална и хоризонтална оптична ос на микроскопа. Резултатите показват, че сперматозоидите са привлечени от повърхността на камерата. Авторите предполагат, че може да има хидродинамични взаимодействия между сперматозоидите и повърхността. Като се вземе това предвид, заедно със способността на спермата на пилетата Шаркаши да образува лепкави кичури, може да се увеличи вероятността спермата да се прилепи към стената на SST и да се съхранява за дълги периоди от време.
Bccetti и Afzeliu26 съобщават, че гликокаликсът на сперматозоидите е необходим за разпознаване и аглутинация на гамети. Forman10 наблюдава, че хидролизата на α-гликозидни връзки в гликопротеин-гликолипидните покрития чрез третиране на птича сперма с невраминидаза води до намалена плодовитост, без да се засяга подвижността на сперматозоидите. Авторите предполагат, че ефектът на невраминидазата върху гликокаликса нарушава секвестрацията на сперматозоидите на маточно-вагиналния преход, като по този начин намалява плодовитостта. Техните наблюдения не могат да пренебрегнат възможността лечението с невраминидаза да намали разпознаването на сперматозоидите и ооцитите. Forman и Engel10 установяват, че плодовитостта е намалена, когато кокошките са били осеменени интравагинално със сперма, третирана с невраминидаза. Въпреки това, ин витро оплождането със сперма, третирана с невраминидаза, не е повлияло на плодовитостта в сравнение с контролните пилета. Авторите заключават, че промените в гликопротеин-гликолипидното покритие около мембраната на сперматозоидите намаляват способността на сперматозоидите да се оплождат, като нарушават секвестрацията на сперматозоидите в маточно-вагиналния преход, което от своя страна увеличава загубата на сперматозоиди поради скоростта на маточно-вагиналния преход, но не влияе върху разпознаването на сперматозоидите и яйцеклетките.
При пуйките Бакст и Баучан 11 открили малки везикули и мембранни фрагменти в лумена на SST и наблюдавали, че някои от тези гранули са се слели със сперматозоидната мембрана. Авторите предполагат, че тези взаимоотношения могат да допринесат за дългосрочното съхранение на сперматозоидите в SST. Изследователите обаче не уточнили източника на тези частици, дали се секретират от CCT епителни клетки, произвеждат се и се секретират от мъжката репродуктивна система или се произвеждат от самите сперматозоиди. Също така, тези частици са отговорни за аглутинацията. Грюцнер и др.27 съобщават, че епителните клетки на епидидима произвеждат и секретират специфичен протеин, необходим за образуването на еднопорни семенни пътища. Авторите също така съобщават, че дисперсията на тези снопчета зависи от взаимодействието на епидидималните протеини. Никсън и др.28 установили, че аднексите секретират протеин, киселинния, богат на цистеин остеонектин; SPARC участва в образуването на сперматозоидни снопчета при късоклюните ехидни и платиноиди. Разсейването на тези лъчи е свързано със загубата на този протеин.
В настоящото проучване, ултраструктурният анализ с помощта на електронна микроскопия показа, че сперматозоидите са прилепнали към голямо количество плътен материал. Смята се, че тези вещества са отговорни за аглутинацията, която кондензира между и около прилепналите глави, но в по-ниски концентрации в областта на опашката. Предполагаме, че това аглутиниращо вещество се екскретира от мъжката репродуктивна система (епидидимис или семепровод) заедно със спермата, тъй като често наблюдаваме отделяне на сперма от лимфата и семенната плазма по време на еякулация. Съобщава се, че когато птичите сперматозоиди преминават през епидидимиса и семепровода, те претърпяват промени, свързани със съзряването, които подкрепят способността им да свързват протеини и да придобиват гликопротеини, свързани с плазмената лема. Персистирането на тези протеини върху резидентните мембрани на сперматозоидите в SST предполага, че тези протеини могат да повлияят на придобиването на стабилност на мембраната на сперматозоидите 30 и да определят тяхната фертилност 31. Ахамад и др.32 съобщават, че сперматозоидите, получени от различни части на мъжката репродуктивна система (от тестисите до дисталния семепровод), показват прогресивно повишаване на жизнеспособността при течни условия на съхранение, независимо от температурата на съхранение, а жизнеспособността при пилетата също се увеличава във фалопиевите тръби след изкуствено осеменяване.
Сперматозоидите на пилетата шаркаши имат различни характеристики и функции от други видове, като ехидни, платиноиди, горски мишки, еленови плъхове и морски свинчета. При пилетата шаркаши образуването на снопчета сперматозоиди намалява скоростта им на плуване в сравнение с единичните сперматозоиди. Тези снопчета обаче увеличават процента на реологично позитивните сперматозоиди и увеличават способността на сперматозоидите да се стабилизират в динамична среда. По този начин нашите резултати потвърждават предишното предположение, че аглутинацията на сперматозоидите в SST е свързана с дългосрочното съхранение на сперматозоиди. Също така предполагаме, че склонността на сперматозоидите да образуват снопчета може да контролира скоростта на загуба на сперматозоиди в SST, което може да промени резултата от конкуренцията на сперматозоидите. Според това предположение, сперматозоидите с нисък аглутинационен капацитет освобождават SST първи, докато сперматозоидите с висок аглутинационен капацитет произвеждат по-голямата част от потомството. Образуването на снопчета сперматозоиди с една пора е полезно и влияе върху съотношението родител-дете, но използва различен механизъм. При ехидните и платинките сперматозоидите са разположени успоредно един на друг, за да се увеличи скоростта на движение на лъча. Снопчетата ехидни се движат около три пъти по-бързо от единичните сперматозоиди. Смята се, че образуването на такива туфи от сперматозоиди при ехидните е еволюционна адаптация за поддържане на господство, тъй като женските са безразборни и обикновено се чифтосват с няколко мъжки. Следователно, сперматозоидите от различни еякулати се конкурират ожесточено за оплождането на яйцеклетката.
Аглутинираните сперматозоиди при пилета шаркаси са лесни за визуализиране с помощта на фазово-контрастна микроскопия, което се счита за предимство, защото позволява лесно изучаване на поведението на сперматозоидите in vitro. Механизмът, чрез който образуването на сперматозоидни снопчета насърчава размножаването при пилета шаркаси, също е различен от този, наблюдаван при някои плацентарни бозайници, представляващи кооперативно поведение на сперматозоидите, като например горски мишки, където някои сперматозоиди достигат до яйцата, помагайки на други сродни индивиди да достигнат и да повредят яйцата им. да се докажат. алтруистично поведение. Самооплождане 34. Друг пример за кооперативно поведение при сперматозоидите е открит при еленски мишки, където сперматозоидите са били в състояние да идентифицират и комбинират с най-генетично сродните сперматозоиди и да образуват кооперативни групи, за да увеличат скоростта си в сравнение с несвързаните сперматозоиди35.
Резултатите, получени в това проучване, не противоречат на теорията на Фоман за дългосрочно съхранение на сперматозоиди в SWS. Изследователите съобщават, че сперматозоидите продължават да се движат в потока от епителни клетки, покриващи SST, за продължителен период от време и след определен период от време енергийните запаси на сперматозоидите се изчерпват, което води до намаляване на скоростта, което позволява изхвърлянето на вещества с ниско молекулно тегло. енергията на сперматозоидите с потока течност от лумена на SST - кухината на фалопиевата тръба. В настоящото проучване наблюдавахме, че половината от единичните сперматозоиди показват способност да плуват срещу течащите течности, а адхезията им в снопа е увеличила способността им да показват положителна реология. Освен това, нашите данни са в съответствие с тези на Matsuzaki et al.1, които съобщават, че повишената секреция на лактат в SST може да инхибира подвижността на резидентните сперматозоиди. Нашите резултати обаче описват образуването на подвижни връзки на сперматозоидите и тяхното реологично поведение в присъствието на динамична среда в микроканал, в опит да се изясни поведението им в SST. Бъдещите изследвания могат да се фокусират върху определянето на химичния състав и произхода на аглутиниращия агент, което несъмнено ще помогне на изследователите да разработят нови начини за съхранение на течна сперма и да увеличат продължителността на плодовитостта.
Петнадесет мъжки шаркаси на 30-седмична възраст с голи вратове (хомозиготно доминантно; NaNa) бяха избрани като донори на сперма в проучването. Птиците бяха отглеждани в Изследователската птицеферма към Факултета по земеделие, Университет Ашит, провинция Ашит, Египет. Птиците бяха настанени в индивидуални клетки (30 x 40 x 40 см), подложени на светлинна програма (16 часа светлина и 8 часа тъмнина) и хранени с диета, съдържаща 160 г суров протеин, 2800 ккал метаболизируема енергия, 35 г калций всяка, 5 грама наличен фосфор на килограм диета.
Според данни 36, ​​37, сперма е събрана от мъжки екземпляри чрез коремен масаж. Общо 45 проби от сперма са събрани от 15 мъже в продължение на 3 дни. Спермата (n = 15/ден) е незабавно разредена 1:1 (v:v) с разредител за сперма от птици Belsville, който съдържа калиев дифосфат (1,27 g), мононатриев глутамат монохидрат (0,867 g), фруктоза (0,5 d), безводен натриев ацетат (0,43 g), трис(хидроксиметил)аминометан (0,195 g), калиев цитрат монохидрат (0,064 g), калиев монофосфат (0,065 g), магнезиев хлорид (0,034 g) и H2O (100 ml), pH = 7,5, осмоларност 333 mOsm/kg38. Разредените проби от сперма първо бяха изследвани под светлинен микроскоп, за да се гарантира добро качество на спермата (влага), и след това съхранявани във водна баня при 37°C до употреба в рамките на половин час след събирането.
Кинематиката и реологията на сперматозоидите са описани с помощта на система от микрофлуидни устройства. Пробите от сперма са допълнително разредени до 1:40 в разредител за птича сперма Beltsville Avian, заредени са в микрофлуидно устройство (виж по-долу), а кинетичните параметри са определени с помощта на система за компютъризиран анализ на сперматозоиди (CASA), разработена предварително за характеризиране на микрофлуиди. Плъгинът може да бъде изтеглен от: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39. Измерени са скоростта на кривата (VCL, μm/s), линейната скорост (VSL, μm/s) и средната скорост на траекторията (VAP, μm/s). Видеозаписите на сперматозоидите са заснети с помощта на обърнат фазово-контрастен микроскоп Optika XDS-3 (с обектив 40x), свързан с камера Tucson ISH1000 при 30 кадъра в секунда за 3 секунди. Използвайте софтуера CASA, за да изследвате поне три области и 500 траектории на сперматозоиди на проба. Записаното видео е обработено с помощта на домашно приготвен CASA. Дефиницията на подвижност в плъгина CASA се основава на скоростта на плуване на сперматозоидите в сравнение с дебита и не включва други параметри, като например движение от страна до страна, тъй като е установено, че това е по-надеждно при поток на течности. Реологичното движение се описва като движение на сперматозоидите срещу посоката на потока на течността. Сперматозоидите с реологични свойства са разделени на броя на подвижните сперматозоиди; сперматозоидите, които са в покой, и конвективно движещите се сперматозоиди са изключени от преброяването.
Всички използвани химикали са получени от Elgomhoria Pharmaceuticals (Кайро, Египет), освен ако не е посочено друго. Устройството е произведено както е описано от El-sherry et al. 40 с някои модификации. Материалите, използвани за изработката на микроканалите, включват стъклени плочи (Howard Glass, Worcester, MA), негативен резист SU-8-25 (MicroChem, Newton, CA), диацетонов алкохол (Sigma Aldrich, Steinheim, Германия) и полиацетон.-184, Dow Corning, Midland, Michigan). Микроканалите са изработени с помощта на мека литография. Първо, прозрачна защитна маска за лице с желания дизайн на микроканала е отпечатана на принтер с висока резолюция (Prismatic, Кайро, Египет и Pacific Arts and Design, Markham, ON). Шаблоните са направени с помощта на стъклени плочи като подложки. Плочите са почистени в ацетон, изопропанол и дейонизирана вода и след това покрити с 20 µm слой SU8-25 чрез центрофугиране (3000 rpm, 1 min). След това слоевете SU-8 бяха внимателно изсушени (65°C, 2 мин. и 95°C, 10 мин.) и изложени на UV лъчение в продължение на 50 секунди. След експониране бяха изпечени при 65°C и 95°C за 1 мин. и 4 мин. за омрежване на откритите слоеве SU-8, последвано от проявяване в диацетонов алкохол за 6,5 мин. Вафлите бяха изпечени твърдо (200°C за 15 мин.) за допълнително втвърдяване на слоя SU-8.
PDMS беше приготвен чрез смесване на мономера и втвърдителя в тегловно съотношение 10:1, след което дегазиран във вакуумен ексикатор и излят върху основната рамка SU-8. PDMS беше втвърден в пещ (120°C, 30 минути), след което каналите бяха изрязани, отделени от шаблона и перфорирани, за да се позволи прикрепването на тръбички на входа и изхода на микроканала. Накрая, PDMS микроканалите бяха трайно прикрепени към микроскопски предметни стъкла с помощта на преносим корона процесор (Electro-Technic Products, Чикаго, Илинойс), както е описано другаде. Микроканалът, използван в това проучване, е с размери 200 µm × 20 µm (Ш × В) и е дълъг 3,6 cm.
Флуидният поток, индуциран от хидростатично налягане вътре в микроканала, се постига чрез поддържане на нивото на флуида във входния резервоар над разликата във височината Δh39 в изходния резервоар (фиг. 1).
където f е коефициентът на триене, дефиниран като f = C/Re за ламинарен поток в правоъгълен канал, където C е константа, зависеща от съотношението на страните на канала, L е дължината на микроканала, Vav е средната скорост вътре в микроканала, Dh е хидравличният диаметър на канала, g – ускорение на гравитацията. Използвайки това уравнение, средната скорост на канала може да се изчисли по следното уравнение: