Gràcies per visitar Nature.com. La versió del navegador que esteu utilitzant té compatibilitat limitada amb CSS. Per a una millor experiència, us recomanem que utilitzeu un navegador actualitzat (o que desactiveu el mode de compatibilitat a l'Internet Explorer). Mentrestant, per garantir el suport continu, renderem el lloc web sense estils ni JavaScript.
La fertilitat de les aus depèn de la seva capacitat per emmagatzemar prou espermatozoides viables durant un període de temps prolongat als túbuls d'emmagatzematge d'espermatozoides (TSE). El mecanisme exacte pel qual els espermatozoides entren, resideixen i surten de l'TSE continua sent controvertit. L'esperma de les gallines sharkasi va mostrar una alta tendència a l'aglutinació, formant feixos filamentosos mòbils que contenen moltes cèl·lules. A causa de la dificultat d'observar la motilitat i el comportament dels espermatozoides en una trompa de Fal·lopi opaca, vam utilitzar un dispositiu microfluídic amb una secció transversal de microcanal similar a la dels espermatozoides per estudiar l'aglutinació i la motilitat dels espermatozoides. Aquest estudi analitza com es formen els feixos d'espermatozoides, com es mouen i el seu possible paper en l'extensió de la residència dels espermatozoides a l'TSE. Vam investigar la velocitat dels espermatozoides i el comportament reològic quan es generava flux de fluids dins d'un canal microfluídic per pressió hidrostàtica (cabal = 33 µm/s). Els espermatozoides tendeixen a nedar contra corrent (reologia positiva) i la velocitat del feixo d'espermatozoides es redueix significativament en comparació amb els espermatozoides individuals. S'ha observat que els feixos d'espermatozoides es mouen en espiral i augmenten de longitud i gruix a mesura que es recluten més espermatozoides individuals. Es va observar que els feixos d'espermatozoides s'acostaven i s'adherien a les parets laterals dels canals microfluídics per evitar ser escombrats amb una velocitat de flux de fluid > 33 µm/s. Es va observar que els feixos d'espermatozoides s'acostaven i s'adherien a les parets laterals dels canals microfluídics per evitar ser escombrats amb una velocitat de flux de fluid > 33 µm/s. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенюкам стенкам стенкам стенидов каналов, чтобы избежать сметания со скоростью потока жидкости> 33 мкм / с. S'ha observat que els feixos d'espermatozoides s'acosten i s'adhereixen a les parets laterals dels canals microfluídics per evitar ser arrossegats a velocitats de flux de fluids > 33 µm/s.观察到精子束接近并粘附在微流体通道的侧壁上，以避免被流体流速流体流速在微流体通道的侧壁上，以避免被流体流速> 33 怉怫迂怟33 µm/s 扫过。 Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стендкосом стенгокрам замечено канала, чтобы избежать сметания потоком жидкости со скоростью > 33 мкм/с. S'ha observat que els feixos d'espermatozoides s'acosten i s'adhereixen a les parets laterals del canal microfluídic per evitar ser arrossegats pel flux de fluid a >33 µm/s.La microscòpia electrònica de rastreig i transmissió va revelar que els feixos d'espermatozoides estaven suportats per un material dens i abundant. Les dades obtingudes demostren la mobilitat única dels espermatozoides de pollastre Sharkazi, així com la capacitat dels espermatozoides per aglutinar-se i formar feixos mòbils, la qual cosa contribueix a una millor comprensió de l'emmagatzematge a llarg termini dels espermatozoides en SMT.
Per aconseguir la fecundació en humans i la majoria d'animals, els espermatozoides i els òvuls han d'arribar al lloc de la fecundació en el moment adequat. Per tant, l'aparellament ha de tenir lloc abans o en el moment de l'ovulació. D'altra banda, alguns mamífers, com els gossos, així com espècies no mamíferes, com ara insectes, peixos, rèptils i ocells, emmagatzemen espermatozoides als seus òrgans reproductors durant un període de temps prolongat fins que els seus òvuls estan preparats per a la fecundació (fecundació asíncrona 1 ). Els ocells són capaços de mantenir la viabilitat dels espermatozoides capaços de fecundar òvuls durant 2-10 setmanes 2 .
Aquesta és una característica única que distingeix les aus d'altres animals, ja que proporciona una alta probabilitat de fecundació després d'una sola inseminació durant diverses setmanes sense aparellament i ovulació simultànies. El principal òrgan d'emmagatzematge d'esperma, anomenat túbul d'emmagatzematge d'esperma (SST), es troba als plecs de la mucosa interna a la unió uterovaginal. Fins ara, els mecanismes pels quals els espermatozoides entren, resideixen i surten del banc d'esperma no s'entenen completament. A partir d'estudis previs, s'han plantejat moltes hipòtesis, però cap d'elles s'ha confirmat.
Forman4 va plantejar la hipòtesi que els espermatozoides mantenen la seva residència a la cavitat de la superfície del subsòl (SST) mitjançant un moviment oscil·latori continu en contra de la direcció del flux de fluids a través dels canals proteics situats a les cèl·lules epitelials de la SST (reologia). L'ATP s'esgota a causa de l'activitat flagel·lar constant necessària per mantenir els espermatozoides al lumen de la SST i la motilitat finalment disminueix fins que els espermatozoides són transportats fora del banc d'esperma pel flux de fluids i comencen un nou viatge per la trompa de Fal·lopi ascendent per fertilitzar els espermatozoides. Òvul (Forman4). Aquest model d'emmagatzematge d'espermatozoides està recolzat per la detecció per immunocitoquímica de les aquaporines 2, 3 i 9 presents a les cèl·lules epitelials de la SST. Fins ara, falten estudis sobre la reologia del semen de pollastre i el seu paper en l'emmagatzematge de la SST, la selecció vaginal d'espermatozoides i la competència entre espermatozoides. En els pollastres, els espermatozoides entren a la vagina després de l'aparellament natural, però més del 80% dels espermatozoides són expulsats de la vagina poc després de l'aparellament. Això suggereix que la vagina és el lloc principal per a la selecció d'espermatozoides en les aus. A més, s'ha informat que menys de l'1% dels espermatozoides fecundats a la vagina acaben en SST2. En la inseminació artificial de pollets a la vagina, el nombre d'espermatozoides que arriben a la SST tendeix a augmentar 24 hores després de la inseminació. Fins ara, el mecanisme de selecció d'espermatozoides durant aquest procés no està clar, i la motilitat dels espermatozoides pot tenir un paper important en l'absorció d'espermatozoides de SST. A causa de les parets gruixudes i opaques de les trompes de Fal·lopi, és difícil controlar directament la motilitat dels espermatozoides a les trompes de Fal·lopi de les aus. Per tant, manquen coneixements bàsics de com els espermatozoides fan la transició a la SST després de la fecundació.
Recentment s'ha reconegut la reologia com un factor important que controla el transport d'espermatozoides als genitals dels mamífers. Basant-se en la capacitat dels espermatozoides mòbils de migrar a contracorrent, Zaferani et al8 van utilitzar un sistema microfluídic corra per aïllar passivament espermatozoides mòbils de mostres de semen en corral. Aquest tipus de classificació del semen és essencial per al tractament de la infertilitat mèdica i la investigació clínica, i es prefereix als mètodes tradicionals que requereixen molt de temps i mà d'obra i poden comprometre la morfologia i la integritat estructural dels espermatozoides. Tanmateix, fins ara, no s'han dut a terme estudis sobre l'efecte de les secrecions dels òrgans genitals dels pollastres sobre la motilitat dels espermatozoides.
Independentment del mecanisme que manté els espermatozoides emmagatzemats a la SST, molts investigadors han observat que els espermatozoides residents s'aglutinen cap a cap a la SST de pollastres 9, 10, guatlles 2 i galls dindis 11 per formar feixos d'espermatozoides aglutinats. Els autors suggereixen que hi ha una relació entre aquesta aglutinació i l'emmagatzematge a llarg termini d'espermatozoides a la SST.
Tingari i Lake12 van informar d'una forta associació entre els espermatozoides a la glàndula receptora d'esperma del pollastre i van qüestionar si els espermatozoides aviars s'aglutinen de la mateixa manera que els espermatozoides mamífers. Creuen que les connexions profundes entre els espermatozoides al conducte deferent poden ser degudes a l'estrès causat per la presència d'un gran nombre d'espermatozoides en un espai reduït.
En avaluar el comportament dels espermatozoides en làmines de vidre penjants fresques, es poden observar signes transitoris d'aglutinació, especialment a les vores de les gotes de semen. Tanmateix, l'aglutinació sovint es veia alterada per l'acció rotacional associada al moviment continu, la qual cosa explica la naturalesa transitòria d'aquest fenomen. Els investigadors també van observar que quan s'afegia el diluent al semen, apareixien agregats cel·lulars allargats "en forma de fil".
Els primers intents d'imitar un espermatozoide es van fer traient un filferro prim d'una gota penjant, cosa que va resultar en una vesícula allargada semblant a un espermatozoide que sobresortia de la gota de semen. Els espermatozoides es van alinear immediatament de manera paral·lela dins de la vesícula, però tota la unitat va desaparèixer ràpidament a causa de la limitació 3D. Per tant, per estudiar l'aglutinació dels espermatozoides, cal observar la motilitat i el comportament dels espermatozoides directament en túbuls d'emmagatzematge d'esperma aïllats, cosa que és difícil d'aconseguir. Per tant, cal desenvolupar un instrument que imiti els espermatozoides per donar suport als estudis de la motilitat i el comportament d'aglutinació dels espermatozoides. Brillard et al13 van informar que la longitud mitjana dels túbuls d'emmagatzematge d'espermatozoides en pollets adults és de 400-600 µm, però alguns tubs de substàncies magnètiques (TSM) poden arribar a fer 2000 µm. Mero i Ogasawara14 van dividir les glàndules seminíferes en túbuls d'emmagatzematge d'espermatozoides engrandits i no engrandits, tots dos de la mateixa longitud (~500 µm) i amplada del coll (~38 µm), però el diàmetre mitjà del lumen dels túbuls era de 56,6 i 56,6 µm, respectivament (11,2 μm). En l'estudi actual, hem utilitzat un dispositiu microfluídic amb una mida de canal de 200 µm × 20 µm (A × A), la secció transversal del qual és una mica propera a la de la SST amplificada. A més, hem examinat la motilitat dels espermatozoides i el comportament d'aglutinació en fluids que flueixen, la qual cosa és coherent amb la hipòtesi de Foreman que el fluid produït per les cèl·lules epitelials de la SST manté els espermatozoides al lumen en una direcció contracorrent (reològica).
L'objectiu d'aquest estudi era superar els problemes d'observació de la motilitat dels espermatozoides a la trompa de Fal·lopi i evitar les dificultats d'estudiar la reologia i el comportament dels espermatozoides en un entorn dinàmic. Es va utilitzar un dispositiu microfluídic que crea pressió hidrostàtica per simular la motilitat dels espermatozoides als genitals d'un pollastre.
Quan es carregava una gota d'una mostra d'esperma diluïda (1:40) al dispositiu de microcanals, es podien identificar dos tipus de motilitat espermàtica (espermatozoides aïllats i espermatozoides lligats). A més, els espermatozoides tendien a nedar a contracorrent (reologia positiva; vídeo 1, 2). Tot i que els feixos d'espermatozoides tenien una velocitat menor que la dels espermatozoides solitaris (p < 0,001), van augmentar el percentatge d'espermatozoides que mostraven reotaxi positiva (p < 0,001; Taula 2). Tot i que els feixos d'espermatozoides tenien una velocitat menor que la dels espermatozoides solitaris (p < 0,001), van augmentar el percentatge d'espermatozoides que mostraven reotaxi positiva (p < 0,001; Taula 2). Хотя пучки сперматозоидов имели более низкую скорость, чем у одиночных сперматозох сперматозо1 (), < 0, низкую скорость увеличивали процент сперматозоидов, демонстрирующих положительный реотаксис (p < 0,001; цтал). Tot i que els feixos d'espermatozoides tenien una velocitat inferior a la dels espermatozoides individuals (p < 0,001), van augmentar el percentatge d'espermatozoides que van mostrar reotaxi positiva (p < 0,001; Taula 2).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度（p < 0,001），但它们增加了显示阳性流变性的精子百分比（p < 0,001；表2）。尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 （p <0,001） ， 但 增加 了 显礏 昳怏 昳怏 昳怏百分比 （p <0,001 ； 2。。。。。。）））））） Хотя скорость пучков сперматозоидов была ниже, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), процент сперматозоидов с положительной реологией (p < 0,001; таблица 2). Tot i que la velocitat dels feixos d'espermatozoides va ser inferior a la dels espermatozoides individuals (p < 0,001), van augmentar el percentatge d'espermatozoides amb reologia positiva (p < 0,001; Taula 2).La reologia positiva per a espermatozoides individuals i flocs s'estima en aproximadament el 53% i el 85%, respectivament.
S'ha observat que els espermatozoides de pollastres sharkasis immediatament després de l'ejaculació formen feixos lineals, que consisteixen en desenes d'individus. Aquests flocs augmenten de longitud i gruix amb el temps i poden romandre in vitro durant diverses hores abans de dissipar-se (vídeo 3). Aquests feixos filamentosos tenen la forma dels espermatozoides d'equidna que es formen al final de l'epidídim. S'ha descobert que el semen de gallina sharkasis té una alta tendència a aglutinar-se i formar un feix reticulat en menys d'un minut després de la recollida. Aquests feixos són dinàmics i capaços d'adherir-se a qualsevol paret o objecte estàtic proper. Tot i que els feixos d'espermatozoides redueixen la velocitat de les cèl·lules espermàtiques, és clar que macroscòpicament augmenten la seva linealitat. La longitud dels feixos varia segons el nombre d'espermatozoides recollits en feixos. Es van aïllar dues parts del feix: la part inicial, que inclou el cap lliure de l'espermatozoide aglutinat, i la part terminal, que inclou la cua i tot l'extrem distal de l'espermatozoide. Mitjançant una càmera d'alta velocitat (950 fps), es van observar caps lliures d'espermatozoides aglutinats a la part inicial del feix, responsables del moviment del feix a causa del seu moviment oscil·latori, arrossegant els restants cap a l'interior del feix amb un moviment helicoïdal (Vídeo 4). No obstant això, en flocs llargs, s'ha observat que alguns caps d'espermatozoides lliures s'adhereixen al cos i la porció terminal del floc actuen com a aspes per ajudar a propulsar el floc.
Mentre que en un flux lent de fluid, els feixos d'espermatozoides es mouen paral·lelament entre si, però, comencen a superposar-se i a enganxar-se a tot el que està quiet, per tal de no ser arrossegats pel flux de corrent a mesura que augmenta la velocitat del flux. Els feixos es formen quan un grapat d'espermatozoides s'acosten, comencen a moure's en sincronia i s'embolcallen les unes al voltant de les altres, i després s'enganxen a una substància enganxosa. Les figures 1 i 2 mostren com els espermatozoides s'acosten, formant una unió a mesura que les cues s'embolcallen l'una al voltant de l'altra.
Els investigadors van aplicar pressió hidrostàtica per crear flux de fluid en un microcanal per estudiar la reologia dels espermatozoides. Es va utilitzar un microcanal amb una mida de 200 µm × 20 µm (amplada × alçada) i una longitud de 3,6 µm. Es van utilitzar microcanals entre els recipients amb xeringues instal·lades als extrems. Es va utilitzar colorant alimentari per fer els canals més visibles.
Lligueu els cables d'interconnexió i els accessoris a la paret. El vídeo es va gravar amb un microscopi de contrast de fase. Amb cada imatge, es presenten imatges de microscòpia de contrast de fase i mapatge. (A) La connexió entre dos corrents resisteix el flux a causa del moviment helicoïdal (fletxa vermella). (B) La connexió entre el feix de tubs i la paret del canal (fletxes vermelles), alhora que estan connectats a dos altres feixos (fletxes grogues). (C) Els feixos d'espermatozoides del canal microfluídic comencen a connectar-se entre si (fletxes vermelles), formant una malla de feixos d'espermatozoides. (D) Formació d'una xarxa de feixos d'espermatozoides.
Quan es carregava una gota d'esperma diluït al dispositiu microfluídic i es creava un flux, es va observar que el feix d'espermatozoides es movia en contra de la direcció del flux. Els feixos s'ajusten perfectament a les parets dels microcanals, i els caps lliures de la part inicial dels feixos s'hi ajusten perfectament (vídeo 5). També s'adhereixen a qualsevol partícula estacionària del seu camí, com ara restes, per evitar ser arrossegats pel corrent. Amb el temps, aquests flocs es converteixen en filaments llargs que atrapen altres espermatozoides individuals i flocs més curts (vídeo 6). A mesura que el flux comença a disminuir, llargues línies d'espermatozoides comencen a formar una xarxa de línies espermàtiques (vídeo 7; figura 2).
A una velocitat de flux elevada (V > 33 µm/s), els moviments en espiral dels fils augmenten en un intent d'atrapar molts espermatozoides individuals formant feixos que resisteixen millor la força de deriva del flux. A una velocitat de flux elevada (V > 33 µm/s), els moviments en espiral dels fils augmenten en un intent d'atrapar molts espermatozoides individuals formant feixos que resisteixen millor la força de deriva del flux. При высокой скорости потока (V > 33 мкм/с) спиралевидные движения нитей усиливаются, постония постолька поймать множество отдельных сперматозоидов, образующих пучки, которые лучше перматозоидов силе потока. A cabals elevats (V > 33 µm/s), els moviments helicoïdals de les fibres augmenten a mesura que intenten atrapar molts espermatozoides individuals formant feixos que són més capaços de resistir millor la força de deriva del flux.在高流速(V > 33 µm/s)时，螺纹的螺旋运动增加，以试图捕捉许多形成束的单个精子，从而更好地抵抗流动的漂移力。在 高 流速 (v> 33 µm/s) 时 ， 的 螺旋 运动 增加 ， 以 试图 许多 形成 束 形成 束 形成 束 动 增加 ，从而 更 地 抵抗 的 漂移力。。。。。。。。。。 При высоких скоростях потока (V > 33 мкм/с) спиральное движение нитей увеличивается в потатхтка множество отдельных сперматозоидов, образующих пучки, чтобы лучше сопротивлше сопротивлятьай маспа. A cabals elevats (V > 33 µm/s), el moviment helicoïdal dels filaments augmenta en un intent de capturar molts espermatozoides individuals formant feixos per resistir millor les forces de deriva del flux.També van intentar fixar microcanals a les parets laterals.
Els feixos d'espermatozoides es van identificar com a grups de caps d'espermatozoides i cues arrissades mitjançant microscòpia òptica (LM). Els feixos d'espermatozoides amb diversos agregats també s'han identificat com a caps retorçats i agregats flagel·lars, múltiples cues d'espermatozoides fusionades, caps d'espermatozoides units a una cua i caps d'espermatozoides amb nuclis corbats com a múltiples nuclis fusionats. microscòpia electrònica de transmissió (TEM). La microscòpia electrònica de rastreig (SEM) va mostrar que els feixos d'espermatozoides eren agregats enfundats de caps d'espermatozoides i els agregats d'espermatozoides mostraven una xarxa unida de cues embolicades.
La morfologia i l'ultraestructura dels espermatozoides, la formació de feixos d'espermatozoides es van estudiar mitjançant microscòpia òptica (mitja secció), microscòpia electrònica de rastreig (SEM) i microscòpia electrònica de transmissió (TEM), els frotis d'espermatozoides es van tenyir amb taronja d'acridina i es van examinar mitjançant microscòpia d'epifluorescència.
La tinció de frotis d'espermatozoides amb taronja d'acridina (Fig. 3B) va mostrar que els caps dels espermatozoides estaven enganxats i coberts de material secretor, cosa que va conduir a la formació de grans flocs (Fig. 3D). Els feixos d'espermatozoides consistien en agregats d'espermatozoides amb una xarxa de cues unides (Fig. 4A-C). Els feixos d'espermatozoides estan compostos per les cues de molts espermatozoides enganxades (Fig. 4D). Els secrets (Fig. 4E, F) cobrien els caps dels feixos d'espermatozoides.
Formació del feix d'espermatozoides Mitjançant microscòpia de contrast de fase i frotis d'espermatozoides tenyits amb taronja d'acridina, es va mostrar que els caps dels espermatozoides s'enganxen. (A) La formació primerenca dels flocs d'espermatozoides comença amb un espermatozoide (cercle blanc) i tres espermatozoides (cercle groc), amb l'espiral començant a la cua i acabant al cap. (B) Microfotografia d'un frotis d'espermatozoides tenyit amb taronja d'acridina que mostra els caps d'espermatozoides adherents (fletxes). La descàrrega cobreix el(s) cap(s). Ampliació × 1000. (C) Desenvolupament d'un gran feix transportat per flux en un canal microfluídic (utilitzant una càmera d'alta velocitat a 950 fps). (D) Micrografia d'un frotis d'espermatozoides tenyit amb taronja d'acridina que mostra grans flocs (fletxes). Ampliació: ×200.
Micrografia electrònica de rastreig d'un feix d'espermatozoides i un frotis d'espermatozoides tenyit amb taronja d'acridina. (A, B, D, E) són micrografies electrònices de rastreig digital en color d'espermatozoides, i C i F són micrografies de frotis d'espermatozoides tenyits amb taronja d'acridina que mostren la unió de múltiples espermatozoides que envolten la xarxa caudal. (AC) Els agregats d'espermatozoides es mostren com una xarxa de cues unides (fletxes). (D) Adhesió de diversos espermatozoides (amb substància adhesiva, contorn rosa, fletxa) que s'envolten al voltant de la cua. (E i F) Agregats del cap de l'espermatozoide (punters) coberts amb material adhesiu (punters). Els espermatozoides van formar feixos amb diverses estructures semblants a vòrtexs (F). (C) Augments de ×400 i (F) ×200.
Mitjançant microscòpia electrònica de transmissió, vam descobrir que els feixos d'espermatozoides tenien cues unides (Fig. 6A, C), caps units a cues (Fig. 6B) o caps units a cues (Fig. 6D). Els caps dels espermatozoides del feixos són corbats, presentant en secció dues regions nuclears (Fig. 6D). Al feixos d'incisió, els espermatozoides tenien un cap retorçat amb dues regions nuclears i múltiples regions flagel·lars (Fig. 5A).
Micrografia electrònica digital en color que mostra les cues de connexió del feix d'espermatozoides i el material aglutinant que connecta els caps dels espermatozoides. (A) Cua adherida d'un gran nombre d'espermatozoides. Observeu com es veu la cua tant en projeccions verticals (fletxa) com horitzontals (fletxa). (B) El cap (fletxa) de l'espermatozoide està connectat a la cua (fletxa). (C) Diverses cues d'espermatozoides (fletxes) estan adherides. (D) El material d'aglutinació (AS, blau) connecta quatre caps dels espermatozoides (morat).
Es va utilitzar microscòpia electrònica de rastreig per detectar caps d'espermatozoides en feixos d'espermatozoides coberts amb secrecions o membranes (Figura 6B), cosa que indica que els feixos d'espermatozoides estaven ancorats per material extracel·lular. El material aglutinat es va concentrar al cap d'espermatozoide (conjunt semblant a un cap de medusa; Fig. 5B) i es va expandir distalment, donant un aspecte groc brillant sota microscòpia de fluorescència quan es tenyeix amb taronja d'acridina (Fig. 6C). Aquesta substància és clarament visible sota un microscopi de rastreig i es considera un aglutinant. Les seccions semifines (Fig. 5C) i els frotis d'espermatozoides tenyits amb taronja d'acridina van mostrar feixos d'espermatozoides que contenien caps densament empaquetats i cues enrotllades (Fig. 5D).
Diverses microfotografies que mostren l'agregació de caps d'espermatozoides i cues plegades utilitzant diversos mètodes. (A) Micrografia electrònica de transmissió digital en color de secció transversal d'un feix d'espermatozoides que mostra un cap d'espermatozoide enrotllat amb un nucli de dues parts (blau) i diverses parts flagel·lars (verd). (B) Micrografia electrònica de rastreig digital en color que mostra un grup de caps d'espermatozoides semblants a meduses (fletxes) que semblen estar coberts. (C) Secció semifina que mostra caps d'espermatozoides agregats (fletxes) i cues enrotllades (fletxes). (D) Micrografia d'un frotis d'espermatozoides tenyit amb taronja d'acridina que mostra agregats de caps d'espermatozoides (fletxes) i cues adherents enrotllades (fletxes). Observeu que una substància enganxosa (S) cobreix el cap de l'espermatozoide. (D) Augment × 1000.
Mitjançant microscòpia electrònica de transmissió (Fig. 7A), també es va observar que els caps dels espermatozoides estaven retorçats i els nuclis tenien forma d'espiral, tal com es va confirmar mitjançant frotis d'espermatozoides tenyits amb taronja d'acridina i examinats mitjançant microscòpia de fluorescència (Fig. 7B).
(A) Micrografia electrònica de transmissió digital en color i (B) Frotis d'espermatozoides tenyit amb taronja d'acridina que mostra els caps enrotllats i la unió dels caps i les cues dels espermatozoides (fletxes). (B) Augment × 1000.
Una troballa interessant és que els espermatozoides de Sharkazi s'agreguen per formar feixos filamentosos mòbils. Les propietats d'aquests feixos ens permeten entendre el seu possible paper en l'absorció i l'emmagatzematge d'espermatozoides a la superfície del subsòl (SST).
Després de l'aparellament, els espermatozoides entren a la vagina i se sotmeten a un intens procés de selecció, la qual cosa fa que només un nombre limitat d'espermatozoides entrin a la SST15,16. Fins ara, els mecanismes pels quals els espermatozoides entren i surten de la SST no estan clars. En les aus de corral, els espermatozoides s'emmagatzemen a la SST durant un període prolongat de 2 a 10 setmanes, depenent de l'espècie6. Hi ha controvèrsia sobre l'estat del semen durant l'emmagatzematge a la SST. Estan en moviment o en repòs? En altres paraules, com mantenen els espermatozoides la seva posició a la SST durant tant de temps?
Forman4 va suggerir que la residència i l'ejecció de la substància subjacent (SST) es podrien explicar en termes de motilitat dels espermatozoides. Els autors plantegen la hipòtesi que els espermatozoides mantenen la seva posició nedant en contra del flux de fluid creat per l'epiteli SST i que els espermatozoides són expulsats de la SST quan la seva velocitat cau per sota del punt en què comencen a moure's cap enrere a causa de la manca d'energia. Zaniboni5 va confirmar la presència d'aquaporines 2, 3 i 9 a la porció apical de les cèl·lules epitelials SST, cosa que pot donar suport indirectament al model d'emmagatzematge d'espermatozoides de Foreman. En l'estudi actual, hem descobert que gairebé la meitat dels espermatozoides de Sharkashi mostren una reologia positiva en el fluid que flueix, i que els feixos d'espermatozoides aglutinats augmenten el nombre d'espermatozoides que mostren una reologia positiva, tot i que l'aglutinació els alenteix. No es coneix completament com els espermatozoides viatgen per la trompa de Fal·lopi de l'ocell fins al lloc de fecundació. En els mamífers, el líquid fol·licular quimioatrau els espermatozoides. Tanmateix, es creu que els quimioatractants dirigeixen els espermatozoides perquè s'acostin a llargues distàncies7. Per tant, altres mecanismes són responsables del transport d'espermatozoides. S'ha informat que la capacitat dels espermatozoides per orientar-se i fluir contra el líquid de les trompes de Fal·lopi alliberat després de l'aparellament és un factor important en la focalització dels espermatozoides en ratolins. Parker 17 va suggerir que els espermatozoides creuen els oviductes nedant contra el corrent ciliar en aus i rèptils. Tot i que no s'ha demostrat experimentalment en aus, Adolphi 18 va ser el primer a descobrir que els espermatozoides aviars donen resultats positius quan es crea una fina capa de líquid entre un cobreobjectes i un portaobjectes amb una tira de paper de filtre. Reologia. Hino i Yanagimachi [19] van col·locar un complex ovari-trompa-uterí de ratolí en un anell de perfusió i van injectar 1 µl de tinta a l'istme per visualitzar el flux de fluid a les trompes de Fal·lopi. Van observar un moviment molt actiu de contracció i relaxació a la trompa de Fal·lopi, en què totes les boles de tinta es movien constantment cap a l'ampolla de la trompa de Fal·lopi. Els autors emfatitzen la importància del flux de líquid tubàric des de les trompes de Fal·lopi inferiors a les superiors per a l'elevació i la fecundació dels espermatozoides. Brillard20 va informar que en pollastres i galls dindis, els espermatozoides migren mitjançant moviment actiu des de l'entrada vaginal, on s'emmagatzemen, fins a la unió uterovaginal, on s'emmagatzemen. Tanmateix, aquest moviment no és necessari entre la unió uterovaginal i l'infundíbul perquè els espermatozoides es transporten per desplaçament passiu. Coneixent aquestes recomanacions prèvies i els resultats obtinguts en l'estudi actual, es pot assumir que la capacitat dels espermatozoides per moure's corrent amunt (reologia) és una de les propietats en què es basa el procés de selecció. Això determina el pas dels espermatozoides a través de la vagina i la seva entrada al CCT per al seu emmagatzematge. Com va suggerir Forman4, això també pot facilitar el procés d'entrada dels espermatozoides a l'SST i el seu hàbitat durant un període de temps i després la seva sortida quan la seva velocitat comença a disminuir.
D'altra banda, Matsuzaki i Sasanami 21 van suggerir que els espermatozoides aviars experimenten canvis de motilitat des de la latència fins a la motilitat en els tractes reproductors masculins i femenins. S'ha proposat la inhibició de la motilitat dels espermatozoides residents a la SST per explicar el llarg temps d'emmagatzematge dels espermatozoides i el posterior rejoveniment després de sortir de la SST. En condicions hipòxiques, Matsuzaki et al. 1 van informar d'una alta producció i alliberament de lactat a la SST, cosa que pot conduir a la inhibició de la motilitat dels espermatozoides residents. En aquest cas, la importància de la reologia dels espermatozoides es reflecteix en la selecció i absorció dels espermatozoides, i no en el seu emmagatzematge.
El patró d'aglutinació d'espermatozoides es considera una explicació plausible per al llarg període d'emmagatzematge d'espermatozoides a la SST, ja que aquest és un patró comú de retenció d'espermatozoides en aus de corral2,22,23. Bakst et al. 2 van observar que la majoria dels espermatozoides s'adherien entre si, formant agregats fasciculars, i rarament es trobaven espermatozoides individuals en CCM de guatlla. D'altra banda, Wen et al. 24 van observar espermatozoides més dispersos i menys flocs d'espermatozoides al lumen de la SST en pollastres. Basant-se en aquestes observacions, es pot suposar que la propensió a l'aglutinació d'espermatozoides difereix entre aus i entre espermatozoides en el mateix ejaculat. A més, Van Krey et al. 9 van suggerir que la dissociació aleatòria dels espermatozoides aglutinats és responsable de la penetració gradual dels espermatozoides al lumen de la trompa de Fal·lopi. Segons aquesta hipòtesi, els espermatozoides amb menor capacitat d'aglutinació haurien de ser expulsats primer de la SST. En aquest context, la capacitat dels espermatozoides per aglutinar-se pot ser un factor que influeixi en el resultat de la competència espermàtica en aus brutes. A més, com més temps es dissocien els espermatozoides aglutinats, més temps es manté la fertilitat.
Tot i que l'agregació d'espermatozoides i l'agregació en feixos s'han observat en diversos estudis2,22,24, no s'han descrit en detall a causa de la complexitat de la seva observació cinemàtica dins del SST. S'han fet diversos intents per estudiar l'aglutinació d'espermatozoides in vitro. Es va observar una agregació extensa però transitòria quan es va treure el filferro prim de la gota de llavor penjant. Això porta al fet que una bombolla allargada sobresurt de la gota, imitant la glàndula seminal. A causa de les limitacions 3D i els curts temps d'assecat per degoteig, tot el bloc va caure ràpidament en mal estat9. En l'estudi actual, utilitzant pollastres Sharkashi i xips microfluídics, vam poder descriure com es formen aquests flocs i com es mouen. Els feixos d'espermatozoides es van formar immediatament després de la recollida de semen i es va trobar que es movien en espiral, mostrant una reologia positiva quan són presents en el flux. A més, quan es veuen macroscòpicament, s'ha observat que els feixos d'espermatozoides augmenten la linealitat de la motilitat en comparació amb els espermatozoides aïllats. Això suggereix que l'aglutinació d'espermatozoides pot produir-se abans de la penetració del lloc d'emmagatzematge (SST) i que la producció d'espermatozoides no es limita a una àrea petita a causa de l'estrès, com s'ha suggerit anteriorment (Tingari i Lake12). Durant la formació del floc, els espermatozoides neden en sincronia fins que formen una unió, després les seves cues s'embolcallen l'una al voltant de l'altra i el cap de l'espermatozoide roman lliure, però la cua i la part distal de l'espermatozoide s'enganxen amb una substància enganxosa. Per tant, el cap lliure del lligament és responsable del moviment, arrossegant la resta del lligament. La microscòpia electrònica de rastreig dels feixos d'espermatozoides va mostrar caps d'espermatozoides adherits coberts amb molt material enganxós, cosa que suggereix que els caps d'espermatozoides estaven units en feixos de repòs, cosa que pot haver ocorregut després d'arribar al lloc d'emmagatzematge (SST).
Quan un frotis d'esperma es tenyeix amb taronja d'acridina, es pot veure material adhesiu extracel·lular al voltant de les cèl·lules espermàtiques sota un microscopi fluorescent. Aquesta substància permet que els feixos d'espermatozoides s'adhereixin i s'aferrin a qualsevol superfície o partícula circumdant, de manera que no es desplacin amb el corrent circumdant. Per tant, les nostres observacions mostren el paper de l'adhesió dels espermatozoides en forma de feixos mòbils. La seva capacitat de nedar contracorrent i adherir-se a les superfícies properes permet que els espermatozoides romanguin més temps a la superfície del subsòl.
Rothschild25 va utilitzar una càmera d'hemocitometria per estudiar la distribució flotant del semen boví en una gota de suspensió, prenent microfotografies a través d'una càmera amb eix òptic tant vertical com horitzontal del microscopi. Els resultats van mostrar que els espermatozoides eren atrets per la superfície de la cambra. Els autors suggereixen que hi pot haver interaccions hidrodinàmiques entre els espermatozoides i la superfície. Tenint això en compte, juntament amb la capacitat del semen de pollastre Sharkashi per formar flocs enganxosos, pot augmentar la probabilitat que el semen s'adhereixi a la paret del tub subjacent al subsòl i s'emmagatzemi durant llargs períodes de temps.
Bccetti i Afzeliu26 van informar que el glicocàlix de l'esperma és necessari per al reconeixement i l'aglutinació dels gàmetes. Forman10 va observar que la hidròlisi dels enllaços α-glicosídics en els recobriments de glicoproteïna-glicolípid mitjançant el tractament del semen aviar amb neuraminidasa va provocar una reducció de la fertilitat sense afectar la motilitat dels espermatozoides. Els autors suggereixen que l'efecte de la neuraminidasa sobre el glicocàlix deteriora el segrest d'espermatozoides a la unió uterovaginal, reduint així la fertilitat. Les seves observacions no poden ignorar la possibilitat que el tractament amb neuraminidasa pugui reduir el reconeixement d'espermatozoides i oòcits. Forman i Engel10 van trobar que la fertilitat es reduïa quan les gallines es van inseminar intravaginalment amb semen tractat amb neuraminidasa. Tanmateix, la FIV amb espermatozoides tractats amb neuraminidasa no va afectar la fertilitat en comparació amb els pollastres de control. Els autors van concloure que els canvis en el recobriment de glicoproteïnes-glicolípids al voltant de la membrana espermàtica van reduir la capacitat dels espermatozoides per fertilitzar, ja que van afectar el segrest d'espermatozoides a la unió uterovaginal, cosa que al seu torn va augmentar la pèrdua d'espermatozoides a causa de la velocitat de la unió uterovaginal, però no va afectar el reconeixement dels espermatozoides i dels òvuls.
En galls dindis, Bakst i Bauchan 11 van trobar petites vesícules i fragments de membrana al lumen de la SST i van observar que alguns d'aquests grànuls s'havien fusionat amb la membrana de l'esperma. Els autors suggereixen que aquestes relacions poden contribuir a l'emmagatzematge a llarg termini d'espermatozoides a la SST. Tanmateix, els investigadors no van especificar la font d'aquestes partícules, si són secretades per cèl·lules epitelials CCT, produïdes i secretades pel sistema reproductor masculí o produïdes pel mateix espermatozoide. A més, aquestes partícules són responsables de l'aglutinació. Grützner et al27 van informar que les cèl·lules epitelials epididimals produeixen i secreten una proteïna específica que es requereix per a la formació de tractes seminals d'un sol porus. Els autors també informen que la dispersió d'aquests feixos depèn de la interacció de les proteïnes epididimals. Nixon et al28 van trobar que els annexos secreten una proteïna, l'osteonectina àcida rica en cisteïna; SPARC està implicat en la formació de flocs d'espermatozoides en equidnes i ornitorincs de bec curt. La dispersió d'aquests feixos està associada amb la pèrdua d'aquesta proteïna.
En l'estudi actual, l'anàlisi ultraestructural mitjançant microscòpia electrònica va mostrar que els espermatozoides s'adherien a una gran quantitat de material dens. Es creu que aquestes substàncies són responsables de l'aglutinació que es condensa entre i al voltant dels caps adherents, però a concentracions més baixes a la regió de la cua. Suposem que aquesta substància aglutinant s'excreta del sistema reproductor masculí (epidídim o conducte deferent) juntament amb el semen, ja que sovint observem que el semen se separa de la limfa i el plasma seminal durant l'ejaculació. S'ha informat que a mesura que els espermatozoides aviars passen per l'epidídim i el conducte deferent, experimenten canvis relacionats amb la maduració que afavoreixen la seva capacitat d'unir-se a proteïnes i adquirir glicoproteïnes associades al lemma plasmàtic. La persistència d'aquestes proteïnes a les membranes espermàtiques residents a la superfície del tub subjacent (SST) suggereix que aquestes proteïnes poden influir en l'adquisició de l'estabilitat de la membrana espermàtica 30 i determinar la seva fertilitat 31. Ahammad et al32 van informar que els espermatozoides obtinguts de diverses parts de l'aparell reproductor masculí (des dels testicles fins al conducte deferent distal) van mostrar un augment progressiu de la viabilitat en condicions d'emmagatzematge líquid, independentment de la temperatura d'emmagatzematge, i la viabilitat en pollastres també augmenta a les trompes de Fal·lopi després de la inseminació artificial.
Els flocs d'esperma de pollastre Sharkashi tenen característiques i funcions diferents que altres espècies com els equidnes, els ornitorincs, els ratolins de bosc, les rates cérvol i els conillets d'Índies. En els pollastres sharkashi, la formació de feixos d'espermatozoides va reduir la seva velocitat de natació en comparació amb els espermatozoides individuals. Tanmateix, aquests feixos van augmentar el percentatge d'espermatozoides reològicament positius i van augmentar la capacitat dels espermatozoides per estabilitzar-se en un entorn dinàmic. Així, els nostres resultats confirmen el suggeriment anterior que l'aglutinació d'espermatozoides en la SST s'associa amb l'emmagatzematge d'espermatozoides a llarg termini. També plantegem la hipòtesi que la propensió dels espermatozoides a formar flocs pot controlar la taxa de pèrdua d'espermatozoides en la SST, cosa que pot alterar el resultat de la competència espermàtica. Segons aquesta suposició, els espermatozoides amb baixa capacitat d'aglutinació alliberen SST primer, mentre que els espermatozoides amb alta capacitat d'aglutinació produeixen la major part de la descendència. La formació de feixos d'espermatozoides d'un sol porus és beneficiosa i afecta la relació pares-fills, però utilitza un mecanisme diferent. En els equidnes i els ornitorincs, els espermatozoides es disposen paral·lelament entre si per augmentar la velocitat d'avanç del feix. Els feixos d'equidnes es mouen unes tres vegades més ràpid que els espermatozoides individuals. Es creu que la formació d'aquests flocs d'espermatozoides en els equidnes és una adaptació evolutiva per mantenir la dominància, ja que les femelles són promíscues i solen aparellar-se amb diversos mascles. Per tant, els espermatozoides de diferents ejaculats competeixen ferotgement per la fertilització de l'òvul.
Els espermatozoides aglutinats de pollastres sharkasis són fàcils de visualitzar mitjançant microscòpia de contrast de fase, cosa que es considera avantatjosa perquè permet un estudi fàcil del comportament dels espermatozoides in vitro. El mecanisme pel qual la formació de flocs d'espermatozoides promou la reproducció en pollastres sharkasis també és diferent del que s'observa en alguns mamífers placentaris que representen un comportament cooperatiu dels espermatozoides, com ara els ratolins de bosc, on alguns espermatozoides arriben als òvuls, ajudant altres individus relacionats a arribar i danyar els seus òvuls. per demostrar-se. comportament altruista. autofecundació 34. Un altre exemple de comportament cooperatiu en espermatozoides es va trobar en ratolins cérvols, on els espermatozoides van ser capaços d'identificar-se i combinar-se amb els espermatozoides més relacionats genèticament i formar grups cooperatius per augmentar la seva velocitat en comparació amb els espermatozoides no relacionats35.
Els resultats obtinguts en aquest estudi no contradiuen la teoria de Foman sobre l'emmagatzematge a llarg termini d'espermatozoides en SWS. Els investigadors informen que els espermatozoides continuen movent-se en el flux de cèl·lules epitelials que recobreixen el SST durant un període de temps prolongat, i després d'un cert període de temps, les reserves d'energia dels espermatozoides s'esgoten, cosa que provoca una disminució de la velocitat, cosa que permet l'expulsió de substàncies de petit pes molecular. L'energia dels espermatozoides amb el flux de fluid des del lumen del SST La cavitat de la trompa de Fal·lopi. En l'estudi actual, vam observar que la meitat dels espermatozoides individuals van mostrar la capacitat de nedar contra els fluids que flueixen, i la seva adhesió al feix va augmentar la seva capacitat de mostrar reologia positiva. A més, les nostres dades són consistents amb les de Matsuzaki et al. 1 que van informar que l'augment de la secreció de lactat en el SST pot inhibir la motilitat dels espermatozoides residents. Tanmateix, els nostres resultats descriuen la formació de lligaments mòbils dels espermatozoides i el seu comportament reològic en presència d'un entorn dinàmic dins d'un microcanal en un intent d'elucidar el seu comportament en el SST. Les futures investigacions es poden centrar en determinar la composició química i l'origen de l'agent aglutinant, cosa que sens dubte ajudarà els investigadors a desenvolupar noves maneres d'emmagatzemar semen líquid i augmentar la durada de la fertilitat.
Quinze sharkasis mascles de coll nu de 30 setmanes d'edat (homozigots dominants; Na Na) van ser seleccionats com a donants d'esperma a l'estudi. Els ocells es van criar a la Granja Avícola de Recerca de la Facultat d'Agricultura de la Universitat d'Ashit, a la governació d'Ashit, Egipte. Els ocells es van allotjar en gàbies individuals (30 x 40 x 40 cm), es van sotmetre a un programa de llum (16 hores de llum i 8 hores de foscor) i es van alimentar amb una dieta que contenia 160 g de proteïna bruta, 2800 kcal d'energia metabolitzable i 35 g de calci cadascuna. 5 grams de fòsfor disponible per quilogram de dieta.
Segons les dades 36 i 37, es va recollir semen d'homes mitjançant massatge abdominal. Es van recollir un total de 45 mostres de semen de 15 homes durant 3 dies. El semen (n = 15/dia) es va diluir immediatament 1:1 (v:v) amb Belsville Poultry Semen Diluent, que conté difosfat de potassi (1,27 g), glutamat monosòdic monohidrat (0,867 g), fructosa (0,5 d), acetat de sodi anhidre (0,43 g), tris(hidroximetil)aminometà (0,195 g), citrat de potassi monohidrat (0,064 g), monofosfat de potassi (0,065 g), clorur de magnesi (0,034 g) i H2O (100 ml), pH = 7,5, osmolaritat 333 mOsm/kg38. Les mostres de semen diluïdes es van examinar primer amb un microscopi òptic per garantir una bona qualitat del semen (humitat) i després es van emmagatzemar en un bany d'aigua a 37 °C fins al seu ús en mitja hora després de la recollida.
La cinemàtica i la reologia dels espermatozoides es descriuen mitjançant un sistema de dispositius microfluídics. Les mostres de semen es van diluir encara més a 1:40 en Beltsville Avian Semen Diluent, es van carregar en un dispositiu microfluídic (vegeu més avall) i els paràmetres cinètics es van determinar mitjançant un sistema d'Anàlisi Computeritzada de Semen (CASA) desenvolupat prèviament per a la caracterització microfluídica. sobre la mobilitat dels espermatozoides en medis líquids (Departament d'Enginyeria Mecànica, Facultat d'Enginyeria, Universitat d'Assiut, Egipte). El complement es pot descarregar a: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39. Es van mesurar la velocitat de la corba (VCL, μm/s), la velocitat lineal (VSL, μm/s) i la velocitat mitjana de la trajectòria (VAP, μm/s). Es van prendre vídeos d'espermatozoides mitjançant un microscopi de contrast de fase invertit Optika XDS-3 (amb objectiu de 40x) connectat a una càmera Tucson ISH1000 a 30 fps durant 3 s. Utilitzeu el programari CASA per estudiar almenys tres àrees i 500 trajectòries d'espermatozoides per mostra. El vídeo gravat es va processar mitjançant un CASA casolà. La definició de motilitat al complement CASA es basa en la velocitat de natació de l'espermatozoide en comparació amb el cabal, i no inclou altres paràmetres com el moviment lateral, ja que s'ha descobert que és més fiable en el flux de fluids. El moviment reològic es descriu com el moviment de les cèl·lules espermàtiques en contra de la direcció del flux de fluids. Els espermatozoides amb propietats reològiques es van dividir pel nombre d'espermatozoides mòbils; els espermatozoides que estaven en repòs i que es movien per convecció es van excloure del recompte.
Tots els productes químics utilitzats es van obtenir d'Elgomhoria Pharmaceuticals (El Caire, Egipte), tret que s'indiqui el contrari. El dispositiu es va fabricar tal com descriuen El-sherry et al. 40 amb algunes modificacions. Els materials utilitzats per fabricar els microcanals incloïen plaques de vidre (Howard Glass, Worcester, MA), resistència negativa SU-8-25 (MicroChem, Newton, CA), alcohol diacetónic (Sigma Aldrich, Steinheim, Alemanya) i poliacetona. -184, Dow Corning, Midland, Michigan). Els microcanals es fabriquen mitjançant litografia tova. Primer, es va imprimir una màscara facial protectora transparent amb el disseny de microcanal desitjat en una impressora d'alta resolució (Prismatic, El Caire, Egipte i Pacific Arts and Design, Markham, ON). Els màsters es van fer utilitzant plaques de vidre com a substrats. Les plaques es van netejar amb acetona, isopropanol i aigua desionitzada i després es van recobrir amb una capa de 20 µm de SU8-25 mitjançant recobriment per centrifugació (3000 rpm, 1 min). Les capes de SU-8 es van assecar suaument (65 °C, 2 min i 95 °C, 10 min) i es van exposar a la radiació UV durant 50 s. Es va coure postexposició a 65 °C i 95 °C durant 1 min i 4 min per reticular les capes de SU-8 exposades, seguit de revelat en alcohol diacetònic durant 6,5 min. Coure els gofres al forn (200 °C durant 15 min) per solidificar encara més la capa de SU-8.
El PDMS es va preparar barrejant el monòmer i l'enduridor en una proporció de pes de 10:1, després es va desgasificar en un dessecador al buit i es va abocar sobre el bastidor principal del SU-8. El PDMS es va curar en un forn (120 °C, 30 min), després es van tallar els canals, es van separar del màster i es van perforar per permetre que es poguessin fixar tubs a l'entrada i sortida del microcanal. Finalment, els microcanals de PDMS es van fixar permanentment a portaobjectes de microscopi mitjançant un processador corona portàtil (Electro-Technic Products, Chicago, IL), tal com es descriu en altres llocs. El microcanal utilitzat en aquest estudi mesura 200 µm × 20 µm (amplada × alçada) i fa 3,6 cm de llarg.
El flux de fluid induït per la pressió hidrostàtica dins del microcanal s'aconsegueix mantenint el nivell de fluid al dipòsit d'entrada per sobre de la diferència d'alçada Δh39 al dipòsit de sortida (Fig. 1).
on f és el coeficient de fricció, definit com f = C/Re per al flux laminar en un canal rectangular, on C és una constant que depèn de la relació d'aspecte del canal, L és la longitud del microcanal, Vav és la velocitat mitjana dins del microcanal, Dh és el diàmetre hidràulic del canal, g – acceleració de la gravetat. Utilitzant aquesta equació, la velocitat mitjana del canal es pot calcular mitjançant l'equació següent: