Hvala vam što ste posjetili Nature.com. Verzija preglednika koju koristite ima ograničenu podršku za CSS. Za najbolje iskustvo preporučujemo da koristite ažurirani preglednik (ili onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru). U međuvremenu, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, prikazivat ćemo stranicu bez stilova i JavaScripta.
Plodnost ptica ovisi o njihovoj sposobnosti pohranjivanja dovoljno održive sperme dulje vrijeme u tubulima za pohranu sperme (SST). Točan mehanizam kojim spermatozoidi ulaze, borave u i izlaze iz SST-a ostaje kontroverzan. Sperma kokoši šarkasija pokazala je visoku sklonost aglutinaciji, formirajući pokretne nitaste snopove koji sadrže mnogo stanica. Zbog teškoće promatranja pokretljivosti i ponašanja spermija u neprozirnom jajovodu, koristili smo mikrofluidni uređaj s presjekom mikrokanala sličnim onome spermatozoida kako bismo proučili aglutinaciju i pokretljivost spermatozoida. Ova studija raspravlja o tome kako se snopovi spermija formiraju, kako se kreću i njihovoj mogućoj ulozi u produljenju boravka spermija u SST-u. Istražili smo brzinu spermija i reološko ponašanje kada je protok tekućine generiran unutar mikrofluidnog kanala hidrostatskim tlakom (brzina protoka = 33 µm/s). Spermatozoidi imaju tendenciju plivati ​​protiv struje (pozitivna reologija), a brzina snopa spermatozoida značajno je smanjena u usporedbi s pojedinačnim spermatozoidima. Opaženo je da se snopovi spermija kreću spiralno te povećavaju duljinu i debljinu kako se regrutira više pojedinačnih spermija. Snopovi spermija su uočeni kako se približavaju i prianjaju uz bočne stijenke mikrofluidnih kanala kako bi se izbjeglo da ih brzina protoka fluida prelazi 33 µm/s. Snopovi spermija su uočeni kako se približavaju i prianjaju uz bočne stijenke mikrofluidnih kanala kako bi se izbjeglo da ih brzina protoka fluida prelazi 33 µm/s. Uočeno je da se spermatozoidi približavaju i prilijepaju bočnim stenama mikrofluidnih kanala, kako bi se izbjeglo smetanje s brzinom protoka tekućine> 33 mkm/s. Uočeno je da se snopovi spermija približavaju i prianjaju uz bočne stijenke mikrofluidnih kanala kako bi izbjegli da ih odnese pri brzinama protoka tekućine >33 µm/s.观察到精子束接近并粘附在微流体通道的侧壁上，以避免被流体流速> 33 µm/s 扫过。33 µm/s 扫过。 Napomenuto je da se spermatozoidi približavaju i priliježu bočnim stenama mikrožidkostnog kanala, kako bi se izbjeglo smetanje protoka tekućine brzinom > 33 mkm/s. Uočeno je kako se snopovi spermija približavaju i prianjaju uz bočne stijenke mikrofluidnog kanala kako bi izbjegli da ih odnese protok tekućine brzinom većom od 33 µm/s.Skenirajuća i transmisijska elektronska mikroskopija otkrile su da su snopovi spermija bili poduprti obilnim gustim materijalom. Dobiveni podaci pokazuju jedinstvenu pokretljivost spermija pilića Sharkazi, kao i sposobnost spermija da se aglutiniraju i formiraju mobilne snopove, što doprinosi boljem razumijevanju dugotrajnog skladištenja spermija u SMT-u.
Da bi se postigla oplodnja kod ljudi i većine životinja, spermiji i jaja moraju stići na mjesto oplodnje u pravo vrijeme. Stoga se parenje mora dogoditi prije ili u vrijeme ovulacije. S druge strane, neki sisavci, poput pasa, kao i vrste koje nisu sisavci, poput kukaca, riba, gmazova i ptica, pohranjuju spermu u svojim reproduktivnim organima dulje vrijeme dok im jaja nisu spremna za oplodnju (asinkrona oplodnja 1 ). Ptice su u stanju održati održivost spermija sposobnih za oplodnju jaja 2-10 tjedana2.
Ovo je jedinstvena značajka koja razlikuje ptice od drugih životinja, jer pruža visoku vjerojatnost oplodnje nakon jedne inseminacije tijekom nekoliko tjedana bez istovremenog parenja i ovulacije. Glavni organ za pohranu sperme, nazvan tubul za pohranu sperme (SST), nalazi se u unutarnjim naborima sluznice na uterovaginalnom spoju. Do danas mehanizmi kojima spermiji ulaze, borave i izlaze iz banke sperme nisu u potpunosti shvaćeni. Na temelju prethodnih studija postavljene su mnoge hipoteze, ali nijedna od njih nije potvrđena.
Forman4 je pretpostavio da spermatozoidi održavaju svoje prebivalište u SST šupljini kontinuiranim oscilatornim kretanjem suprotno od smjera protoka tekućine kroz proteinske kanale smještene na SST epitelnim stanicama (reologija). ATP se iscrpljuje zbog stalne flagelarne aktivnosti potrebne za održavanje spermija u SST lumenu, a pokretljivost na kraju opada sve dok spermiji ne budu izneseni iz banke sperme protokom tekućine i ne započnu novo putovanje niz uzlazni jajovod kako bi oplodili spermij. Jajna stanica (Forman4). Ovaj model pohrane sperme podupire detekcija akvaporina 2, 3 i 9 prisutnih u SST epitelnim stanicama imunocitokemijom. Do danas nedostaju studije o reologiji pilećeg sjemena i njegovoj ulozi u pohranjivanju SST-a, vaginalnoj selekciji spermija i konkurenciji spermija. Kod pilića sperma ulazi u vaginu nakon prirodnog parenja, ali više od 80% spermija izbacuje se iz vagine ubrzo nakon parenja. To sugerira da je vagina primarno mjesto za selekciju spermija kod ptica. Osim toga, zabilježeno je da manje od 1% spermija oplođenih u vagini završi u SST-ovima2. Kod umjetne oplodnje pilića u vagini, broj spermija koji dosegnu SST ima tendenciju povećanja 24 sata nakon oplodnje. Do sada mehanizam selekcije spermija tijekom ovog procesa nije jasan, a pokretljivost spermija može igrati važnu ulogu u unosu spermija u SST. Zbog debelih i neprozirnih stijenki jajovoda, teško je izravno pratiti pokretljivost spermija u jajovodima ptica. Stoga nam nedostaje osnovno znanje o tome kako spermatozoidi prelaze u SST nakon oplodnje.
Reologija je nedavno prepoznata kao važan faktor koji kontrolira transport spermija u genitalijama sisavaca. Na temelju sposobnosti pokretnih spermija da migriraju u suprotnom smjeru, Zaferani i suradnici8 koristili su corra mikrofluidni sustav za pasivnu izolaciju pokretnih spermija iz uzoraka sjemena. Ova vrsta sortiranja sjemena ključna je za medicinsko liječenje neplodnosti i klinička istraživanja te se preferira u odnosu na tradicionalne metode koje su dugotrajne i naporne te mogu ugroziti morfologiju i strukturni integritet spermija. Međutim, do danas nisu provedene studije o utjecaju sekreta iz genitalnih organa pilića na pokretljivost spermija.
Bez obzira na mehanizam koji održava spermu pohranjenom u SST-u, mnogi istraživači su primijetili da se rezidualni spermatozoidi aglutiniraju glava uz glavu u SST-u pilića 9, 10, prepelica 2 i purana 11 kako bi formirali aglutinirane snopiće sperme. Autori sugeriraju da postoji veza između ove aglutinacije i dugotrajnog pohranjivanja spermija u SST-u.
Tingari i Lake12 izvijestili su o snažnoj povezanosti između spermija u žlijezdi koja prima spermu kod kokoši te su doveli u pitanje aglutiniraju li ptičji spermatozoidi na isti način kao i spermatozoidi sisavaca. Vjeruju da duboke veze između spermija u sjemenovodu mogu biti posljedica stresa uzrokovanog prisutnošću velikog broja spermija u malom prostoru.
Prilikom procjene ponašanja spermija na svježe visećim staklenim pločicama mogu se vidjeti prolazni znakovi aglutinacije, posebno na rubovima kapljica sjemena. Međutim, aglutinaciju je često poremetilo rotacijsko djelovanje povezano s kontinuiranim kretanjem, što objašnjava prolaznu prirodu ovog fenomena. Istraživači su također primijetili da su se, kada se razrjeđivač doda u sjeme, pojavili izduženi stanični agregati nalik nitima.
Rani pokušaji oponašanja spermatozoida učinjeni su uklanjanjem tanke žice iz viseće kapi, što je rezultiralo izduženom vezikulom nalik spermiju koji je stršio iz kapi sjemena. Spermatozoidi su se odmah poredali paralelno unutar vezikule, ali cijela jedinica je brzo nestala zbog 3D ograničenja. Stoga je za proučavanje aglutinacije spermatozoida potrebno izravno promatrati pokretljivost i ponašanje spermatozoida u izoliranim tubulima za pohranu sperme, što je teško postići. Stoga je potrebno razviti instrument koji oponaša spermatozoide kako bi se podržale studije pokretljivosti i ponašanja aglutinacije spermija. Brillard i sur.13 izvijestili su da je prosječna duljina tubula za pohranu sperme kod odraslih pilića 400–600 µm, ali neki SST-ovi mogu biti dugi i do 2000 µm. Mero i Ogasawara14 podijelili su sjemenske žlijezde na povećane i neuvećane tubule za pohranu spermija, koje su obje bile iste duljine (~500 µm) i širine vrata (~38 µm), ali prosječni promjer lumena tubula bio je 56,6 odnosno 56,6 µm, odnosno 11,2 μm. U ovoj studiji koristili smo mikrofluidni uređaj s veličinom kanala 200 µm × 20 µm (Š × V), čiji je presjek donekle blizak onome pojačanog SST-a. Osim toga, ispitali smo pokretljivost spermija i ponašanje aglutinacije u tekućoj tekućini, što je u skladu s Foremanovom hipotezom da tekućina koju proizvode epitelne stanice SST-a drži spermije u lumenu u protustrujnom (reološkom) smjeru.
Cilj ove studije bio je prevladati probleme promatranja pokretljivosti spermija u jajovodu i izbjeći poteškoće proučavanja reologije i ponašanja spermija u dinamičnom okruženju. Korišten je mikrofluidni uređaj koji stvara hidrostatski tlak za simulaciju pokretljivosti spermija u genitalijama pileta.
Kada je kap razrijeđenog uzorka sperme (1:40) unesena u mikrokanalni uređaj, mogle su se identificirati dvije vrste pokretljivosti spermija (izolirani spermiji i vezani spermiji). Osim toga, spermiji su imali tendenciju plivati ​​protiv struje (pozitivna reologija; video 1, 2). Iako su snopovi spermija imali nižu brzinu od brzine usamljenih spermija (p < 0,001), povećali su postotak spermija koji pokazuju pozitivnu reotaksiju (p < 0,001; Tablica 2). Iako su snopovi spermija imali nižu brzinu od brzine usamljenih spermija (p < 0,001), povećali su postotak spermija koji pokazuju pozitivnu reotaksiju (p < 0,001; Tablica 2). Iako su pukotine spermatozoida imale nižu brzinu nego kod pojedinačnih spermatozoida (p < 0,001), povećale su postotak spermatozoida, pokazujući pozitivnu reotaksu (p < 0,001; tablica 2). Iako su snopovi spermatozoida imali nižu brzinu od brzine pojedinačnih spermatozoida (p < 0,001), povećali su postotak spermatozoida koji pokazuju pozitivnu reotaksiju (p < 0,001; Tablica 2).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度（p < 0,001，但它们增加了显示阳性流变性的精子百分比（p < 0,001；表2）。尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 （p <0,001） ， 但 增加 了 显示 阳性 流变性 精子百分比 （p <0,001 ； 2。。。。。。））)）)) Iako je brzina punjenja spermatozoida bila niža od one kod pojedinačnih spermatozoida (p < 0,001), oni su povećali postotak spermatozoida s pozitivnom reologijom (p < 0,001; tablica 2). Iako je brzina snopića spermija bila niža od brzine pojedinačnih spermija (p < 0,001), povećali su postotak spermija s pozitivnom reologijom (p < 0,001; Tablica 2).Pozitivna reologija za pojedinačne spermije i čuperke procjenjuje se na približno 53% odnosno 85%.
Uočeno je da spermatozoidi kokoši sharkashi odmah nakon ejakulacije formiraju linearne snopove, koji se sastoje od desetaka jedinki. Ti se čuperci s vremenom povećavaju u duljini i debljini te mogu ostati in vitro nekoliko sati prije nego što se rasprše (video 3). Ovi nitasti snopovi oblikovani su poput spermatozoida echidna koji se formiraju na kraju epididimisa. Utvrđeno je da sperma kokoši sharkashi ima visoku sklonost aglutinaciji i formiranju mrežastog snopa za manje od jedne minute nakon sakupljanja. Ove zrake su dinamične i sposobne su se zalijepiti za bilo koje obližnje stijenke ili statične predmete. Iako snopovi spermija smanjuju brzinu spermija, jasno je da makroskopski povećavaju njihovu linearnost. Duljina snopova varira ovisno o broju spermija prikupljenih u snopovima. Izolirana su dva dijela snopa: početni dio, uključujući slobodnu glavu aglutiniranog spermija, i terminalni dio, uključujući rep i cijeli distalni kraj spermija. Pomoću kamere velike brzine (950 fps), u početnom dijelu snopa uočene su slobodne glave aglutiniranih spermija, odgovorne za kretanje snopa zbog svog oscilatornog gibanja, povlačeći preostale u snop spiralnim gibanjem (Video 4). Međutim, kod dugih čuperaka uočeno je da su se neke slobodne glave spermija prilijepile za tijelo, a završni dio čuperka djeluje kao lopatice koje pomažu u pokretanju čuperka.
Dok su u sporom toku tekućine, snopovi spermija kreću se paralelno jedan s drugim, međutim, počinju se preklapati i lijepiti za sve što miruje, kako ih ne bi odnio trenutni tok kako se brzina protoka povećava. Snopovi se formiraju kada se nekoliko spermija približi jedan drugome, počnu se kretati sinkronizirano i omotavati jedan oko drugoga, a zatim se lijepe za ljepljivu tvar. Slike 1 i 2 prikazuju kako se spermiji približavaju jedan drugome, formirajući spoj dok se repovi omotavaju jedan oko drugoga.
Istraživači su primijenili hidrostatski tlak kako bi stvorili protok tekućine u mikrokanalu kako bi proučavali reologiju sperme. Korišten je mikrokanal veličine 200 µm × 20 µm (Š × V) i duljine 3,6 µm. Između spremnika korišteni su mikrokanali sa štrcaljkama pričvršćenim na krajeve. Kako bi kanali bili vidljiviji, korištena je prehrambena boja.
Pričvrstite međusobne kabele i pribor na zid. Video je snimljen faznokontrastnim mikroskopom. Uz svaku sliku prikazane su slike faznokontrastne mikroskopije i mapiranja. (A) Veza između dva toka opire se protoku zbog spiralnog gibanja (crvena strelica). (B) Veza između snopa cijevi i stijenke kanala (crvene strelice), istovremeno su povezani s dva druga snopa (žute strelice). (C) Snopovi spermija u mikrofluidnom kanalu počinju se međusobno spajati (crvene strelice), tvoreći mrežu snopova spermija. (D) Formiranje mreže snopova spermija.
Kada je kap razrijeđene sperme ubačena u mikrofluidni uređaj i stvoren je protok, uočeno je da se snop sperme kreće suprotno od smjera protoka. Snopovi čvrsto prianjaju uz stijenke mikrokanala, a slobodne glave u početnom dijelu snopova čvrsto prianjaju uz njih (video 5). Također se lijepe za sve nepokretne čestice na svom putu, poput krhotina, kako bi se oduprle odnošenju strujom. S vremenom, ovi čuperci postaju dugi filamenti koji hvataju druge pojedinačne spermatozoide i kraće čuperke (video 6). Kako se protok počinje usporavati, dugi redovi spermija počinju formirati mrežu linija spermija (video 7; slika 2).
Pri velikoj brzini protoka (V > 33 µm/s), spiralni pokreti niti se povećavaju u pokušaju hvatanja što više pojedinačnih snopova spermija koji tvore bolje otporne sili zanošenja protoka. Pri velikoj brzini protoka (V > 33 µm/s), spiralni pokreti niti se povećavaju u pokušaju hvatanja što više pojedinačnih snopova spermija koji tvore bolje otporne sili zanošenja protoka. Pri visokoj brzini protoka (V > 33 mkm/s) spiralne pokrete nitej usilivaju, budući da oni pokušavaju uzeti mnoštvo pojedinačnih spermatozoida, koji formiraju pukotine, koji se bolje suprotstavljaju drejfujućem silnom toku. Pri visokim brzinama protoka (V > 33 µm/s), spiralni pokreti niti se povećavaju dok pokušavaju uhvatiti mnogo pojedinačnih spermija koji formiraju snopove koji se bolje odupiru sili zanošenja protoka.在高流速 (V > 33 µm/s)时，螺纹的螺旋运动增加，以试图捕捉许多形成束的单个精子，从而更好地抵抗流动的漂移力。在 高 流速 (v> 33 µm/s) 时 ， 的 螺旋 运动 增加 ， 以 试图 许多 形成 束 单 个 精子 ，从而 更 地 抵抗 的 漂移力。。。。。。。。。 Pri velikim brzinama protoka (V > 33 mkm/s) spiralno kretanje nitej povećava se u pokušaju zahvaćanja mnoštva pojedinačnih spermatozoida koji stvaraju pukotine da bi se bolje suprotstavili silama protoka drejfa. Pri visokim brzinama protoka (V > 33 µm/s), spiralno kretanje filamenata se povećava u pokušaju hvatanja više pojedinačnih spermatozoida koji tvore snopove kako bi se bolje oduprli silama zanošenja protoka.Također su pokušali pričvrstiti mikrokanale na bočne stijenke.
Snopovi spermija identificirani su kao nakupine glava spermija i uvijenih repova pomoću svjetlosne mikroskopije (LM). Snopovi spermija s različitim agregatima također su identificirani kao uvijene glave i flagelarni agregati, višestruki spojeni repovi spermija, glave spermija pričvršćene za rep i glave spermija sa savijenim jezgrama kao višestruke spojene jezgre. transmisijska elektronska mikroskopija (TEM). Skenirajuća elektronska mikroskopija (SEM) pokazala je da su snopovi spermija bili obaleni agregati glava spermija, a agregati spermija pokazivali su pričvršćenu mrežu omotanih repova.
Morfologija i ultrastruktura spermija, formiranje snopića spermija proučavani su svjetlosnom mikroskopijom (polovični presjek), skenirajućom elektronskom mikroskopijom (SEM) i transmisijom elektronskom mikroskopijom (TEM), razmazi sperme obojeni su akridin oranžom i pregledani epifluorescentnom mikroskopijom.
Bojenje razmaza sperme akridinskim narančastim (slika 3B) pokazalo je da su glave spermija bile slijepljene i prekrivene sekretornim materijalom, što je dovelo do stvaranja velikih čuperaka (slika 3D). Snopovi spermija sastojali su se od agregata spermija s mrežom pričvršćenih repova (slika 4A-C). Snopovi spermija sastavljeni su od repova mnogih spermija slijepljenih zajedno (slika 4D). Sekreti (slika 4E,F) prekrivali su glave snopova spermija.
Formiranje snopa spermija Korištenjem faznokontrastne mikroskopije i razmaza sperme obojenih akridin narančastom bojom, pokazano je da se glave spermija lijepe zajedno. (A) Rano formiranje čuperaka sperme započinje s jednim spermijem (bijeli krug) i tri spermija (žuti krug), pri čemu spirala počinje na repu, a završava na glavi. (B) Fotomikrografija razmaza sperme obojenog akridin narančastom bojom koja prikazuje prianjajuće glave spermija (strelice). Iscjedak prekriva glavu(e). Uvećanje × 1000. (C) Razvoj velikog snopa prenesenog protokom u mikrofluidnom kanalu (korištenjem brze kamere pri 950 fps). (D) Mikrografija razmaza sperme obojenog akridin narančastom bojom koja prikazuje velike čuperke (strelice). Uvećanje: ×200.
Skenirajuća elektronska mikrografija snopa sperme i razmaza sperme obojenog akridin narančastom bojom. (A, B, D, E) su digitalne skenirajuće elektronske mikrografije spermatozoida u boji, a C i F su mikrografije razmaza sperme obojenih akridin narančastom bojom koje prikazuju pričvršćivanje više spermija koji omotavaju repnu mrežu. (AC) Agregati spermija prikazani su kao mreža pričvršćenih repova (strelice). (D) Prianjanje nekoliko spermija (s ljepljivom tvari, ružičasti obris, strelica) koji se omotavaju oko repa. (E i F) Agregati glave spermija (pokazivači) prekriveni ljepljivim materijalom (pokazivači). Spermatozoidi su formirali snopove s nekoliko struktura nalik vrtlogu (F). (C) ×400 i (F) ×200 uvećanja.
Pomoću transmisijske elektronske mikroskopije otkrili smo da snopovi spermija imaju pričvršćene repove (slika 6A, C), glave pričvršćene na repove (slika 6B) ili glave pričvršćene na repove (slika 6D). Glave spermija u snopu su zakrivljene, a u presjeku prikazuju dvije nuklearne regije (slika 6D). U snopu incizije, spermatozoidi su imali uvijenu glavu s dvije nuklearne regije i više flagelarnih regija (slika 5A).
Digitalna elektronska mikrografija u boji koja prikazuje spojne repove u snopu spermija i aglutinirajući materijal koji spaja glave spermija. (A) Pričvršćeni rep velikog broja spermija. Obratite pažnju na to kako rep izgleda i u portretnoj (strelica) i u pejzažnoj (strelica) projekciji. (B) Glava (strelica) spermija spojena je s repom (strelica). (C) Nekoliko repova spermija (strelice) je pričvršćeno. (D) Aglutinirajući materijal (AS, plavo) spaja četiri glave spermija (ljubičasto).
Skenirajuća elektronska mikroskopija korištena je za otkrivanje glava spermija u snopovima spermija prekrivenim sekretima ili membranama (slika 6B), što ukazuje na to da su snopovi spermija usidreni izvanstaničnim materijalom. Aglutinirani materijal koncentriran je u glavi spermija (sklop nalik glavi meduze; slika 5B) i proširen distalno, dajući briljantno žuti izgled pod fluorescentnom mikroskopijom kada se boji akridin narančastom bojom (slika 6C). Ova tvar je jasno vidljiva pod skenirajućim mikroskopom i smatra se vezivom. Polutanki rezovi (slika 5C) i razmazi sperme obojeni akridin narančastom bojom pokazali su snopove spermija koji sadrže gusto zbijene glave i uvijene repove (slika 5D).
Različite fotomikrografije koje prikazuju agregaciju glava spermija i presavijenih repova korištenjem različitih metoda. (A) Presječna digitalna transmisijska elektronska mikrografija snopa spermija koja prikazuje spiralno savijenu glavu spermija s dvodijelnom jezgrom (plavo) i nekoliko flagelarnih dijelova (zeleno). (B) Digitalna skenirajuća elektronska mikrografija u boji koja prikazuje skup glava spermija nalik meduzama (strelice) koje izgledaju prekrivene. (C) Polutanki presjek koji prikazuje agregirane glave spermija (strelice) i uvijene repove (strelice). (D) Mikrografija razmaza sperme obojenog akridinskim narančastom bojom koja prikazuje agregate glava spermija (strelice) i uvijene prianjajuće repove (strelice). Treba napomenuti da ljepljiva tvar (S) prekriva glavu spermija. (D) × 1000 uvećanje.
Korištenjem transmisijske elektronske mikroskopije (slika 7A) također je uočeno da su glave spermija bile uvijene, a jezgre spiralnog oblika, što je potvrđeno razmazima sperme obojenim akridin oranžom i pregledanim fluorescentnom mikroskopijom (slika 7B).
(A) Digitalna transmisijska elektronska mikrografija u boji i (B) Razmaz sperme obojen akridinskim narančastim akrilinom koji prikazuje spiralno savijene glave i pričvršćivanje glava i repova spermija (strelice). (B) Povećanje × 1000.
Zanimljivo otkriće je da se Sharkazijeva sperma agregira i formira pokretne nitaste snopiće. Svojstva tih snopića omogućuju nam da razumijemo njihovu moguću ulogu u apsorpciji i pohranjivanju spermija u SST-u.
Nakon parenja, spermiji ulaze u vaginu i prolaze kroz intenzivan proces selekcije, što rezultira s ograničenim brojem spermija koji ulaze u SST15,16. Do danas, mehanizmi kojima spermiji ulaze i izlaze iz SST-a nisu jasni. Kod peradi, spermatozoidi se pohranjuju u SST-u dulje vrijeme od 2 do 10 tjedana, ovisno o vrsti6. Kontroverza ostaje oko stanja sjemena tijekom pohrane u SST-u. Jesu li u pokretu ili miruju? Drugim riječima, kako spermiji tako dugo održavaju svoj položaj u SST-u?
Forman4 je sugerirao da se zadržavanje i izbacivanje SST-a može objasniti pokretljivošću spermija. Autori pretpostavljaju da spermiji održavaju svoj položaj plivajući protiv protoka tekućine koji stvara epitel SST-a i da se spermiji izbacuju iz SST-a kada im brzina padne ispod točke u kojoj se počinju kretati unatrag zbog nedostatka energije. Zaniboni5 je potvrdio prisutnost akvaporina 2, 3 i 9 u apikalnom dijelu epitelnih stanica SST-a, što može neizravno podržati Foremanov model pohrane sperme. U trenutnoj studiji otkrili smo da gotovo polovica Sharkashijevih spermija pokazuje pozitivnu reologiju u tekućini koja teče te da aglutinirani snopovi spermija povećavaju broj spermija koji pokazuju pozitivnu reologiju, iako ih aglutinacija usporava. Kako spermiji putuju uz jajovod ptice do mjesta oplodnje nije u potpunosti razjašnjeno. Kod sisavaca, folikularna tekućina kemoatraktira spermije. Međutim, vjeruje se da kemoatraktanti usmjeravaju spermije da se približe velikim udaljenostima7. Stoga su za transport spermija odgovorni drugi mehanizmi. Sposobnost spermija da se orijentiraju i teku protiv tekućine jajovoda koja se oslobađa nakon parenja navedena je kao glavni čimbenik u ciljanju spermija kod miševa. Parker 17 je sugerirao da spermatozoidi prelaze jajovode plivajući protiv cilijarne struje kod ptica i gmazova. Iako to nije eksperimentalno dokazano kod ptica, Adolphi 18 je prvi otkrio da ptičja sperma daje pozitivne rezultate kada se tanki sloj tekućine između pokrovnog stakalca i pločice stvori trakom filter papira. Reologija. Hino i Yanagimachi [19] stavili su mišji kompleks jajnik-jajovod-maternica u perfuzijski prsten i ubrizgali 1 µl tinte u prevlaku kako bi vizualizirali protok tekućine u jajovodima. Primijetili su vrlo aktivno kretanje kontrakcije i opuštanja u jajovodu, u kojem su se sve kuglice tinte stalno kretale prema ampuli jajovoda. Autori naglašavaju važnost protoka tekućine u jajovodima iz donjeg u gornji dio jajovoda za podizanje i oplodnju spermija. Brillard20 je izvijestio da kod pilića i purana spermatozoidi migriraju aktivnim kretanjem od vaginalnog ulaza, gdje se pohranjuju, do uterovaginalnog spoja, gdje se pohranjuju. Međutim, ovo kretanje nije potrebno između uterovaginalnog spoja i infundibuluma jer se spermatozoidi prenose pasivnim pomicanjem. Poznavajući ove prethodne preporuke i rezultate dobivene u trenutnoj studiji, može se pretpostaviti da je sposobnost spermatozoida da se kreću uzvodno (reologija) jedno od svojstava na kojima se temelji proces selekcije. To određuje prolazak spermatozoida kroz vaginu i njihov ulazak u CCT radi pohrane. Kao što je Forman4 sugerirao, to također može olakšati proces ulaska spermija u SST i njegovo stanište na određeno vrijeme, a zatim izlaska kada im se brzina počne usporavati.
S druge strane, Matsuzaki i Sasanami 21 sugerirali su da ptičji spermatozoidi prolaze kroz promjene pokretljivosti od mirovanja do pokretljivosti u muškom i ženskom reproduktivnom traktu. Inhibicija pokretljivosti rezidentnih spermija u SST-u predložena je kao objašnjenje dugog vremena pohrane sperme, a zatim pomlađivanja nakon napuštanja SST-a. U hipoksičnim uvjetima, Matsuzaki i sur. 1 izvijestili su o visokoj proizvodnji i oslobađanju laktata u SST-u, što može dovesti do inhibicije pokretljivosti rezidentnih spermija. U ovom slučaju, važnost reologije spermija ogleda se u odabiru i apsorpciji spermija, a ne u njihovom pohranjivanju.
Uzorak aglutinacije spermija smatra se vjerojatnim objašnjenjem za dugo razdoblje skladištenja sperme u SST-u, budući da je to uobičajeni obrazac zadržavanja sperme kod peradi2,22,23. Bakst i sur.2 primijetili su da se većina spermija prianja jedna uz drugu, tvoreći fascikularne agregate, a pojedinačni spermatozoidi rijetko su pronađeni u CCM-u prepelice. S druge strane, Wen i sur.24 primijetili su više raspršenih spermija i manje čuperaka spermija u lumenu SST-a kod pilića. Na temelju ovih opažanja može se pretpostaviti da se sklonost aglutinaciji spermija razlikuje između ptica i između spermija u istom ejakulatu. Osim toga, Van Krey i sur.9 sugerirali su da je slučajna disocijacija aglutiniranih spermija odgovorna za postupno prodiranje spermija u lumen jajovoda. Prema ovoj hipotezi, spermatozoidi s nižim kapacitetom aglutinacije trebali bi se prvo izbaciti iz SST-a. U tom kontekstu, sposobnost aglutinacije spermija može biti faktor koji utječe na ishod natjecanja spermija kod prljavih ptica. Osim toga, što se aglutinirani spermiji dulje disociraju, to se dulje održava plodnost.
Iako je agregacija spermija i agregacija u snopove uočena u nekoliko studija2,22,24, nisu detaljno opisani zbog složenosti njihovog kinematičkog promatranja unutar SST-a. Učinjeno je nekoliko pokušaja proučavanja aglutinacije spermija in vitro. Opsežna, ali prolazna agregacija uočena je kada je tanka žica uklonjena iz viseće kapi sjemena. To dovodi do činjenice da iz kapi strši izduženi mjehurić, oponašajući sjemenu žlijezdu. Zbog 3D ograničenja i kratkog vremena sušenja kapanjem, cijeli blok se brzo raspao9. U trenutnoj studiji, koristeći Sharkashi piliće i mikrofluidne čipove, uspjeli smo opisati kako se ovi čuperci formiraju i kako se kreću. Snopovi spermija formirali su se odmah nakon sakupljanja sjemena i utvrđeno je da se kreću spiralno, pokazujući pozitivnu reologiju kada su prisutni u toku. Nadalje, kada se makroskopski promatraju, uočeno je da snopovi spermija povećavaju linearnost pokretljivosti u usporedbi s izoliranim spermatozoidima. To sugerira da se aglutinacija spermija može dogoditi prije prodiranja SST-a i da proizvodnja spermija nije ograničena na malo područje zbog stresa kao što je prethodno sugerirano (Tingari i Lake12). Tijekom stvaranja čuperka, spermatozoidi plivaju sinkronizirano dok ne formiraju spoj, zatim se njihovi repovi omotaju jedan oko drugoga i glava spermatozoida ostaju slobodni, ali rep i distalni dio spermatozoida slijepe se ljepljivom tvari. Stoga je slobodna glava ligamenta odgovorna za kretanje, povlačeći ostatak ligamenta. Skenirajuća elektronska mikroskopija snopova spermija pokazala je pričvršćene glave spermija prekrivene s puno ljepljivog materijala, što sugerira da su glave spermija bile pričvršćene u snopovima mirovanja, što se moglo dogoditi nakon dolaska do mjesta pohrane (SST).
Kada se razmaz sperme oboji akridinskim narančastim, izvanstanični adhezivni materijal oko spermija može se vidjeti pod fluorescentnim mikroskopom. Ova tvar omogućuje snopovima spermija da se prilijepe i zadrže na bilo koje okolne površine ili čestice tako da ne plutaju s okolnim tokom. Dakle, naša opažanja pokazuju ulogu adhezije spermija u obliku pokretnih snopova. Njihova sposobnost plivanja protiv struje i lijepljenja za obližnje površine omogućuje spermijima da dulje ostanu u SST-u.
Rothschild25 koristio je hemocitometrijsku kameru za proučavanje plutajuće distribucije goveđe sperme u kapi suspenzije, snimajući fotomikrografije kamerom s vertikalnom i horizontalnom optičkom osi mikroskopa. Rezultati su pokazali da su spermatozoidi privučeni površinom komore. Autori sugeriraju da mogu postojati hidrodinamičke interakcije između spermija i površine. Uzimajući to u obzir, zajedno sa sposobnošću sjemena pilića Sharkashi da formira ljepljive čuperke, može se povećati vjerojatnost da će se sperma prilijepiti za stijenku SST-a i biti pohranjena dulje vrijeme.
Bccetti i Afzeliu26 izvijestili su da je glikokaliks sperme potreban za prepoznavanje i aglutinaciju gameta. Forman10 primijetio je da hidroliza α-glikozidnih veza u glikoprotein-glikolipidnim premazima tretiranjem ptičje sperme neuraminidazom rezultira smanjenom plodnošću bez utjecaja na pokretljivost spermija. Autori sugeriraju da učinak neuraminidaze na glikokaliks oštećuje sekvestraciju sperme na uterovaginalnom spoju, čime se smanjuje plodnost. Njihova zapažanja ne mogu zanemariti mogućnost da tretman neuraminidazom može smanjiti prepoznavanje spermija i oocita. Forman i Engel10 otkrili su da je plodnost smanjena kada su kokoši intravaginalno oplodnjene spermom tretiranom neuraminidazom. Međutim, IVF sa spermom tretiranom neuraminidazom nije utjecao na plodnost u usporedbi s kontrolnim kokošima. Autori su zaključili da promjene u glikoprotein-glikolipidnom omotaču oko membrane spermija smanjuju sposobnost oplodnje spermija oštećujući sekvestraciju spermija na uterovaginalnom spoju, što zauzvrat povećava gubitak spermija zbog brzine uterovaginalnog spoja, ali ne utječe na prepoznavanje spermija i jajnih stanica.
Kod purana Bakst i Bauchan 11 pronašli su male vezikule i fragmente membrane u lumenu SST-a te uočili da su se neke od tih granula spojile s membranom spermija. Autori sugeriraju da ti odnosi mogu doprinijeti dugotrajnom pohranjivanju spermija u SST-u. Međutim, istraživači nisu naveli izvor tih čestica, jesu li ih izlučuju epitelne stanice CCT-a, proizvode ih i izlučuje muški reproduktivni sustav ili ih proizvodi sama spermija. Također, te su čestice odgovorne za aglutinaciju. Grützner i sur.27 izvijestili su da epitelne stanice epididimisa proizvode i izlučuju specifični protein koji je potreban za stvaranje sjemenih puteva s jednom porom. Autori također izvješćuju da disperzija tih snopova ovisi o interakciji proteina epididimisa. Nixon i sur.28 otkrili su da adnexa izlučuju protein, kiseli osteonektin bogat cisteinom; SPARC je uključen u stvaranje čuperaka spermija kod kratkokljunih ehidna i kljunaša. Raspršivanje tih zraka povezano je s gubitkom ovog proteina.
U trenutnoj studiji, ultrastrukturna analiza elektronskom mikroskopijom pokazala je da su spermatozoidi prianjali na veliku količinu gustog materijala. Smatra se da su te tvari odgovorne za aglutinaciju koja se kondenzira između i oko prianjajućih glavica, ali u nižim koncentracijama u području repa. Pretpostavljamo da se ova aglutinirajuća tvar izlučuje iz muškog reproduktivnog sustava (epididimis ili sjemenovod) zajedno sa sjemenom, budući da često opažamo odvajanje sjemena od limfe i sjemene plazme tijekom ejakulacije. Izviješteno je da dok ptičji spermatozoidi prolaze kroz epididimis i sjemenovod, prolaze kroz promjene povezane sa sazrijevanjem koje podržavaju njihovu sposobnost vezanja proteina i stjecanja glikoproteina povezanih s lemom plazme. Perzistencija ovih proteina na rezidualnim membranama spermija u SST-u sugerira da ti proteini mogu utjecati na stjecanje stabilnosti membrane spermija 30 i odrediti njihovu plodnost 31. Ahammad i sur.32 izvijestili su da spermatozoidi dobiveni iz različitih dijelova muškog reproduktivnog sustava (od testisa do distalnog sjemovoda) pokazuju progresivno povećanje održivosti u tekućim uvjetima skladištenja, bez obzira na temperaturu skladištenja, a održivost kod pilića također se povećava u jajovodima nakon umjetne oplodnje.
Čuperci sperme pilića Sharkashi imaju drugačije karakteristike i funkcije od drugih vrsta poput ehidna, kljunača, šumskih miševa, jelenjih štakora i zamoraca. Kod pilića sharkashi, stvaranje snopića spermija smanjilo je brzinu plivanja u usporedbi s pojedinačnim spermatozoidima. Međutim, ovi snopići povećali su postotak reološki pozitivnih spermija i povećali sposobnost spermija da se stabiliziraju u dinamičnom okruženju. Dakle, naši rezultati potvrđuju prethodnu sugestiju da je aglutinacija spermija u SST-u povezana s dugotrajnim skladištenjem sperme. Također pretpostavljamo da sklonost spermija stvaranju čuperaka može kontrolirati brzinu gubitka spermija u SST-u, što može promijeniti ishod natjecanja spermija. Prema ovoj pretpostavci, spermatozoidi s niskim kapacitetom aglutinacije prvi oslobađaju SST, dok spermatozoidi s visokim kapacitetom aglutinacije proizvode većinu potomstva. Stvaranje snopića spermija s jednom porom je korisno i utječe na omjer roditelja i djece, ali koristi drugačiji mehanizam. Kod ehidna i kljunaša, spermatozoidi su raspoređeni paralelno jedan s drugim kako bi se povećala brzina kretanja snopa. Snopovi ehidna kreću se oko tri puta brže od pojedinačnih spermija. Vjeruje se da je stvaranje takvih čuperaka spermija kod ehidna evolucijska prilagodba za održavanje dominacije, budući da su ženke promiskuitetne i obično se pare s nekoliko mužjaka. Stoga se spermatozoidi iz različitih ejakulata žestoko natječu za oplodnju jajne stanice.
Aglutinirani spermatozoidi pilića sharkasi lako se vizualiziraju pomoću faznokontrastne mikroskopije, što se smatra povoljnim jer omogućuje jednostavno proučavanje ponašanja spermija in vitro. Mehanizam kojim stvaranje čuperaka sperme potiče reprodukciju kod pilića sharkasi također se razlikuje od onog koji se vidi kod nekih placentalnih sisavaca, što predstavlja kooperativno ponašanje spermija, poput šumskih miševa, gdje neki spermatozoidi dosežu jajašca, pomažući drugim srodnim jedinkama da dođu do njihovih jajašca i oštete ih. dokazati se. altruistično ponašanje. Samooplodnja 34. Drugi primjer kooperativnog ponašanja kod spermatozoida pronađen je kod jelenskih miševa, gdje su spermatozoidi bili u stanju identificirati i kombinirati se s genetski najsrodnijim spermatozoidima te formirati kooperativne skupine kako bi povećali svoju brzinu u usporedbi sa spermatozoidima koji nisu srodni35.
Rezultati dobiveni u ovoj studiji ne proturječe Fomanovoj teoriji dugotrajnog skladištenja spermija u SST-u. Istraživači izvještavaju da se spermiji nastavljaju kretati u toku epitelnih stanica koje oblažu SST dulje vrijeme, a nakon određenog vremena, zalihe energije spermija se iscrpljuju, što rezultira smanjenjem brzine, što omogućuje izbacivanje tvari male molekularne težine. U trenutnoj studiji primijetili smo da polovica pojedinačnih spermija pokazuje sposobnost plivanja protiv protoka tekućine, a njihovo prianjanje u snopu povećalo je njihovu sposobnost pokazivanja pozitivne reologije. Nadalje, naši su podaci u skladu s podacima Matsuzakija i suradnika 1 koji su izvijestili da povećano lučenje laktata u SST-u može inhibirati pokretljivost rezidentnih spermija. Međutim, naši rezultati opisuju stvaranje pokretnih ligamenata spermija i njihovo reološko ponašanje u prisutnosti dinamičkog okruženja unutar mikrokanala u pokušaju da se razjasni njihovo ponašanje u SST-u. Buduća istraživanja mogla bi se usredotočiti na određivanje kemijskog sastava i podrijetla aglutinirajućeg agensa, što će nesumnjivo pomoći istraživačima u razvoju novih načina pohrane tekuće sperme i povećanja trajanja plodnosti.
Petnaest 30 tjedana starih mužjaka šarkasija bez vrata (homozigotno dominantni; Na-Na) odabrani su kao donori sperme u studiji. Ptice su uzgajane na Istraživačkoj peradarskoj farmi Poljoprivrednog fakulteta Sveučilišta Ashit, Governorate Ashit, Egipat. Ptice su bile smještene u pojedinačne kaveze (30 x 40 x 40 cm), podvrgnute svjetlosnom programu (16 sati svjetla i 8 sati tame) i hranjene prehranom koja je sadržavala 160 g sirovih proteina, 2800 kcal metabolizabilne energije, 35 g kalcija po osobi i 5 grama dostupnog fosfora po kilogramu prehrane.
Prema podacima 36, ​​​​37, sjeme je prikupljeno od mužjaka masažom abdomena. Ukupno je prikupljeno 45 uzoraka sjemena od 15 muškaraca tijekom 3 dana. Sjeme (n = 15/dan) odmah je razrijeđeno 1:1 (v:v) s Belsville Poultry Semen Diluentom, koji sadrži kalijev difosfat (1,27 g), mononatrijev glutamat monohidrat (0,867 g), fruktozu (0,5 d), bezvodni natrijev acetat (0,43 g), tris(hidroksimetil)aminometan (0,195 g), kalijev citrat monohidrat (0,064 g), kalijev monofosfat (0,065 g), magnezijev klorid (0,034 g) i H2O (100 ml), pH = 7,5, osmolarnost 333 mOsm/kg38. Razrijeđeni uzorci sjemena prvo su pregledani pod svjetlosnim mikroskopom kako bi se osigurala dobra kvaliteta sjemena (vlaga), a zatim su pohranjeni u vodenoj kupelji na 37°C do upotrebe unutar pola sata nakon prikupljanja.
Kinematika i reologija spermatozoida opisane su pomoću sustava mikrofluidnih uređaja. Uzorci sjemena dodatno su razrijeđeni na 1:40 u Beltsville Avian Semen Diluentu, ubačeni u mikrofluidni uređaj (vidi dolje), a kinetički parametri određeni su pomoću računalnog sustava za analizu sjemena (CASA) prethodno razvijenog za mikrofluidnu karakterizaciju. Dodatak se može preuzeti na: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39. Mjerene su brzina krivulje (VCL, μm/s), linearna brzina (VSL, μm/s) i prosječna brzina putanje (VAP, μm/s). Videozapisi spermatozoida snimljeni su pomoću invertiranog Optika XDS-3 faznokontrastnog mikroskopa (s objektivom 40x) spojenog na Tucson ISH1000 kameru pri 30 fps tijekom 3 s. Pomoću CASA softvera proučite najmanje tri područja i 500 putanja spermija po uzorku. Snimljeni video obrađen je pomoću domaćeg CASA programa. Definicija pokretljivosti u CASA dodatku temelji se na brzini plivanja spermija u usporedbi s brzinom protoka i ne uključuje druge parametre poput kretanja s jedne strane na drugu, jer se pokazalo da je to pouzdanije kod protoka tekućine. Reološko gibanje opisuje se kao kretanje spermija suprotno smjeru protoka tekućine. Spermatozoidi s reološkim svojstvima podijeljeni su s brojem pokretnih spermija; spermatozoidi koji su mirovali i spermatozoidi koji se konvektivno kreću isključeni su iz brojanja.
Sve korištene kemikalije nabavljene su od tvrtke Elgomhoria Pharmaceuticals (Kairo, Egipat), osim ako nije drugačije navedeno. Uređaj je proizveden kako je opisano od strane El-sherryja i suradnika 40, uz neke izmjene. Materijali korišteni za izradu mikrokanala uključivali su staklene ploče (Howard Glass, Worcester, MA), SU-8-25 negativni rezist (MicroChem, Newton, CA), diacetonski alkohol (Sigma Aldrich, Steinheim, Njemačka) i poliaceton.-184, Dow Corning, Midland, Michigan). Mikrokanali su izrađeni mekom litografijom. Prvo je prozirna zaštitna maska ​​za lice sa željenim dizajnom mikrokanala ispisana na pisaču visoke rezolucije (Prismatic, Kairo, Egipat i Pacific Arts and Design, Markham, ON). Masteri su izrađeni korištenjem staklenih ploča kao podloga. Ploče su očišćene u acetonu, izopropanolu i deioniziranoj vodi, a zatim premazane slojem SU8-25 debljine 20 µm centrifugiranjem (3000 okretaja u minuti, 1 min). Slojevi SU-8 su zatim nježno osušeni (65°C, 2 min i 95°C, 10 min) i izloženi UV zračenju tijekom 50 sekundi. Nakon izlaganja, pečeni su na 65°C i 95°C tijekom 1 min i 4 min kako bi se umrežili izloženi slojevi SU-8, nakon čega je slijedilo razvijanje u diacetonskom alkoholu tijekom 6,5 min. Vafli su tvrdo pečeni (200°C tijekom 15 min) kako bi se sloj SU-8 dodatno učvrstio.
PDMS je pripremljen miješanjem monomera i učvršćivača u težinskom omjeru 10:1, zatim degaziran u vakuumskom eksikatoru i izliven na glavni okvir SU-8. PDMS je sušen u pećnici (120°C, 30 min), a zatim su kanali izrezani, odvojeni od matrice i perforirani kako bi se omogućilo pričvršćivanje cijevi na ulazu i izlazu mikrokanala. Konačno, PDMS mikrokanali su trajno pričvršćeni na mikroskopska stakalca pomoću prijenosnog korona procesora (Electro-Technic Products, Chicago, IL) kao što je opisano drugdje. Mikrokanal korišten u ovoj studiji mjeri 200 µm × 20 µm (Š × V) i dug je 3,6 cm.
Protok fluida izazvan hidrostatskim tlakom unutar mikrokanala postiže se održavanjem razine fluida u ulaznom spremniku iznad visinske razlike Δh39 u izlaznom spremniku (slika 1).
gdje je f koeficijent trenja, definiran kao f = C/Re za laminarni tok u pravokutnom kanalu, gdje je C konstanta koja ovisi o omjeru stranica kanala, L je duljina mikrokanala, Vav je prosječna brzina unutar mikrokanala, Dh je hidraulički promjer kanala, g – ubrzanje gravitacije. Korištenjem ove jednadžbe, prosječna brzina kanala može se izračunati pomoću sljedeće jednadžbe: