Dankie dat u Nature.com besoek het. Die blaaierweergawe wat u gebruik, het beperkte CSS-ondersteuning. Vir die beste ervaring beveel ons aan dat u 'n opgedateerde blaaier gebruik (of Verenigbaarheidsmodus in Internet Explorer deaktiveer). Intussen, om voortgesette ondersteuning te verseker, sal ons die webwerf sonder style en JavaScript weergee.
Die vrugbaarheid van voëls hang af van hul vermoë om genoeg lewensvatbare sperm vir 'n lang tydperk in die spermbergingsbuisies (SST) te stoor. Die presiese meganisme waardeur spermatozoa die SST binnedring, daarin bly en verlaat, bly kontroversieel. Die sperm van sharkasi-henne het 'n hoë neiging tot agglutinasie getoon, wat mobiele filamentagtige bondels vorm wat baie selle bevat. As gevolg van die moeilikheid om die beweeglikheid en gedrag van spermatozoa in 'n ondeursigtige fallopiese buis waar te neem, het ons 'n mikrofluidiese toestel met 'n mikrokanaal-dwarssnit soortgelyk aan dié van spermatozoa gebruik om spermatozoa-agglutinasie en -motiliteit te bestudeer. Hierdie studie bespreek hoe spermbondels vorm, hoe hulle beweeg, en hul moontlike rol in die verlenging van spermverblyf in die SST. Ons het spermsnelheid en reologiese gedrag ondersoek wanneer vloeistofvloei binne 'n mikrofluidiese kanaal gegenereer is deur hidrostatiese druk (vloeitempo = 33 µm/s). Die spermatozoa is geneig om teen die stroom te swem (positiewe reologie) en die snelheid van die spermatozoa-bondel word aansienlik verminder in vergelyking met enkele spermatozoa. Daar is waargeneem dat spermbondels in 'n spiraal beweeg en in lengte en dikte toeneem namate meer enkele sperma gewerf word. Spermbondels is waargeneem wat die sywande van die mikrofluidiese kanale nader en daaraan kleef om te verhoed dat hulle met 'n vloeistofvloeisnelheid > 33 µm/s meegesleur word. Spermbondels is waargeneem wat die sywande van die mikrofluidiese kanale nader en daaraan kleef om te verhoed dat hulle met 'n vloeistofvloeisnelheid > 33 µm/s meegesleur word. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрофлюидных, избежать сметания со скоростью потока жидкости> 33 мкм / с. Daar is waargeneem dat spermbondels die sywande van die mikrofluidiese kanale nader en daaraan kleef om te verhoed dat hulle weggevee word teen vloeistofvloeitempo's >33 µm/s.观察到精子束接近并粘附在微流体通道的侧壁上，以避免被流体流速>/33 s.33 µm/s 扫过. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрожидкостног, микрожидкостног избежать сметания потоком жидкости со скоростью > 33 мкм/с. Daar is waargeneem dat spermbondels die sywande van die mikrofluidiese kanaal nader en daaraan kleef om te verhoed dat hulle deur vloeistofvloei teen >33 µm/s meegesleur word.Skandeer- en transmissie-elektronmikroskopie het getoon dat die spermbondels deur oorvloedige digte materiaal ondersteun is. Die data wat verkry is, demonstreer die unieke mobiliteit van Sharkazi-hoenderspermatozoa, sowel as die vermoë van spermatozoa om te agglutineer en mobiele bondels te vorm, wat bydra tot 'n beter begrip van die langtermynberging van spermatozoa in SMT.
Om bevrugting by mense en die meeste diere te bewerkstellig, moet sperm en eiers op die regte tyd by die plek van bevrugting aankom. Daarom moet paring voor of tydens ovulasie plaasvind. Aan die ander kant stoor sommige soogdiere, soos honde, sowel as nie-soogdierspesies, soos insekte, visse, reptiele en voëls, sperm in hul voortplantingsorgane vir 'n lang tydperk totdat hul eiers gereed is vir bevrugting (asinchrone bevrugting 1 ). Voëls kan die lewensvatbaarheid van spermatozoa wat eiers kan bevrug, vir 2-10 weke 2 handhaaf.
Dit is 'n unieke kenmerk wat voëls van ander diere onderskei, aangesien dit 'n hoë waarskynlikheid van bevrugting bied na 'n enkele inseminasie vir etlike weke sonder gelyktydige paring en ovulasie. Die hoofspermbergingsorgaan, genaamd die spermbergingsbuisie (SST), is geleë in die interne mukosale voue by die uterovaginale aansluiting. Tot op hede word die meganismes waardeur sperm die spermbank binnedring, bly en verlaat, nie ten volle verstaan ​​nie. Gebaseer op vorige studies, is baie hipoteses geopper, maar geeneen daarvan is bevestig nie.
Forman4 het gehipotetiseer dat spermatozoa hul verblyf in die SST-holte handhaaf deur voortdurende ossillerende beweging teen die rigting van vloeistofvloei deur proteïenkanale wat op SST-epiteelselle geleë is (reologie). ATP word uitgeput as gevolg van die konstante flagellêre aktiwiteit wat nodig is om die sperm in die SST-lumen te hou en beweeglikheid neem uiteindelik af totdat die sperm deur vloeistofvloei uit die spermbank gedra word en 'n nuwe reis deur die stygende fallopiese buis begin om die sperm te bevrug. Eier (Forman4). Hierdie model van spermberging word ondersteun deur die opsporing deur immunositokemie van akwaporiene 2, 3 en 9 wat in SST-epiteelselle teenwoordig is. Tot op hede ontbreek studies oor hoendersemenreologie en die rol daarvan in SST-berging, vaginale spermseleksie en spermkompetisie. By hoenders betree sperm die vagina na natuurlike paring, maar meer as 80% van die spermatozoa word kort na paring uit die vagina uitgewerp. Dit dui daarop dat die vagina die primêre plek vir spermseleksie by voëls is. Daarbenewens is daar berig dat minder as 1% van spermatozoa wat in die vagina bevrug word, in SST's2 beland. In kunsmatige inseminasie van kuikens in die vagina, is die aantal spermatozoa wat SST bereik geneig om 24 uur na inseminasie toe te neem. Tot dusver is die meganisme van spermseleksie tydens hierdie proses onduidelik, en spermmotiliteit kan 'n belangrike rol speel in SST-spermaopname. As gevolg van die dik en ondeursigtige wande van die fallopiese buise, is dit moeilik om spermmotiliteit in die fallopiese buise van voëls direk te monitor. Daarom het ons nie basiese kennis oor hoe spermatozoa na SST oorgaan na bevrugting nie.
Reologie is onlangs erken as 'n belangrike faktor wat spermvervoer in die soogdiergenitalieë beheer. Gebaseer op die vermoë van beweeglike spermatozoa om teenstroom te migreer, het Zaferani et al8 'n corra-mikrofluidiese stelsel gebruik om beweeglike spermatozoa passief uit gestrekte semenmonsters te isoleer. Hierdie tipe semensortering is noodsaaklik vir mediese onvrugbaarheidsbehandeling en kliniese navorsing, en word verkies bo tradisionele metodes wat tyd- en arbeidsintensief is en spermmorfologie en strukturele integriteit kan benadeel. Tot op hede is daar egter geen studies gedoen oor die effek van afskeidings van die geslagsorgane van hoenders op spermmotiliteit nie.
Ongeag die meganisme wat sperm in die SST gestoor hou, het baie navorsers waargeneem dat inwonende spermatozoa kop-aan-kop in die SST van hoenders 9, 10, kwartels 2 en kalkoene 11 agglutineer om geagglutineerde spermbondels te vorm. Die outeurs stel voor dat daar 'n verband is tussen hierdie agglutinasie en langtermynberging van spermatozoa in die SST.
Tingari en Lake12 het 'n sterk verband tussen spermatozoa in die sperm-ontvangende klier van die hoender gerapporteer en bevraagteken of voëlspermatozoa op dieselfde manier as soogdierspermatozoa agglutineer. Hulle glo dat die diep verbindings tussen sperma in die vas deferens moontlik te wyte is aan die stres wat veroorsaak word deur die teenwoordigheid van 'n groot aantal sperma in 'n klein ruimte.
Wanneer die gedrag van spermatozoa op vars hangende glasplaatjies geëvalueer word, kan verbygaande tekens van agglutinasie gesien word, veral aan die rande van die semendruppels. Agglutinasie is egter dikwels versteur deur die rotasieaksie wat met voortdurende beweging geassosieer word, wat die verbygaande aard van hierdie verskynsel verklaar. Die navorsers het ook opgemerk dat wanneer die verdunningsmiddel by die semen gevoeg is, verlengde "draadagtige" selaggregate verskyn het.
Vroeë pogings om 'n spermatozoon na te boots, is aangewend deur 'n dun draadjie van 'n hangende druppel te verwyder, wat gelei het tot 'n verlengde spermagtige vesikel wat uit die druppel semen uitsteek. Die spermatozoa het onmiddellik parallel binne die vesikel opgestel, maar die hele eenheid het vinnig verdwyn as gevolg van die 3D-beperking. Om spermatozoa-agglutinasie te bestudeer, is dit dus nodig om die beweeglikheid en gedrag van spermatozoa direk in geïsoleerde spermbergingsbuisies waar te neem, wat moeilik is om te bereik. Daarom is dit nodig om 'n instrument te ontwikkel wat spermatozoa naboots om studies van spermmotiliteit en agglutinasiegedrag te ondersteun. Brillard et al13 het berig dat die gemiddelde lengte van spermbergingsbuisies in volwasse kuikens 400-600 µm is, maar sommige SST's kan so lank as 2000 µm wees. Mero en Ogasawara14 het die seminifere kliere verdeel in vergrote en nie-vergrote spermbergingsbuisies, wat albei dieselfde in lengte (~500 µm) en nekwydte (~38 µm) was, maar die gemiddelde lumendiameter van die buisies was onderskeidelik 56.6 en 56.6 µm. . , en onderskeidelik 11.2 μm. In die huidige studie het ons 'n mikrofluidiese toestel met 'n kanaalgrootte van 200 µm × 20 µm (B × H) gebruik, waarvan die dwarssnit ietwat naby aan dié van die versterkte SST is. Daarbenewens het ons spermmotiliteit en agglutinasiegedrag in vloeiende vloeistof ondersoek, wat ooreenstem met Foreman se hipotese dat vloeistof wat deur SST-epiteelselle geproduseer word, sperm in die lumen in 'n teenstroom (reologiese) rigting hou.
Die doel van hierdie studie was om die probleme van die waarneming van spermatozoa-motiliteit in die fallopiese buis te oorkom en die probleme van die bestudering van die reologie en gedrag van spermatozoa in 'n dinamiese omgewing te vermy. 'n Mikrofluidiese toestel is gebruik wat hidrostatiese druk skep om spermmotiliteit in die geslagsdele van 'n hoender te simuleer.
Toe 'n druppel van 'n verdunde spermmonster (1:40) in die mikrokanaaltoestel gelaai is, kon twee tipes spermmotiliteit geïdentifiseer word (geïsoleerde sperm en gebonde sperm). Daarbenewens het spermatozoa geneig om teen die stroom te swem (positiewe reologie; video 1, 2). Alhoewel spermbondels 'n laer snelheid as dié van alleenstaande sperma gehad het (p < 0.001), het hulle die persentasie sperma wat positiewe reotaksie toon, verhoog (p < 0.001; Tabel 2). Alhoewel spermbondels 'n laer snelheid as dié van alleenstaande sperma gehad het (p < 0.001), het hulle die persentasie sperma wat positiewe reotaksie toon, verhoog (p < 0.001; Tabel 2). Хотя пучки сперматозоидов имели более низкую скорость, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), ливенич сперматозоидов, демонстрирующих положительный реотаксис (p < 0,001; таблица 2). Alhoewel die spermatozoa-bondels 'n laer snelheid gehad het as dié van enkele spermatozoa (p < 0.001), het hulle die persentasie spermatozoa wat positiewe reotaksie toon, verhoog (p < 0.001; Tabel 2).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度（p < 0.001），但它们增加了显示阳性流变性的精子百分比（p < 0.001；表2）.尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 （p <0.001） ， 但 增加 昧 逧 倧 示百分比 （p <0.001； 2。。。。。。））))）) Хотя скорость пучков сперматозоидов была ниже, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), они увелитивив сперматозоидов с положительной реологией (p < 0,001; таблица 2). Alhoewel die spoed van spermbondels laer was as dié van enkele spermatozoa (p < 0.001), het hulle die persentasie spermatozoa met positiewe reologie verhoog (p < 0.001; Tabel 2).Positiewe reologie vir enkel-spermatozoa en polle word onderskeidelik op ongeveer 53% en 85% geskat.
Daar is waargeneem dat die spermatozoa van sharkashi-hoenders onmiddellik na ejakulasie lineêre bondels vorm, wat uit dosyne individue bestaan. Hierdie polle neem mettertyd in lengte en dikte toe en kan vir etlike ure in vitro bly voordat hulle verdwyn (video 3). Hierdie filamentagtige bondels is gevorm soos echidna-spermatozoa wat aan die einde van die epididimis vorm. Daar is gevind dat Sharkashi-hensperma 'n hoë neiging het om te agglutineer en 'n netvormige bondel te vorm in minder as een minuut na versameling. Hierdie strale is dinamies en kan aan enige nabygeleë mure of statiese voorwerpe vassit. Alhoewel spermbondels die spoed van spermselle verminder, is dit duidelik dat hulle makroskopies hul lineariteit verhoog. Die lengte van die bondels wissel na gelang van die aantal sperm wat in bondels versamel word. Twee dele van die bondel is geïsoleer: die aanvanklike deel, insluitend die vrye kop van die geagglutineerde sperm, en die terminale deel, insluitend die stert en die hele distale punt van die sperm. Met behulp van 'n hoëspoedkamera (950 fps) is vrye koppe van geagglutineerde spermatozoa in die aanvanklike deel van die bondel waargeneem. Dit is verantwoordelik vir die beweging van die bondel as gevolg van hul ossillerende beweging, wat die oorblywendes met 'n heliese beweging in die bondel insleep (Video 4). In lang polle is daar egter waargeneem dat sommige vrye spermkoppe aan die liggaam vasgeheg is en dat die eindgedeelte van die polle as vleuels optree om die polle te help dryf.
Terwyl hulle in 'n stadige vloeistofvloei is, beweeg die spermbondels parallel met mekaar, maar hulle begin oorvleuel en aan alles wat stilstaan, vassit sodat hulle nie deur die stroom weggespoel word soos die vloeispoed toeneem nie. Die bondels vorm wanneer 'n handvol spermselle mekaar nader, hulle begin sinchronies beweeg en om mekaar draai, en kleef dan aan 'n klewerige stof vas. Figure 1 en 2 wys hoe die spermselle mekaar nader en 'n aansluiting vorm soos die sterte om mekaar draai.
Die navorsers het hidrostatiese druk toegepas om vloeistofvloei in 'n mikrokanaal te skep om spermreologie te bestudeer. 'n Mikrokanaal met 'n grootte van 200 µm × 20 µm (B × H) en 'n lengte van 3.6 µm is gebruik. Gebruik mikrokanale tussen houers met spuite aan die punte. Voedselkleursel is gebruik om die kanale meer sigbaar te maak.
Bind tussenkabels en bykomstighede aan die muur vas. Die video is met 'n fasekontrasmikroskoop geneem. Met elke beeld word fasekontrasmikroskopie en karteringsbeelde aangebied. (A) Die verbinding tussen twee strome weerstaan ​​die vloei as gevolg van heliese beweging (rooi pyl). (B) Die verbinding tussen die buisbundel en die kanaalwand (rooi pyle), terwyl hulle terselfdertyd aan twee ander bundels gekoppel is (geel pyle). (C) Spermbundels in die mikrofluidiese kanaal begin met mekaar verbind (rooi pyle) en vorm 'n maas van spermbundels. (D) Vorming van 'n netwerk van spermbundels.
Toe 'n druppel verdunde sperm in die mikrofluidiese toestel gelaai is en 'n vloei geskep is, is waargeneem dat die spermstraal teen die rigting van die vloei beweeg. Die bondels pas styf teen die wande van die mikrokanale, en die vrykoppe in die aanvanklike deel van die bondels pas styf teen hulle (video 5). Hulle kleef ook aan enige stilstaande deeltjies in hul pad, soos puin, om te verhoed dat hulle deur die stroom meegesleur word. Met verloop van tyd word hierdie polle lang filamente wat ander enkele spermatozoa en korter polle vasvang (Video 6). Soos die vloei begin verlangsaam, begin lang rye sperm 'n netwerk van spermlyne vorm (Video 7; Figuur 2).
Teen hoë vloeisnelheid (V > 33 µm/s) word die spiraalbewegings van die drade verhoog in 'n poging om baie individuele spermvormende bondels te vang om die drywende krag van die vloei beter te weerstaan. Teen hoë vloeisnelheid (V > 33 µm/s) word die spiraalbewegings van die drade verhoog in 'n poging om baie individuele spermvormende bondels te vang om die drywende krag van die vloei beter te weerstaan. При высокой скорости потока (V > 33 mkm/s) спиралевидные движения нитей усиливаются, поскольку опытаю множество отдельных сперматозоидов, образующих пучки, которые лучше противостоят дрейфующих силей. Teen hoë vloeitempo's (V > 33 µm/s) neem die heliese bewegings van die stringe toe namate hulle probeer om baie individuele spermatozoa te vang en bondels te vorm wat beter in staat is om die drywende krag van die vloei te weerstaan.在高流速(V > 33 µm/s)时，螺纹的螺旋运动增加，以试图捕捉许多形成束的单个精子，从而更好地抵抗流动的漂移力.在 高 流速 (v> 33 µm/s) 时 ， 的 螺旋 运动 增加 ， 以 试图 许多 形成＾ 坟 形成 ​​缾坟从而 更 地 抵抗 的 漂移力。。。。。。。。。。 При высоких скоростях потока (V > 33 mkm/s) спиральное движение нитей увеличивается в попытке захть отдельных сперматозоидов, образующих пучки, чтобы лучше сопротивляться силам дрейфа потока. Teen hoë vloeitempo's (V > 33 µm/s) neem die heliese beweging van die filamente toe in 'n poging om baie individuele spermatozoa-vormende bondels vas te vang om die dryfkragte van die vloei beter te weerstaan.Hulle het ook probeer om mikrokanale aan die sywande te heg.
Spermbondels is geïdentifiseer as trosse spermkoppe en gekrulde sterte met behulp van ligmikroskopie (LM). Spermbondels met verskeie aggregate is ook geïdentifiseer as gedraaide koppe en flagellêre aggregate, veelvuldige saamgesmelte spermsterte, spermkoppe wat aan 'n stert geheg is, en spermkoppe met gebuigde kerne as veelvuldige saamgesmelte kerne. transmissie-elektronmikroskopie (TEM). Skandeerelektronmikroskopie (SEM) het getoon dat die spermbondels omhulde aggregate van spermkoppe was en die spermaggregate het 'n aangehegte netwerk van toegedraaide sterte getoon.
Die morfologie en ultrastruktuur van spermatozoa, die vorming van spermatozoabundels is bestudeer met behulp van ligmikroskopie (halfsnit), skandeerelektronmikroskopie (SEM) en transmissie-elektronmikroskopie (TEM), spermsmere is gekleur met akridienoranje en ondersoek met behulp van epifluoresensiemikroskopie.
Spermsmeerkleuring met akridienoranje (Fig. 3B) het getoon dat die spermkoppe aan mekaar vasgeplak en met sekretoriese materiaal bedek was, wat gelei het tot die vorming van groot polle (Fig. 3D). Die spermbondels het bestaan ​​uit spermaggregate met 'n netwerk van aangehegte sterte (Fig. 4A-C). Spermbondels bestaan ​​uit die sterte van baie spermatozoa wat aan mekaar vasgeplak is (Fig. 4D). Geheime (Fig. 4E,F) het die koppe van spermatozoabondels bedek.
Vorming van die spermatozoabundel Deur fasekontrasmikroskopie en spermsmere gekleur met akridienoranje te gebruik, is getoon dat die koppe van die spermatozoa aan mekaar vassit. (A) Vroeë spermklosvorming begin met 'n sperm (wit sirkel) en drie sperma (geel sirkel), met die spiraal wat by die stert begin en by die kop eindig. (B) Fotomikrografie van 'n spermsmere gekleur met akridienoranje wat aanhangende spermkoppe (pyle) toon. Die afskeiding bedek die kop(pe). Vergroting × 1000. (C) Ontwikkeling van 'n groot straal wat deur vloei in 'n mikrofluidiese kanaal vervoer word (met behulp van 'n hoëspoedkamera teen 950 fps). (D) Mikrograaf van 'n spermsmere gekleur met akridienoranje wat groot klossies (pyle) toon. Vergroting: ×200.
Skandeerelektronmikrograaf van 'n spermstraal en 'n spermsmeer gekleur met akridienoranje. (A, B, D, E) is digitale kleurskandeerelektronmikrograwe van spermatozoa, en C en F is mikrograwe van akridienoranje gekleurde spermsmere wat die aanhegting van veelvuldige spermatozoa wat die stertweb toedraai, toon. (AC) Spermaggregate word getoon as 'n netwerk van aangehegte sterte (pyle). (D) Adhesie van verskeie spermatozoa (met kleefstof, pienk buitelyn, pyl) wat om die stert draai. (E en F) Spermkopaggregate (wysers) bedek met kleefmateriaal (wysers). Die spermatozoa het bondels met verskeie vortex-agtige strukture gevorm (F). (C) ×400 en (F) ×200 vergrotings.
Deur transmissie-elektronmikroskopie te gebruik, het ons gevind dat spermbondels aangehegte sterte gehad het (Fig. 6A, C), koppe aan sterte (Fig. 6B), of koppe aan sterte (Fig. 6D). Die koppe van die spermatozoa in die bondel is geboë en word in die snit twee kernstreke aangebied (Fig. 6D). In die insnydingsbondel het die spermatozoa 'n gedraaide kop met twee kernstreke en veelvuldige flagellêre streke gehad (Fig. 5A).
Digitale kleur-elektronmikrograaf wat die verbindende sterte in die spermbondel en die agglutinerende materiaal wat die spermkoppe verbind, toon. (A) Aangehegte stert van 'n groot aantal spermatozoa. Let op hoe die stert in beide portret- (pyl) en landskap- (pyl) projeksies lyk. (B) Die kop (pyl) van die sperm is aan die stert (pyl) gekoppel. (C) Verskeie spermsterte (pyle) is aangeheg. (D) Agglutinasiemateriaal (AS, blou) verbind vier spermkoppe (pers).
Skandeerelektronmikroskopie is gebruik om spermkoppe in spermbondels bedek met afskeidings of membrane op te spoor (Figuur 6B), wat aandui dat die spermbondels deur ekstrasellulêre materiaal geanker was. Die geagglutineerde materiaal was in die spermkop gekonsentreer (jellieviskopagtige samestelling; Fig. 5B) en het distaal uitgebrei, wat 'n briljante geel voorkoms onder fluoresensiemikroskopie gee wanneer dit met akridienoranje gekleur is (Fig. 6C). Hierdie stof is duidelik sigbaar onder 'n skandeermikroskoop en word as 'n bindmiddel beskou. Semi-dun snitte (Fig. 5C) en spermsmere gekleur met akridienoranje het spermbondels getoon wat diggepakte koppe en gekrulde sterte bevat (Fig. 5D).
Verskeie fotomikrograwe wat die samevoeging van spermkoppe en gevoude sterte met behulp van verskeie metodes toon. (A) Dwarssnit digitale kleurtransmissie-elektronmikrograaf van 'n spermbondel wat 'n opgerolde spermkop met 'n tweedelige kern (blou) en verskeie flagellêre dele (groen) toon. (B) Digitale kleurskandeer-elektronmikrograaf wat 'n groep jellievisagtige spermkoppe (pyle) toon wat bedek lyk. (C) Semi-dun snit wat saamgevoegde spermkoppe (pyle) en gekrulde sterte (pyle) toon. (D) Mikrograaf van 'n spermsmeer gekleur met akridienoranje wat aggregate van spermkoppe (pyle) en gekrulde aanhegtende sterte (pyle) toon. Let daarop dat 'n klewerige stof (S) die kop van die spermatozoön bedek. (D) × 1000 vergroting.
Met behulp van transmissie-elektronmikroskopie (Fig. 7A) is ook opgemerk dat die spermkoppe gedraai was en die kerne 'n spiraalvorm gehad het, soos bevestig deur spermsmere gekleur met akridienoranje en ondersoek met behulp van fluoresensiemikroskopie (Fig. 7B).
(A) Digitale kleurtransmissie-elektronmikrograaf en (B) Akridien-oranje gekleurde spermsmeer wat gedraaide koppe en die aanhegting van spermkoppe en -sterte (pyle) toon. (B) × 1000 vergroting.
'n Interessante bevinding is dat Sharkazi se sperm saamtrek om mobiele filamentagtige bondels te vorm. Die eienskappe van hierdie bondels stel ons in staat om hul moontlike rol in die absorpsie en berging van spermatozoa in die SST te verstaan.
Na paring gaan die sperm die vagina binne en ondergaan 'n intense seleksieproses, wat daartoe lei dat slegs 'n beperkte aantal sperm die SST binnegaan15,16. Tot op hede is die meganismes waardeur sperm die SST binnegaan en verlaat onduidelik. By pluimvee word spermatozoa vir 'n lang tydperk van 2 tot 10 weke in die SST gestoor, afhangende van die spesie6. Omstredenheid bly bestaan ​​oor die toestand van die semen tydens berging in die SST. Is hulle in beweging of in rus? Met ander woorde, hoe behou spermselle hul posisie in die SST so lank?
Forman4 het voorgestel dat SST-verblyf en -uitwerping verklaar kan word in terme van spermmotiliteit. Die outeurs veronderstel dat sperm hul posisie behou deur teen die vloeistofvloei wat deur die SST-epiteel geskep word, te swem en dat sperm uit die SST uitgewerp word wanneer hul snelheid onder die punt daal waar hulle begin agteruit beweeg as gevolg van 'n gebrek aan energie. Zaniboni5 het die teenwoordigheid van akwaporiene 2, 3 en 9 in die apikale gedeelte van SST-epiteelselle bevestig, wat indirek Foreman se spermbergingsmodel kan ondersteun. In die huidige studie het ons gevind dat byna die helfte van Sharkashi se spermatozoa positiewe reologie in die vloeiende vloeistof toon, en dat geagglutineerde spermbondels die aantal spermatozoa wat positiewe reologie toon, verhoog, hoewel agglutinasie hulle vertraag. Hoe spermselle in die voël se fallopiese buis na die plek van bevrugting opbeweeg, word nie ten volle verstaan ​​nie. By soogdiere lok die follikulêre vloeistof spermatozoa chemo-aantrek. Daar word egter geglo dat chemoattraktante spermatozoa na lang afstande lei7. Daarom is ander meganismes verantwoordelik vir spermvervoer. Die vermoë van sperm om te oriënteer en te vloei teen die fallopiese buisvloeistof wat na paring vrygestel word, is berig as 'n belangrike faktor in die teikenstelling van sperm in muise. Parker17 het voorgestel dat spermatozoa die eierleiers kruis deur teen die siliêre stroom in voëls en reptiele te swem. Alhoewel dit nie eksperimenteel in voëls gedemonstreer is nie, was Adolphi18 die eerste om te vind dat voëlsperma positiewe resultate gee wanneer 'n dun lagie vloeistof tussen 'n dekglas en 'n glasplaatjie met 'n strook filterpapier geskep word. Reologie. Hino en Yanagimachi [19] het 'n muis-ovarium-buis-baarmoederkompleks in 'n perfusering geplaas en 1 µl ink in die isthmus ingespuit om vloeistofvloei in die fallopiese buise te visualiseer. Hulle het 'n baie aktiewe beweging van sametrekking en ontspanning in die fallopiese buis opgemerk, waarin al die inkballetjies bestendig na die ampulla van die fallopiese buis beweeg het. Die outeurs beklemtoon die belangrikheid van buisvloeistofvloei van die onderste na die boonste fallopiese buise vir spermopheffing en bevrugting. Brillard20 het berig dat spermatozoa in hoenders en kalkoene deur aktiewe beweging migreer vanaf die vaginale ingang, waar hulle gestoor word, na die utero-vaginale aansluiting, waar hulle gestoor word. Hierdie beweging is egter nie nodig tussen die utero-vaginale aansluiting en infundibulum nie, omdat die spermatozoa deur passiewe verplasing vervoer word. Kennis van hierdie vorige aanbevelings en die resultate wat in die huidige studie verkry is, kan aanvaar word dat die vermoë van spermatozoa om stroomop te beweeg (reologie) een van die eienskappe is waarop die seleksieproses gebaseer is. Dit bepaal die deurgang van spermatozoa deur die vagina en hul toetrede tot die CCT vir berging. Soos Forman4 voorgestel het, kan dit ook die proses van sperm wat die SST en sy habitat vir 'n tydperk binnedring en dan verlaat wanneer hul spoed begin verlangsaam, vergemaklik.
Aan die ander kant het Matsuzaki en Sasanami 21 voorgestel dat voëlspermatozoa beweeglikheidsveranderinge ondergaan van dormansie na beweeglikheid in die manlike en vroulike voortplantingskanale. Inhibisie van inwonende spermmotiliteit in die SST is voorgestel om die lang bergingstyd van sperm en dan verjonging na verlaat van die SST te verduidelik. Onder hipoksiese toestande het Matsuzaki et al. 1 hoë produksie en vrystelling van laktaat in die SST gerapporteer, wat kan lei tot inhibisie van inwonende spermmotiliteit. In hierdie geval word die belangrikheid van spermreologie weerspieël in die seleksie en absorpsie van spermatozoa, en nie in hul berging nie.
Die sperm-agglutinasiepatroon word as 'n aanneemlike verduideliking vir die lang bergingstydperk van sperm in die SST beskou, aangesien dit 'n algemene patroon van spermretensie in pluimvee is2,22,23. Bakst et al. 2 het waargeneem dat die meeste spermatozoa aan mekaar vasgeheg het en fassikulêre aggregate gevorm het, en enkele spermatozoa is selde in kwartels-CCM gevind. Aan die ander kant het Wen et al. 24 meer verspreide spermatozoa en minder spermatozoa-klossies in die SST-lumen in hoenders waargeneem. Gebaseer op hierdie waarnemings kan aanvaar word dat die geneigdheid tot sperm-agglutinasie verskil tussen voëls en tussen spermatozoa in dieselfde ejakulaat. Daarbenewens het Van Krey et al. 9 voorgestel dat ewekansige dissosiasie van geagglutineerde spermatozoa verantwoordelik is vir die geleidelike penetrasie van spermatozoa in die lumen van die fallopiese buis. Volgens hierdie hipotese moet spermatozoa met laer agglutinasiekapasiteit eers uit die SST verdryf word. In hierdie konteks kan die vermoë van spermatozoa om te agglutineer 'n faktor wees wat die uitkoms van spermkompetisie in vuil voëls beïnvloed. Boonop, hoe langer die agglutineerde sperm dissosieer, hoe langer word vrugbaarheid gehandhaaf.
Alhoewel spermatozoa-aggregasie en aggregasie in bondels in verskeie studies waargeneem is2,22,24, is dit nie in detail beskryf nie as gevolg van die kompleksiteit van hul kinematiese waarneming binne die SST. Verskeie pogings is aangewend om spermagglutinasie in vitro te bestudeer. Uitgebreide maar verbygaande aggregasie is waargeneem toe die dun draad uit die hangende saaddruppel verwyder is. Dit lei daartoe dat 'n verlengde borrel uit die druppel uitsteek en die seminale klier naboots. As gevolg van 3D-beperkings en kort drupdroogtye het die hele blok vinnig in verval geraak9. In die huidige studie, met behulp van Sharkashi-hoenders en mikrofluidiese skyfies, kon ons beskryf hoe hierdie polle vorm en hoe hulle beweeg. Spermbondels het onmiddellik na semenversameling gevorm en is gevind dat hulle in 'n spiraal beweeg, wat positiewe reologie toon wanneer dit in die vloei teenwoordig is. Verder, wanneer makroskopies beskou word, is waargeneem dat spermbondels die lineariteit van beweeglikheid verhoog in vergelyking met geïsoleerde spermatozoa. Dit dui daarop dat spermagglutinasie kan plaasvind voor SST-penetrasie en dat spermproduksie nie beperk is tot 'n klein area as gevolg van stres soos voorheen voorgestel (Tingari en Lake12) nie. Tydens polvorming swem die spermatozoa in sinchronie totdat hulle 'n aansluiting vorm, dan draai hul sterte om mekaar en die kop van die spermatozoa bly vry, maar die stert en distale deel van die spermatozoa kleef aan mekaar vas met 'n klewerige stof. Daarom is die vrye kop van die ligament verantwoordelik vir die beweging en sleep die res van die ligament saam. Skandeerelektronmikroskopie van die spermbondels het aangehegte spermkoppe getoon wat met baie klewerige materiaal bedek was, wat daarop dui dat die spermkoppe in rusbondels aangeheg was, wat moontlik plaasgevind het nadat hulle die bergingsplek (SST) bereik het.
Wanneer 'n spermsmeer met akridienoranje gekleur word, kan ekstrasellulêre kleefmateriaal rondom die spermselle onder 'n fluoreserende mikroskoop gesien word. Hierdie stof laat spermbondels toe om aan enige omliggende oppervlaktes of deeltjies vas te kleef sodat hulle nie saam met die omliggende vloei dryf nie. Dus toon ons waarnemings die rol van spermatozoa-adhesie in die vorm van mobiele bondels. Hul vermoë om teen die stroom te swem en aan nabygeleë oppervlaktes vas te kleef, laat sperm langer in die SST bly.
Rothschild25 het 'n hemositometrie-kamera gebruik om die drywende verspreiding van beessemen in 'n druppel suspensie te bestudeer, deur fotomikrograwe te neem deur 'n kamera met beide vertikale en horisontale optiese asse van die mikroskoop. Die resultate het getoon dat die spermatozoa na die oppervlak van die kamer aangetrokke is. Die outeurs stel voor dat daar hidrodinamiese interaksies tussen die sperm en die oppervlak kan wees. Met inagneming hiervan, tesame met die vermoë van Sharkashi-kuikensemen om klewerige klossies te vorm, kan dit die waarskynlikheid verhoog dat semen aan die SST-wand sal kleef en vir lang tydperke gestoor sal word.
Bccetti en Afzeliu26 het berig dat die spermglikokaliks benodig word vir gameetherkenning en -agglutinasie. Forman10 het waargeneem dat hidrolise van α-glikosidiese bindings in glikoproteïen-glikolipiedbedekkings deur die behandeling van voëlsemen met neuraminidase gelei het tot verminderde vrugbaarheid sonder om spermmotiliteit te beïnvloed. Die outeurs stel voor dat die effek van neuraminidase op die glikokokaliks spermsekwestrasie by die utero-vaginale aansluiting belemmer, wat vrugbaarheid verminder. Hul waarnemings kan nie die moontlikheid ignoreer dat neuraminidasebehandeling sperm- en oosietherkenning kan verminder nie. Forman en Engel10 het bevind dat vrugbaarheid verminder is toe henne intravaginaal geïnsemineer is met semen wat met neuraminidase behandel is. IVF met neuraminidase-behandelde sperm het egter nie vrugbaarheid beïnvloed in vergelyking met kontrolehoenders nie. Die outeurs het tot die gevolgtrekking gekom dat veranderinge in die glikoproteïen-glikolipied-laag rondom die spermmembraan die vermoë van sperm om te bevrug, verminder deur die sekwestrasie van sperm by die utero-vaginale aansluiting te belemmer, wat weer spermverlies verhoog het as gevolg van die spoed van die utero-vaginale aansluiting, maar nie sperm- en eierherkenning beïnvloed nie.
In kalkoene het Bakst en Bauchan 11 klein vesikels en membraanfragmente in die lumen van die SST gevind en waargeneem dat sommige van hierdie korrels met die spermmembraan versmelt het. Die outeurs stel voor dat hierdie verwantskappe kan bydra tot die langtermynberging van spermatozoa in SST. Die navorsers het egter nie die bron van hierdie deeltjies gespesifiseer nie, of dit nou deur CCT-epiteelselle afgeskei word, deur die manlike voortplantingstelsel geproduseer en afgeskei word, of deur die sperm self geproduseer word. Hierdie deeltjies is ook verantwoordelik vir agglutinasie. Grützner et al27 het berig dat epididimale epiteelselle 'n spesifieke proteïen produseer en afskei wat benodig word vir die vorming van enkelporie-sementrakte. Die outeurs berig ook dat die verspreiding van hierdie bundels afhang van die interaksie van epididimale proteïene. Nixon et al28 het bevind dat die adnexa 'n proteïen, die suur sisteïenryke osteonektien, afskei; SPARC is betrokke by die vorming van spermklossies in kortbek-echidnas en platypusse. Die verstrooiing van hierdie strale word geassosieer met die verlies van hierdie proteïen.
In die huidige studie het ultrastrukturele analise met behulp van elektronmikroskopie getoon dat die spermatozoa aan 'n groot hoeveelheid digte materiaal vasgeheg het. Daar word vermoed dat hierdie stowwe verantwoordelik is vir die agglutinasie wat tussen en om die aanhegtende koppe kondenseer, maar teen laer konsentrasies in die stertstreek. Ons neem aan dat hierdie agglutinerende stof saam met semen uit die manlike voortplantingstelsel (epididimis of vas deferens) uitgeskei word, aangesien ons dikwels semen sien skei van limf- en seminale plasma tydens ejakulasie. Daar is berig dat soos voëlspermatozoa deur die epididimis en vas deferens beweeg, hulle rypwordingsverwante veranderinge ondergaan wat hul vermoë ondersteun om proteïene te bind en plasma-lemma-geassosieerde glikoproteïene te verkry. Die aanhoudendheid van hierdie proteïene op residensiële spermmembrane in die SST dui daarop dat hierdie proteïene die verkryging van spermmembraanstabiliteit 30 kan beïnvloed en hul vrugbaarheid 31 kan bepaal. Ahammad et al32 het berig dat spermatozoa wat verkry is uit verskeie dele van die manlike voortplantingstelsel (van die testes tot die distale vas deferens) 'n progressiewe toename in lewensvatbaarheid onder vloeibare bergingstoestande getoon het, ongeag die bergingstemperatuur, en lewensvatbaarheid by hoenders neem ook toe in die fallopiese buise na kunsmatige inseminasie.
Sharkashi-hoenderspermklossies het verskillende eienskappe en funksies as ander spesies soos echidnas, platypusse, houtmuise, takbokrotte en proefkonyne. In sharkasi-hoenders het die vorming van spermatozoa-bondels hul swemspoed verminder in vergelyking met enkelspermatozoa. Hierdie bondels het egter die persentasie reologies positiewe spermatozoa verhoog en die vermoë van spermatozoa om hulself in 'n dinamiese omgewing te stabiliseer, verhoog. Dus bevestig ons resultate die vorige voorstel dat spermagglutinasie in SST geassosieer word met langtermyn-spermberging. Ons hipotetiseer ook dat die geneigdheid van sperm om klossies te vorm die tempo van spermverlies in SST kan beheer, wat die uitkoms van spermkompetisie kan verander. Volgens hierdie aanname stel spermatozoa met lae agglutinasiekapasiteit eerste SST vry, terwyl spermatozoa met hoë agglutinasiekapasiteit die meeste van die nageslag produseer. Die vorming van enkelporie-spermbondels is voordelig en beïnvloed die ouer-kind-verhouding, maar gebruik 'n ander meganisme. In echidnas en platypusse word die spermatozoa parallel met mekaar gerangskik om die voorwaartse spoed van die straal te verhoog. Bondels echidnas beweeg ongeveer drie keer vinniger as enkele spermatozoa. Daar word geglo dat die vorming van sulke spermklossies in echidnas 'n evolusionêre aanpassing is om dominansie te handhaaf, aangesien wyfies promisku is en gewoonlik met verskeie mannetjies paar. Daarom kompeteer spermatozoa van verskillende ejakulate hewig om die bevrugting van die eiersel.
Geagglutineerde spermatozoa van sharkasi-hoenders is maklik om te visualiseer met behulp van fasekontrasmikroskopie, wat as voordelig beskou word omdat dit maklike studie van die gedrag van spermatozoa in vitro moontlik maak. Die meganisme waardeur spermklosvorming voortplanting in sharkasi-hoenders bevorder, verskil ook van dié wat gesien word in sommige plasentale soogdiere wat koöperatiewe spermgedrag verteenwoordig, soos houtmuise, waar sommige spermatozoa die eiers bereik en ander verwante individue help om hul eiers te bereik en te beskadig. om jouself te bewys. altruïstiese gedrag. Selfbevrugting 34. Nog 'n voorbeeld van koöperatiewe gedrag in spermatozoa is gevind in takbokmuise, waar spermatozoa die mees geneties verwante spermatozoa kon identifiseer en kombineer en koöperatiewe groepe kon vorm om hul spoed te verhoog in vergelyking met onverwante spermatozoa 35.
Die resultate wat in hierdie studie verkry is, weerspreek nie Foman se teorie van langtermynberging van spermatozoa in SWS nie. Die navorsers rapporteer dat spermselle vir 'n lang tydperk in die vloei van epiteelselle wat die SST uitvoer, aanhou beweeg, en na 'n sekere tydperk word die energievoorrade van die spermselle uitgeput, wat lei tot 'n afname in spoed, wat die uitsetting van stowwe met 'n klein molekulêre gewig met die vloei van vloeistof uit die lumen van die SST en die holte van die fallopiese buis moontlik maak. In die huidige studie het ons waargeneem dat die helfte van die enkele sperm die vermoë getoon het om teen vloeiende vloeistowwe te swem, en hul adhesie in die bondel het hul vermoë verhoog om positiewe reologie te toon. Verder stem ons data ooreen met dié van Matsuzaki et al. 1 wat berig het dat verhoogde laktaatafskeiding in SST die beweeglikheid van die sperm kan inhibeer. Ons resultate beskryf egter die vorming van sperm-motiele ligamente en hul reologiese gedrag in die teenwoordigheid van 'n dinamiese omgewing binne 'n mikrokanaal in 'n poging om hul gedrag in SST te verduidelik. Toekomstige navorsing kan fokus op die bepaling van die chemiese samestelling en oorsprong van die agglutinerende middel, wat ongetwyfeld navorsers sal help om nuwe maniere te ontwikkel om vloeibare semen te stoor en die duur van vrugbaarheid te verhoog.
Vyftien 30 weke oue kaalnek-mannetjieshaarkasi (homosigoties dominant; NaNa) is as spermskenkers in die studie gekies. Die voëls is grootgemaak by die Navorsingspluimveeplaas van die Fakulteit Landbou, Ashit Universiteit, Ashit Governorate, Egipte. Voëls is in individuele hokke (30 x 40 x 40 cm) gehuisves, aan 'n ligprogram onderwerp (16 uur lig en 8 uur donkerte) en 'n dieet gevoer wat 160 g ru-proteïen, 2800 kcal metaboliseerbare energie, 35 g kalsium elk en 5 gram beskikbare fosfor per kilogram dieet bevat.
Volgens data 36, ​​37 is semen van mans deur middel van abdominale massering versamel. 'n Totaal van 45 semenmonsters is oor 3 dae van 15 mans versamel. Semen (n = 15/dag) is onmiddellik 1:1 (v:v) verdun met Belsville Poultry Semen Diluent, wat kaliumdifosfaat (1.27 g), mononatriumglutamaatmonohidraat (0.867 g), fruktose (0.5 d), anhidriese natriumasetaat (0.43 g), tris(hidroksimetiel)aminometaan (0.195 g), kaliumsitraatmonohidraat (0.064 g), kaliummonofosfaat (0.065 g), magnesiumchloried (0.034 g) en H2O (100 ml) bevat, pH = 7, 5, osmolariteit 333 mOsm/kg38. Verdunde semenmonsters is eers onder 'n ligmikroskoop ondersoek om goeie semenkwaliteit (vog) te verseker en toe in 'n waterbad teen 37°C gestoor tot gebruik binne 'n halfuur na versameling.
Die kinematika en reologie van spermatozoa word beskryf met behulp van 'n stelsel van mikrofluidiese toestelle. Semenmonsters is verder verdun tot 1:40 in Beltsville Avian Semen Diluent, in 'n mikrofluidiese toestel gelaai (sien hieronder), en kinetiese parameters is bepaal met behulp van 'n Gerekenariseerde Semen Analise (CASA) stelsel wat voorheen ontwikkel is vir mikrofluidiese karakterisering oor die mobiliteit van spermatozoa in vloeibare media (Departement Meganiese Ingenieurswese, Fakulteit Ingenieurswese, Assiut Universiteit, Egipte). Die inprop kan afgelaai word by: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39. Krommingssnelheid (VCL, μm/s), lineêre snelheid (VSL, μm/s) en gemiddelde trajeksnelheid (VAP, μm/s) is gemeet. Video's van spermatozoa is geneem met behulp van 'n omgekeerde Optika XDS-3 fase kontrasmikroskoop (met 40x objektief) gekoppel aan 'n Tucson ISH1000 kamera teen 30 fps vir 3 s. Gebruik die CASA-sagteware om ten minste drie areas en 500 spermtrajekte per monster te bestudeer. Die opgeneemde video is verwerk met behulp van 'n tuisgemaakte CASA. Die definisie van beweeglikheid in die CASA-inprop is gebaseer op die swemspoed van die sperm in vergelyking met die vloeitempo, en sluit nie ander parameters soos sy-tot-sy beweging in nie, aangesien dit meer betroubaar gevind is in vloeistofvloei. Reologiese beweging word beskryf as die beweging van spermselle teen die rigting van vloeistofvloei. Spermatozoa met reologiese eienskappe is gedeel deur die aantal beweeglike spermatozoa; spermatozoa wat in rus was en konvektief bewegende spermatozoa is van die telling uitgesluit.
Alle chemikalieë wat gebruik is, is verkry van Elgomhoria Pharmaceuticals (Kaïro, Egipte) tensy anders vermeld. Die toestel is vervaardig soos beskryf deur El-sherry et al. 40 met 'n paar wysigings. Die materiale wat gebruik is om die mikrokanale te vervaardig, het glasplate ingesluit (Howard Glass, Worcester, MA), SU-8-25 negatiewe weerstand (MicroChem, Newton, CA), diacetone alkohol (Sigma Aldrich, Steinheim, Duitsland), en poliasetone. -184, Dow Corning, Midland, Michigan). Mikrokanale word vervaardig met behulp van sagte litografie. Eers is 'n deursigtige beskermende gesigmasker met die verlangde mikrokanaalontwerp op 'n hoë-resolusie drukker gedruk (Prismatic, Kaïro, Egipte en Pacific Arts and Design, Markham, ON). Die meesters is gemaak met behulp van glasplate as substrate. Die plate is skoongemaak in asetoon, isopropanol en gedeïoniseerde water en dan bedek met 'n 20 µm laag SU8-25 deur spinbedekking (3000 rpm, 1 min). Die SU-8 lae is toe liggies gedroog (65°C, 2 min en 95°C, 10 min) en vir 50 s aan UV-straling blootgestel. Na-blootstelling gebak by 65°C en 95°C vir 1 min en 4 min om blootgestelde SU-8 lae te kruisbind, gevolg deur ontwikkeling in diacetone alkohol vir 6.5 min. Bak die wafels hard (200°C vir 15 min) om die SU-8 laag verder te stol.
PDMS is voorberei deur die monomeer en verharder in 'n gewigsverhouding van 10:1 te meng, dan in 'n vakuum-eksikkator ontgas en op die SU-8 hoofraam gegooi. Die PDMS is in 'n oond (120°C, 30 min) gehard, toe is die kanale uitgesny, van die meester geskei en geperforeer om buise by die inlaat en uitlaat van die mikrokanaal te laat vasmaak. Laastens is PDMS-mikrokanale permanent aan mikroskoopskyfies vasgemaak met behulp van 'n draagbare koronaverwerker (Electro-Technic Products, Chicago, IL) soos elders beskryf. Die mikrokanaal wat in hierdie studie gebruik is, meet 200 µm × 20 µm (B × H) en is 3.6 cm lank.
Die vloeistofvloei wat deur hidrostatiese druk binne die mikrokanaal geïnduseer word, word bereik deur die vloeistofvlak in die inlaatreservoir bo die hoogteverskil Δh39 in die uitlaatreservoir te handhaaf (Fig. 1).
waar f die wrywingskoëffisiënt is, gedefinieer as f = C/Re vir laminêre vloei in 'n reghoekige kanaal, waar C 'n konstante is wat afhang van die aspekverhouding van die kanaal, L die lengte van die mikrokanaal is, Vav die gemiddelde snelheid binne die mikrokanaal is, Dh die hidrouliese deursnee van die kanaal is, g – swaartekragversnelling. Deur hierdie vergelyking te gebruik, kan die gemiddelde kanaalsnelheid bereken word met behulp van die volgende vergelyking: