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A fertilità di l'acelli dipende da a so capacità di almacenà abbastanza sperma viabile per un periudu di tempu allargatu in i tubuli di almacenamentu di sperma (SST). U mecanismu esattu per u quale i spermatozoi entranu, residenu è lascianu u SST ferma cuntruversu. U sperma di e galline sharkasi hà mostratu una alta tendenza à l'agglutinazione, furmendu fasci filamentosi mobili chì cuntenenu parechje cellule. A causa di a difficultà d'osservà a motilità è u cumpurtamentu di i spermatozoi in una tuba di Falloppiu opaca, avemu utilizatu un dispositivu microfluidicu cù una sezione trasversale di microcanali simile à quella di i spermatozoi per studià l'agglutinazione è a motilità di i spermatozoi. Questu studiu discute cumu si formanu i fasci di sperma, cumu si movenu è u so pussibule rolu in l'estensione di a residenza di u sperma in u SST. Avemu investigatu a velocità di u sperma è u cumpurtamentu reologicu quandu u flussu di fluidu hè statu generatu in un canale microfluidicu da a pressione idrostatica (tassa di flussu = 33 µm/s). I spermatozoi tendenu à natà contr'à a corrente (reologia pusitiva) è a velocità di u fasciu di spermatozoi hè significativamente ridutta paragunata à i spermatozoi singuli. I fasci di sperma sò stati osservati muvimenti in spirale è aumentanu di lunghezza è spessore à misura chì più spermatozoi singuli sò reclutati. I fasci di sperma sò stati osservati avvicinassi è aderisce à e pareti laterali di i canali microfluidichi per evità di esse spazzati cù una velocità di flussu di fluidu > 33 µm/s. I fasci di sperma sò stati osservati avvicinassi è aderisce à e pareti laterali di i canali microfluidichi per evità di esse spazzati cù una velocità di flussu di fluidu > 33 µm/s. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам стенкам ными каналов, чтобы избежать сметания со скоростью потока жидкости> 33 мкм / с. Hè statu osservatu chì i fasci di sperma s'avvicinanu è aderiscenu à i muri laterali di i canali microfluidichi per evità di esse spazzati via à velocità di flussu di fluidu > 33 µm/s.观察到精子束接近并粘附在微流体通道的侧壁上，以避免被流体流速在微流体通道的侧壁上，以避免被流体流速>/s 33 怫m33 µm/s 扫过。 Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкрам стенком замечено канала, чтобы избежать сметания потоком жидкости со скоростью > 33 мкм/с. I fasci di sperma sò stati osservati avvicinassi è aderisce à i muri laterali di u canale microfluidicu per evità di esse spazzati via da u flussu di fluidu à >33 µm/s.A microscopia elettronica à scansione è à trasmissione hà rivelatu chì i fasci di spermatozoi eranu sustinuti da un materiale densu abbundante. I dati ottenuti dimustranu a mobilità unica di i spermatozoi di gallina Sharkazi, è ancu a capacità di i spermatozoi di agglutinassi è di furmà fasci mobili, ciò chì cuntribuisce à una megliu comprensione di u almacenamentu à longu andà di i spermatozoi in SMT.
Per ottene a fecundazione in l'omu è in a maiò parte di l'animali, u sperma è l'ova devenu ghjunghje à u situ di a fecundazione à u mumentu ghjustu. Dunque, l'accoppiamentu deve accade prima o à u mumentu di l'ovulazione. D’altronde, certi mammiferi, cum'è i cani, è ancu e spezie non mammiferi, cum'è l'insetti, i pesci, i rettili è l'acelli, immagazzinanu u sperma in i so organi riproduttivi per un periudu di tempu prolongatu finu à chì i so ovi sò pronti per a fecundazione (fecundazione asincrona 1). L'acelli sò capaci di mantene a viabilità di i spermatozoi capaci di fecundà l'ova per 2-10 settimane 2.
Questa hè una caratteristica unica chì distingue l'acelli da altri animali, postu chì furnisce una alta probabilità di fecundazione dopu una sola inseminazione per parechje settimane senza accoppiamentu è ovulazione simultanei. L'organu principale di almacenamentu di u sperma, chjamatu tubulu di almacenamentu di u sperma (SST), si trova in e pieghe mucose interne à a giunzione uterovaginale. Finu à oghje, i meccanismi per i quali u sperma entra, reside è esce da a banca di sperma ùn sò micca cumpletamente capiti. Basatu annantu à studii precedenti, sò state avanzate parechje ipotesi, ma nisuna di elle hè stata cunfirmata.
Forman4 hà ipotizzatu chì i spermatozoi mantenenu a so residenza in a cavità SST per via di un muvimentu oscillatoriu cuntinuu contr'à a direzzione di u flussu di fluidu attraversu i canali proteichi situati nantu à e cellule epiteliali SST (reologia). L'ATP hè esauritu per via di l'attività flagellare custante necessaria per mantene u sperma in u lume SST è a motilità diminuisce eventualmente finu à chì u sperma hè purtatu fora di a banca di sperma da u flussu di fluidu è principia un novu viaghju longu a tuba di Falloppiu ascendente per fecundà u sperma. Ovu (Forman4). Stu mudellu di almacenamentu di sperma hè sustinutu da a rilevazione per immunocitochimica di l'acquaporine 2, 3 è 9 presenti in e cellule epiteliali SST. Finu à oghje, mancanu studii nantu à a reologia di u sperma di u pullastru è u so rolu in l'almacenamentu SST, a selezzione vaginale di u sperma è a cumpetizione di u sperma. In i pullastri, u sperma entra in a vagina dopu l'accoppiamentu naturale, ma più di l'80% di i spermatozoi sò espulsi da a vagina pocu dopu l'accoppiamentu. Questu suggerisce chì a vagina hè u situ primariu per a selezzione di u sperma in l'uccelli. Inoltre, hè statu signalatu chì menu di l'1% di i spermatozoi fecundati in a vagina finiscenu in SST2. In l'inseminazione artificiale di i pulcini in a vagina, u numeru di spermatozoi chì ghjunghjenu à SST tende à aumentà 24 ore dopu l'inseminazione. Finu à avà, u mecanismu di selezzione di u sperma durante stu prucessu ùn hè chjaru, è a motilità di u sperma pò ghjucà un rolu impurtante in l'assorbimentu di u sperma SST. A causa di i muri spessi è opachi di e tube di Falloppiu, hè difficiule di monitorà direttamente a motilità di u sperma in e tube di Falloppiu di l'acelli. Dunque, ci mancanu cunniscenze basiche di cume i spermatozoi passanu à SST dopu a fecundazione.
A reologia hè stata recentemente ricunnisciuta cum'è un fattore impurtante chì cuntrolla u trasportu di u sperma in i genitali di i mammiferi. Basatu annantu à a capacità di i spermatozoi mobili di migrà in contracorrente, Zaferani et al8 anu utilizatu un sistema microfluidicu corra per isolà passivamente i spermatozoi mobili da campioni di sperma in stabulazione. Stu tipu di classificazione di u sperma hè essenziale per u trattamentu di l'infertilità medica è a ricerca clinica, è hè preferitu à i metudi tradiziunali chì richiedenu tempu è travagliu è ponu compromettere a morfologia è l'integrità strutturale di u sperma. Tuttavia, finu à oghje, ùn sò stati realizati studii nantu à l'effettu di e secrezioni da l'organi genitali di i polli nantu à a motilità di u sperma.
Indipendentemente da u mecanismu chì mantene u sperma almacenatu in u SST, parechji investigatori anu osservatu chì i spermatozoi residenti s'agglutinanu testa à testa in u SST di polli 9, 10, quaglie 2 è tacchini 11 per furmà fasci di sperma agglutinati. L'autori suggerenu chì ci hè un ligame trà sta agglutinazione è u almacenamentu à longu andà di i spermatozoi in u SST.
Tingari è Lake12 anu signalatu una forte associazione trà i spermatozoi in a glandula ricevente u sperma di u pullastru è si sò dumandati se i spermatozoi aviari s'agglutinanu in u listessu modu cum'è i spermatozoi di i mammiferi. Credenu chì e cunnessione prufonde trà u sperma in u vas deferens possinu esse dovute à u stress causatu da a presenza di un gran numeru di spermatozoi in un picculu spaziu.
Quandu si valuta u cumpurtamentu di i spermatozoi nantu à i vetrini freschi appesi, si ponu vede segni transitori di agglutinazione, in particulare à i bordi di e gocce di sperma. Tuttavia, l'agglutinazione era spessu disturbata da l'azione rotazionale assuciata à u muvimentu cuntinuu, ciò chì spiega a natura transitoria di stu fenomenu. I circadori anu ancu nutatu chì quandu u diluente era aghjuntu à u sperma, apparianu aggregati cellulari allungati "filiformi".
I primi tentativi di imità un spermatozoide sò stati fatti rimuovendu un filu finu da una goccia appesa, ciò chì hà risultatu in una vescicula allungata simile à un sperma chì spuntava da a goccia di sperma. I spermatozoi si sò subitu allineati in modu parallelu in a vescicula, ma l'intera unità hè sparita rapidamente per via di a limitazione 3D. Dunque, per studià l'agglutinazione di i spermatozoi, hè necessariu osservà a motilità è u cumpurtamentu di i spermatozoi direttamente in i tubuli isolati di almacenamentu di u sperma, ciò chì hè difficiule da ottene. Dunque, hè necessariu sviluppà un strumentu chì imiti i spermatozoi per sustene studii di motilità è cumpurtamentu di agglutinazione di u sperma. Brillard et al13 anu riportatu chì a lunghezza media di i tubuli di almacenamentu di u sperma in i pulcini adulti hè di 400-600 µm, ma alcuni SST ponu esse longhi finu à 2000 µm. Mero è Ogasawara14 anu divisu e glandule seminifere in tubuli di almacenamentu di sperma ingranditi è micca ingranditi, tramindui listessi in lunghezza (~500 µm) è larghezza di u collu (~38 µm), ma u diametru mediu di u lume di i tubuli era 56,6 è 56,6 µm. . , rispettivamente 11,2 μm, rispettivamente. In u studiu attuale, avemu utilizatu un dispositivu microfluidicu cù una dimensione di canale di 200 µm × 20 µm (L × A), chì a so sezione trasversale hè in qualchì modu vicina à quella di u SST amplificatu. Inoltre, avemu esaminatu a motilità di u sperma è u cumpurtamentu di agglutinazione in u fluidu chì scorre, ciò chì hè coerente cù l'ipotesi di Foreman chì u fluidu pruduttu da e cellule epiteliali SST mantene u sperma in u lume in una direzzione contracorrente (reologica).
U scopu di stu studiu era di superà i prublemi di l'osservazione di a motilità di i spermatozoi in a tuba di Falloppiu è di evità e difficultà di studià a reologia è u cumpurtamentu di i spermatozoi in un ambiente dinamicu. Hè statu utilizatu un dispositivu microfluidicu chì crea una pressione idrostatica per simulà a motilità di i spermatozoi in i genitali di un pollu.
Quandu una goccia di un campione di sperma diluitu (1:40) hè stata caricata in u dispusitivu à microcanali, si sò pussutu identificà dui tipi di motilità di u sperma (sperma isolatu è sperma ligatu). Inoltre, i spermatozoi tendevanu à natà contr'à a corrente (reologia pusitiva; video 1, 2). Ancu s'è i fasci di sperma avianu una velocità più bassa chè quella di u sperma solitario (p < 0,001), anu aumentatu a percentuale di sperma chì mostranu reotassi pusitiva (p < 0,001; Tabella 2). Ancu s'è i fasci di sperma avianu una velocità più bassa chè quella di u sperma solitario (p < 0,001), anu aumentatu a percentuale di sperma chì mostranu reotassi pusitiva (p < 0,001; Tabella 2). Хотя пучки сперматозоидов имели более низкую скорость, чем у одиночных сперматочных сперматозо1 (), < 0, низкую скорость увеличивали процент сперматозоидов, демонстрирующих положительный реотаксис (p < 0,001; табл.). Ancu s'è i fasci di spermatozoi avianu una velocità più bassa chè quella di i spermatozoi singuli (p < 0,001), anu aumentatu a percentuale di spermatozoi chì mostranu reotassi pusitiva (p < 0,001; Tabella 2).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度（p < 0.001），但它们增加了显示阳性流变性的精子百分比（p < 0.001；表2）。尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 （p <0.001） ， 但 增加 了 显礏 昳怏 昳怏 昀百分比 （p <0,001 ； 2。。。。。。）））））） Хотя скорость пучков сперматозоидов была ниже, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), вуела ниже процент сперматозоидов с положительной реологией (p < 0,001; таблица 2). Ancu s'è a velocità di i fasci di spermatozoi era più bassa chè quella di i spermatozoi singuli (p < 0,001), anu aumentatu a percentuale di spermatozoi cù reologia pusitiva (p < 0,001; Tabella 2).A reologia pusitiva per i spermatozoi singuli è i ciuffi hè stimata à circa 53% è 85%, rispettivamente.
Hè statu osservatu chì i spermatozoi di i polli sharkasis subitu dopu l'eiaculazione formanu fasci lineari, custituiti da decine d'individui. Quessi ciuffi aumentanu in lunghezza è spessore cù u tempu è ponu stà in vitro per parechje ore prima di dissipà si (video 3). Quessi fasci filamentosi anu a forma di spermatozoi d'echidna chì si formanu à a fine di l'epididimu. U sperma di gallina Sharkasis hè statu trovu avè una alta tendenza à agglutinà si è à furmà un fasciu reticulatu in menu di un minutu dopu a raccolta. Quessi fasci sò dinamici è capaci di attaccà si à qualsiasi muru vicinu o ughjettu staticu. Ancu s'è i fasci di spermatozoi riducenu a velocità di e cellule spermatiche, hè chjaru chì macroscopicamente aumentanu a so linearità. A lunghezza di i fasci varia secondu u numeru di spermatozoi raccolti in fasci. Dui parti di u fasciu sò state isolate: a parte iniziale, cumprese a testa libera di u spermatozoide agglutinatu, è a parte terminale, cumprese a coda è tutta l'estremità distale di u spermatozoide. Cù una camera à alta velocità (950 fps), sò state osservate teste libere di spermatozoi agglutinati in a parte iniziale di u fasciu, rispunsevuli di u muvimentu di u fasciu per via di u so muvimentu oscillatoriu, trascinendu quelli rimanenti in u fasciu cù un muvimentu elicoidale (Video 4). Tuttavia, in i ciuffi longhi, hè statu osservatu chì alcune teste libere di spermatozoi aderiscenu à u corpu è a parte terminale di u ciuffu agiscenu cum'è palette per aiutà à spinghje u ciuffu.
Mentre sò in un flussu lentu di fluidu, i fasci di sperma si movenu paralleli trà di elli, ma cumincianu à sovrappone si è à attaccassi à tuttu ciò chì hè fermu, per ùn esse lavati via da u flussu di corrente mentre a velocità di u flussu aumenta. I fasci si formanu quandu una manata di cellule spermatiche s'avvicinanu, cumincianu à muoversi in sincronia è à avvolge si l'una intornu à l'altra, è dopu si attaccanu à una sustanza appiccicosa. E figure 1 è 2 mostranu cumu i spermatozoi s'avvicinanu, furmendu una giunzione mentre e code s'avvolgenu l'una intornu à l'altra.
I circadori anu applicatu una pressione idrostatica per creà un flussu di fluidu in un microcanale per studià a reologia di u sperma. Hè statu utilizatu un microcanale cù una dimensione di 200 µm × 20 µm (L × A) è una lunghezza di 3,6 µm. Aduprate microcanali trà i cuntenitori cù siringhe muntate à l'estremità. U colorante alimentariu hè statu utilizatu per rende i canali più visibili.
Attaccate i cavi d'interconnessione è l'accessori à u muru. U video hè statu fattu cù un microscopiu à cuntrastu di fase. Cù ogni imagine, sò presentate immagini di microscopia à cuntrastu di fase è di mappatura. (A) A cunnessione trà dui flussi resiste à u flussu per via di u muvimentu elicoidale (freccia rossa). (B) A cunnessione trà u fasciu di tubi è a parete di u canale (frecce rosse), à ​​u listessu tempu sò cunnessi à altri dui fasci (frecce gialle). (C) I fasci di sperma in u canale microfluidicu cumincianu à cunnette si trà di elli (frecce rosse), furmendu una maglia di fasci di sperma. (D) Furmazione di una rete di fasci di sperma.
Quandu una goccia di sperma diluitu hè stata caricata in u dispusitivu microfluidicu è hè statu creatu un flussu, hè statu osservatu chì u fasciu di sperma si move contr'à a direzzione di u flussu. I fasci si adattanu perfettamente à i muri di i microcanali, è e teste libere in a parte iniziale di i fasci si adattanu perfettamente à elli (video 5). Si attaccanu ancu à qualsiasi particella stazionaria in u so percorsu, cum'è i detriti, per resiste à esse spazzati via da a corrente. Cù u tempu, sti ciuffi diventanu longhi filamenti chì intrappulanu altri spermatozoi singuli è ciuffi più corti (Video 6). Quandu u flussu cumencia à rallentà, longhe linee di sperma cumincianu à furmà una rete di linee di sperma (Video 7; Figura 2).
À alta velocità di flussu (V > 33 µm/s), i muvimenti spirali di i fili sò aumentati cum'è un tentativu di catturà parechji spermatozoi individuali chì formanu fasci chì resistenu megliu à a forza di deriva di u flussu. À alta velocità di flussu (V > 33 µm/s), i muvimenti spirali di i fili sò aumentati cum'è un tentativu di catturà parechji spermatozoi individuali chì formanu fasci chì resistenu megliu à a forza di deriva di u flussu. При высокой скорости потока (V > 33 мкм/с) спиралевидные движения нитей усиливаются, постонькпы поймать множество отдельных сперматозоидов, образующих пучки, которые лучше протефитево силе потока. À velocità di flussu elevate (V > 33 µm/s), i muvimenti elicoidali di i filamenti aumentanu mentre cercanu di catturà parechji spermatozoi individuali furmendu fasci chì sò megliu capaci di resistere à a forza di deriva di u flussu.在高流速(V > 33 µm/s)时，螺纹的螺旋运动增加，以试图捕捉许多形成束的单个精子，从而更好地抵抗流动的漂移力。在 高 流速 (v> 33 µm/s) 时 ， 的 螺旋 运动 增加 ， 以 试图 许多 形成 束 形成 束 动 增加 ，从而 更 地 抵抗 的 漂移力。。。。。。。。。。 При высоких скоростях потока (V > 33 мкм/с) спиральное движение нитей увеличивается в потатхтка множество отдельных сперматозоидов, образующих пучки, чтобы лучше сопротивлятьа сопротивлятьа пучки. À velocità di flussu elevate (V > 33 µm/s), u muvimentu elicoidale di i filamenti aumenta in un tentativu di catturà parechji spermatozoi individuali chì formanu fasci per resiste megliu à e forze di deriva di u flussu.Anu ancu pruvatu à attaccà microcanali à i muri laterali.
I fasci di sperma sò stati identificati cum'è gruppi di teste di spermatozoi è code arricciate utilizendu a microscopia ottica (LM). I fasci di sperma cù vari aggregati sò stati ancu identificati cum'è teste ritorte è aggregati flagellari, code di sperma multiple fuse, teste di sperma attaccate à una coda, è teste di sperma cù nuclei piegati cum'è nuclei multipli fusi. microscopia elettronica à trasmissione (TEM). A microscopia elettronica à scansione (SEM) hà dimustratu chì i fasci di sperma eranu aggregati rivestiti di teste di sperma è l'aggregati di sperma anu mostratu una rete attaccata di code avvolte.
A morfologia è l'ultrastruttura di i spermatozoi, a furmazione di fasci di spermatozoi sò state studiate per mezu di microscopia ottica (mezza sezione), microscopia elettronica à scansione (SEM) è microscopia elettronica à trasmissione (TEM), i strisci di sperma sò stati colorati cù aranciu di acridina è esaminati per mezu di microscopia à epifluorescenza.
A culurazione di u strisciu di sperma cù l'aranciu di acridina (Fig. 3B) hà mustratu chì e teste di i spermatozoi eranu attaccate inseme è cuperte di materiale secretoriu, ciò chì hà purtatu à a furmazione di grandi ciuffi (Fig. 3D). I fasci di sperma eranu custituiti da aggregati di sperma cù una rete di code attaccate (Fig. 4A-C). I fasci di sperma sò cumposti da e code di parechji spermatozoi attaccati inseme (Fig. 4D). I secreti (Fig. 4E,F) cuprianu e teste di i fasci di spermatozoi.
Furmazione di u fasciu di spermatozoi Utilizendu a microscopia à cuntrastu di fase è strisci di sperma culuriti cù aranciu acridina, hà dimustratu chì e teste di i spermatozoi si attaccanu inseme. (A) A furmazione iniziale di u ciuffu di sperma principia cù un spermatozoide (cerchiu biancu) è trè spermatozoi (cerchiu giallu), cù a spirale chì principia à a coda è finisce à a testa. (B) Microfotografia di un strisciu di sperma culuritu cù aranciu acridina chì mostra e teste di sperma aderenti (frecce). A scarica copre a/e testa/e. Ingrandimentu × 1000. (C) Sviluppu di un grande fasciu trasportatu da u flussu in un canale microfluidicu (utilizendu una camera à alta velocità à 950 fps). (D) Micrografia di un strisciu di sperma culuritu cù aranciu acridina chì mostra grandi ciuffi (frecce). Ingrandimentu: ×200.
Micrografia elettronica à scansione di un fasciu di sperma è di un strisciu di sperma culuritu cù aranciu di acridina. (A, B, D, E) sò micrografie elettroniche à scansione di culori digitale di spermatozoi, è C è F sò micrografie di strisci di sperma culuriti cù aranciu di acridina chì mostranu l'attaccamentu di parechji spermatozoi chì avvolgenu a rete caudale. (AC) L'aggregati di sperma sò mostrati cum'è una rete di code attaccate (frecce). (D) Adesione di parechji spermatozoi (cù sustanza adesiva, contornu rosa, freccia) chì avvolgenu a coda. (E è F) Aggregati di a testa di u sperma (puntatori) cuparti di materiale adesivo (puntatori). I spermatozoi anu furmatu fasci cù parechje strutture simili à vortici (F). (C) Ingrandimenti ×400 è (F) ×200.
Utilizendu a microscopia elettronica à trasmissione, avemu scupertu chì i fasci di spermatozoi avianu code attaccate (Fig. 6A, C), teste attaccate à e code (Fig. 6B), o teste attaccate à e code (Fig. 6D). E teste di i spermatozoi in u fasciu sò curve, prisentendu in sezione duie regioni nucleari (Fig. 6D). In u fasciu d'incisione, i spermatozoi avianu una testa ritorta cù duie regioni nucleari è parechje regioni flagellari (Fig. 5A).
Micrografia elettronica digitale à culori chì mostra e code di cunnessione in u fasciu di spermatozoi è u materiale agglutinante chì cunnetta e teste di i spermatozoi. (A) Coda attaccata di un gran numeru di spermatozoi. Nutate cumu si vede a coda in e pruiezioni sia verticale (freccia) sia orizzontale (freccia). (B) A testa (freccia) di u spermatozoo hè cunnessa à a coda (freccia). (C) Parechje code di spermatozoi (frecce) sò attaccate. (D) U materiale di agglutinazione (AS, blu) cunnetta quattru teste di spermatozoi (viola).
A microscopia elettronica à scansione hè stata aduprata per rilevà e teste di sperma in fasci di sperma cuparti di secrezioni o membrane (Figura 6B), chì indica chì i fasci di sperma eranu ancorati da materiale extracellulare. U materiale agglutinatu era cuncintratu in a testa di u sperma (assemblaggio simile à una testa di medusa; Fig. 5B) è si espansione distalmente, dendu un aspettu giallu brillanti sottu à a microscopia à fluorescenza quandu hè stata culurita cù aranciu acridina (Fig. 6C). Sta sustanza hè chjaramente visibile sottu à un microscopiu à scansione è hè cunsiderata un legante. Sezioni semi-fini (Fig. 5C) è strisci di sperma culuriti cù aranciu acridina anu mostratu fasci di sperma chì cuntenenu teste densamente impacchettate è code arricciate (Fig. 5D).
Diverse microfotografie chì mostranu l'aggregazione di teste di spermatozoi è code piegate utilizendu diversi metudi. (A) Micrografia elettronica à trasmissione digitale à culori in sezione trasversale di un fasciu di spermatozoi chì mostra una testa di spermatozoi arrotolata cù un nucleu in duie parti (blu) è parechje parti flagellari (verde). (B) Micrografia elettronica à scansione digitale à culori chì mostra un gruppu di teste di spermatozoi simili à meduse (frecce) chì parenu esse cuperte. (C) Sezione semi-sottile chì mostra teste di spermatozoi aggregate (frecce) è code arricciate (frecce). (D) Micrografia di un striscio di sperma coloratu cù aranciu acridina chì mostra aggregati di teste di spermatozoi (frecce) è code aderenti arricciate (frecce). Nutate chì una sustanza appiccicosa (S) copre a testa di u spermatozoo. (D) Ingrandimentu × 1000.
Usendu a microscopia elettronica à trasmissione (Fig. 7A), hè statu ancu nutatu chì e teste di i spermatozoi eranu ritorte è i nuclei avianu una forma a spirale, cum'è cunfirmatu da strisci di sperma culuriti cù aranciu acridina è esaminati cù a microscopia à fluorescenza (Fig. 7B).
(A) Micrografia elettronica à trasmissione digitale à culori è (B) striscio di sperma culuritu cù aranciu d'acridina chì mostra e teste arrotolate è l'attaccamentu di e teste è di e code di i spermatozoi (frecce). (B) Ingrandimentu × 1000.
Una scuperta interessante hè chì u sperma di Sharkazi s'aggrega per furmà fasci filamentosi mobili. E proprietà di sti fasci ci permettenu di capisce u so pussibule rolu in l'assorbimentu è u almacenamentu di i spermatozoi in u SST.
Dopu l'accoppiamentu, u sperma entra in a vagina è subisce un intensu prucessu di selezzione, chì porta solu à un numeru limitatu di sperma chì entranu in u SST15,16. Finu à oghje, i meccanismi per i quali u sperma entra è esce da u SST ùn sò micca chjari. In u pollame, i spermatozoi sò almacenati in u SST per un periodu allargatu da 2 à 10 settimane, secondu a spezia6. A cuntruversia ferma nantu à a cundizione di u sperma durante u almacenamentu in u SST. Sò in muvimentu o à riposu ? In altre parolle, cumu si mantenenu e cellule spermatiche a so pusizione in u SST per tantu tempu ?
Forman4 hà suggeritu chì a residenza è l'espulsione di SST puderianu esse spiegate in termini di motilità di u sperma. L'autori ipotizzanu chì u sperma mantene a so pusizione nuotendu contr'à u flussu di fluidu creatu da l'epiteliu SST è chì u sperma hè espulsu da u SST quandu a so velocità scende sottu à u puntu in u quale cumincianu à spustassi in daretu per via di a mancanza d'energia. Zaniboni5 hà cunfirmatu a presenza di l'acquaporine 2, 3 è 9 in a parte apicale di e cellule epiteliali SST, chì pò sustene indirettamente u mudellu di almacenamentu di u sperma di Foreman. In u studiu attuale, avemu trovu chì quasi a metà di i spermatozoi di Sharkashi mostranu una reologia pusitiva in u fluidu chì scorre, è chì i fasci di spermatozoi agglutinati aumentanu u numeru di spermatozoi chì mostranu una reologia pusitiva, ancu se l'agglutinazione li rallenta. Cumu e cellule spermatiche viaghjanu finu à a tuba di Falloppiu di l'uccellu finu à u situ di fecundazione ùn hè micca cumpletamente capitu. In i mammiferi, u fluidu folliculare chemioattrae i spermatozoi. Tuttavia, si crede chì i chemioattrattanti dirigenu i spermatozoi à avvicinassi à longhe distanze7. Dunque, altri meccanismi sò rispunsevuli di u trasportu di u sperma. A capacità di u sperma di orientà si è di scorrere contr'à u fluidu di e tube di Falloppiu liberatu dopu l'accoppiamentu hè stata signalata cum'è un fattore maiò in u targeting di u sperma in i topi. Parker 17 hà suggeritu chì i spermatozoi attraversanu l'ovidotti nuotendu contr'à a corrente ciliare in l'uccelli è i rettili. Ancu s'ellu ùn hè statu dimustratu sperimentalmente in l'uccelli, Adolphi18 hè statu u primu à scopre chì u sperma aviariu dà risultati pusitivi quandu un stratu finu di liquidu trà un vetrino coprioggetto è un vetrino hè creatu cù una striscia di carta da filtru. Reologia. Hino è Yanagimachi [19] anu piazzatu un cumplessu ovariu-tuba-uteru di topu in un anellu di perfusione è anu iniettatu 1 µl d'inchiostru in l'istmu per visualizà u flussu di fluidu in e tube di Falloppiu. Anu nutatu un muvimentu assai attivu di cuntrazione è rilassamentu in a tuba di Falloppiu, in u quale tutte e palle d'inchiostru si muvianu costantemente versu l'ampolla di a tuba di Falloppiu. L'autori sottolineanu l'impurtanza di u flussu di fluidu tubarile da e tube di Falloppiu inferiori à quelle superiori per u sollevamentu è a fecundazione di u sperma. Brillard20 hà signalatu chì in i polli è i tacchini, i spermatozoi migranu per muvimentu attivu da l'entrata vaginale, induve sò almacenati, à a junzione utero-vaginale, induve sò almacenati. Tuttavia, questu muvimentu ùn hè micca necessariu trà a junzione uterovaginale è l'infundibulu perchè i spermatozoi sò trasportati per spustamentu passivu. Cunnoscendu queste raccomandazioni precedenti è i risultati ottenuti in u studiu attuale, si pò suppone chì a capacità di i spermatozoi di spustassi à monte (reologia) hè una di e proprietà nantu à e quali si basa u prucessu di selezzione. Questu determina u passaghju di i spermatozoi attraversu a vagina è a so entrata in u CCT per u almacenamentu. Cum'è Forman4 hà suggeritu, questu pò ancu facilità u prucessu di sperma chì entra in u SST è u so habitat per un periudu di tempu è poi esce quandu a so velocità cumencia à rallentà.
Da l'altra parte, Matsuzaki è Sasanami 21 anu suggeritu chì i spermatozoi aviari subiscenu cambiamenti di motilità da a dormienza à a motilità in i tratti riproduttivi maschili è femini. L'inibizione di a motilità di u sperma residente in u SST hè stata pruposta per spiegà u longu tempu di almacenamentu di u sperma è dopu u ringiovanimentu dopu avè lasciatu u SST. In cundizioni ipossiche, Matsuzaki et al. 1 anu signalatu una alta pruduzzione è liberazione di lattatu in u SST, chì pò purtà à l'inibizione di a motilità di u sperma residente. In questu casu, l'impurtanza di a reologia di u sperma si riflette in a selezzione è l'assorbimentu di i spermatozoi, è micca in u so almacenamentu.
U mudellu d'agglutinazione di u sperma hè cunsideratu una spiegazione plausibile per u longu periodu di almacenamentu di u sperma in u SST, postu chì questu hè un mudellu cumunu di ritenzione di u sperma in u pollame2,22,23. Bakst et al. 2 anu osservatu chì a maiò parte di i spermatozoi aderiscenu trà di elli, furmendu aggregati fasciculari, è i spermatozoi singuli sò stati raramente truvati in u CCM di quaglia. D’altronde, Wen et al. 24 anu osservatu spermatozoi più spargugliati è menu ciuffi di spermatozoi in u lume SST in i polli. Basatu annantu à queste osservazioni, si pò suppone chì a propensione à l'agglutinazione di u sperma differisce trà l'acelli è trà i spermatozoi in u listessu eiaculatu. Inoltre, Van Krey et al. 9 anu suggeritu chì a dissociazione casuale di i spermatozoi agglutinati hè rispunsevule di a penetrazione graduale di i spermatozoi in u lume di a tuba di Falloppiu. Sicondu sta ipotesi, i spermatozoi cù una capacità d'agglutinazione più bassa devenu esse espulsi prima da u SST. In questu cuntestu, a capacità di i spermatozoi di agglutinassi pò esse un fattore chì influenza u risultatu di a cumpetizione di sperma in l'acelli sporchi. Inoltre, più longu hè u sperma agglutinatu dissociatu, più longa hè a fertilità mantenuta.
Ancu s'è l'aggregazione di spermatozoi è l'aggregazione in fasci sò state osservate in parechji studii2,22,24, ùn sò state descritte in dettagliu per via di a cumplessità di a so osservazione cinematica in u SST. Parechji tentativi sò stati fatti per studià l'agglutinazione di u sperma in vitro. Una aggregazione estensiva ma transitoria hè stata osservata quandu u filu finu hè statu cacciatu da a goccia di sementi pendente. Questu porta à u fattu chì una bolla allungata sporge da a goccia, imitendu a glàndula seminale. A causa di limitazioni 3D è tempi di asciugatura à goccia brevi, tuttu u bloccu hè cascatu rapidamente in rovina9. In u studiu attuale, aduprendu polli Sharkashi è chip microfluidichi, simu stati capaci di discrive cumu si formanu questi ciuffi è cumu si movenu. I fasci di sperma si sò furmati subitu dopu a raccolta di u sperma è sò stati trovati à muoversi in una spirale, mustrendu una reologia pusitiva quandu sò presenti in u flussu. Inoltre, quandu sò stati osservati macroscopicamente, hè statu osservatu chì i fasci di sperma aumentanu a linearità di a motilità paragunatu à i spermatozoi isolati. Questu suggerisce chì l'agglutinazione di u sperma pò accade prima di a penetrazione di SST è chì a pruduzzione di sperma ùn hè micca limitata à una piccula zona per via di u stress cum'è suggeritu prima (Tingari è Lake12). Durante a furmazione di u ciuffu, i spermatozoi natanu in sincronia finu à chì formanu una giunzione, poi e so code s'avvolgenu l'una intornu à l'altra è a testa di u spermatozoo ferma libera, ma a coda è a parte distale di u spermatozoo si attaccanu inseme cù una sustanza appiccicosa. Dunque, a testa libera di u ligamentu hè rispunsevule di u muvimentu, trascinendu u restu di u ligamentu. A microscopia elettronica à scansione di i fasci di sperma hà mostratu teste di sperma attaccate cuperte da assai materiale appiccicosu, chì suggerisce chì e teste di sperma eranu attaccate in fasci di riposu, chì puderanu esse accadute dopu avè righjuntu u situ di almacenamentu (SST).
Quandu un strisciu di sperma hè culuritu cù aranciu d'acridina, u materiale adesivu extracellulare intornu à e cellule spermatiche pò esse vistu sottu à un microscopiu fluorescente. Sta sustanza permette à i fasci di sperma d'aderisce è di aggrappassi à qualsiasi superficia o particella circundante in modu chì ùn si movenu micca cù u flussu circundante. Cusì, e nostre osservazioni mostranu u rolu di l'adesione di i spermatozoi in forma di fasci mobili. A so capacità di natà contr'à a corrente è di attaccà si à e superfici vicine permette à i sperma di stà più longu in u SST.
Rothschild25 hà utilizatu una camera di emocitometria per studià a distribuzione flottante di u sperma bovinu in una goccia di sospensione, pigliendu microfotografie attraversu una camera cù asse otticu verticale è orizzontale di u microscopiu. I risultati anu dimustratu chì i spermatozoi eranu attratti da a superficia di a camera. L'autori suggerenu chì ci ponu esse interazioni idrodinamiche trà u sperma è a superficia. Tenendu contu di questu, inseme cù a capacità di u sperma di pulcinu Sharkashi di furmà ciuffi appiccicosi, pò aumentà a probabilità chì u sperma aderisce à u muru SST è sia almacenatu per longhi periodi di tempu.
Bccetti è Afzeliu26 anu signalatu chì u glicocalice di u sperma hè necessariu per u ricunniscimentu è l'agglutinazione di i gameti. Forman10 hà osservatu chì l'idrolisi di i ligami α-glicosidici in i rivestimenti glicoproteina-glicolipidi trattendu u sperma aviariu cù neuraminidasi hà risultatu in una riduzzione di a fertilità senza influenzà a motilità di u sperma. L'autori suggerenu chì l'effettu di a neuraminidasi nantu à u glicocalice altera u sequestru di u sperma à a giunzione utero-vaginale, riducendu cusì a fertilità. E so osservazioni ùn ponu ignurà a pussibilità chì u trattamentu cù neuraminidasi possi riduce u ricunniscimentu di u sperma è di l'ovociti. Forman è Engel10 anu trovu chì a fertilità era ridutta quandu e galline eranu inseminate intravaginalmente cù sperma trattatu cù neuraminidasi. Tuttavia, a FIV cù sperma trattatu cù neuraminidasi ùn hà micca influenzatu a fertilità paragunata à i polli di cuntrollu. L'autori anu cunclusu chì i cambiamenti in u rivestimentu di glicoproteine-glicolipidi intornu à a membrana di u sperma anu riduttu a capacità di u sperma di fecundà alterendu u sequestramentu di u sperma à a junzione utero-vaginale, chì à u so tornu hà aumentatu a perdita di sperma per via di a velocità di a junzione utero-vaginale, ma ùn hà micca effettu nant'à u ricunniscimentu di u sperma è di l'ovu.
In i tacchini, Bakst è Bauchan 11 anu trovu piccule vescicule è frammenti di membrana in u lume di u SST è anu osservatu chì alcuni di sti granuli si sò fusi cù a membrana di u sperma. L'autori suggerenu chì ste relazioni possinu cuntribuisce à u almacenamentu à longu andà di i spermatozoi in SST. Tuttavia, i circadori ùn anu micca specificatu a fonte di ste particelle, s'elle sò secrete da e cellule epiteliali CCT, prudutte è secrete da u sistema riproduttivu maschile, o prudutte da u sperma stessu. Inoltre, ste particelle sò rispunsevuli di l'agglutinazione. Grützner et al27 anu signalatu chì e cellule epiteliali epididimali producenu è secretanu una proteina specifica chì hè necessaria per a furmazione di tratti seminali à poru unicu. L'autori signalanu ancu chì a dispersione di sti fasci dipende da l'interazione di e proteine ​​epididimali. Nixon et al28 anu trovu chì l'adnexa secretanu una proteina, l'osteonectina acida ricca di cisteina; SPARC hè implicatu in a furmazione di ciuffi di sperma in echidna è ornitorinchi à beccu cortu. A sparghjera di sti fasci hè assuciata à a perdita di sta proteina.
In u studiu attuale, l'analisi ultrastrutturale cù a microscopia elettronica hà dimustratu chì i spermatozoi anu aderitu à una grande quantità di materiale densu. Si pensa chì queste sustanze sianu rispunsevuli di l'agglutinazione chì si condensa trà è intornu à e teste aderenti, ma à concentrazioni più basse in a regione di a coda. Supponemu chì sta sustanza agglutinante sia escreta da u sistema riproduttivu maschile (epididimo o vas deferens) inseme cù u sperma, postu chì spessu observemu u sperma chì si separa da a linfa è da u plasma seminale durante l'eiaculazione. Hè statu signalatu chì mentre i spermatozoi aviari passanu per l'epididimo è u vas deferens, subiscenu cambiamenti ligati à a maturazione chì sustenenu a so capacità di ligà e proteine ​​è acquistà glicoproteine ​​​​associate à u lemma plasmaticu. A persistenza di queste proteine ​​​​​​nantu à e membrane di u sperma residenti in u SST suggerisce chì queste proteine ​​​​​​possanu influenzà l'acquisizione di a stabilità di a membrana di u sperma 30 è determinà a so fertilità 31. Ahammad et al32 anu signalatu chì i spermatozoi ottenuti da varie parti di u sistema riproduttivu maschile (da i testicoli à u vas deferens distale) anu mostratu un aumentu progressivu di a viabilità in cundizioni di conservazione liquida, indipendentemente da a temperatura di conservazione, è a viabilità in i polli aumenta ancu in e tube di Falloppiu dopu l'inseminazione artificiale.
I ciuffi di sperma di pollu Sharkashi anu caratteristiche è funzioni diverse da altre spezie cum'è l'echidna, l'ornitorinchi, i topi di legnu, i ratti cervi è i porcellini d'India. In i polli sharkasi, a furmazione di fasci di spermatozoi hà riduttu a so velocità di natazione paragunata à i spermatozoi singuli. Tuttavia, questi fasci anu aumentatu a percentuale di spermatozoi reologicamente pusitivi è anu aumentatu a capacità di i spermatozoi di stabilizzassi in un ambiente dinamicu. Cusì, i nostri risultati cunfermanu a suggerimentu precedente chì l'agglutinazione di u sperma in SST hè assuciata à u almacenamentu di u sperma à longu andà. Ipotizzemu ancu chì a propensione di u sperma à furmà ciuffi pò cuntrullà u tassu di perdita di sperma in SST, ciò chì pò alterà u risultatu di a cumpetizione di u sperma. Sicondu sta ipotesi, i spermatozoi cù bassa capacità di agglutinazione liberanu SST prima, mentre chì i spermatozoi cù alta capacità di agglutinazione producenu a maiò parte di a discendenza. A furmazione di fasci di spermatozoi à poru unicu hè benefica è influenza u rapportu genitori-figli, ma usa un mecanismu diversu. In l'echidne è l'ornitorinchi, i spermatozoi sò disposti paralleli trà di elli per aumentà a velocità di avanzamentu di u fasciu. I fasci d'echidne si movenu circa trè volte più velocemente chè i spermatozoi singuli. Si crede chì a furmazione di tali ciuffi di sperma in l'echidne sia un adattamentu evolutivu per mantene a dominanza, postu chì e femine sò promiscue è di solitu si accoppianu cù parechji masci. Dunque, i spermatozoi di diversi eiaculati competenu ferocemente per a fecundazione di l'ovu.
I spermatozoi agglutinati di i polli sharkasi sò faciuli da visualizà cù a microscopia à cuntrastu di fase, chì hè cunsiderata vantaghjosa perchè permette un studiu faciule di u cumpurtamentu di i spermatozoi in vitro. U mecanismu per u quale a furmazione di ciuffi di sperma prumove a ripruduzzione in i polli sharkasi hè ancu diversu da quellu osservatu in certi mammiferi placentari chì rapprisentanu u cumpurtamentu cooperativu di u sperma cum'è i topi di legnu, induve certi spermatozoi ghjunghjenu à l'ova, aiutendu altri individui parenti à ghjunghje è dannighjà i so ovi. per pruvà sè stessu. cumpurtamentu altruisticu. Autofecondazione 34. Un altru esempiu di cumpurtamentu cooperativu in i spermatozoi hè statu trovu in i topi cervi, induve i spermatozoi eranu capaci di identificà è cumminà si cù i spermatozoi più geneticamente parenti è furmà gruppi cooperativi per aumentà a so velocità paragunata à i spermatozoi senza relazione35.
I risultati ottenuti in questu studiu ùn cuntradiscenu micca a teoria di Foman di u almacenamentu à longu andà di i spermatozoi in SWS. I circadori riportanu chì e cellule spermatiche cuntinueghjanu à spustassi in u flussu di e cellule epiteliali chì rivestenu u SST per un periudu di tempu allargatu, è dopu un certu periudu di tempu, e riserve d'energia di e cellule spermatiche sò esaurite, risultendu in una diminuzione di a velocità, chì permette l'espulsione di sustanzi di picculu pesu moleculare. energia di i spermatozoi cù u flussu di fluidu da u lume di u SST A cavità di a tuba di Falloppiu. In u studiu attuale, avemu osservatu chì a metà di i spermatozoi singuli anu mostratu a capacità di natà contr'à i fluidi chì scorrenu, è a so adesione in u fasciu hà aumentatu a so capacità di mustrà reologia pusitiva. Inoltre, i nostri dati sò coerenti cù quelli di Matsuzaki et al. 1 chì anu riportatu chì una maggiore secrezione di lattatu in SST pò inibisce a motilità di i spermatozoi residenti. Tuttavia, i nostri risultati descrivenu a furmazione di ligamenti motili di i spermatozoi è u so cumpurtamentu reologicu in presenza di un ambiente dinamicu in un microcanale in un tentativu di elucidà u so cumpurtamentu in SST. E ricerche future puderanu fucalizà si nantu à a determinazione di a cumpusizione chimica è di l'origine di l'agente agglutinante, ciò chì aiuterà senza dubbitu i circadori à sviluppà novi modi per almacenà u sperma liquidu è aumentà a durata di a fertilità.
Quindici sharkasi masci di 30 settimane à collu nudu (omozigoti dominanti; Na Na) sò stati selezziunati cum'è donatori di sperma in u studiu. L'acelli sò stati allevati à a Fattoria di Pollame di Ricerca di a Facultà di Agricultura, Università Ashit, Guvernatoratu Ashit, Egittu. L'acelli sò stati allughjati in gabbie individuali (30 x 40 x 40 cm), sottumessi à un prugramma di luce (16 ore di luce è 8 ore di bughjura) è alimentati cù una dieta chì cuntene 160 g di proteine ​​grezze, 2800 kcal di energia metabolizzabile, 35 g di calciu ognunu. 5 grammi di fosforu dispunibule per chilogrammu di dieta.
Sicondu i dati 36, 37, u sperma hè statu raccoltu da l'omi per massaggio addominale. Un totale di 45 campioni di sperma sò stati raccolti da 15 omi in 3 ghjorni. U sperma (n = 15/ghjornu) hè statu immediatamente diluitu 1:1 (v:v) cù Belsville Poultry Semen Diluent, chì cuntene difosfatu di potassiu (1,27 g), glutamatu monosodicu monoidratatu (0,867 g), fruttosio (0,5 d) acetatu di sodiu anidru (0,43 g), tris(idrossimetil)aminometanu (0,195 g), citratu di potassiu monoidratatu (0,064 g), monofosfatu di potassiu (0,065 g), cloruru di magnesiu (0,034 g) è H2O (100 ml), pH = 7,5, osmularità 333 mOsm/kg38. I campioni di sperma diluiti sò stati prima esaminati sottu à un microscopiu otticu per assicurà una bona qualità di u sperma (umidità) è dopu cunservati in un bagnu d'acqua à 37 ° C finu à l'usu in una mezz'ora dopu a raccolta.
A cinematica è a reologia di i spermatozoi sò descritte aduprendu un sistema di dispositivi microfluidichi. I campioni di sperma sò stati ulteriormente diluiti à 1:40 in Beltsville Avian Semen Diluent, caricati in un dispositivu microfluidicu (vede sottu), è i parametri cinetichi sò stati determinati aduprendu un sistema di Analisi Computerizzata di u Semen (CASA) sviluppatu prima per a caratterizazione di a microfluidica. nantu à a mobilità di i spermatozoi in mezzi liquidi (Dipartimentu di Ingegneria Meccanica, Facultà di Ingegneria, Università Assiut, Egittu). U plugin pò esse scaricatu à: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39. A velocità di a curva (VCL, μm/s), a velocità lineare (VSL, μm/s) è a velocità media di a traiettoria (VAP, μm/s) sò state misurate. I video di i spermatozoi sò stati presi aduprendu un microscopiu di cuntrastu di fase Optika XDS-3 inversu (cù ughjettivu 40x) cunnessu à una camera Tucson ISH1000 à 30 fps per 3 s. Aduprate u software CASA per studià almenu trè zone è 500 traiettorie di sperma per campione. U video registratu hè statu trattatu cù un CASA fattu in casa. A definizione di motilità in u plug-in CASA hè basata annantu à a velocità di natazione di u sperma paragunata à a velocità di flussu, è ùn include micca altri parametri cum'è u muvimentu da un latu à l'altru, postu chì questu hè statu trovu esse più affidabile in u flussu di fluidi. U muvimentu reologicu hè discrittu cum'è u muvimentu di e cellule spermatiche contr'à a direzzione di u flussu di fluidi. I spermatozoi cù proprietà reologiche sò stati divisi per u numeru di spermatozoi mobili; i spermatozoi chì eranu à riposu è chì si muvianu per cunvezione sò stati esclusi da u contu.
Tutti i prudutti chimichi utilizati sò stati ottenuti da Elgomhoria Pharmaceuticals (Cairo, Egittu) salvu indicazione contraria. U dispusitivu hè statu fabbricatu cum'è descrittu da El-sherry et al. 40 cù alcune mudificazioni. I materiali utilizati per fabricà i microcanali includenu lastre di vetru (Howard Glass, Worcester, MA), resist negativu SU-8-25 (MicroChem, Newton, CA), alcolu diacetone (Sigma Aldrich, Steinheim, Germania) è poliacetone. -184, Dow Corning, Midland, Michigan). I microcanali sò fabbricati cù litografia dolce. Prima, una maschera faciale protettiva trasparente cù u disignu di microcanali desideratu hè stata stampata nantu à una stampante ad alta risoluzione (Prismatic, Cairo, Egittu è Pacific Arts and Design, Markham, ON). I master sò stati fatti utilizendu lastre di vetru cum'è substrati. E lastre sò state pulite in acetone, isopropanolu è acqua deionizzata è poi rivestite cù un stratu di 20 µm di SU8-25 per spin coating (3000 rpm, 1 min). I strati SU-8 sò stati poi asciugati delicatamente (65°C, 2 min è 95°C, 10 min) è esposti à a radiazione UV per 50 s. Cottura post-esposizione à 65°C è 95°C per 1 min è 4 min per reticolare i strati SU-8 esposti, seguita da sviluppu in alcolu diacetone per 6,5 min. Cottura forte di e cialde (200°C per 15 min) per solidificà ulteriormente u stratu SU-8.
U PDMS hè statu preparatu mischjendu u monomeru è l'indurente in un rapportu di pesu di 10:1, poi degassatu in un essiccatore à vuoto è versatu nantu à u quadru principale SU-8. U PDMS hè statu polimerizatu in un fornu (120°C, 30 min), poi i canali sò stati tagliati, separati da u maestru è perforati per permette di attaccà i tubi à l'entrata è à l'uscita di u microcanale. Infine, i microcanali PDMS sò stati attaccati permanentemente à i vetrini di microscopiu utilizendu un processore corona portatile (Electro-Technic Products, Chicago, IL) cum'è descrittu in altrò. U microcanale utilizatu in questu studiu misura 200 µm × 20 µm (L × A) è hè longu 3,6 cm.
U flussu di fluidu induttu da a pressione idrostatica in u microcanale hè ottenutu mantenendu u livellu di fluidu in u reservoir d'entrata sopra à a differenza d'altezza Δh39 in u reservoir di uscita (Fig. 1).
induve f hè u coefficientu di attritu, definitu cum'è f = C/Re per u flussu laminare in un canale rettangulare, induve C hè una costante chì dipende da u rapportu d'aspettu di u canale, L hè a lunghezza di u microcanale, Vav hè a velocità media in u microcanale, Dh hè u diametru idraulicu di u canale, g - accelerazione di gravità. Usendu sta equazione, a velocità media di u canale pò esse calculata aduprendu a seguente equazione: