Salamat sa pagbisita sa Nature.com. Limitado ang suporta sa CSS sa bersyon ng browser na iyong ginagamit. Para sa pinakamahusay na karanasan, inirerekomenda namin na gumamit ka ng updated na browser (o i-disable ang Compatibility Mode sa Internet Explorer). Samantala, upang matiyak ang patuloy na suporta, ire-render namin ang site nang walang mga style at JavaScript.
Ang pagkamayabong ng mga ibon ay nakasalalay sa kanilang kakayahang mag-imbak ng sapat na mabubuhay na semilya sa loob ng mahabang panahon sa mga sperm storage tubules (SST). Ang eksaktong mekanismo kung paano pumapasok, nananatili, at umaalis ang spermatozoa sa SST ay nananatiling kontrobersyal. Ang semilya ng mga inahing sharkasi ay nagpakita ng mataas na tendensiya sa aglutinasyon, na bumubuo ng mga mobile filamentous bundle na naglalaman ng maraming selula. Dahil sa kahirapan ng pag-obserba sa motility at pag-uugali ng spermatozoa sa isang opaque fallopian tube, gumamit kami ng isang microfluidic device na may microchannel cross-section na katulad ng sa spermatozoa upang pag-aralan ang aglutinasyon at motility ng spermatozoa. Tinatalakay ng pag-aaral na ito kung paano nabubuo ang mga sperm bundle, kung paano sila gumagalaw, at ang kanilang posibleng papel sa pagpapahaba ng sperm residency sa SST. Sinuri namin ang bilis at rheological na pag-uugali ng semilya kapag ang daloy ng likido ay nabuo sa loob ng isang microfluidic channel sa pamamagitan ng hydrostatic pressure (flow rate = 33 µm/s). Ang spermatozoa ay may posibilidad na lumangoy laban sa agos (positibong rheology) at ang bilis ng spermatozoon bundle ay makabuluhang nabawasan kumpara sa iisang spermatozoa. Naobserbahang gumagalaw ang mga bungkos ng tamud nang paikot at lumalaki ang haba at kapal habang mas maraming iisang tamud ang narerekrut. Naobserbahan ang mga bungkos ng tamud na papalapit at dumidikit sa mga gilid ng mga microfluidic channel upang maiwasan ang pagkatangay ng bilis ng daloy ng likido na > 33 µm/s. Naobserbahan ang mga bungkos ng tamud na papalapit at dumidikit sa mga gilid ng mga microfluidic channel upang maiwasan ang pagkatangay ng bilis ng daloy ng likido na > 33 µm/s. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрофлюитодных каналбожв сметания со скоростью потока жидкости> 33 мкм / с. Naobserbahang lumalapit at dumidikit ang mga bungkos ng tamud sa mga gilid na dingding ng mga microfluidic channel upang maiwasan ang pagkatangay sa mga rate ng daloy ng likido na >33 µm/s.观察到精子束接近并粘附在微流体通道的侧壁上，以避免被流体流速> 33 µm/s。33 µm/s 扫过。 Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрожидкостногочяжнижала, приближаются потоком жидкости со скоростью > 33 мкм/с. Naobserbahang lumalapit at dumidikit ang mga bungkos ng tamud sa mga gilid na dingding ng microfluidic channel upang maiwasan ang pagkatangay ng daloy ng likido sa bilis na >33 µm/s.Ipinakita ng scanning at transmission electron microscopy na ang mga sperm bundle ay sinusuportahan ng masaganang siksik na materyal. Ang datos na nakuha ay nagpapakita ng kakaibang mobilidad ng Sharkazi chicken spermatozoa, pati na rin ang kakayahan ng spermatozoa na mag-aglutinate at bumuo ng mga mobile bundle, na nakakatulong sa mas mahusay na pag-unawa sa pangmatagalang pag-iimbak ng spermatozoa sa SMT.
Upang makamit ang pertilisasyon sa mga tao at karamihan sa mga hayop, ang semilya at itlog ay dapat dumating sa lugar ng pertilisasyon sa tamang oras. Samakatuwid, ang pag-aasawa ay dapat mangyari bago o sa oras ng obulasyon. Sa kabilang banda, ang ilang mga mammal, tulad ng mga aso, pati na rin ang mga di-mammal na uri, tulad ng mga insekto, isda, reptilya, at ibon, ay nag-iimbak ng semilya sa kanilang mga organong pangreproduktibo sa loob ng mahabang panahon hanggang sa ang kanilang mga itlog ay handa na para sa pertilisasyon (asynchronous fertilization 1). Nagagawa ng mga ibon na mapanatili ang kakayahang mabuhay ng spermatozoa na may kakayahang magpertilisasyon ng mga itlog sa loob ng 2-10 linggo2.
Ito ay isang natatanging katangian na nagpapaiba sa mga ibon mula sa ibang mga hayop, dahil nagbibigay ito ng mataas na posibilidad ng pertilisasyon pagkatapos ng isang beses na pagpapabinhi sa loob ng ilang linggo nang walang sabay na pag-aasawa at obulasyon. Ang pangunahing organo ng imbakan ng tamud, na tinatawag na sperm storage tubule (SST), ay matatagpuan sa internal mucosal folds sa uterovaginal junction. Sa ngayon, ang mga mekanismo kung saan pumapasok, nananatili, at lumalabas ang tamud sa sperm bank ay hindi pa lubos na nauunawaan. Batay sa mga nakaraang pag-aaral, maraming mga hypotheses ang naihain, ngunit wala sa mga ito ang nakumpirma.
Naghipotesis si Forman4 na pinapanatili ng mga spermatozoa ang kanilang paninirahan sa lukab ng SST sa pamamagitan ng patuloy na oscillatory na paggalaw laban sa direksyon ng daloy ng likido sa mga channel ng protina na matatagpuan sa mga SST epithelial cells (rheology). Nauubos ang ATP dahil sa patuloy na aktibidad ng flagellar na kinakailangan upang mapanatili ang sperm sa lumen ng SST at kalaunan ay bumababa ang motility hanggang sa ang sperm ay madala palabas ng sperm bank sa pamamagitan ng daloy ng likido at magsimula ng isang bagong paglalakbay pababa sa ascending fallopian tube upang lagyan ng pataba ang sperm. Itlog (Forman4). Ang modelong ito ng pag-iimbak ng sperm ay sinusuportahan ng pagtuklas sa pamamagitan ng immunocytochemistry ng mga aquaporins 2, 3 at 9 na nasa mga SST epithelial cells. Sa ngayon, kulang pa ang mga pag-aaral sa rheology ng semilya ng manok at ang papel nito sa pag-iimbak ng SST, pagpili ng semilya ng ari ng babae, at kompetisyon ng semilya. Sa mga manok, ang semilya ay pumapasok sa ari pagkatapos ng natural na pagsasama, ngunit mahigit sa 80% ng spermatozoa ay inilalabas mula sa ari pagkatapos ng pagsasama. Ipinahihiwatig nito na ang ari ang pangunahing lugar para sa pagpili ng semilya sa mga ibon. Bukod pa rito, naiulat na wala pang 1% ng spermatozoa na na-fertilize sa ari ay napupunta sa mga SST2. Sa artipisyal na pagpapabinhi ng mga sisiw sa ari, ang bilang ng spermatozoa na umaabot sa SST ay may posibilidad na tumaas 24 oras pagkatapos ng pagpapabinhi. Sa ngayon, ang mekanismo ng pagpili ng sperm sa prosesong ito ay hindi pa malinaw, at ang galaw ng sperm ay maaaring gumanap ng mahalagang papel sa pagsipsip ng sperm sa SST. Dahil sa makapal at malabong mga dingding ng fallopian tubes, mahirap direktang subaybayan ang galaw ng sperm sa fallopian tubes ng mga ibon. Samakatuwid, kulang kami sa pangunahing kaalaman kung paano lumilipat ang spermatozoa sa SST pagkatapos ng pagpapabinhi.
Kamakailan lamang ay kinilala ang rheology bilang isang mahalagang salik na kumokontrol sa transportasyon ng tamud sa ari ng mammal. Batay sa kakayahan ng motile spermatozoa na lumipat nang pasalungat, gumamit si Zaferani et al8 ng isang corra microfluidic system upang pasibong ihiwalay ang motile spermatozoa mula sa mga sample ng semilya na nakakulong. Ang ganitong uri ng pag-uuri ng semilya ay mahalaga para sa medikal na paggamot sa kawalan ng kakayahang magkaanak at klinikal na pananaliksik, at mas gusto kaysa sa mga tradisyonal na pamamaraan na magastos sa oras at paggawa at maaaring makompromiso ang morpolohiya at integridad ng istruktura ng tamud. Gayunpaman, hanggang sa kasalukuyan, wala pang mga pag-aaral na isinagawa sa epekto ng mga secretions mula sa mga genital organ ng mga manok sa motility ng tamud.
Anuman ang mekanismo na nagpapanatili sa semilya na nakaimbak sa SST, maraming mananaliksik ang nakapansin na ang mga resident spermatozoa ay nagsasama-sama nang harapan sa SST ng mga manok 9, 10, pugo 2, at pabo 11 upang bumuo ng mga pinagsama-samang sperm bundle. Iminumungkahi ng mga may-akda na mayroong kaugnayan sa pagitan ng pagsasama-samang ito at pangmatagalang pag-iimbak ng spermatozoa sa SST.
Iniulat nina Tingari at Lake12 ang isang malakas na kaugnayan sa pagitan ng spermatozoa sa glandulang tumatanggap ng sperm ng manok at kinuwestiyon kung ang avian spermatozoa ay nagsasama-sama sa parehong paraan tulad ng mammalian spermatozoa. Naniniwala sila na ang malalalim na koneksyon sa pagitan ng sperm sa vas deferens ay maaaring dahil sa stress na dulot ng pagkakaroon ng maraming bilang ng sperm sa isang maliit na espasyo.
Kapag sinusuri ang kilos ng spermatozoa sa mga bagong nakasabit na glass slide, makikita ang mga panandaliang senyales ng aglutinasyon, lalo na sa mga gilid ng mga patak ng semilya. Gayunpaman, ang aglutinasyon ay kadalasang nababagabag ng rotational action na nauugnay sa patuloy na paggalaw, na nagpapaliwanag sa panandaliang katangian ng phenomenon na ito. Napansin din ng mga mananaliksik na kapag idinagdag ang diluent sa semilya, lumilitaw ang mga pahabang "tulad ng sinulid" na pinagsama-samang selula.
Ang mga unang pagtatangka na gayahin ang isang spermatozoon ay ginawa sa pamamagitan ng pag-alis ng isang manipis na alambre mula sa isang nakasabit na patak, na nagresulta sa isang pahabang vesicle na parang sperm na nakausli mula sa patak ng semilya. Ang spermatozoa ay agad na pumila nang magkapareho sa loob ng vesicle, ngunit ang buong yunit ay mabilis na nawala dahil sa limitasyon ng 3D. Samakatuwid, upang pag-aralan ang aglutinasyon ng spermatozoa, kinakailangang obserbahan ang motility at pag-uugali ng spermatozoa nang direkta sa mga nakahiwalay na sperm storage tubules, na mahirap makamit. Samakatuwid, kinakailangang bumuo ng isang instrumento na ginagaya ang spermatozoa upang suportahan ang mga pag-aaral ng motility at pag-uugali ng aglutinasyon ng sperm. Iniulat nina Brillard et al13 na ang average na haba ng sperm storage tubules sa mga adult na sisiw ay 400–600 µm, ngunit ang ilang SST ay maaaring umabot ng hanggang 2000 µm. Hinati nina Mero at Ogasawara14 ang mga seminiferous gland sa pinalaki at hindi pinalaking mga sperm storage tubules, na parehong magkapareho ang haba (~500 µm) at lapad ng leeg (~38 µm), ngunit ang mean lumen diameter ng mga tubules ay 56.6 at 56.6 µm. . , ayon sa pagkakabanggit ay 11.2 μm, ayon sa pagkakabanggit. Sa kasalukuyang pag-aaral, gumamit kami ng isang microfluidic device na may sukat ng channel na 200 µm × 20 µm (W × H), na ang cross section ay medyo malapit sa pinalakas na SST. Bukod pa rito, sinuri namin ang galaw ng sperm at ang pag-uugali ng aglutinasyon sa umaagos na likido, na naaayon sa hypothesis ni Foreman na ang likidong nalilikha ng mga SST epithelial cell ay nagpapanatili sa sperm sa lumen sa isang countercurrent (rheological) na direksyon.
Ang layunin ng pag-aaral na ito ay upang malampasan ang mga problema sa pag-obserba sa paggalaw ng spermatozoa sa fallopian tube at upang maiwasan ang mga kahirapan sa pag-aaral ng rheology at pag-uugali ng spermatozoa sa isang pabago-bagong kapaligiran. Ginamit ang isang microfluidic device na lumilikha ng hydrostatic pressure upang gayahin ang paggalaw ng sperm sa ari ng isang manok.
Nang ang isang patak ng diluted sperm sample (1:40) ay inilagay sa microchannel device, dalawang uri ng motility ng sperm ang natukoy (isolated sperm at bound sperm). Bukod pa rito, ang spermatozoa ay may tendensiyang lumangoy laban sa agos (positive rheology; video 1, 2). Bagama't mas mababa ang velocity ng mga sperm bundle kaysa sa lonesome sperm (p < 0.001), pinataas nito ang porsyento ng sperm na nagpapakita ng positibong rheotaxis (p < 0.001; Table 2). Bagama't mas mababa ang velocity ng mga sperm bundle kaysa sa lonesome sperm (p < 0.001), pinataas nito ang porsyento ng sperm na nagpapakita ng positibong rheotaxis (p < 0.001; Table 2). Хотя пучки сперматозоидов имели более низкую скорость, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), оливачнлив сперматозоидов, демонстрирующих положительный реотаксис (p < 0,001; таблица 2). Bagama't ang mga bundle ng spermatozoa ay may mas mababang velocity kaysa sa iisang spermatozoa (p < 0.001), pinataas nito ang porsyento ng spermatozoa na nagpapakita ng positibong rheotaxis (p < 0.001; Table 2).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度（p < 0.001），但它们增加了显示阳性流变性的精子百分比（p < 0.001；表2）。尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 （p <0.001） ， 但 增加 了 显示 阳性 流性 流性百分比 （p <0.001 ； 2。。。。。））））） Хотя скорость пучков сперматозоидов была ниже, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), они увеличирдим товеличивали с положительной реологией (p < 0,001; таблица 2). Bagama't mas mababa ang bilis ng mga bundle ng sperm kaysa sa iisang spermatozoa (p < 0.001), pinataas nila ang porsyento ng spermatozoa na may positibong rheology (p < 0.001; Table 2).Ang positibong rheology para sa iisang spermatozoa at tufts ay tinatayang nasa humigit-kumulang 53% at 85%, ayon sa pagkakabanggit.
Naobserbahan na ang spermatozoa ng mga manok na sharkasi pagkatapos ng paglabas ay bumubuo ng mga linear bundle, na binubuo ng dose-dosenang mga indibidwal. Ang mga tuft na ito ay lumalaki ang haba at kapal sa paglipas ng panahon at maaaring manatili sa vitro nang ilang oras bago mawala (video 3). Ang mga filamentous bundle na ito ay hugis tulad ng echidna spermatozoa na nabubuo sa dulo ng epididymis. Natuklasan na ang semilya ng inahin na Sharkashi ay may mataas na tendensiya na mag-aglutinate at bumuo ng isang reticulate bundle nang wala pang isang minuto pagkatapos ng koleksyon. Ang mga sinag na ito ay dynamic at kayang dumikit sa anumang kalapit na dingding o mga static na bagay. Bagama't binabawasan ng mga sperm bundle ang bilis ng mga sperm cell, malinaw na sa makroskopikong paraan ay pinapataas nila ang kanilang linearity. Ang haba ng mga bundle ay nag-iiba depende sa bilang ng sperm na nakolekta sa mga bundle. Dalawang bahagi ng bundle ang inihiwalay: ang unang bahagi, kabilang ang malayang ulo ng aglutinated sperm, at ang terminal na bahagi, kabilang ang buntot at ang buong distal na dulo ng sperm. Gamit ang isang high-speed camera (950 fps), naobserbahan ang mga malayang ulo ng aglutinated spermatozoa sa unang bahagi ng bundle, na responsable sa paggalaw ng bundle dahil sa kanilang oscillatory motion, na hinihila ang mga natitira papasok sa bundle nang may helical motion (Video 4). Gayunpaman, sa mahahabang tufts, naobserbahan na ang ilang malayang ulo ng sperm ay dumikit sa katawan at ang terminal na bahagi ng tuft ay nagsisilbing mga vane upang makatulong sa pagtulak ng tuft.
Habang nasa mabagal na daloy ng likido, ang mga bundle ng tamud ay gumagalaw nang parallel sa isa't isa, gayunpaman, nagsisimula silang magpatong-patong at dumikit sa lahat ng bagay na hindi gumagalaw, upang hindi maanod ng daloy ng kuryente habang tumataas ang bilis ng daloy. Nabubuo ang mga bundle kapag ang isang dakot ng mga selula ng tamud ay naglalapit sa isa't isa, nagsisimula silang gumalaw nang sabay-sabay at pumulupot sa isa't isa, at pagkatapos ay dumikit sa isang malagkit na sangkap. Ipinapakita ng mga Larawan 1 at 2 kung paano lumalapit ang tamud sa isa't isa, na bumubuo ng isang dugtong habang ang mga buntot ay pumulupot sa isa't isa.
Naglapat ang mga mananaliksik ng hydrostatic pressure upang lumikha ng daloy ng likido sa isang microchannel upang pag-aralan ang rheology ng tamud. Isang microchannel na may sukat na 200 µm × 20 µm (W × H) at haba na 3.6 µm ang ginamit. Gumamit ng mga microchannel sa pagitan ng mga lalagyan na may mga hiringgilya na nakakabit sa mga dulo. Ginamit ang food coloring upang mas makita ang mga channel.
Ikabit ang mga kable at aksesorya ng interconnect sa dingding. Ang video ay kinunan gamit ang isang phase contrast microscope. Sa bawat larawan, ipinapakita ang phase contrast microscopy at mga imahe ng mapping. (A) Ang koneksyon sa pagitan ng dalawang daluyan ay lumalaban sa daloy dahil sa helical motion (pulang arrow). (B) Ang koneksyon sa pagitan ng tube bundle at ng channel wall (pulang arrow), kasabay nito ay nakakonekta ang mga ito sa dalawa pang bundle (dilaw na arrow). (C) Ang mga sperm bundle sa microfluidic channel ay nagsisimulang kumonekta sa isa't isa (mga pulang arrow), na bumubuo ng isang mesh ng mga sperm bundle. (D) Pagbuo ng isang network ng mga sperm bundle.
Nang ang isang patak ng diluted sperm ay inilagay sa microfluidic device at nagkaroon ng daloy, ang sperm beam ay naobserbahang gumagalaw pasalungat sa direksyon ng daloy. Ang mga bundle ay mahigpit na kumakapit sa mga dingding ng mga microchannel, at ang mga malayang ulo sa unang bahagi ng mga bundle ay mahigpit na kumakapit sa mga ito (video 5). Dumidikit din ang mga ito sa anumang nakatigil na particle sa kanilang dinaraanan, tulad ng mga debris, upang hindi matangay ng agos. Sa paglipas ng panahon, ang mga tuft na ito ay nagiging mahahabang filament na kumukulong sa iba pang mga single spermatozoa at mas maiikling tuft (Video 6). Habang nagsisimulang bumagal ang daloy, ang mahahabang linya ng sperm ay nagsisimulang bumuo ng isang network ng mga linya ng sperm (Video 7; Figure 2).
Sa mataas na bilis ng daloy (V > 33 µm/s), ang mga paikot na galaw ng mga sinulid ay tumataas bilang pagtatangkang mahuli ang maraming indibidwal na bungkos ng semilya na bumubuo ng semilya upang mas mahusay na makayanan ang puwersa ng pag-anod ng daloy. Sa mataas na bilis ng daloy (V > 33 µm/s), ang mga paikot na galaw ng mga sinulid ay tumataas bilang pagtatangkang mahuli ang maraming indibidwal na bungkos ng semilya na bumubuo ng semilya upang mas mahusay na makayanan ang puwersa ng pag-anod ng daloy. При высокой скорости потока (V > 33 мкм/с) спиралевидные движения нитей усиливаются, поскольку они пытаются понмтся отдельных сперматозоидов, образующих пучки, которые лучше противостоят дрейфующей силе потока. Sa matataas na bilis ng daloy (V > 33 µm/s), tumataas ang helical na paggalaw ng mga hibla habang sinusubukan nilang saluhin ang maraming indibidwal na spermatozoa na bumubuo ng mga bundle na mas nakakayanan ang puwersa ng pag-anod ng daloy.在高流速(V > 33 µm/s)时，螺纹的螺旋运动增加，以试图捕捉许多形成束的单个精子，从而更好地抵抗的单个精子。在 高 流速 (v> 33 µm/s) 时 ， 的 螺旋 运动 增加 ， 以 试图 许多 形成 束 单 与 ，地 抵抗 的 漂移力。。。。。。。。 При высоких скоростях потока (V > 33 мкм/с) спиральное движение нитей увеличивается в попытке захватить множествот сперматозоидов, образующих пучки, чтобы лучше сопротивляться силам дрейфа потока. Sa mataas na bilis ng daloy (V > 33 µm/s), ang helical na paggalaw ng mga filament ay tumataas sa pagtatangkang makuha ang maraming indibidwal na bundle ng spermatozoa na bumubuo ng mga bundle upang mas mahusay na mapaglabanan ang mga puwersa ng pag-agos ng daloy.Sinubukan din nilang magkabit ng mga microchannel sa mga sidewall.
Ang mga bundle ng tamud ay kinilala bilang mga kumpol ng mga ulo ng tamud at mga kulot na buntot gamit ang light microscopy (LM). Ang mga bundle ng tamud na may iba't ibang aggregate ay natukoy din bilang mga twisted head at flagellar aggregate, maraming fused sperm tail, mga ulo ng tamud na nakakabit sa isang buntot, at mga ulo ng tamud na may baluktot na nuclei bilang maraming fused nuclei. transmission electron microscopy (TEM). Ipinakita ng scanning electron microscopy (SEM) na ang mga bundle ng tamud ay mga sheathed aggregate ng mga ulo ng tamud at ang mga aggregate ng tamud ay nagpakita ng isang nakakabit na network ng mga nakabalot na buntot.
Ang morpolohiya at ultraistruktura ng spermatozoa, ang pagbuo ng mga bundle ng spermatozoa ay pinag-aralan gamit ang light microscopy (half section), scanning electron microscopy (SEM) at transmission electron microscopy (TEM), ang mga sperm smear ay kinulayan ng acridine orange at sinuri gamit ang epifluorescence microscopy.
Ang paglamlam ng sperm smear gamit ang acridine orange (Fig. 3B) ay nagpakita na ang mga ulo ng sperm ay magkakadikit at natatakpan ng secretory material, na humantong sa pagbuo ng malalaking tufts (Fig. 3D). Ang mga sperm bundle ay binubuo ng mga sperm aggregates na may network ng mga nakakabit na buntot (Fig. 4A-C). Ang mga sperm bundle ay binubuo ng mga buntot ng maraming spermatozoa na magkakadikit (Fig. 4D). Ang mga sikreto (Fig. 4E,F) ay bumabalot sa mga ulo ng mga spermatozoa bundle.
Pagbuo ng bundle ng spermatozoa Gamit ang phase contrast microscopy at mga sperm smear na kinulayan ng acridine orange, ipinakita na ang mga ulo ng spermatozoa ay magkakadikit. (A) Ang maagang pagbuo ng tuft ng sperm ay nagsisimula sa isang sperm (puting bilog) at tatlong sperm (dilaw na bilog), kung saan ang spiral ay nagsisimula sa buntot at nagtatapos sa ulo. (B) Photomicrograph ng isang sperm smear na kinulayan ng acridine orange na nagpapakita ng mga nakadikit na ulo ng sperm (mga arrow). Ang discharge ay tumatakip sa ulo(mga ulo). Magnification × 1000. (C) Pagbuo ng isang malaking beam na dinadala ng daloy sa isang microfluidic channel (gamit ang isang high speed camera sa 950 fps). (D) Micrograph ng isang sperm smear na kinulayan ng acridine orange na nagpapakita ng malalaking tuft (mga arrow). Magnification: ×200.
Scanning electron micrograph ng isang sperm beam at isang sperm smear na may kulay na acridine orange. Ang (A, B, D, E) ay mga digital color scanning electron micrograph ng spermatozoa, at ang C at F ay mga micrograph ng acridine orange stained sperm smears na nagpapakita ng pagkakabit ng maraming spermatozoa na bumabalot sa caudal web. (AC) Ang mga sperm aggregate ay ipinapakita bilang isang network ng mga nakakabit na buntot (mga arrow). (D) Pagdikit ng ilang spermatozoa (na may adhesive substance, pink outline, arrow) na bumabalot sa buntot. (E at F) Mga sperm head aggregate (mga pointer) na natatakpan ng adhesive material (mga pointer). Ang spermatozoa ay bumuo ng mga bundle na may ilang vortex-like na istruktura (F). (C) ×400 at (F) ×200 magnification.
Gamit ang transmission electron microscopy, natuklasan namin na ang mga sperm bundle ay may mga nakakabit na buntot (Fig. 6A, C), mga ulo na nakakabit sa mga buntot (Fig. 6B), o mga ulo na nakakabit sa mga buntot (Fig. 6D). Ang mga ulo ng spermatozoa sa bundle ay kurbado, na nagtatanghal sa seksyon dalawang rehiyon ng nukleyar (Fig. 6D). Sa incision bundle, ang spermatozoa ay may baluktot na ulo na may dalawang rehiyon ng nukleyar at maraming rehiyon ng flagellar (Fig. 5A).
Isang digital color electron micrograph na nagpapakita ng mga nagdudugtong na buntot sa bundle ng tamud at ng aglutinating material na nagdurugtong sa mga ulo ng tamud. (A) Nakakabit na buntot ng isang malaking bilang ng spermatozoa. Pansinin kung ano ang hitsura ng buntot sa parehong portrait (arrow) at landscape (arrow) na mga projection. (B) Ang ulo (arrow) ng tamud ay konektado sa buntot (arrow). (C) Ilang buntot ng tamud (arrow) ang nakakabit. (D) Ang aglutination material (AS, asul) ay nagdurugtong sa apat na ulo ng tamud (lila).
Ginamit ang scanning electron microscopy upang matukoy ang mga ulo ng tamud sa mga bundle ng tamud na natatakpan ng mga secretion o membrane (Figure 6B), na nagpapahiwatig na ang mga bundle ng tamud ay nakaangkla ng extracellular material. Ang aglutinated material ay nakonsentra sa ulo ng tamud (tulad ng ulo ng dikya; Fig. 5B) at lumawak nang distal, na nagbibigay ng matingkad na dilaw na anyo sa ilalim ng fluorescence microscopy kapag kinulayan ng acridine orange (Fig. 6C). Ang substansiyang ito ay malinaw na nakikita sa ilalim ng scanning microscope at itinuturing na isang binder. Ang mga semi-thin section (Fig. 5C) at mga sperm smear na kinulayan ng acridine orange ay nagpakita ng mga bundle ng tamud na naglalaman ng mga siksik na ulo at mga kulot na buntot (Fig. 5D).
Iba't ibang photomicrograph na nagpapakita ng pagsasama-sama ng mga ulo ng tamud at mga nakatiklop na buntot gamit ang iba't ibang pamamaraan. (A) Cross-sectional digital color transmission electron micrograph ng isang sperm bundle na nagpapakita ng isang nakapulupot na ulo ng tamud na may dalawang-bahaging nucleus (asul) at ilang bahagi ng flagellar (berde). (B) Digital color scanning electron micrograph na nagpapakita ng isang kumpol ng mga ulo ng tamud na parang dikya (mga arrow) na tila natatakpan. (C) Semi-thin na seksyon na nagpapakita ng pinagsama-samang mga ulo ng tamud (mga arrow) at mga kulot na buntot (mga arrow). (D) Micrograph ng isang sperm smear na kinulayan ng acridine orange na nagpapakita ng mga pinagsama-samang mga ulo ng tamud (mga arrow) at mga kulot na nakadikit na buntot (mga arrow). Tandaan na ang isang malagkit na substansiya (S) ay bumabalot sa ulo ng spermatozoon. (D) × 1000 magnification.
Gamit ang transmission electron microscopy (Fig. 7A), napansin din na ang mga ulo ng semilya ay nakabaluktot at ang mga nuclei ay may hugis na paikot, gaya ng kinumpirma ng mga pahid ng semilya na kinulayan ng acridine orange at sinuri gamit ang fluorescence microscopy (Fig. 7B).
(A) Digital color transmission electron micrograph at (B) Acridine orange stained sperm smear na nagpapakita ng mga nakapulupot na ulo at pagkakakabit ng mga ulo at buntot ng tamud (mga palaso). (B) × 1000 magnification.
Isang kawili-wiling natuklasan ay ang pagsasama-sama ng tamud ni Sharkazi upang bumuo ng mga mobile filamentous bundle. Ang mga katangian ng mga bundle na ito ay nagbibigay-daan sa atin upang maunawaan ang kanilang posibleng papel sa pagsipsip at pag-iimbak ng spermatozoa sa SST.
Pagkatapos magtalik, ang semilya ay pumapasok sa ari at sumasailalim sa isang matinding proseso ng pagpili, na nagreresulta lamang sa limitadong bilang ng semilya na pumapasok sa SST15,16. Sa ngayon, ang mga mekanismo kung paano pumapasok at lumalabas ang semilya sa SST ay hindi pa malinaw. Sa mga manok, ang mga spermatozoa ay iniimbak sa SST sa loob ng mahabang panahon na 2 hanggang 10 linggo, depende sa uri6. Nananatili ang kontrobersiya tungkol sa kondisyon ng semilya habang iniimbak sa SST. Ang mga ito ba ay gumagalaw o hindi gumagalaw? Sa madaling salita, paano napapanatili ng mga selula ng semilya ang kanilang posisyon sa SST nang ganito katagal?
Iminungkahi ni Forman4 na ang paninirahan at paglabas ng SST ay maaaring ipaliwanag sa mga tuntunin ng paggalaw ng tamud. Ipinapalagay ng mga may-akda na pinapanatili ng tamud ang kanilang posisyon sa pamamagitan ng paglangoy laban sa daloy ng likido na nilikha ng SST epithelium at ang tamud ay inilalabas mula sa SST kapag ang kanilang bilis ay bumaba sa punto kung saan nagsisimula silang gumalaw pabalik dahil sa kakulangan ng enerhiya. Kinumpirma ni Zaniboni5 ang pagkakaroon ng mga aquaporin 2, 3, at 9 sa apical na bahagi ng mga SST epithelial cell, na maaaring hindi direktang sumusuporta sa modelo ng imbakan ng tamud ni Foreman. Sa kasalukuyang pag-aaral, natuklasan namin na halos kalahati ng spermatozoa ni Sharkashi ay nagpapakita ng positibong rheology sa dumadaloy na likido, at ang mga agglutinated sperm bundle ay nagpapataas ng bilang ng spermatozoa na nagpapakita ng positibong rheology, bagaman ang agglutination ay nagpapabagal sa mga ito. Kung paano naglalakbay ang mga sperm cell pataas sa fallopian tube ng ibon patungo sa lugar ng pertilisasyon ay hindi pa lubos na nauunawaan. Sa mga mammal, ang follicular fluid ay umaakit sa spermatozoa. Gayunpaman, pinaniniwalaang ang mga chemoattractant ay nagdidirekta sa spermatozoa na lumapit sa malalayong distansya7. Samakatuwid, may iba pang mga mekanismo na responsable para sa transportasyon ng tamud. Ang kakayahan ng tamud na tumuon at dumaloy laban sa likido ng fallopian tube na inilabas pagkatapos ng pagsasama ay naiulat na isang pangunahing salik sa pag-target sa tamud sa mga daga. Iminungkahi ni Parker 17 na ang mga spermatozoa ay tumatawid sa mga oviduct sa pamamagitan ng paglangoy laban sa ciliary current sa mga ibon at reptilya. Bagama't hindi pa ito naipakita sa eksperimento sa mga ibon, si Adolphi18 ang unang nakatuklas na ang tamud ng mga ibon ay nagbibigay ng positibong resulta kapag ang isang manipis na patong ng likido sa pagitan ng isang coverslip at slide ay nilikha gamit ang isang strip ng filter paper. Rheology. Naglagay sina Hino at Yanagimachi [19] ng isang mouse ovary-tubal-uterine complex sa isang perfusion ring at nag-inject ng 1 µl ng tinta sa isthmus upang mailarawan ang daloy ng likido sa mga fallopian tube. Napansin nila ang isang napaka-aktibong paggalaw ng pag-urong at pagrerelaks sa fallopian tube, kung saan ang lahat ng mga bola ng tinta ay patuloy na gumagalaw patungo sa ampulla ng fallopian tube. Binibigyang-diin ng mga may-akda ang kahalagahan ng daloy ng likido ng tubal mula sa ibabang patungo sa itaas na mga fallopian tube para sa pagtaas at pagpapabunga ng tamud. Iniulat ni Brillard20 na sa mga manok at pabo, ang mga spermatozoa ay lumilipat sa pamamagitan ng aktibong paggalaw mula sa pasukan ng ari, kung saan sila nakaimbak, patungo sa utero-vaginal junction, kung saan sila nakaimbak. Gayunpaman, ang paggalaw na ito ay hindi kinakailangan sa pagitan ng uterovaginal junction at infundibulum dahil ang mga spermatozoa ay dinadala sa pamamagitan ng passive displacement. Alam ang mga naunang rekomendasyong ito at ang mga resultang nakuha sa kasalukuyang pag-aaral, maaaring ipagpalagay na ang kakayahan ng spermatozoa na gumalaw pataas (rheology) ay isa sa mga katangian kung saan nakabatay ang proseso ng pagpili. Tinutukoy nito ang pagdaan ng spermatozoa sa ari at ang kanilang pagpasok sa CCT para sa pag-iimbak. Gaya ng iminungkahi ni Forman4, maaari rin nitong mapadali ang proseso ng pagpasok ng sperm sa SST at sa tirahan nito sa loob ng isang panahon at pagkatapos ay lumalabas kapag ang kanilang bilis ay nagsimulang bumagal.
Sa kabilang banda, iminungkahi nina Matsuzaki at Sasanami 21 na ang mga spermatozoa ng ibon ay sumasailalim sa mga pagbabago sa motility mula sa dormancy patungo sa motility sa mga reproductive tract ng lalaki at babae. Ang pagpigil sa resident sperm motility sa SST ay iminungkahi upang ipaliwanag ang mahabang oras ng pag-iimbak ng sperm at pagkatapos ay ang pagpapabata pagkatapos umalis sa SST. Sa ilalim ng mga kondisyong hypoxic, iniulat nina Matsuzaki et al. 1 ang mataas na produksyon at paglabas ng lactate sa SST, na maaaring humantong sa pagpigil sa resident sperm motility. Sa kasong ito, ang kahalagahan ng sperm rheology ay makikita sa pagpili at pagsipsip ng spermatozoa, at hindi sa kanilang pag-iimbak.
Ang sperm aglutination pattern ay itinuturing na isang makatwirang paliwanag para sa mahabang panahon ng pag-iimbak ng sperm sa SST, dahil ito ay isang karaniwang pattern ng pagpapanatili ng sperm sa mga manok2,22,23. Naobserbahan nina Bakst et al. 2 na karamihan sa mga spermatozoa ay dumidikit sa isa't isa, na bumubuo ng mga fascicular aggregate, at ang mga iisang spermatozoa ay bihirang matagpuan sa pugo CCM. Sa kabilang banda, naobserbahan nina Wen et al. 24 ang mas maraming kalat-kalat na spermatozoa at mas kaunting mga tuft ng spermatozoa sa SST lumen sa mga manok. Batay sa mga obserbasyong ito, maaaring ipagpalagay na ang posibilidad ng sperm aglutination ay magkakaiba sa pagitan ng mga ibon at sa pagitan ng spermatozoa sa parehong ejaculate. Bilang karagdagan, iminungkahi nina Van Krey et al. 9 na ang random dissociation ng agglutinated spermatozoa ay responsable para sa unti-unting pagtagos ng spermatozoa sa lumen ng fallopian tube. Ayon sa hypothesis na ito, ang spermatozoa na may mas mababang kapasidad ng aglutination ay dapat munang ilabas mula sa SST. Sa kontekstong ito, ang kakayahan ng spermatozoa na mag-aglutinate ay maaaring isang salik na nakakaimpluwensya sa resulta ng kompetisyon ng sperm sa mga maruruming ibon. Bukod pa rito, habang tumatagal ang paghihiwalay ng mga nag-aglutinate na sperm, mas matagal mapapanatili ang fertility.
Bagama't naobserbahan na sa ilang pag-aaral ang pagsasama-sama at pagsasama-sama ng spermatozoa sa mga bundle, hindi pa ito inilarawan nang detalyado dahil sa kasalimuotan ng kanilang kinematic na obserbasyon sa loob ng SST. Ilang pagtatangka na ang ginawa upang pag-aralan ang pagsasama-sama ng sperm in vitro. Malawakan ngunit panandaliang pagsasama-sama ang naobserbahan nang tanggalin ang manipis na alambre mula sa nakalawit na patak ng binhi. Ito ay humahantong sa katotohanan na isang pahabang bula ang nakausli mula sa patak, na ginagaya ang seminal gland. Dahil sa mga limitasyon sa 3D at maikling oras ng pagpapatuyo ng drip, mabilis na nasira ang buong bloke9. Sa kasalukuyang pag-aaral, gamit ang mga manok na Sharkashi at microfluidic chips, nailarawan namin kung paano nabubuo ang mga tuft na ito at kung paano sila gumagalaw. Ang mga bundle ng sperm ay nabuo kaagad pagkatapos ng pagkolekta ng semilya at natagpuang gumagalaw nang paikot, na nagpapakita ng positibong rheology kapag naroroon sa daloy. Bukod pa rito, kapag tiningnan sa macroscopic na paraan, naobserbahan na pinapataas ng mga bundle ng sperm ang linearity ng motility kumpara sa nakahiwalay na spermatozoa. Ipinahihiwatig nito na ang aglutinasyon ng tamud ay maaaring mangyari bago ang pagtagos ng SST at ang produksyon ng tamud ay hindi limitado sa isang maliit na lugar dahil sa stress gaya ng naunang iminungkahi (Tingari at Lake12). Sa panahon ng pagbuo ng tuft, ang spermatozoa ay lumalangoy nang sabay-sabay hanggang sa bumuo sila ng isang junction, pagkatapos ang kanilang mga buntot ay pumulupot sa isa't isa at ang ulo ng spermatozoon ay nananatiling malaya, ngunit ang buntot at distal na bahagi ng spermatozoon ay dumidikit sa isang malagkit na sangkap. Samakatuwid, ang malayang ulo ng ligament ang responsable para sa paggalaw, na hinihila ang natitirang bahagi ng ligament. Ang scanning electron microscopy ng mga bundle ng sperm ay nagpakita ng nakakabit na mga ulo ng sperm na natatakpan ng maraming malagkit na materyal, na nagmumungkahi na ang mga ulo ng sperm ay nakakabit sa mga resting bundle, na maaaring nangyari pagkatapos makarating sa storage site (SST).
Kapag ang isang sperm smear ay kinulayan ng acridine orange, ang extracellular adhesive material sa paligid ng mga sperm cell ay makikita sa ilalim ng fluorescent microscope. Ang substansiyang ito ay nagpapahintulot sa mga sperm bundle na dumikit at kumapit sa anumang nakapalibot na ibabaw o particle upang hindi sila maanod kasama ng nakapalibot na daloy. Kaya, ipinapakita ng aming mga obserbasyon ang papel ng pagdikit ng spermatozoa sa anyo ng mga mobile bundle. Ang kanilang kakayahang lumangoy laban sa agos at dumikit sa mga kalapit na ibabaw ay nagpapahintulot sa sperm na manatili nang mas matagal sa SST.
Gumamit si Rothschild25 ng isang hemocytometry camera upang pag-aralan ang lumulutang na distribusyon ng semilya ng baka sa isang patak ng suspensyon, kumukuha ng mga photomicrograph sa pamamagitan ng isang camera na may parehong patayo at pahalang na optical axis ng mikroskopyo. Ipinakita ng mga resulta na ang mga spermatozoa ay naaakit sa ibabaw ng silid. Iminumungkahi ng mga may-akda na maaaring mayroong hydrodynamic interactions sa pagitan ng semilya at ng ibabaw. Kung isasaalang-alang ito, kasama ang kakayahan ng semilya ng sisiw ng Sharkashi na bumuo ng malagkit na mga tuft, maaari nitong mapataas ang posibilidad na ang semilya ay dumikit sa dingding ng SST at maiimbak sa mahabang panahon.
Iniulat nina Bccetti at Afzeliu26 na ang glycocalyx ng tamud ay kinakailangan para sa pagkilala at aglutinasyon ng gamete. Naobserbahan ni Forman10 na ang hydrolysis ng α-glycosidic bonds sa glycoprotein-glycolipid coatings sa pamamagitan ng paggamot sa semilya ng ibon gamit ang neuraminidase ay nagresulta sa pagbaba ng fertility nang hindi naaapektuhan ang motility ng tamud. Iminumungkahi ng mga may-akda na ang epekto ng neuraminidase sa glycocalyx ay nakakasira sa sperm sequestration sa utero-vaginal junction, sa gayon ay binabawasan ang fertility. Hindi maaaring balewalain ng kanilang mga obserbasyon ang posibilidad na ang paggamot sa neuraminidase ay maaaring makabawas sa pagkilala sa tamud at oocyte. Natuklasan nina Forman at Engel10 na ang fertility ay nabawasan kapag ang mga inahin ay ipina-inseminate sa pamamagitan ng intravaginally gamit ang semilya na ginagamot ng neuraminidase. Gayunpaman, ang IVF na may sperm na ginagamot ng neuraminidase ay hindi nakakaapekto sa fertility kumpara sa mga kontrol na manok. Napagpasyahan ng mga may-akda na ang mga pagbabago sa patong ng glycoprotein-glycolipid sa paligid ng lamad ng tamud ay nagbawas sa kakayahan ng tamud na magpatubo sa pamamagitan ng pagpapahina sa pagsingit ng tamud sa utero-vaginal junction, na siya namang nagpapataas ng pagkawala ng tamud dahil sa bilis ng utero-vaginal junction, ngunit hindi nakakaapekto sa pagkilala ng tamud at itlog.
Sa mga pabo, natagpuan nina Bakst at Bauchan 11 ang maliliit na vesicle at mga piraso ng lamad sa lumen ng SST at naobserbahan na ang ilan sa mga granule na ito ay nagsanib sa lamad ng tamud. Iminumungkahi ng mga may-akda na ang mga ugnayang ito ay maaaring mag-ambag sa pangmatagalang pag-iimbak ng spermatozoa sa SST. Gayunpaman, hindi tinukoy ng mga mananaliksik ang pinagmulan ng mga particle na ito, kung ang mga ito ay inilalabas ng mga CCT epithelial cell, ginawa at inilalabas ng sistemang reproduktibo ng lalaki, o ginawa mismo ng tamud. Gayundin, ang mga particle na ito ay responsable para sa aglutinasyon. Iniulat nina Grützner et al27 na ang mga epididymal epithelial cell ay gumagawa at naglalabas ng isang partikular na protina na kinakailangan para sa pagbuo ng mga single-pore seminal tract. Iniulat din ng mga may-akda na ang pagkalat ng mga bundle na ito ay nakasalalay sa interaksyon ng mga epididymal protein. Natuklasan nina Nixon et al28 na ang adnexa ay naglalabas ng isang protina, ang acidic cysteine-rich osteonectin; ang SPARC ay kasangkot sa pagbuo ng mga tuft ng tamud sa mga short-beaked echidna at platypus. Ang pagkalat ng mga sinag na ito ay nauugnay sa pagkawala ng protina na ito.
Sa kasalukuyang pag-aaral, ipinakita ng ultrastructural analysis gamit ang electron microscopy na ang spermatozoa ay dumikit sa isang malaking halaga ng siksik na materyal. Ang mga sangkap na ito ay pinaniniwalaang responsable para sa aglutinasyon na namumuo sa pagitan at paligid ng mga nakadikit na ulo, ngunit sa mas mababang konsentrasyon sa rehiyon ng buntot. Ipinapalagay namin na ang aglutinating substance na ito ay inilalabas mula sa reproductive system ng lalaki (epididymis o vas deferens) kasama ng semilya, dahil madalas naming napapansin ang semilya na humihiwalay mula sa lymph at seminal plasma habang nagbubuga. Naiulat na habang ang avian spermatozoa ay dumadaan sa epididymis at vas deferens, sumasailalim sila sa mga pagbabagong nauugnay sa maturation na sumusuporta sa kanilang kakayahang magbigkis ng mga protina at makakuha ng mga plasma lemma-associated glycoprotein. Ang pananatili ng mga protina na ito sa mga resident sperm membrane sa SST ay nagmumungkahi na ang mga protina na ito ay maaaring makaimpluwensya sa pagkuha ng katatagan ng sperm membrane 30 at matukoy ang kanilang fertility 31. Iniulat nina Ahammad et al32 na ang spermatozoa na nakuha mula sa iba't ibang bahagi ng sistemang reproduktibo ng lalaki (mula sa testes hanggang sa distal vas deferens) ay nagpakita ng progresibong pagtaas sa viability sa ilalim ng mga kondisyon ng pag-iimbak ng likido, anuman ang temperatura ng pag-iimbak, at ang viability sa mga manok ay tumataas din sa mga fallopian tube pagkatapos ng artificial insemination.
Ang mga tuft ng tamud ng manok na Sharkashi ay may iba't ibang katangian at tungkulin kumpara sa ibang mga uri ng hayop tulad ng echidna, platypus, wood mice, deer rats, at guinea pig. Sa mga manok na Sharkasi, ang pagbuo ng mga bundle ng spermatozoa ay nagpababa ng kanilang bilis ng paglangoy kumpara sa mga single spermatozoa. Gayunpaman, ang mga bundle na ito ay nagpataas ng porsyento ng rheologically positive spermatozoa at nagpataas ng kakayahan ng spermatozoa na patatagin ang kanilang mga sarili sa isang dynamic na kapaligiran. Kaya, kinukumpirma ng aming mga resulta ang naunang mungkahi na ang sperm aglutination sa SST ay nauugnay sa pangmatagalang pag-iimbak ng tamud. Ipinapalagay din namin na ang posibilidad ng sperm na bumuo ng mga tuft ay maaaring makontrol ang rate ng pagkawala ng tamud sa SST, na maaaring magpabago sa resulta ng kompetisyon ng tamud. Ayon sa palagay na ito, ang spermatozoa na may mababang kapasidad ng aglutination ay unang naglalabas ng SST, habang ang spermatozoa na may mataas na kapasidad ng aglutination ay nagbubunga ng karamihan sa mga supling. Ang pagbuo ng mga single-pore sperm bundle ay kapaki-pakinabang at nakakaapekto sa ratio ng magulang-anak, ngunit gumagamit ng ibang mekanismo. Sa mga echidna at platypus, ang mga spermatozoa ay nakaayos nang parallel sa isa't isa upang mapataas ang bilis ng pag-abante ng sinag. Ang mga bungkos ng echidna ay gumagalaw nang halos tatlong beses na mas mabilis kaysa sa iisang spermatozoa. Pinaniniwalaan na ang pagbuo ng mga naturang tuft ng sperm sa mga echidna ay isang ebolusyonaryong adaptasyon upang mapanatili ang pangingibabaw, dahil ang mga babae ay palabiro at karaniwang nakikipagtalik sa ilang mga lalaki. Samakatuwid, ang mga spermatozoa mula sa iba't ibang ejaculate ay matinding nakikipagkumpitensya para sa pertilisasyon ng itlog.
Madaling mailarawan ang mga agglutinated spermatozoa ng mga manok na sharkasi gamit ang phase contrast microscopy, na itinuturing na kapaki-pakinabang dahil nagbibigay-daan ito sa madaling pag-aaral ng pag-uugali ng spermatozoa in vitro. Ang mekanismo kung saan ang pagbuo ng sperm tuft ay nagtataguyod ng reproduksyon sa mga manok na sharkasi ay naiiba rin sa nakikita sa ilang placental mammal na kumakatawan sa kooperatibong pag-uugali ng sperm tulad ng wood mice, kung saan ang ilang spermatozoa ay umaabot sa mga itlog, na tumutulong sa iba pang kaugnay na indibidwal na maabot at masira ang kanilang mga itlog. upang mapatunayan ang iyong sarili. altruistic na pag-uugali. Self-fertilization 34. Ang isa pang halimbawa ng kooperatibong pag-uugali sa spermatozoa ay natagpuan sa mga daga ng usa, kung saan ang mga spermatozoa ay nakilala at pinagsama sa mga spermatozoa na may pinaka-genetically related at bumuo ng mga kooperatibong grupo upang mapataas ang kanilang bilis kumpara sa mga hindi kaugnay na spermatozoa35.
Ang mga resultang nakuha sa pag-aaral na ito ay hindi sumasalungat sa teorya ni Foman tungkol sa pangmatagalang pag-iimbak ng spermatozoa sa SWS. Iniulat ng mga mananaliksik na ang mga sperm cell ay patuloy na gumagalaw sa daloy ng mga epithelial cell na nakahanay sa SST sa loob ng mahabang panahon, at pagkatapos ng isang tiyak na tagal ng panahon, ang mga imbakan ng enerhiya ng mga sperm cell ay nauubos, na nagreresulta sa pagbaba ng bilis, na nagpapahintulot sa pagpapatalsik ng maliliit na molekular na timbang na mga sangkap. enerhiya ng spermatozoa kasama ang daloy ng likido mula sa lumen ng SST Ang lukab ng fallopian tube. Sa kasalukuyang pag-aaral, naobserbahan namin na kalahati ng nag-iisang sperm ay nagpakita ng kakayahang lumangoy laban sa dumadaloy na mga likido, at ang kanilang pagdikit sa bundle ay nagpataas ng kanilang kakayahang magpakita ng positibong rheology. Bukod pa rito, ang aming datos ay naaayon sa kay Matsuzaki et al. 1 na nag-ulat na ang pagtaas ng lactate secretion sa SST ay maaaring pumigil sa resident sperm motility. Gayunpaman, inilalarawan ng aming mga resulta ang pagbuo ng mga sperm motile ligament at ang kanilang rheological na pag-uugali sa presensya ng isang dynamic na kapaligiran sa loob ng isang microchannel sa pagtatangkang linawin ang kanilang pag-uugali sa SST. Ang mga pananaliksik sa hinaharap ay maaaring tumuon sa pagtukoy ng kemikal na komposisyon at pinagmulan ng agglutinating agent, na walang alinlangang makakatulong sa mga mananaliksik na bumuo ng mga bagong paraan upang mag-imbak ng likidong semilya at mapataas ang tagal ng pertilidad.
Labinlimang 30-linggong gulang na lalaking sharkasi (homozygous dominant; Na Na) na walang sapin ang leeg at may edad na hubad ang napili bilang mga donor ng tamud sa pag-aaral. Ang mga ibon ay pinalaki sa Research Poultry Farm ng Faculty of Agriculture, Ashit University, Ashit Governorate, Egypt. Ang mga ibon ay inilagay sa magkakahiwalay na kulungan (30 x 40 x 40 cm), isinailalim sa isang programa ng pag-iilaw (16 na oras ng liwanag at 8 oras ng dilim) at pinakain ng diyeta na naglalaman ng 160 g ng krudong protina, 2800 kcal ng metabolizable energy, 35 g ng calcium bawat isa. 5 gramo ng magagamit na phosphorus bawat kilo ng diyeta.
Ayon sa datos 36, ​​37, ang semilya ay kinolekta mula sa mga lalaki sa pamamagitan ng abdominal massage. Isang kabuuang 45 na sample ng semilya ang kinolekta mula sa 15 lalaki sa loob ng 3 araw. Ang semilya (n = 15/araw) ay agad na diluted 1:1 (v:v) gamit ang Belsville Poultry Semen Diluent, na naglalaman ng potassium diphosphate (1.27 g), monosodium glutamate monohydrate (0.867 g), fructose (0.5 d) anhydrous sodium, acetate (0.43 g), tris(hydroxymethyl)aminomethane (0.195 g), potassium citrate monohydrate (0.064 g), potassium monophosphate (0.065 g), magnesium chloride (0.034 g) at H2O (100 ml), pH = 7, 5, osmolarity 333 mOsm/kg38. Ang mga diluted na sample ng semilya ay unang sinuri sa ilalim ng light microscope upang matiyak ang magandang kalidad ng semilya (moisture) at pagkatapos ay iniimbak sa isang water bath sa 37°C hanggang sa gamitin sa loob ng kalahating oras pagkatapos ng pagkolekta.
Ang kinematika at reolohiya ng spermatozoa ay inilalarawan gamit ang isang sistema ng mga microfluidic device. Ang mga sample ng semilya ay lalong pinalabnaw sa 1:40 sa Beltsville Avian Semen Diluent, na inilagay sa isang microfluidic device (tingnan sa ibaba), at ang mga kinetic parameter ay natukoy gamit ang isang Computerized Semen Analysis (CASA) system na dating binuo para sa microfluidics characterization. Tungkol sa mobility ng spermatozoa sa liquid media (Department of Mechanical Engineering, Faculty of Engineering, Assiut University, Egypt). Maaaring i-download ang plugin sa: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39. Sinukat ang curve velocity (VCL, μm/s), linear velocity (VSL, μm/s) at average trajectory velocity (VAP, μm/s). Ang mga video ng spermatozoa ay kinunan gamit ang isang inverted Optika XDS-3 phase contrast microscope (na may 40x objective) na nakakonekta sa isang Tucson ISH1000 camera sa 30 fps sa loob ng 3 segundo. Gamitin ang CASA software upang pag-aralan ang kahit tatlong lugar at 500 trajectory ng sperm bawat sample. Ang na-record na video ay pinoproseso gamit ang isang homemade na CASA. Ang kahulugan ng motility sa CASA plug-in ay batay sa bilis ng paglangoy ng sperm kumpara sa flow rate, at hindi kasama ang iba pang mga parameter tulad ng paggalaw mula sa gilid hanggang gilid, dahil ito ay natuklasang mas maaasahan sa daloy ng fluid. Ang rheological motion ay inilalarawan bilang ang paggalaw ng mga sperm cell laban sa direksyon ng daloy ng fluid. Ang mga spermatozoa na may mga rheological properties ay hinati sa bilang ng mga motile spermatozoa; ang mga spermatozoa na nakapahinga at convectively moving spermatozoa ay hindi isinama sa bilang.
Ang lahat ng kemikal na ginamit ay nakuha mula sa Elgomhoria Pharmaceuticals (Cairo, Egypt) maliban kung may ibang nabanggit. Ang aparato ay ginawa ayon sa paglalarawan nina El-sherry et al. 40 na may ilang mga pagbabago. Ang mga materyales na ginamit sa paggawa ng mga microchannel ay kinabibilangan ng mga glass plate (Howard Glass, Worcester, MA), SU-8-25 negative resist (MicroChem, Newton, CA), diacetone alcohol (Sigma Aldrich, Steinheim, Germany), at polyacetone. -184, Dow Corning, Midland, Michigan). Ang mga microchannel ay ginawa gamit ang malambot na lithography. Una, isang malinaw na proteksiyon na maskara sa mukha na may nais na disenyo ng microchannel ang inilimbag sa isang high resolution printer (Prismatic, Cairo, Egypt and Pacific Arts and Design, Markham, ON). Ang mga master ay ginawa gamit ang mga glass plate bilang substrate. Ang mga plato ay nilinis sa acetone, isopropanol at deionized na tubig at pagkatapos ay pinahiran ng 20 µm na layer ng SU8-25 sa pamamagitan ng spin coating (3000 rpm, 1 min). Ang mga patong ng SU-8 ay dahan-dahang pinatuyo (65°C, 2 minuto at 95°C, 10 minuto) at inilantad sa radyasyon ng UV sa loob ng 50 segundo. I-bake pagkatapos ng exposure sa 65°C at 95°C sa loob ng 1 minuto at 4 na minuto upang i-crosslink ang mga nakalantad na patong ng SU-8, na sinundan ng pagpapatubo sa diacetone alcohol sa loob ng 6.5 minuto. I-hard bake ang mga waffle (200°C sa loob ng 15 minuto) upang lalong tumigas ang patong ng SU-8.
Ang PDMS ay inihanda sa pamamagitan ng paghahalo ng monomer at hardener sa weight ratio na 10:1, pagkatapos ay tinanggal ang gas sa isang vacuum desiccator at ibinuhos sa SU-8 main frame. Ang PDMS ay pinatuyo sa isang oven (120°C, 30 min), pagkatapos ay pinutol ang mga channel, inihiwalay mula sa master, at binutasan upang ang mga tubo ay maikabit sa inlet at outlet ng microchannel. Panghuli, ang mga PDMS microchannel ay permanenteng ikinabit sa mga microscope slide gamit ang isang portable corona processor (Electro-Technic Products, Chicago, IL) gaya ng inilarawan sa ibang lugar. Ang microchannel na ginamit sa pag-aaral na ito ay may sukat na 200 µm × 20 µm (W × H) at 3.6 cm ang haba.
Ang daloy ng pluido na dulot ng hydrostatic pressure sa loob ng microchannel ay nakakamit sa pamamagitan ng pagpapanatili ng antas ng pluido sa inlet reservoir na mas mataas sa pagkakaiba ng taas na Δh39 sa outlet reservoir (Fig. 1).
kung saan ang f ay ang coefficient of friction, na tinukoy bilang f = C/Re para sa laminar flow sa isang rectangular channel, kung saan ang C ay isang constant depende sa aspect ratio ng channel, ang L ay ang haba ng microchannel, ang Vav ay ang average velocity sa loob ng microchannel, ang Dh ay ang hydraulic diameter ng channel, at ang g – acceleration of gravity. Gamit ang equation na ito, ang average channel velocity ay maaaring kalkulahin gamit ang sumusunod na equation: