Kiitos käynnistäsi Nature.com-sivustolla. Käyttämäsi selainversio tukee CSS:ää rajoitetusti. Parhaan käyttökokemuksen saavuttamiseksi suosittelemme käyttämään päivitettyä selainta (tai poistamaan yhteensopivuustilan käytöstä Internet Explorerissa). Sillä välin tuen jatkuvuuden varmistamiseksi renderöimme sivuston ilman tyylejä ja JavaScriptiä.
Lintujen hedelmällisyys riippuu niiden kyvystä varastoida riittävästi elinkelpoisia siittiöitä pitkän aikaa siittiöiden varastoputkissa (SST). Tarkka mekanismi, jolla siittiöt pääsevät SST:hen, pysyvät siellä ja poistuvat sieltä, on edelleen kiistanalainen. Sharkasi-kanojen siittiöillä oli voimakas taipumus agglutinaatioon, muodostaen liikkuvia rihmamaisia ​​kimppuja, jotka sisälsivät useita soluja. Koska siittiöiden liikkuvuutta ja käyttäytymistä on vaikea havaita läpinäkymättömässä munanjohtimessa, käytimme mikrofluidilaitetta, jonka mikrokanavan poikkileikkaus on samanlainen kuin siittiöillä, tutkiaksemme siittiöiden agglutinaaatiota ja liikkuvuutta. Tässä tutkimuksessa käsitellään, miten siittiökimput muodostuvat, miten ne liikkuvat ja miten ne mahdollisesti vaikuttavat siittiöiden pysymiseen SST:ssä. Tutkimme siittiöiden nopeutta ja reologista käyttäytymistä, kun nestevirtaus tuotettiin mikrofluidikanavassa hydrostaattisen paineen avulla (virtausnopeus = 33 µm/s). Siittiöt pyrkivät uimaan vastavirtaan (positiivinen reologia), ja siittiökimpun nopeus on merkittävästi pienempi kuin yksittäisillä siittiöillä. Siittiökimpujen on havaittu liikkuvan spiraalimaisesti ja kasvavan pituudeltaan ja paksuudeltaan, kun useampia yksittäisiä siittiöitä rekrytoidaan. Siittiökimpuiden havaittiin lähestyvän ja tarttuvan mikrofluidikanavien sivuseiniin, jotta vältettäisiin yli 33 µm/s nesteen virtausnopeuden aiheuttama pyyhkäisy. Siittiökimpuiden havaittiin lähestyvän ja tarttuvan mikrofluidikanavien sivuseiniin, jotta vältettäisiin yli 33 µm/s nesteen virtausnopeuden aiheuttama pyyhkäisy. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрофлюиканачх, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрофлюиканачх, избежать сметания со скоростью потока жидкости> 33 мкм / с. Siittiökimpuiden on havaittu lähestyvän ja tarttuvan mikrofluidikanavien sivuseiniin välttääkseen niiden viemisen pois nesteen virtausnopeuksilla >33 µm/s.观察到精子束接近并粘附在微流体通道的侧壁上，以避免被流体流速> 流体流速> 33 流µ臟> 3333 µm/s 扫过. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрожидкатостного, избежать сметания потоком жидкости со скоростью > 33 мкм/с. Siittiökimpuiden on havaittu lähestyvän ja tarttuvan mikrofluidikanavan sivuseiniin välttääkseen yli 33 µm/s nopeudella virtaavan nesteen viemät aineet.Skannaus- ja läpäisyelektronimikroskopia paljasti, että siittiökimput olivat runsaan tiheän materiaalin tukemia. Saadut tiedot osoittavat Sharkazi-kanan siittiöiden ainutlaatuisen liikkuvuuden sekä kyvyn agglutinoitua ja muodostaa liikkuvia kimppuja, mikä auttaa ymmärtämään siittiöiden pitkäaikaista varastointia SMT:ssä.
Ihmisillä ja useimmilla eläimillä hedelmöityksen saavuttamiseksi siittiöiden ja munasolujen on saavuttava hedelmöityskohtaan oikeaan aikaan. Siksi parittelun on tapahduttava ennen ovulaatiota tai sen aikana. Toisaalta jotkut nisäkkäät, kuten koirat, sekä muut kuin nisäkäslajit, kuten hyönteiset, kalat, matelijat ja linnut, varastoivat siittiöitä lisääntymiselimissään pitkään, kunnes niiden munat ovat valmiita hedelmöitykseen (asynkroninen hedelmöitys1). Linnut pystyvät ylläpitämään munasolujen hedelmöittämiseen kykenevien siittiöiden elinkykyä 2–10 viikkoa2.
Tämä on ainutlaatuinen ominaisuus, joka erottaa linnut muista eläimistä, sillä se tarjoaa suuren hedelmöityksen todennäköisyyden yhden useiden viikkojen ajan tapahtuneen keinosiemennyksen jälkeen ilman samanaikaista parittelua ja ovulaatiota. Tärkein siittiöiden varastointielin, jota kutsutaan siittiöiden varastointiputkeksi (SST), sijaitsee sisäisen limakalvon poimuissa kohdun ja emättimen liitoskohdassa. Tähän mennessä mekanismeja, joilla siittiöt pääsevät spermapankkiin, pysyvät siellä ja poistuvat sieltä, ei täysin ymmärretä. Aiempien tutkimusten perusteella on esitetty monia hypoteeseja, mutta yhtäkään niistä ei ole vahvistettu.
Forman4 oletti, että siittiöt säilyttävät sijaintinsa SST-ontelossa jatkuvan värähtelyliikkeen kautta nesteen virtausta vastaan ​​SST-epiteelisoluissa sijaitsevien proteiinikanavien läpi (reologia). ATP on ehtynyt jatkuvan siimatoiminnan vuoksi, jota tarvitaan siittiöiden pitämiseen SST-ontelossa, ja liikkuvuus lopulta heikkenee, kunnes nestevirtaus kuljettaa siittiöt pois siittiöpankista ja aloittaa uuden matkan nousevaa munanjohinta pitkin hedelmöittämään siittiöitä. Munasolu (Forman4). Tätä siittiöiden varastointimallia tukee SST-epiteelisoluissa olevien akvaporiinien 2, 3 ja 9 havaitseminen immunosytokemialla. Tähän mennessä tutkimuksia kanan siemennesteen reologiasta ja sen roolista SST-varastoissa, emättimen siittiöiden valinnassa ja siittiöiden kilpailussa ei ole tehty. Kanoilla siittiöt saapuvat emättimeen luonnollisen parittelun jälkeen, mutta yli 80 % siittiöistä poistuu emättimestä pian parittelun jälkeen. Tämä viittaa siihen, että emätin on lintujen ensisijainen siittiöiden valinnan paikka. Lisäksi on raportoitu, että alle 1 % emättimessä hedelmöitetyistä siittiöistä päätyy SST-onteloihin2. Poikasten keinosiemennyksessä emättimessä munanjohtimiin siirtyvien siittiöiden määrä yleensä kasvaa 24 tuntia keinosiemennyksen jälkeen. Siittiöiden valinnan mekanismi tässä prosessissa on toistaiseksi epäselvä, ja siittiöiden liikkuvuudella voi olla tärkeä rooli siittiöiden imeytymisessä munanjohtimiin. Munanjohtimien paksujen ja läpinäkymättömien seinämien vuoksi siittiöiden liikkuvuutta on vaikea seurata suoraan lintujen munanjohtimissa. Siksi meillä ei ole perustietoa siitä, miten siittiöt siirtyvät munanjohtimiin hedelmöityksen jälkeen.
Reologia on äskettäin tunnistettu tärkeäksi tekijäksi, joka säätelee siittiöiden kuljetusta nisäkkäiden sukupuolielimissä. Liikkuvien siittiöiden kyvyn siirtyä vastavirtaan perusteella Zaferani ym.8 käyttivät Corra-mikrofluidijärjestelmää liikkuvien siittiöiden passiiviseen eristämiseen aitauksessa olleista siemennestenäytteistä. Tämäntyyppinen siemennesteen lajittelu on välttämätöntä lääketieteellisessä lapsettomuuden hoidossa ja kliinisessä tutkimuksessa, ja sitä suositaan perinteisiin menetelmiin verrattuna, jotka ovat aikaa ja työtä vaativia ja voivat vaarantaa siittiöiden morfologian ja rakenteellisen eheyden. Tähän mennessä ei kuitenkaan ole tehty tutkimuksia kanojen sukupuolielinten eritteiden vaikutuksesta siittiöiden liikkuvuuteen.
Riippumatta mekanismista, joka ylläpitää siittiöiden varastointia SST:hen, monet tutkijat ovat havainneet, että siittiöt agglutinoituvat päätä vasten kanojen 9 ja 10, viiriäisten 2 ja kalkkunoiden 11 SST:ssä muodostaen agglutinoituneita siittiökimpuja. Kirjoittajat ehdottavat, että tämän agglutinaation ja siittiöiden pitkäaikaisen varastoinnin SST:ssä välillä on yhteys.
Tingari ja Lake12 raportoivat vahvasta yhteydestä kanan siittiöiden vastaanottorauhasissa olevien siittiöiden välillä ja kyseenalaistivat, agglutinoivatko lintujen siittiöt samalla tavalla kuin nisäkkäiden siittiöt. He uskovat, että siittiöiden väliset syvät yhteydet siemenjohtimessa saattavat johtua stressistä, joka johtuu suuresta siittiömäärästä pienessä tilassa.
Kun arvioidaan siittiöiden käyttäytymistä tuoreilla lasilevyillä, voidaan havaita ohimeneviä agglutinaation merkkejä, erityisesti siemennesepisaroiden reunoilla. Agglutinaatiota kuitenkin usein häiritsi jatkuvaan liikkeeseen liittyvä pyörimisliike, mikä selittää ilmiön ohimenevän luonteen. Tutkijat huomasivat myös, että kun laimennusainetta lisättiin siemennesteeseen, ilmestyi pitkänomaisia, "lankamaisia" soluaggregaatteja.
Varhaisia ​​yrityksiä matkia siittiöitä tehtiin poistamalla ohut lanka roikkuvasta pisarasta, jolloin siemenpisarasta työntyi esiin pitkänomainen siittiötä muistuttava vesikkeli. Siittiöt asettuivat välittömästi yhdensuuntaisesti vesikkelin sisään, mutta koko yksikkö katosi nopeasti 3D-rajoituksen vuoksi. Siksi siittiöiden agglutinaation tutkimiseksi on välttämätöntä tarkkailla siittiöiden liikkuvuutta ja käyttäytymistä suoraan eristetyissä siittiöiden varastoputkissa, mikä on vaikea saavuttaa. Siksi on tarpeen kehittää laite, joka matkii siittiöitä siittiöiden liikkuvuuden ja agglutinaatiokäyttäytymisen tutkimusten tukemiseksi. Brillard ym.13 raportoivat, että siittiöiden varastoputkien keskimääräinen pituus aikuisilla poikasilla on 400–600 µm, mutta jotkut varastoputket voivat olla jopa 2000 µm pitkiä. Mero ja Ogasawara14 jakoivat siemenrauhaset suurentuneisiin ja suurentumattomiin siittiöiden varastoputkiin, jotka molemmat olivat samanpituisia (~500 µm) ja kaulan leveyksiä (~38 µm), mutta putkien keskimääräinen luumenin halkaisija oli 56,6 ja 56,6 µm, vastaavasti 11,2 μm. Tässä tutkimuksessa käytimme mikrofluidilaitetta, jonka kanavan koko oli 200 µm × 20 µm (L × K) ja jonka poikkileikkaus on jonkin verran lähellä monistetun siemenrauhasen poikkileikkausta. Lisäksi tutkimme siittiöiden liikkuvuutta ja agglutinaatiokäyttäytymistä virtaavassa nesteessä, mikä on yhdenmukaista Foremanin hypoteesin kanssa, jonka mukaan siemenrauhasten epiteelisolujen tuottama neste pitää siittiöt luumenissa vastavirtaan (reologiseen) suuntaan.
Tämän tutkimuksen tavoitteena oli ratkaista siittiöiden liikkuvuuden havainnointiin munanjohtimessa liittyvät ongelmat ja välttää siittiöiden reologian ja käyttäytymisen tutkimiseen dynaamisessa ympäristössä liittyvät vaikeudet. Tutkimuksessa käytettiin mikrofluidilaitetta, joka simuloi siittiöiden liikkuvuutta kanan sukupuolielimissä luomalla hydrostaattista painetta.
Kun pisara laimennettua siittiönäytettä (1:40) ladattiin mikrokanavalaitteeseen, voitiin tunnistaa kahden tyyppistä siittiöiden liikkuvuutta (eristetyt siittiöt ja sitoutuneet siittiöt). Lisäksi siittiöt pyrkivät uimaan vastavirtaan (positiivinen reologia; video 1, 2). Vaikka siittiökimpuilla oli hitaampi nopeus kuin yksinäisillä siittiöillä (p < 0,001), ne lisäsivät positiivisen reotaksian omaavien siittiöiden prosenttiosuutta (p < 0,001; taulukko 2). Vaikka siittiökimpuilla oli hitaampi nopeus kuin yksinäisillä siittiöillä (p < 0,001), ne lisäsivät positiivisen reotaksian omaavien siittiöiden prosenttiosuutta (p < 0,001; taulukko 2). Хотя пучки сперматозоидов имели более низкую скорость, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), валоичив процент сперматозоидов, демонстрирующих положительный реотаксис (p < 0,001; таблица 2). Vaikka siittiöiden kimppujen nopeus oli pienempi kuin yksittäisten siittiöiden (p < 0,001), ne lisäsivät positiivisen reotaksian osoittavien siittiöiden prosenttiosuutta (p < 0,001; taulukko 2).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度（p < 0,001），但它们增加了显示阳性流变性的精子百分比（p < 0,001；表2）.尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 （p <0,001） ， 但 增加 了 增加 了 显珧 阳 显羺 阳百分比 (p <0,001 ； 2。。。。。。)））））） Хотя скорость пучков сперматозоидов была ниже, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), они уверматозоидов они увелинчем сперматозоидов с положительной реологией (p < 0,001; таблица 2). Vaikka siittiökimpujen liikkumisnopeus oli hitaampi kuin yksittäisten siittiöiden (p < 0,001), ne lisäsivät positiivisen reologian omaavien siittiöiden prosenttiosuutta (p < 0,001; taulukko 2).Yksittäisten siittiöiden ja siittiötassojen positiivisen reologian osuudeksi arvioidaan noin 53 % ja 85 %.
On havaittu, että sharkasi-kanojen siittiöt muodostavat heti siemensyöksyn jälkeen lineaarisia kimppuja, jotka koostuvat kymmenistä yksilöistä. Nämä kimput kasvavat pituudeltaan ja paksuudeltaan ajan myötä ja voivat pysyä in vitro useita tunteja ennen haihtumistaan ​​(video 3). Nämä rihmamaiset kimput ovat muodoltaan kuin echidna-siittiöt, jotka muodostuvat lisäkiveksen päähän. Sharkashi-kanan siemennesteen on havaittu agglutinoituvan voimakkaasti ja muodostavan verkkomaisen kimpun alle minuutissa keräämisen jälkeen. Nämä siemennestekeilat ovat dynaamisia ja pystyvät tarttumaan lähellä oleviin seiniin tai staattisiin esineisiin. Vaikka siittiökimput hidastavat siittiösolujen nopeutta, on selvää, että makroskooppisesti ne lisäävät niiden lineaarisuutta. Kimpujen pituus vaihtelee kimppuihin kerättyjen siittiöiden määrän mukaan. Kimvusta eristettiin kaksi osaa: alkuosa, joka sisälsi agglutinoituneen siittiön vapaan pään, ja loppuosa, joka sisälsi siittiön hännän ja koko distaalisen pään. Suurnopeuskameralla (950 fps) havaittiin kimpun alkuosassa agglutinoituneiden siittiöiden vapaita päitä, jotka vastaavat kimpun liikkeestä värähtelevän liikkeensä ansiosta ja vetävät loput siittiöt kimppuun kierteisellä liikkeellä (video 4). Pitkissä tupsuissa on kuitenkin havaittu, että joitakin vapaita siittiöiden päitä on kiinnittynyt runkoon ja tupsun päätyosa toimii siipien tavoin auttaen tupsun liikkumisessa.
Hitaassa nestevirtauksessa siittiökimput liikkuvat yhdensuuntaisesti toistensa kanssa, mutta ne alkavat olla päällekkäin ja tarttua kaikkeen liikkumattomaan, jotta virtaus ei huuhtoisi niitä pois virtausnopeuden kasvaessa. Kimput muodostuvat, kun kourallinen siittiösoluja lähestyy toisiaan, ne alkavat liikkua synkronisesti ja kiertyä toistensa ympärille ja tarttuvat sitten tahmeaan aineeseen. Kuvat 1 ja 2 osoittavat, kuinka siittiöt lähestyvät toisiaan muodostaen liitoskohdan, kun niiden hännät kiertyvät toistensa ympärille.
Tutkijat käyttivät hydrostaattista painetta nesteen virtauksen aikaansaamiseksi mikrokanavassa siittiöiden reologian tutkimiseksi. Käytetyn mikrokanavan koko oli 200 µm × 20 µm (L × K) ja pituus 3,6 µm. Säiliöiden välissä käytettiin mikrokanavia, joiden päihin oli kiinnitetty ruiskuja. Elintarvikeväriä käytettiin kanavien näkyvyyden parantamiseksi.
Sido yhdyskaapelit ja lisävarusteet seinään. Video kuvattiin faasikontrastimikroskoopilla. Jokaisen kuvan yhteydessä esitetään faasikontrastimikroskopia- ja kartoituskuvat. (A) Kahden virran välinen yhteys vastustaa virtausta kierukkaliikkeen vuoksi (punainen nuoli). (B) Putkikimpun ja kanavan seinämän välinen yhteys (punaiset nuolet), samalla kun ne ovat yhteydessä kahteen muuhun kimppuun (keltaiset nuolet). (C) Mikrofluidikanavan siittiökimput alkavat yhdistyä toisiinsa (punaiset nuolet) muodostaen siittiökimpujen verkon. (D) Siittiökimpujen verkoston muodostuminen.
Kun pisara laimennettua siittiötä ladattiin mikrofluidilaitteeseen ja virtaus syntyi, siittiösuihkun havaittiin liikkuvan virtauksen suuntaa vastaan. Kimput sopivat tiiviisti mikrokanavien seinämiä vasten, ja kimppujen alkuosan vapaat päät sopivat tiiviisti niitä vasten (video 5). Ne tarttuvat myös kaikkiin liikkumattomiin hiukkasiin, kuten roskiin, estääkseen virran viemästä niitä mennessään. Ajan myötä näistä kimpuista tulee pitkiä säikeitä, jotka vangitsevat muita yksittäisiä siittiöitä ja lyhyempiä kimppuja (video 6). Kun virtaus alkaa hidastua, pitkät siittiöriivet alkavat muodostaa siittiöriivien verkoston (video 7; kuva 2).
Suurella virtausnopeudella (V > 33 µm/s) lankojen spiraalimaiset liikkeet lisääntyvät, kun yritetään saada kiinni useita yksittäisiä siittiöiden kimppuja, jotka muodostavat kimppuja ja vastustavat paremmin virtauksen ajautumisvoimaa. Suurella virtausnopeudella (V > 33 µm/s) lankojen spiraalimaiset liikkeet lisääntyvät, kun yritetään saada kiinni useita yksittäisiä siittiöiden kimppuja, jotka muodostavat kimppuja ja vastustavat paremmin virtauksen ajautumisvoimaa. При высокой скорости потока (V > 33 мкм/с) спиралевидные движения нитей усиливаются, поскольку они пытаются отдельных сперматозоидов, образующих пучки, которые лучше противостоят дрейфующей силе потока. Suurilla virtausnopeuksilla (V > 33 µm/s) säikeiden kierteiset liikkeet lisääntyvät, kun ne yrittävät saada kiinni useita yksittäisiä siittiöitä muodostaen kimppuja, jotka kykenevät paremmin vastustamaan virtauksen ajautumisvoimaa.在高流速 (V > 33 µm/s)时，螺纹的螺旋运动增加，以试图捕捉许多形成束的单个精子，从而更好地抵抗流动的漂移力.在 高 流速 (v> 33 µm/s) 时 ， 的 螺旋 运动 增加 ， 以 试图 箭多 形成 束 束从而 更 地 抵抗 的 漂移力。。。。。。。。。. При высоких скоростях потока (V > 33 мкм/с) спиральное движение нитей увеличивается в попытке захватесть захватить моростях сперматозоидов, образующих пучки, чтобы лучше сопротивляться силам дрейфа потока. Suurilla virtausnopeuksilla (V > 33 µm/s) filamenttien kierteinen liike kasvaa, kun yritetään vangita useita yksittäisiä siittiöitä muodostaen kimppuja, jotta ne vastustaisivat paremmin virtauksen ajautumisvoimia.He yrittivät myös kiinnittää mikrokanavia sivuseiniin.
Siittiökimput tunnistettiin siittiöpäiden ja käpertyneiden häntien ryppäiksi valomikroskopialla (LM). Siittiökimpuissa, joissa on erilaisia ​​aggregaatteja, on tunnistettu myös kiertyneinä päinä ja siimaaggregaatteina, useina yhteen sulautuneina siittiöhäntiöinä, häntään kiinnittyneinä siittiöpäinä ja useina yhteen sulautuneina tummina esiintyvinä siittiöpäinä, joissa on taipuneita tumia. Läpäisyelektronimikroskopia (TEM). Pyyhkäisyelektronimikroskopia (SEM) osoitti, että siittiökimput olivat siittiöpäiden peittämiä aggregaatteja ja siittiöaggregaateissa näkyi kiinnittynyt verkosto kiertyneitä häntiä.
Siittiöiden morfologiaa ja ultrastruktuuria sekä siittiökimpujen muodostumista tutkittiin valomikroskopialla (puolileikkaus), pyyhkäisyelektronimikroskopialla (SEM) ja läpäisyelektronimikroskopialla (TEM). Siittiönäytteet värjättiin akridiinioranssilla ja tutkittiin epifluoresenssimikroskopialla.
Akridiinioranssilla värjätyt siittiönäytteet (kuva 3B) osoittivat, että siittiöiden päät olivat tarttuneet toisiinsa ja peittyneet eritteeseen, mikä johti suurten kimppujen muodostumiseen (kuva 3D). Siittiökimput koostuivat siittiöaggregaateista, joissa oli verkosto toisiinsa kiinnittyneitä häntiä (kuva 4A-C). Siittiökimput koostuvat useiden siittiöiden hännistä, jotka ovat tarttuneet toisiinsa (kuva 4D). Eritteet (kuva 4E, F) peittivät siittiökimppojen päitä.
Siittiökimpun muodostuminen Vaihekontrastimikroskopian ja akridiinioranssilla värjättyjen siittiönäytteiden avulla osoitettiin, että siittiöiden päät tarttuvat toisiinsa. (A) Varhainen siittiötupen muodostuminen alkaa siittiöstä (valkoinen ympyrä) ja kolmesta siittiöstä (keltainen ympyrä), spiraalin alkaessa hännästä ja päättyessä päähän. (B) Akridiinioranssilla värjätystä siittiönäytteestä otettu mikrovalokuva, jossa näkyvät toisiinsa kiinnittyneet siittiöpäät (nuolet). Vuode peittää pään/päät. Suurennus × 1000. (C) Suuren säteen kehittyminen virtauksen mukana mikrofluidikanavassa (käyttäen suurnopeuskameraa 950 fps:n nopeudella). (D) Akridiinioranssilla värjätyn siittiönäytteen mikrovalokuva, jossa näkyvät suuret tupsut (nuolet). Suurennus: × 200.
Siittiösuihkun pyyhkäisyelektronimikroskooppikuva ja akridiinioranssilla värjätty siittiönäytteen kuva. (A, B, D, E) ovat digitaalisia värillisiä pyyhkäisyelektronimikroskooppikuvia siittiöistä, ja C ja F ovat mikrokuvia akridiinioranssilla värjätyistä siittiönäytteistä, jotka osoittavat useiden siittiöiden kiinnittymisen pyrstön ympärille. (AC) Siittiöaggregaatit näkyvät kiinnittyneiden häntäverkostona (nuolet). (D) Useiden siittiöiden (liima-aineen kanssa, vaaleanpunainen ääriviiva, nuoli) kiinnittyminen hännän ympärille. (E ja F) Siittiöpäiden aggregaatit (osoittimet) peitettynä liima-aineella (osoittimet). Siittiöt muodostivat kimppuja, joissa oli useita pyörremäisiä rakenteita (F). (C) ×400 ja (F) ×200 suurennokset.
Läpäisyelektronimikroskopialla havaitsimme, että siittiökimpuissa oli kiinnittyneet hännät (kuva 6A, C), häntiin kiinnittyneet päät (kuva 6B) tai häntiin kiinnittyneet päät (kuva 6D). Kimpun siittiöiden päät ovat kaarevat ja niissä näkyy leikatussa kohdassa kaksi tuma-aluetta (kuva 6D). Viiltokimpussa siittiöillä oli kiertynyt pää, jossa oli kaksi tuma-aluetta ja useita siima-alueita (kuva 5A).
Digitaalinen värielektronimikroskooppikuva, joka näyttää siittiökimpun yhdistävät hännät ja siittiöiden päitä yhdistävän agglutinaatiomassan. (A) Suuren määrän siittiöitä kiinnittynyt häntä. Huomaa, miltä häntä näyttää sekä pysty- (nuoli) että vaakasuuntaisessa (nuoli) projektiossa. (B) Siittiön pää (nuoli) on kiinnittynyt häntään (nuoli). (C) Useita siittiöiden häntiä (nuolet) on kiinnittynyt toisiinsa. (D) Agglutinaatiomassa (AS, sininen) yhdistää neljä siittiöiden päätä (violetti).
Siittiöiden päiden havaitsemiseksi siittiökimpuissa, jotka olivat peittyneet eritteisiin tai kalvoihin (kuva 6B), käytettiin pyyhkäisyelektronimikroskopiaa, mikä osoitti, että siittiökimput olivat ankkuroituneet solunulkoiseen materiaaliin. Agglutinoitunut materiaali oli tiivistynyt siittiön päähän (meduusan pään kaltainen kokoonpano; kuva 5B) ja laajeni distaalisesti, jolloin se näytti kirkkaan keltaiselta fluoresenssimikroskopiassa akridiinioranssilla värjättynä (kuva 6C). Tämä aine on selvästi näkyvissä pyyhkäisymikroskoopissa ja sitä pidetään sideaineena. Puoliohuet leikkeet (kuva 5C) ja akridiinioranssilla värjätyt siittiönäytteet osoittivat siittiökimpuissa tiheästi pakkautuneita päitä ja kiertyneitä häntiä (kuva 5D).
Erilaisia ​​mikrovalokuvia, jotka esittävät siittiöiden päiden ja taittuneiden häntäkuvien aggregaatiota eri menetelmillä. (A) Siittiökimpun poikkileikkausdigitaalinen värielektronimikroskooppikuva, jossa näkyy kiertynyt siittiön pää, jossa on kaksiosainen tuma (sininen) ja useita siimoja (vihreä). (B) Digitaalinen väripyyhkäisyelektronimikroskooppikuva, jossa näkyy meduusan kaltaisten siittiöiden päiden rykelmä (nuolet), jotka näyttävät olevan peittyneitä. (C) Puoliohut leikkaus, jossa näkyy aggregoituneita siittiöiden päitä (nuolet) ja käpristyneitä häntiä (nuolet). (D) Akridiinioranssilla värjätyn siittiönäytteen mikrovalokuva, jossa näkyy siittiöiden päiden aggregaatteja (nuolet) ja kiertyneitä, kiinnittyneitä häntiä (nuolet). Huomaa, että siittiön pään peittää tahmea aine (S). (D) × 1000 suurennus.
Läpäisyelektronimikroskopialla (kuva 7A) havaittiin myös, että siittiöiden päät olivat vääntyneet ja tumat spiraalinmuotoisia, mikä vahvistettiin akridiinioranssilla värjätyillä ja fluoresenssimikroskopialla tutkituilla siittiönäytteillä (kuva 7B).
(A) Digitaalinen väriläpäisyelektronimikroskooppikuva ja (B) akridiinioranssilla värjätty siittiösolunäytteistys, jossa näkyvät kiertyneet päät ja siittiöpäiden ja -häntien kiinnittyminen toisiinsa (nuolet). (B) × 1000 suurennus.
Mielenkiintoinen havainto on, että Sharkazin siittiöt kasautuvat muodostaen liikkuvia rihmamaisia ​​kimppuja. Näiden kimppujen ominaisuudet auttavat meitä ymmärtämään niiden mahdollista roolia siittiöiden imeytymisessä ja varastoinnissa kudosnesteessä.
Parittelun jälkeen siittiöt menevät emättimeen ja käyvät läpi intensiivisen valintaprosessin, jonka tuloksena vain rajallinen määrä siittiöitä pääsee emätinputkeen15,16. Tähän mennessä mekanismit, joilla siittiöt pääsevät emätinputkeen ja poistuvat sieltä, ovat epäselviä. Siipikarjalla siittiöitä säilytetään emätinputkessa 2–10 viikkoa lajista riippuen6. Siemennesteen kunnosta emätinputkessa säilytyksen aikana on edelleen kiistaa. Ovatko ne liikkeessä vai levossa? Toisin sanoen, miten siittiöt säilyttävät asemansa emätinputkessa niin kauan?
Forman4 ehdotti, että munanjohtimen pysyminen munanjohtimessa (ST) ja sen poistuminen munanjohtimesta (ST) voitaisiin selittää siittiöiden liikkuvuudella. Kirjoittajat olettavat, että siittiöt säilyttävät asemansa uimalla SST:n epiteelin luomaa nestevirtausta vastaan ​​ja että siittiöt sinkoutuvat SST:stä, kun niiden nopeus laskee alle pisteen, jossa ne alkavat liikkua taaksepäin energian puutteen vuoksi. Zaniboni5 vahvisti akvaporiinien 2, 3 ja 9 läsnäolon SST:n epiteelisolujen apikaalisessa osassa, mikä voi epäsuorasti tukea Foremanin siittiöiden varastointimallia. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että lähes puolella Sharkashin siittiöistä on positiivinen reologia virtaavassa nesteessä ja että agglutinoituneet siittiökimput lisäävät positiivisen reologian omaavien siittiöiden määrää, vaikka agglutinaatio hidastaa niitä. Sitä, miten siittiöt kulkeutuvat linnun munanjohtinta pitkin hedelmöityskohtaan, ei täysin ymmärretä. Nisäkkäillä follikkelineste vetää puoleensa siittiöitä kemoattraktiivisesti. Kemoattraktanttien uskotaan kuitenkin ohjaavan siittiöitä lähestymään pitkiä matkoja7. Siksi siittiöiden kuljetuksesta vastaavat muut mekanismit. Siittiöiden kyvyn suunnistaa ja virrata parittelun jälkeen vapautuvaa munanjohtimen nestettä vasten on raportoitu olevan merkittävä tekijä siittiöiden kohdentamisessa hiirillä. Parker 17 ehdotti, että siittiöt ylittävät munanjohtimet uimalla sädekehän virtausta vastaan ​​linnuilla ja matelijoilla. Vaikka sitä ei ole kokeellisesti osoitettu linnuilla, Adolphi18 havaitsi ensimmäisenä, että lintujen siittiöt antavat positiivisia tuloksia, kun peitinlasin ja lasilevyn väliin luodaan ohut nestekerros suodatinpaperiliuskalla. Reologia. Hino ja Yanagimachi [19] asettivat hiiren munasarja-munajohtimet-kohtu -kompleksin perfuusiorenkaaseen ja injektoivat 1 µl mustetta kaulanalueelle visualisoidakseen nesteen virtauksen munanjohtimissa. He havaitsivat erittäin aktiivisen supistumis- ja rentoutumisliikkeen munanjohtimessa, jossa kaikki mustepallot liikkuivat tasaisesti kohti munanjohtimen ampullaa. Kirjoittajat korostavat munanjohtimen nesteen virtauksen merkitystä alemmista munanjohtimista ylempiin munanjohtimiin siittiöiden nousun ja hedelmöityksen kannalta. Brillard20 raportoi, että kanoilla ja kalkkunoilla siittiöt siirtyvät aktiivisella liikkeellä emättimen suuaukosta, jossa ne säilyvät, kohdun ja emättimen liitoskohtaan, jossa ne säilyvät. Tätä liikettä ei kuitenkaan vaadita kohdun ja emättimen liitoskohdan ja mahalaukun välillä, koska siittiöt kuljetetaan passiivisesti siirtymällä. Näiden aiempien suositusten ja tässä tutkimuksessa saatujen tulosten perusteella voidaan olettaa, että siittiöiden kyky liikkua ylävirtaan (reologia) on yksi ominaisuuksista, joihin valintaprosessi perustuu. Tämä määrittää siittiöiden kulun emättimen läpi ja niiden pääsyn emättimen tiiviiseen soluun säilytystä varten. Kuten Forman4 ehdotti, tämä voi myös helpottaa siittiöiden pääsyä emättimen tiiviiseen soluun ja sen elinympäristöön joksikin aikaa ja poistumista sieltä, kun niiden nopeus alkaa hidastua.
Toisaalta Matsuzaki ja Sasanami21 ehdottivat, että lintujen siittiöt käyvät läpi liikkuvuusmuutoksia lepotilasta liikkuvuuteen uroksen ja naaraan lisääntymiskanavissa. Paikallisten siittiöiden liikkuvuuden estymistä solukalvolla (SST) on ehdotettu selittämään siittiöiden pitkää säilytysaikaa ja sitten uusiutumista SST:stä poistumisen jälkeen. Hypoksisissa olosuhteissa Matsuzaki ym.1 raportoivat laktaatin runsasta tuotantoa ja vapautumista SST:ssä, mikä voi johtaa paikallisten siittiöiden liikkuvuuden estymiseen. Tässä tapauksessa siittiöiden reologian merkitys heijastuu siittiöiden valinnassa ja imeytymisessä, ei niiden varastoinnissa.
Siittiöiden agglutinaatiokuviota pidetään uskottavana selityksenä siittiöiden pitkälle säilytysajalle munanjohtimen luumenissa, koska tämä on yleinen siittiöiden säilymiskuvio siipikarjalla2,22,23. Bakst ym.2 havaitsivat, että useimmat siittiöt tarttuivat toisiinsa muodostaen kimppuja, ja yksittäisiä siittiöitä löydettiin harvoin viiriäisten munanjohtimen luumenista. Toisaalta Wen ym.24 havaitsivat kanojen munanjohtimen luumenissa enemmän hajallaan olevia siittiöitä ja vähemmän siittiötuppoja. Näiden havaintojen perusteella voidaan olettaa, että siittiöiden agglutinaatioalttius vaihtelee lintujen ja samassa siemennesteessä olevien siittiöiden välillä. Lisäksi Van Krey ym.9 ehdottivat, että agglutinoituneiden siittiöiden satunnainen irtoaminen on vastuussa siittiöiden asteittaisesta tunkeutumisesta munanjohtimen luumeniin. Tämän hypoteesin mukaan siittiöt, joilla on alhaisempi agglutinaatiokyky, tulisi poistaa ensin munanjohtimen luumenista. Tässä yhteydessä siittiöiden kyky agglutinoitua voi olla tekijä, joka vaikuttaa siittiökilpailun lopputulokseen likaisilla linnuilla. Lisäksi mitä kauemmin agglutinoituneet siittiöt dissosioituvat, sitä pidempään hedelmällisyys säilyy.
Vaikka siittiöiden agglutinaatiota ja agglutinaatiota kimpuiksi on havaittu useissa tutkimuksissa2,22,24, niitä ei ole kuvattu yksityiskohtaisesti niiden kinemaattisen havainnoinnin monimutkaisuuden vuoksi siemennesteenkestävässä laitteessa (SST). Siittiöiden agglutinaatiota on yritetty tutkia useita kertoja in vitro. Laajaa mutta ohimenevää agglutinaatiota havaittiin, kun ohut lanka poistettiin roikkuvasta siemenpisarasta. Tämä johtaa siihen, että pisarasta työntyy esiin pitkänomainen kupla, joka jäljittelee siemenrauhasta. 3D-rajoitusten ja lyhyiden tippukuivausaikojen vuoksi koko lohko rapistui nopeasti9. Tässä tutkimuksessa, jossa käytimme Sharkashi-kanoja ja mikrofluidisiruja, pystyimme kuvaamaan, miten nämä kimput muodostuvat ja miten ne liikkuvat. Siittiökimput muodostuivat heti siemennesteen keräämisen jälkeen, ja niiden havaittiin liikkuvan spiraalimaisesti, mikä osoittaa positiivista reologiaa virtauksessa. Lisäksi makroskooppisesti tarkasteltuna siittiökimpujen on havaittu lisäävän liikkuvuuden lineaarisuutta verrattuna eristettyihin siittiöihin. Tämä viittaa siihen, että siittiöiden agglutinaatio voi tapahtua ennen SST:n tunkeutumista ja että siittiöiden tuotanto ei rajoitu pienelle alueelle stressin vuoksi, kuten aiemmin on ehdotettu (Tingari ja Lake12). Tupsun muodostumisen aikana siittiöt uivat synkronisesti, kunnes ne muodostavat liitoskohdan, sitten niiden hännät kietoutuvat toistensa ympärille ja siittiön pää pysyy vapaana, mutta siittiön häntä ja distaalinen osa tarttuvat yhteen tahmean aineen avulla. Näin ollen nivelsiteen vapaa pää vastaa liikkeestä ja vetää mukanaan muuta nivelsidettä. Siittiökimpujen pyyhkäisyelektronimikroskopiassa näkyi kiinnittyneitä siittiöiden päitä, jotka olivat peittyneet runsaalla tahmealla materiaalilla, mikä viittaa siihen, että siittiöiden päät olivat kiinnittyneet lepokimppuihin, mikä on saattanut tapahtua varastointipaikan (SST) saavuttamisen jälkeen.
Kun siittiösolunäytteestä värjätään akridiinioranssi, siittiösolujen ympärillä oleva solunulkoinen liima-aine voidaan nähdä fluoresenssimikroskoopilla. Tämä aine mahdollistaa siittiökimpujen tarttumisen ympäröiviin pintoihin tai hiukkasiin, jotta ne eivät ajaudu ympäröivän virtauksen mukana. Havaintomme osoittavat siis siittiöiden kiinnittymisen roolin liikkuvien kimppujen muodossa. Niiden kyky uida vastavirtaan ja tarttua lähellä oleviin pintoihin antaa siittiöille mahdollisuuden pysyä pidempään solukalvossa.
Rothschild25 käytti hemosytometriakameraa tutkiakseen naudan siemennesteen kelluvaa jakautumista suspensiopisarassa ottamalla mikrovalokuvia kameran läpi, jonka mikroskoopin optinen akseli oli sekä pystysuora että vaakasuora. Tulokset osoittivat, että siittiöt tunsivat puoleensa siittiöitä kammion pintaa kohti. Kirjoittajat ehdottavat, että siittiöiden ja pinnan välillä saattaa olla hydrodynaamisia vuorovaikutuksia. Kun tämä otetaan huomioon yhdessä Sharkashi-kanan siemennesteen kyvyn kanssa muodostaa tahmeita tupsuja, se voi lisätä todennäköisyyttä, että siemenneste tarttuu SST:n seinämään ja säilyy pitkiä aikoja.
Bccetti ja Afzeliu26 raportoivat, että siittiöiden glykokalyksi on välttämätön sukusolujen tunnistamiseen ja agglutinaatioon. Forman10 havaitsi, että lintujen siemennesteen käsittely neuraminidaasilla hydrolyysi glykoproteiini-glykolipidipinnoitteissa heikensi hedelmällisyyttä vaikuttamatta siittiöiden liikkuvuuteen. Kirjoittajat ehdottavat, että neuraminidaasin vaikutus glykokalyksiin heikentää siittiöiden sitoutumista kohdun ja emättimen liitoskohdassa ja siten vähentää hedelmällisyyttä. Heidän havaintonsa eivät voi sivuuttaa mahdollisuutta, että neuraminidaasikäsittely voi vähentää siittiöiden ja munasolujen tunnistusta. Forman ja Engel10 havaitsivat, että hedelmällisyys heikkeni, kun kanoja siemennettiin intravaginaalisesti neuraminidaasilla käsitellyllä siemennesteellä. Neuraminidaasilla käsitellyillä siittiöillä tehty koeputkihedelmöitys ei kuitenkaan vaikuttanut hedelmällisyyteen verrattuna kontrollikanoihin. Kirjoittajat päättelivät, että muutokset siittiökalvon ympärillä olevassa glykoproteiini-glykolipidipinnoitteessa heikensivät siittiöiden hedelmöityskykyä heikentämällä siittiöiden sitoutumista kohdun ja emättimen liitoskohdassa, mikä puolestaan ​​lisäsi siittiöiden menetystä kohdun ja emättimen liitoskohdan nopeuden vuoksi, mutta ei vaikuta siittiöiden ja munasolujen tunnistukseen.
Kalkkunoilla Bakst ja Bauchan 11 löysivät pieniä vesikkeleitä ja kalvofragmentteja siemennesteen kalvosta ja havaitsivat, että jotkut näistä jyväsistä olivat fuusioituneet siittiökalvoon. Kirjoittajat ehdottavat, että nämä suhteet voivat vaikuttaa siittiöiden pitkäaikaiseen varastointiin siemennesteessä. Tutkijat eivät kuitenkaan täsmentäneet näiden hiukkasten lähdettä, olivatko ne CCT-epiteelisolujen erittämiä, miehen lisääntymisjärjestelmän tuottamia ja erittämiä vai itse siittiöiden tuottamia. Nämä hiukkaset ovat myös vastuussa agglutinaatiosta. Grützner ym. 27 raportoivat, että lisäkiveksen epiteelisolut tuottavat ja erittävät spesifistä proteiinia, jota tarvitaan yksihuokosisten siemenjuonteiden muodostumiseen. Kirjoittajat raportoivat myös, että näiden kimppujen leviäminen riippuu lisäkiveksen proteiinien vuorovaikutuksesta. Nixon ym. 28 havaitsivat, että sivuelimet erittävät proteiinia, hapanta kysteiinipitoista osteonektiiniä; SPARC osallistuu siittiötuppojen muodostumiseen lyhytnokkisilla piikkisiilillä ja vesinokkaeläimillä. Näiden säteiden sironta liittyy tämän proteiinin menetykseen.
Tässä tutkimuksessa elektronimikroskopialla tehdyt ultrastruktuurianalyysit osoittivat, että siittiöt olivat kiinnittyneet suureen määrään tiheää materiaalia. Näiden aineiden uskotaan olevan vastuussa agglutinaatiosta, joka tiivistyy kiinnittyneiden päiden väliin ja ympärille, mutta pienempinä pitoisuuksina hännän alueella. Oletamme, että tämä agglutinoiva aine erittyy miehen lisääntymisjärjestelmästä (lisäkives tai siemenjohdin) siemennesteen mukana, koska havaitsemme usein siemennesteen erottuvan imusolmukkeesta ja siemenplasmasta siemensyöksyn aikana. On raportoitu, että lintujen siittiöiden kulkiessa lisäkiveksen ja siemenjohtimen läpi ne käyvät läpi kypsymiseen liittyviä muutoksia, jotka tukevat niiden kykyä sitoutua proteiineihin ja hankkia plasman lemmaan liittyviä glykoproteiineja. Näiden proteiinien pysyvyys siittiöiden kalvoilla SST:ssä viittaa siihen, että nämä proteiinit voivat vaikuttaa siittiöiden kalvojen vakauteen 30 ja määrittää niiden hedelmällisyyden 31. Ahammad ym.32 raportoivat, että miehen lisääntymisjärjestelmän eri osista (kiveksistä distaaliseen siemenjohtimeen) saadut siittiöt osoittivat asteittaista elinkykyisyyden kasvua nestemäisissä säilytysolosuhteissa säilytyslämpötilasta riippumatta, ja kanojen elinkyky lisääntyy myös munanjohtimissa keinosiemennyksen jälkeen.
Sharkashi-kanan siittiötupsuilla on erilaisia ​​ominaisuuksia ja toimintoja kuin muilla lajeilla, kuten nokkasiilillä, vesinokkaeläimillä, metsähiirillä, peurarotilla ja marsuilla. Sharkasi-kanoilla siittiökimpujen muodostuminen hidasti niiden uintinopeutta verrattuna yksittäisiin siittiöihin. Nämä kimput kuitenkin lisäsivät reologisesti positiivisten siittiöiden prosenttiosuutta ja paransivat siittiöiden kykyä vakauttaa itsensä dynaamisessa ympäristössä. Tuloksemme vahvistavat siis aiemman ehdotuksen, jonka mukaan siittiöiden agglutinaatio SST:ssä liittyy siittiöiden pitkäaikaiseen varastointiin. Oletamme myös, että siittiöiden taipumus muodostaa tupsuja voi kontrolloida siittiöiden häviämisen nopeutta SST:ssä, mikä voi muuttaa siittiökilpailun lopputulosta. Tämän oletuksen mukaan alhaisen agglutinaatiokyvyn omaavat siittiöt vapauttavat SST:tä ensin, kun taas korkean agglutinaatiokyvyn omaavat siittiöt tuottavat suurimman osan jälkeläisistä. Yksihuokosisten siittiökimpujen muodostuminen on hyödyllistä ja vaikuttaa vanhempi-lapsi-suhteeseen, mutta käyttää eri mekanismia. Nokkasiilillä ja vesinokkaeläimillä siittiöt ovat järjestäytyneet yhdensuuntaisesti toisiinsa nähden, mikä lisää säteen etenemisnopeutta. Nokkasiilojen kimput liikkuvat noin kolme kertaa nopeammin kuin yksittäiset siittiöt. Uskotaan, että tällaisten siittiötuppojen muodostuminen nokkasiiloilla on evolutiivinen sopeutuminen hallitsevuuden säilyttämiseksi, koska naaraat ovat siveetöntä ja parittelevat yleensä useiden koiraiden kanssa. Siksi eri siemennesteiden siittiöt kilpailevat kiivaasti munasolun hedelmöityksestä.
Sharkasi-kanojen agglutinoituneita siittiöitä on helppo visualisoida faasikontrastimikroskopialla, mitä pidetään edullisena, koska se mahdollistaa siittiöiden käyttäytymisen helpon tutkimisen in vitro. Mekanismi, jolla siittiötupen muodostuminen edistää lisääntymistä sharkasi-kanoilla, eroaa myös siitä, mitä havaitaan joillakin istukkaisilla nisäkkäillä, jotka edustavat yhteistyöhön perustuvaa siittiökäyttäytymistä, kuten metsähiirillä, joissa jotkut siittiöt pääsevät muniin auttaen muita sukua olevia yksilöitä saavuttamaan ja vahingoittamaan munia. todistaa itsesi. altruistinen käyttäytyminen. Itsehedelmöitys 34. Toinen esimerkki siittiöiden yhteistyöhön perustuvasta käyttäytymisestä löydettiin peurahiiristä, joissa siittiöt pystyivät tunnistamaan ja yhdistymään geneettisesti sukua oleviin siittiöihin ja muodostamaan yhteistyöryhmiä lisätäkseen nopeuttaan verrattuna toisiinsa liittymättömiin siittiöihin 35.
Tässä tutkimuksessa saadut tulokset eivät ole ristiriidassa Fomanin teorian kanssa siittiöiden pitkäaikaisesta varastoinnista munanjohtimen kanavassa (SST). Tutkijat raportoivat, että siittiöt jatkavat liikkumista SST:tä reunustavien epiteelisolujen virtauksessa pitkään, ja tietyn ajan kuluttua siittiöiden energiavarastot ehtyvät, mikä johtaa nopeuden hidastumiseen, mikä mahdollistaa pienimolekyylipainoisten aineiden poistumisen nesteen virtauksen mukana SST:n luumenista munanjohtimen onteloon. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että puolet yksittäisistä siittiöistä osoitti kykyä uida virtaavia nesteitä vasten, ja niiden tarttuminen kimppuun lisäsi niiden kykyä osoittaa positiivista reologiaa. Lisäksi tietomme ovat yhdenmukaisia ​​Matsuzakin ym. 1 tietojen kanssa, jotka raportoivat, että lisääntynyt laktaatin eritys SST:ssä voi estää siittiöiden liikkuvuutta. Tuloksemme kuvaavat kuitenkin siittiöiden liikkuvien nivelsiteiden muodostumista ja niiden reologista käyttäytymistä dynaamisessa ympäristössä mikrokanavassa pyrkiessään selvittämään niiden käyttäytymistä SST:ssä. Tuleva tutkimus voi keskittyä agglutinoivan aineen kemiallisen koostumuksen ja alkuperän määrittämiseen, mikä epäilemättä auttaa tutkijoita kehittämään uusia tapoja säilyttää nestemäistä siemennestettä ja pidentää hedelmällisyyden kestoa.
Tutkimukseen valittiin siittiöiden luovuttajiksi viisitoista 30 viikon ikäistä paljasniskaista uros sharkasi-lintua (homotsygoottinen dominantti; Na Na). Linnut kasvatettiin Ashitin yliopiston maataloustieteellisen tiedekunnan tutkimussiipikarjatilalla Ashitin kuvernoraatissa Egyptissä. Linnut pidettiin yksittäisissä häkeissä (30 x 40 x 40 cm), niille annettiin valo-ohjelma (16 tuntia valoa ja 8 tuntia pimeyttä) ja rehu, joka sisälsi 160 g raakaproteiinia, 2800 kcal metaboloituvaa energiaa ja 35 g kalsiumia kukin. 5 grammaa käytettävissä olevaa fosforia rehukiloa kohden.
Tietojen 36, 37 mukaan sperma kerättiin miehiltä vatsahieronnalla. Yhteensä 45 spermanäytettä kerättiin 15 mieheltä kolmen päivän aikana. Siemenneste (n = 15/vrk) laimennettiin välittömästi suhteessa 1:1 (v:v) Belsville Poultry Semen Diluent -liuoksella, joka sisältää kaliumdifosfaattia (1,27 g), natriumglutamaattimonohydraattia (0,867 g), fruktoosia (0,5 d), vedetöntä natriumasetaattia (0,43 g), tris(hydroksimetyyli)aminometaania (0,195 g), kaliumsitraattimonohydraattia (0,064 g), kaliumonofosfaattia (0,065 g), magnesiumkloridia (0,034 g) ja H2O:ta (100 ml), pH = 7,5, osmolaarisuus 333 mOsm/kg38. Laimennetut siemennestenäytteet tutkittiin ensin valomikroskoopilla siemennesteen laadun (kosteuden) varmistamiseksi ja säilytettiin sitten vesihauteessa 37 °C:ssa, kunnes niitä käytettiin puolen tunnin kuluessa keräämisestä.
Siittiöiden kinematiikkaa ja reologiaa kuvataan mikrofluidististen laitteiden järjestelmän avulla. Siemennestenäytteet laimennettiin edelleen suhteessa 1:40 Beltsville Avian Semen Diluent -liuoksella, ladattiin mikrofluidistiseen laitteeseen (katso alla), ja kineettiset parametrit määritettiin aiemmin mikrofluidistista karakterisointia varten kehitetyllä tietokonepohjaisella siemennesteen analyysijärjestelmällä (CASA). Tutkimus siittiöiden liikkuvuudesta nestemäisissä väliaineissa (konetekniikan laitos, teknillinen tiedekunta, Assiutin yliopisto, Egypti). Lisäosan voi ladata osoitteesta: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39. Käyränopeus (VCL, μm/s), lineaarinen nopeus (VSL, μm/s) ja keskimääräinen lentoratanopeus (VAP, μm/s) mitattiin. Siittiöistä otettiin videoita käänteisellä Optika XDS-3 -vaihekontrastimikroskoopilla (40x objektiivilla), joka oli kytketty Tucson ISH1000 -kameraan 30 fps:n nopeudella 3 sekunnin ajan. Käytä CASA-ohjelmistoa tutkiaksesi vähintään kolmea aluetta ja 500 siittiön lentorataa näytettä kohden. Tallennettu video käsiteltiin itse tehdyllä CASA-ohjelmistolla. CASA-laajennuksen liikkuvuuden määritelmä perustuu siittiöiden uintinopeuteen verrattuna virtausnopeuteen, eikä se sisällä muita parametreja, kuten puolelta toiselle liikettä, koska tämän on havaittu olevan luotettavampi nesteen virtauksessa. Reologista liikettä kuvataan siittiösolujen liikkeenä nesteen virtaussuuntaa vastaan. Reologisia ominaisuuksia omaavat siittiöt jaettiin liikkuvien siittiöiden lukumäärällä; lepotilassa olevat ja konvektiivisesti liikkuvat siittiöt jätettiin laskennasta pois.
Kaikki käytetyt kemikaalit hankittiin Elgomhoria Pharmaceuticalsilta (Kairo, Egypti), ellei toisin mainita. Laite valmistettiin El-sherryn ym.40 kuvaamalla tavalla, joitakin muutoksia tehden. Mikrokanavien valmistukseen käytettyjä materiaaleja olivat lasilevyt (Howard Glass, Worcester, MA), SU-8-25 negatiivinen resisti (MicroChem, Newton, CA), diasetonialkoholi (Sigma Aldrich, Steinheim, Saksa) ja polyasetoni 0-184, Dow Corning, Midland, Michigan). Mikrokanavat valmistetaan pehmeällä litografialla. Ensin tulostettiin kirkas suojaava kasvonaamio halutulla mikrokanavakuviolla korkearesoluutioisella tulostimella (Prismatic, Kairo, Egypti ja Pacific Arts and Design, Markham, ON). Master-mallit tehtiin käyttäen lasilevyjä alustoina. Levyt puhdistettiin asetonissa, isopropanolissa ja deionisoidussa vedessä ja päällystettiin sitten 20 µm:n kerroksella SU8-25-lakkaa linkouspäällystyksellä (3000 rpm, 1 min). SU-8-kerrokset kuivattiin sitten varovasti (65 °C, 2 min ja 95 °C, 10 min) ja altistettiin UV-säteilylle 50 sekunnin ajan. Altistuksen jälkeen ne paistettiin 65 °C:ssa ja 95 °C:ssa 1 minuutin ja 4 minuutin ajan valotettujen SU-8-kerrosten silloittamiseksi, minkä jälkeen ne kehitettiin diasetonialkoholissa 6,5 ​​minuutin ajan. Vohvelit paistettiin kovassa uunissa (200 °C, 15 min) SU-8-kerroksen jähmettämiseksi entisestään.
PDMS valmistettiin sekoittamalla monomeeri ja kovete painosuhteessa 10:1, minkä jälkeen seos poistettiin kaasuista tyhjiöeksikaattorissa ja kaadettiin SU-8-päärungolle. PDMS kovetettiin uunissa (120 °C, 30 min), minkä jälkeen kanavat leikattiin irti, erotettiin masterista ja rei'itettiin, jotta putket voitiin kiinnittää mikrokanavan sisään- ja ulostuloon. Lopuksi PDMS-mikrokanavat kiinnitettiin pysyvästi mikroskooppilasilevyihin käyttämällä kannettavaa koronaprosessoria (Electro-Technic Products, Chicago, IL) muualla kuvatulla tavalla. Tässä tutkimuksessa käytetyn mikrokanavan mitat ovat 200 µm × 20 µm (L × K) ja pituus 3,6 cm.
Mikrokanavan sisällä hydrostaattisen paineen aiheuttama nestevirtaus saavutetaan pitämällä nestepinta tulosäiliössä poistosäiliön korkeuseron Δh39 yläpuolella (kuva 1).
jossa f on kitkakerroin, joka määritellään kaavalla f = C/Re laminaarivirtaukselle suorakaiteen muotoisessa kanavassa, jossa C on vakio, joka riippuu kanavan sivusuhteesta, L on mikrokanavan pituus, Vav on keskimääräinen nopeus mikrokanavan sisällä, Dh on kanavan hydraulinen halkaisija ja g – painovoiman kiihtyvyys. Tätä yhtälöä käyttämällä keskimääräinen kanavan nopeus voidaan laskea seuraavalla yhtälöllä: