Nature.comをご利用いただきありがとうございます。お使いのブラウザのバージョンはCSSのサポートが制限されています。最適な閲覧体験のために、最新バージョンのブラウザをご利用いただくか、Internet Explorerの互換表示モードを無効にしてください。当面の間、継続的なサポートを確保するため、スタイルシートとJavaScriptを使用せずにサイトを表示させていただきます。
鳥の繁殖力は、精子貯蔵管（SST）に十分な生存可能な精子を長期間貯蔵できる能力に依存している。精子がSSTに入り、SST内に留まり、SSTから出る正確なメカニズムは依然として議論の的となっている。シャーカシ鶏の精子は凝集傾向が高く、多くの細胞を含む可動性の糸状束を形成した。不透明な卵管内で精子の運動性と挙動を観察することが困難であるため、精子の凝集と運動性を研究するために、精子と同様のマイクロチャネル断面を持つマイクロ流体デバイスを使用した。本研究では、精子束がどのように形成され、どのように移動し、SST内での精子の滞留時間を延長する可能性のある役割について考察する。静水圧（流量 = 33 µm/s）によってマイクロ流体チャネル内で流体の流れを生成したときの精子の速度とレオロジー挙動を調査した。精子は流れに逆らって泳ぐ傾向があり（正のレオロジー）、精子束の速度は単独の精子に比べて著しく低下する。精子束は螺旋状に移動し、より多くの単独の精子が取り込まれるにつれて長さと太さが増していくことが観察されている。 精子の束は、33 µm/s を超える流体流速で流されるのを避けるため、マイクロ流体チャネルの側壁に接近して付着しているのが観察された。 精子の束は、33 µm/s を超える流体流速で流されるのを避けるため、マイクロ流体チャネルの側壁に接近して付着しているのが観察された。 Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрофлюидных каналов, Їтобы избежать сметания со скоростью потока жидкости> 33 мкм / с. 精子束は、33 µm/sを超える流体流速で流されるのを避けるため、マイクロ流体チャネルの側壁に接近して付着することが観察されている。３３μｍ／秒を超える流体流速の通過を避けるために、ビームが微小流体通路の側壁に接近して付着しているのが観察された。33 μm/s で通過。 Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрожидкостного канала,時刻は 33 分/秒です。 精子束は、33 µm/s を超える流体の流れによって流されるのを避けるため、マイクロ流体チャネルの側壁に接近して付着することが観察されている。走査型電子顕微鏡および透過型電子顕微鏡による観察の結果、精子束は豊富な高密度物質によって支えられていることが明らかになった。得られたデータは、シャーカジ鶏の精子の特異な運動性、および精子が凝集して可動性の束を形成する能力を示しており、SMTにおける精子の長期保存に関する理解を深めるのに役立つ。
ヒトやほとんどの動物で受精を達成するには、精子と卵子が適切なタイミングで受精部位に到達する必要があります。したがって、交尾は排卵前または排卵時に行われなければなりません。一方、イヌなどの一部の哺乳類や、昆虫、魚類、爬虫類、鳥類などの非哺乳類種は、卵子が受精の準備が整うまで、生殖器官に精子を長期間貯蔵します（非同期受精 1）。鳥類は、卵子を受精させる能力のある精子の生存能力を 2～10 週間維持することができます 2。
これは鳥類を他の動物と区別する独特の特徴であり、同時交尾と排卵なしに数週間にわたって1回の人工授精で高い受精確率が得られる。精子貯蔵器官である精子貯蔵管（SST）は、子宮膣接合部の内側の粘膜ひだに位置している。現在までに、精子が精子バンクに入り、留まり、出るメカニズムは完全には解明されていない。これまでの研究に基づいて多くの仮説が提唱されてきたが、いずれも確認されていない。
Forman4は、精子がSST上皮細胞に存在するタンパク質チャネルを通る流体の流れの方向とは逆の連続的な振動運動によってSST腔内に留まるという仮説を立てた（レオロジー）。精子をSST内腔に維持するために必要な鞭毛の絶え間ない活動によりATPが枯渇し、運動性は最終的に低下し、精子は流体の流れによって精子バンクから運び出され、卵管を上行して卵子を受精させる新たな旅を始める（Forman4）。この精子貯蔵モデルは、SST上皮細胞に存在するアクアポリン2、3、9の免疫細胞化学による検出によって裏付けられている。現在までに、ニワトリの精液レオロジーとSST貯蔵、膣内精子選択、精子競争におけるその役割に関する研究は不足している。ニワトリでは、自然交尾後に精子が膣に入るが、精子の80%以上は交尾後すぐに膣から排出される。これは、膣が鳥類における精子選択の主要な場所であることを示唆している。さらに、膣内で受精した精子のうちSSTに到達するのは1%未満であることが報告されている2。ヒナの膣内人工授精では、SSTに到達する精子の数は授精後24時間で増加する傾向がある。これまでのところ、この過程における精子選択のメカニズムは不明であり、精子の運動性がSST精子の取り込みに重要な役割を果たしている可能性がある。卵管の壁は厚く不透明であるため、鳥類の卵管内で精子の運動性を直接観察することは困難である。したがって、受精後に精子がどのようにSSTに移行するかについての基礎知識が不足している。
レオロジーは近年、哺乳類の生殖器における精子輸送を制御する重要な因子として認識されている。運動性精子が逆流移動する能力に基づき、Zaferaniら8はコラマイクロ流体システムを用いて、飼育された精液サンプルから運動性精子を受動的に分離した。この種の精液選別は不妊治療や臨床研究に不可欠であり、時間と労力がかかり、精子の形態や構造的完全性を損なう可能性のある従来の方法よりも好ましい。しかし、現在までに、ニワトリの生殖器からの分泌物が精子の運動性に及ぼす影響に関する研究は行われていない。
SSTに貯蔵された精子を維持するメカニズムに関わらず、多くの研究者が、ニワトリ9,10、ウズラ2、および七面鳥11のSST内で常在精子が頭部同士で凝集して凝集精子束を形成することを観察している。著者らは、この凝集とSSTにおける精子の長期保存との間に関連性があると示唆している。
TingariとLake12は、ニワトリの精子受容腺における精子間の強い関連性を報告し、鳥類の精子が哺乳類の精子と同じように凝集するのかどうか疑問を呈した。彼らは、精管内の精子間の深い結合は、狭い空間に多数の精子が存在することによって引き起こされるストレスによるものかもしれないと考えている。
新鮮な吊り下げ式スライド上で精子の挙動を評価すると、特に精液滴の縁に一時的な凝集の兆候が見られる。しかし、凝集は連続的な動きに伴う回転運動によってしばしば阻害され、これがこの現象が一時的なものである理由を説明している。研究者らはまた、精液に希釈液を加えると、細長い「糸状」の細胞凝集体が現れることにも気づいた。
精子を模倣する初期の試みは、垂れ下がった液滴から細いワイヤーを取り除くことによって行われ、その結果、精液の液滴から細長い精子のような小胞が突き出た。精子はすぐに小胞内で平行に並んだが、3D の制限によりユニット全体がすぐに消えてしまった。したがって、精子の凝集を研究するには、単離された精子貯蔵管内で精子の運動性と挙動を直接観察する必要があるが、これは達成が難しい。したがって、精子の運動性と凝集挙動の研究をサポートするために、精子を模倣する装置を開発する必要がある。Brillard ら 13 は、成鳥のヒヨコの精子貯蔵管の平均長さは 400〜600 µm であると報告したが、一部の SST は 2000 µm にもなることがある。 MeroとOgasawara14は精細管を肥大した精子貯蔵管と肥大していない精子貯蔵管に分け、どちらも長さ（約500 µm）と頸部の幅（約38 µm）は同じでしたが、管の平均内腔径はそれぞれ56.6 µmと56.6 µmでした。本研究では、チャネルサイズが200 µm × 20 µm（W × H）のマイクロ流体デバイスを使用しました。このデバイスの断面は、増幅されたSSTの断面にやや近いものです。さらに、流体中の精子の運動性と凝集挙動を調べました。これは、SST上皮細胞によって生成された流体が精子を対向流（レオロジー）方向に管腔内に保持するというForemanの仮説と一致しています。
本研究の目的は、卵管内での精子運動の観察における問題点を克服し、動的な環境下での精子のレオロジーと挙動の研究における困難を回避することであった。ニワトリの生殖器内での精子運動をシミュレートするために、静水圧を発生させるマイクロ流体デバイスを使用した。
希釈した精子サンプル（1:40）をマイクロチャネル装置に一滴注入すると、2種類の精子運動（孤立精子と結合精子）が観察された。さらに、精子は流れに逆らって泳ぐ傾向があった（正のレオロジー特性；動画1、2）。 精子束は単独の精子よりも速度が低かったものの（p < 0.001）、正の走流性を示す精子の割合を増加させた（p < 0.001、表2）。 精子束は単独の精子よりも速度が低かったものの（p < 0.001）、正の走流性を示す精子の割合を増加させた（p < 0.001、表2）。 Хотя пучки сперматозоидов имели более низкую скорость, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), они (p < 0,001; таблица 2)。 精子束は単独の精子よりも速度が低かったものの（p < 0.001）、正の走流性を示す精子の割合を増加させた（p < 0.001、表2）。ストリームの速度は孤立したストリームの速度よりも遅いが（p < 0.001）、顕著な流動性を示すピクセルの百分率は増加しています（p < 0.001; 表 2）。チューブ束の速度は孤独の速度よりも低い (p <0.001) が、示されるアルカリ性流動性のアイコンの百分率が増加しました (p <0.001 ; 2。。。。。))))) Хотя скорость пучков сперматозоидов была ниже, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), они увеличивали (p < 0,001; таблица 2)。 精子束の速度は単一精子の速度よりも低かったものの（p < 0.001）、陽性レオロジーを示す精子の割合は増加した（p < 0.001、表2）。単一精子と精子束の正のレオロジー特性は、それぞれ約53%と85%と推定される。
シャーカシ鶏の精子は射精直後に数十個の個体からなる線状の束を形成することが観察されている。これらの束は時間とともに長さと太さが増し、数時間体外に留まってから消滅する（ビデオ3）。これらの糸状の束は、精巣上体の末端で形成されるハリモグラの精子に似た形をしている。シャーカシ鶏の精液は、採取後1分以内に凝集して網状の束を形成する傾向が高いことがわかっている。これらの束は動的で、近くの壁や静止した物体に付着することができる。精子束は精子の速度を低下させるが、肉眼的には直線性を高めることは明らかである。束の長さは、束に採取された精子の数によって異なる。束は2つの部分に分けられた。凝集した精子の遊離頭部を含む初期部分と、尾部および精子の遠位端全体を含む末端部分である。高速カメラ（950 fps）を用いて観察したところ、凝集した精子の遊離した頭部が束の先端部にあり、その振動運動によって束が動き、残りの精子をらせん状に束の中に引き込んでいることがわかった（動画4）。しかし、長い房では、体と房の末端部に付着した遊離した精子の頭部が羽根のように働き、房の推進力を高めていることが観察された。
ゆっくりとした流体の流れの中では、精子の束は互いに平行に移動しますが、流速が上がると、流れに流されないように、重なり合って静止しているものに付着し始めます。精子の束は、少数の精子細胞が互いに近づくと形成され、同期して動き始め、互いに巻き付き、粘着性のある物質に付着します。図1と図2は、精子が互いに近づき、尾部が互いに巻き付いて接合部を形成する様子を示しています。
研究者らは、精子のレオロジーを研究するために、マイクロチャネル内に静水圧をかけて流体の流れを作り出した。使用したマイクロチャネルは、幅200 µm × 高さ20 µm、長さ3.6 µmのものである。容器間にマイクロチャネルを設置し、両端に注射器を取り付けた。チャネルを目立たせるために食用色素を使用した。
相互接続ケーブルとアクセサリを壁に固定します。このビデオは位相差顕微鏡で撮影されました。各画像には、位相差顕微鏡画像とマッピング画像が表示されます。(A) 2 つの流れの接続部は、らせん運動 (赤い矢印) により流れに抵抗します。(B) チューブ束とチャネル壁 (赤い矢印) の接続部は、同時に他の 2 つの束 (黄色い矢印) にも接続されています。(C) マイクロ流体チャネル内の精子束が互いに接続し始め (赤い矢印)、精子束のメッシュを形成します。(D) 精子束のネットワークの形成。
希釈した精子の液滴をマイクロ流体デバイスに注入して流れを作ると、精子ビームが流れの方向とは逆方向に移動するのが観察された。精子の束はマイクロチャネルの壁にぴったりと密着し、束の最初の部分にある自由頭部も壁にぴったりと密着する（ビデオ5）。また、流れに流されないように、経路上のデブリなどの静止粒子にも付着する。時間が経つにつれて、これらの束は他の単独の精子やより短い束を捕捉する長いフィラメントになる（ビデオ6）。流れが遅くなり始めると、長い精子の列が精子の列のネットワークを形成し始める（ビデオ7、図2）。
流速が高い場合（V > 33 µm/s）、糸のらせん状の動きが増加し、多数の個々の精子を捕捉して束を形成することで、流れの漂流力に抵抗しや​​すくなる。 流速が高い場合（V > 33 µm/s）、糸のらせん状の動きが増加し、多数の個々の精子を捕捉して束を形成することで、流れの漂流力に抵抗しや​​すくなる。 При высокой скорости потока (V > 33 мкм/с) спиралевидные движения нитей усиливаются, поскольку они пытаются поймать множество отдельных сперматозоидов, образующих пучки, которые лучзе противостоят дрейфующей силе 。 流速が高い場合（V > 33 µm/s）、糸状構造のらせん運動が増加し、多くの個々の精子を捕捉して束を形成し、流れの漂流力によりよく抵抗できるようになります。流速が高い場合（Ｖ＞３３μｍ／ｓ）、スクリューの螺旋運動が増加して、形成された単一の液体をより多く捕捉して、流動の漂流にさらに対抗する。高い流速（v>33μm/s）では、らせん運動が増加し、図に示すように、より広範囲に浮遊力に対抗するための束状の描画が形成される。 При высоких скоростях потока (V > 33 мкм/с) спиральное движение нитей увеличивается в попытке захватить множество отдельных сперматозоидов、образующих пучки、чтобы лучзе сопротивляться силам дрейфа потока。 流速が高い場合（V > 33 µm/s）、フィラメントのらせん運動が増加し、多くの個々の精子を束状に捕捉して、流れのドリフト力によりよく抵抗しようとする。彼らはまた、側壁にマイクロチャネルを取り付けることも試みた。
精子束は、光学顕微鏡（LM）を用いて精子の頭部と巻き尾の集まりとして同定された。さまざまな凝集体を持つ精子束は、ねじれた頭部と鞭毛の凝集体、複数の融合した精子尾、尾に付着した精子の頭部、および複数の融合した核として曲がった核を持つ精子の頭部としても同定された。透過型電子顕微鏡（TEM）による観察では、走査型電子顕微鏡（SEM）により、精子束は精子の頭部の鞘状凝集体であり、精子凝集体には巻き付いた尾のネットワークが付着していることが示された。
精子の形態と超微細構造、精子束の形成は、光学顕微鏡（半切片）、走査型電子顕微鏡（SEM）、透過型電子顕微鏡（TEM）を用いて研究され、精子塗抹標本はアクリジンオレンジで染色され、落射蛍光顕微鏡を用いて観察された。
アクリジンオレンジで染色した精子塗抹標本（図3B）では、精子の頭部がくっついて分泌物で覆われ、大きな房状構造を形成していることが示された（図3D）。精子束は、尾部が網状に付着した精子の集合体から構成されていた（図4A-C）。精子束は、多数の精子の尾部がくっついて構成されている（図4D）。分泌物（図4E、F）が精子束の頭部を覆っていた。
精子束の形成 位相差顕微鏡とアクリジンオレンジで染色した精子塗抹標本を用いて、精子の頭部がくっつくことが示された。(A) 初期の精子束の形成は、1 個の精子 (白い円) と 3 個の精子 (黄色い円) から始まり、らせんは尾部から始まり頭部で終わる。(B) アクリジンオレンジで染色した精子塗抹標本の顕微鏡写真。付着した精子の頭部 (矢印) が示されている。分泌物が頭部を覆っている。倍率 × 1000。(C) マイクロ流体チャネル内の流れによって運ばれる大きなビームの発達 (950 fps の高速カメラを使用)。(D) アクリジンオレンジで染色した精子塗抹標本の顕微鏡写真。大きな束 (矢印) が示されている。倍率: × 200。
精子ビームとアクリジンオレンジで染色した精子塗抹標本の走査型電子顕微鏡写真。(A、B、D、E)は精子のデジタルカラー走査型電子顕微鏡写真で、CとFはアクリジンオレンジで染色した精子塗抹標本の顕微鏡写真で、尾部膜を包む複数の精子の付着を示している。(AC)精子凝集体は、付着した尾部(矢印)のネットワークとして示されている。(D)尾部を包む複数の精子(接着物質、ピンクの輪郭、矢印付き)の接着。(EとF)接着物質(ポインタ)で覆われた精子頭部凝集体(ポインタ)。精子はいくつかの渦状構造(F)を持つ束を形成した。(C)は400倍、(F)は200倍の倍率。
透過型電子顕微鏡を用いて観察したところ、精子束には尾部が付着しているもの（図6A、C）、尾部に頭部が付着しているもの（図6B）、または尾部に頭部が付着しているもの（図6D）が見られた。束内の精子の頭部は湾曲しており、断面には2つの核領域が認められた（図6D）。切開束内の精子はねじれた頭部を持ち、2つの核領域と複数の鞭毛領域を有していた（図5A）。
精子束内の連結尾部と精子頭部を連結する凝集物質を示すデジタルカラー電子顕微鏡写真。(A) 多数の精子の尾部が付着している。縦向き(矢印)と横向き(矢印)の両方の投影で尾部がどのように見えるかに注目してください。(B) 精子の頭部(矢印)が尾部(矢印)に連結している。(C) 複数の精子の尾部(矢印)が付着している。(D) 凝集物質(AS、青色)が4つの精子頭部(紫色)を連結している。
走査型電子顕微鏡を用いて、分泌物や膜で覆われた精子束中の精子頭部を検出した（図6B）。これは、精子束が細胞外物質によって固定されていることを示している。凝集物質は精子頭部に集中し（クラゲの頭のような集合体；図5B）、遠位方向に広がっており、アクリジンオレンジで染色すると蛍光顕微鏡下で鮮やかな黄色に見える（図6C）。この物質は走査型顕微鏡下で明瞭に観察でき、結合剤と考えられている。半薄切片（図5C）およびアクリジンオレンジで染色した精子塗抹標本では、密集した頭部と巻き込んだ尾部を含む精子束が観察された（図5D）。
さまざまな方法を用いて精子の頭部と折り畳まれた尾部が凝集している様子を示すさまざまな顕微鏡写真。(A) 精子束の断面デジタルカラー透過型電子顕微鏡写真。2つの部分からなる核(青)といくつかの鞭毛部分(緑)を持つ、コイル状の精子の頭部が写っている。(B) デジタルカラー走査型電子顕微鏡写真。覆われているように見えるクラゲのような精子の頭部(矢印)の塊が写っている。(C) 半薄切片。凝集した精子の頭部(矢印)とカールした尾部(矢印)が写っている。(D) アクリジンオレンジで染色した精子塗抹標本の顕微鏡写真。精子の頭部(矢印)とカールして付着した尾部(矢印)の凝集が写っている。粘着性物質(S)が精子の頭部を覆っていることに注目。(D) 1000倍拡大。
透過型電子顕微鏡（図7A）を用いた観察では、精子の頭部がねじれており、核がらせん状になっていることが確認された。これは、アクリジンオレンジで染色した精子塗抹標本を蛍光顕微鏡で観察した結果（図7B）からも裏付けられる。
（A）デジタルカラー透過型電子顕微鏡写真、および（B）アクリジンオレンジで染色した精子塗抹標本。精子の頭部が巻いており、頭部と尾部が付着している様子が示されている（矢印）。（B）1000倍拡大。
興味深い発見として、シャーカジの精子は凝集して可動性の糸状束を形成することが挙げられます。これらの束の特性を理解することで、精巣上体における精子の吸収と貯蔵におけるその役割を解明できる可能性があります。
交尾後、精子は膣に入り、厳しい選別過程を経て、限られた数の精子のみが精巣上体（SST）に入る15,16。現在まで、精子が精巣上体に出入りするメカニズムは不明である。家禽では、種によって異なるが、精子は精巣上体に2～10週間という長期間保存される6。精巣上体での保存中の精液の状態については議論が続いている。精子は動いているのか、それとも静止しているのか？言い換えれば、精子細胞はどのようにして精巣上体に長期間その位置を維持しているのか？
Forman4は、SSTの滞留と排出は精子の運動性によって説明できると示唆した。著者らは、精子はSST上皮によって作られた流体の流れに逆らって泳ぐことで位置を維持し、エネルギー不足のために後退し始める点よりも速度が低下するとSSTから排出されると仮説を立てた。Zaniboni5は、SST上皮細胞の頂端部分にアクアポリン2、3、9が存在することを確認し、これは間接的にForemanの精子貯蔵モデルを支持する可能性がある。本研究では、Sharkashiの精子のほぼ半分が流体中で正のレオロジーを示し、凝集した精子束は正のレオロジーを示す精子の数を増加させるが、凝集によって速度が低下することがわかった。精子細胞が鳥の卵管を上って受精部位までどのように移動するかは完全には理解されていない。哺乳類では、卵胞液が精子を化学誘引する。しかし、化学誘引物質は精子を長距離にわたって接近させると考えられている7。したがって、精子輸送には他のメカニズムが関与している。交尾後に放出される卵管液に逆らって精子が方向を定めて流れる能力は、マウスの精子を標的とする主要な要因であると報告されている。パーカー17は、鳥類や爬虫類では精子が繊毛流に逆らって泳ぐことで卵管を通過すると示唆した。鳥類では実験的に実証されていないが、アドルフ18は、カバーガラスとスライドガラスの間にろ紙片で薄い液体層を作ると鳥類の精子が陽性反応を示すことを初めて発見した。レオロジー。日野と柳町[19]は、マウスの卵巣-卵管-子宮複合​​体を灌流リングに入れ、峡部に1 µlのインクを注入して卵管内の流体の流れを可視化した。彼らは、卵管内で非常に活発な収縮と弛緩の動きに気づき、すべてのインクボールが卵管膨大部に向かって着実に移動していることを発見した。著者らは、精子の上昇と受精のために、卵管下部から上部への卵管液の流れが重要であることを強調している。Brillard20は、ニワトリと七面鳥では、精子は、貯蔵されている膣入口から、貯蔵されている子宮膣接合部まで能動的な動きで移動すると報告した。しかし、精子は受動的な移動によって運ばれるため、子宮膣接合部と漏斗部の間ではこの動きは必要ない。これらの以前の推奨事項と現在の研究で得られた結果を知ると、精子が上流へ移動する能力（レオロジー）は、選択プロセスの基礎となる特性の1つであると推測できる。これは、精子が膣を通過して貯蔵のためにCCTに入ることを決定する。 Forman4が示唆したように、これは精子がSSTに入り、一定期間その生息環境にとどまり、速度が低下し始めるとそこから出るプロセスを促進する可能性もある。
一方、松崎と笹波21は、鳥類の精子は雄と雌の生殖器内で休眠状態から運動状態へと運動性の変化を起こすと示唆した。SST内での精子の運動性抑制は、精子の長期保存とSSTからの退出後の再生を説明するために提案されている。低酸素条件下では、松崎ら1はSST内で乳酸の高産生と放出を報告しており、これが精子の運動性抑制につながる可能性がある。この場合、精子レオロジーの重要性は精子の選択と吸収に反映され、精子の保存には反映されない。
精子凝集パターンは、精子がSSTに長期間保存されることの妥当な説明と考えられており、これは家禽における精子保持の一般的なパターンである2,22,23。Bakstら2は、ウズラのCCMではほとんどの精子が互いに付着して束状凝集体を形成し、単独の精子はほとんど見られないことを観察した。一方、Wenら24は、ニワトリのSST内腔では、より多くの散在した精子とより少ない精子の束を観察した。これらの観察に基づくと、精子凝集傾向は鳥類間および同じ射精液中の精子間で異なると考えられる。さらに、Van Kreyら9は、凝集した精子のランダムな解離が、精子の卵管内腔への徐々の侵入の原因であると示唆した。この仮説によれば、凝集能力の低い精子はまず精巣から排出されるはずである。このことから、精子の凝集能力は、汚れた鳥における精子競争の結果に影響を与える要因となり得る。さらに、凝集した精子が解離する時間が長いほど、受精能力は長く維持される。
精子の凝集や束への凝集はいくつかの研究2,22,24で観察されているが、SST内での運動学的観察の複雑さのため、詳細には記述されていない。体外での精子凝集の研究にはいくつかの試みがなされてきた。垂れ下がった種子滴から細いワイヤーを取り除くと、広範囲にわたるが一時的な凝集が観察された。これにより、精液腺を模倣した細長い気泡が滴から突き出るという事実につながる。3Dの制限と短い滴下乾燥時間のため、ブロック全体がすぐに崩壊した9。本研究では、シャークシ鶏とマイクロ流体チップを使用して、これらの房がどのように形成され、どのように移動するかを記述することができた。精子束は精液採取直後に形成され、流れの中に存在すると正のレオロジーを示し、螺旋状に移動することがわかりました。さらに、肉眼で観察すると、精子束は単離された精子と比較して運動の直線性を高めることが観察された。これは、精子凝集がSST侵入前に起こり、精子産生が以前示唆されていたようにストレスによる狭い領域に限定されていないことを示唆している（TingariとLake12）。タフト形成中、精子は同期して泳ぎ、接合部を形成し、その後尾部が互いに巻き付き、精子の頭部は自由なままだが、尾部と精子の遠位部は粘着性物質でくっつく。したがって、靭帯の自由な頭部が動きを担い、靭帯の残りの部分を引っ張る。精子束の走査型電子顕微鏡観察では、付着した精子の頭部が多くの粘着性物質で覆われていることが示され、精子の頭部が静止束に付着していることが示唆され、これは貯蔵部位（SST）に到達した後に起こった可能性がある。
精子塗抹標本をアクリジンオレンジで染色すると、蛍光顕微鏡下で精子細胞の周囲に細胞外接着物質が観察される。この物質により、精子束は周囲の表面や粒子に付着し、流れに流されることなく留まることができる。したがって、我々の観察結果は、移動可能な精子束という形での精子の接着の役割を示している。流れに逆らって泳ぎ、近くの表面に付着する能力によって、精子はSST（海水表面温度）内に長く留まることができる。
Rothschild25は、血球計算盤カメラを用いて、懸濁液滴中のウシ精液の浮遊分布を研究し、顕微鏡の垂直および水平光軸の両方でカメラを通して顕微鏡写真を撮影した。その結果、精子はチャンバーの表面に引き寄せられることが示された。著者らは、精子と表面の間に流体力学的相互作用がある可能性を示唆している。これを考慮すると、シャークシヒナの精液が粘着性のある房を形成する能力と相まって、精液がSSTの壁に付着し、長期間保存される可能性が高まる可能性がある。
BccettiとAfzeliu26は、精子のグリコカリックスが配偶子の認識と凝集に必要であることを報告した。Forman10は、鳥類の精液をノイラミニダーゼで処理して糖タンパク質-糖脂質コーティングのα-グリコシド結合を加水分解すると、精子の運動性には影響せずに受精率が低下することを観察した。著者らは、グリコカリックスに対するノイラミニダーゼの影響が子宮膣接合部での精子隔離を阻害し、それによって受精率が低下することを示唆している。彼らの観察では、ノイラミニダーゼ処理が精子と卵母細胞の認識を低下させる可能性を無視することはできない。FormanとEngel10は、雌鶏にノイラミニダーゼ処理した精液を膣内授精すると受精率が低下することを発見した。しかし、ノイラミニダーゼ処理した精子を用いた体外受精は、対照鶏と比較して受精率に影響を与えなかった。著者らは、精子膜周囲の糖タンパク質-糖脂質コーティングの変化が、子宮膣接合部での精子の隔離を阻害することで精子の受精能力を低下させ、その結果、子宮膣接合部の移動速度によって精子の損失が増加するが、精子と卵子の認識には影響しないと結論付けた。
七面鳥では、Bakst と Bauchan 11 は SST の内腔に小さな小胞と膜断片を発見し、これらの顆粒の一部が精子膜と融合していることを観察した。著者らは、これらの関係が SST での精子の長期保存に寄与している可能性があると示唆している。しかし、研究者らは、これらの粒子が CCT 上皮細胞によって分泌されるのか、雄の生殖器系によって生成および分泌されるのか、または精子自体によって生成されるのか、その起源を特定しなかった。また、これらの粒子は凝集の原因である。Grützner ら 27 は、精巣上皮細胞が単孔精管の形成に必要な特定のタンパク質を生成および分泌すると報告した。著者らはまた、これらの束の分散は精巣上体タンパク質の相互作用に依存すると報告している。Nixon ら 28 は、付属器が酸性システインリッチオステオネクチンというタンパク質を分泌することを発見した。 SPARCは、ハリモグラやカモノハシにおける精子束の形成に関与している。これらの精子束の散乱は、このタンパク質の消失と関連している。
本研究では、電子顕微鏡を用いた超微細構造解析により、精子が大量の高密度物質に付着していることが示された。これらの物質は、付着した頭部の間や周囲に凝集する凝集に関与していると考えられているが、尾部では濃度が低い。射精時に精液がリンパ液や精漿から分離する様子がしばしば観察されることから、この凝集物質は精液とともに雄の生殖器系（精巣上体または精管）から排出されると推測される。鳥類の精子は精巣上体や精管を通過する際に、タンパク質結合能や血漿膜関連糖タンパク質の獲得能を支える成熟関連の変化を受けることが報告されている。SST内の常在精子膜にこれらのタンパク質が持続的に存在することは、これらのタンパク質が精子膜の安定性獲得に影響を与え、受精能を決定づける可能性があることを示唆している。 Ahammadら32は、男性生殖器系のさまざまな部分（精巣から精管遠位部まで）から得られた精子は、保存温度に関係なく、液体保存条件下で生存率が徐々に増加し、ニワトリの生存率も人工授精後に卵管内で増加することを報告した。
シャーカシ鶏の精子束は、ハリモグラ、カモノハシ、アカネズミ、シカネズミ、モルモットなどの他の種とは異なる特徴と機能を持っています。シャーカシ鶏では、精子束の形成により、単一の精子と比較して遊泳速度が低下しました。しかし、これらの束はレオロジー的に陽性の精子の割合を増加させ、動的な環境下での精子の安定化能力を高めました。したがって、私たちの結果は、SSTにおける精子凝集が長期精子貯蔵と関連しているという以前の示唆を裏付けています。また、精子が束を形成する傾向がS​​STにおける精子損失率を制御し、精子競争の結果を変える可能性があると仮説を立てました。この仮説によれば、凝集能力の低い精子が最初にSSTを放出し、凝集能力の高い精子が子孫の大部分を生産します。単一孔精子束の形成は有益であり、親子比に影響を与えますが、異なるメカニズムを使用します。ハリモグラやカモノハシでは、精子が互いに平行に並んでおり、ビームの前進速度を高めている。ハリモグラの精子の束は、単独の精子よりも約3倍速く移動する。ハリモグラにおけるこのような精子の束の形成は、雌が乱交的で通常複数の雄と交尾するため、優位性を維持するための進化的な適応であると考えられている。そのため、異なる射精液由来の精子は、卵子の受精をめぐって激しく競争する。
シャーカシ鶏の凝集精子は位相差顕微鏡で容易に観察でき、体外での精子の挙動を容易に研究できるため有利であると考えられている。シャーカシ鶏の精子房形成が繁殖を促進するメカニズムは、一部の精子が卵子に到達し、他の関連個体が卵子に到達して損傷するのを助けるアカネズミなどの協力的な精子行動を示す胎盤哺乳類に見られるものとも異なっている。 34. 精子の協力行動のもう1つの例はシカネズミで見られ、精子は遺伝的に最も関連のある精子を識別して結合し、協力グループを形成して、無関係の精子と比較して速度を上げることができた35。
この研究で得られた結果は、SWSにおける精子の長期保存に関するFomanの理論と矛盾しない。研究者らは、精子細胞はSSTを覆う上皮細胞の流れの中で長期間動き続け、一定期間後には精子細胞のエネルギー貯蔵が枯渇し、速度が低下して低分子量物質の排出が可能になると報告している。精子のエネルギーはSSTの内腔からの流体の流れによって失われる。現在の研究では、単一精子の半数が流体の流れに逆らって泳ぐ能力を示し、束の中での接着によって正のレオロジーを示す能力が増加することを観察した。さらに、我々のデータは、SSTにおける乳酸分泌の増加が常在精子の運動性を阻害する可能性があると報告したMatsuzakiら1のデータと一致している。しかしながら、本研究の結果は、マイクロチャネル内の動的な環境下における精子運動靭帯の形成とそのレオロジー的挙動を記述しており、SSTにおけるそれらの挙動を解明する試みである。今後の研究では、凝集剤の化学組成と起源の特定に焦点を当てる可能性があり、これは間違いなく、研究者が液体精液の保存方法を開発し、受精可能期間を延長するのに役立つだろう。
本研究では、精子提供者として、生後30週齢の裸首雄シャーカシ（ホモ接合優性；Na Na）15羽を選定した。これらの鳥は、エジプト、アシット県、アシット大学農学部の研究養鶏場で飼育された。鳥は個別のケージ（30 x 40 x 40 cm）に収容され、16時間の明期と8時間の暗期の光周期プログラムが適用され、粗タンパク質160 g、代謝エネルギー2800 kcal、カルシウム35 g、利用可能なリン5 g/kgの飼料が与えられた。
データ36、37によると、腹部マッサージにより男性から精液を採取した。3日間で15人の男性から合計45の精液サンプルを採取した。精液（n = 15/日）は、リン酸二カリウム（1.27 g）、グルタミン酸ナトリウム一水和物（0.867 g）、果糖（0.5 g）、無水酢酸ナトリウム（0.43 g）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（0.195 g）、クエン酸カリウム一水和物（0.064 g）、リン酸一カリウム（0.065 g）、塩化マグネシウム（0.034 g）、およびH2O（100 ml）を含むBelsville Poultry Semen Diluentで直ちに1:1（v:v）に希釈した。pH = 7.5、浸透圧333 mOsm/kg38。希釈した精液サンプルは、まず光学顕微鏡で検査して精液の質（水分量）が良好であることを確認し、その後、採取後30分以内に使用するまで37℃の恒温水槽に保存した。
精子の運動学とレオロジーは、マイクロ流体デバイスのシステムを使用して記述されます。精液サンプルは、Beltsville Avian Semen Diluentでさらに1:40に希釈され、マイクロ流体デバイス（下記参照）にロードされ、マイクロ流体特性評価用に以前に開発されたコンピュータ化精液分析（CASA）システムを使用して運動パラメータが決定されました。液体媒体中の精子の移動性について（エジプト、アシュート大学工学部機械工学科）。プラグインは、http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39 からダウンロードできます。曲線速度（VCL、μm/s）、線速度（VSL、μm/s）、および平均軌道速度（VAP、μm/s）が測定されました。精子の動画は、Tucson ISH1000 カメラに接続された倒立型 Optika XDS-3 位相差顕微鏡 (40 倍対物レンズ付き) を使用して 3 秒間 30 fps で撮影されました。CASA ソフトウェアを使用して、サンプルごとに少なくとも 3 つの領域と 500 の精子軌跡を調べます。記録された動画は、自作の CASA を使用して処理されました。CASA プラグインでの運動性の定義は、流速と比較した精子の遊泳速度に基づいており、流体の流れではより信頼性が高いことがわかっているため、左右の動きなどの他のパラメータは含まれていません。レオロジー運動は、流体の流れの方向とは逆方向の精子細胞の動きとして説明されます。レオロジー特性を持つ精子は、運動性精子の数で除算されました。静止している精子と対流運動している精子はカウントから除外されました。
特に断りのない限り、使用したすべての化学物質はElgomhoria Pharmaceuticals（エジプト、カイロ）から入手した。デバイスはEl-sherryら40によって記載された方法で製造され、一部変更が加えられている。マイクロチャネルの作製に使用した材料には、ガラス板（Howard Glass、マサチューセッツ州ウースター）、SU-8-25ネガレジスト（MicroChem、カリフォルニア州ニュートン）、ジアセトンアルコール（Sigma Aldrich、ドイツ、シュタインハイム）、ポリアセトン（-184、Dow Corning、ミシガン州ミッドランド）が含まれる。マイクロチャネルはソフトリソグラフィーを使用して作製される。まず、高解像度プリンター（Prismatic、エジプト、カイロおよびPacific Arts and Design、オンタリオ州マーカム）で、目的のマイクロチャネル設計の透明な保護フェイスマスクを印刷した。マスターは、基板としてガラス板を使用して作製した。プレートをアセトン、イソプロパノール、脱イオン水で洗浄し、スピンコーティング（3000 rpm、1 分）により 20 µm の SU8-25 層をコーティングした。次に SU-8 層を穏やかに乾燥させ（65 °C、2 分、95 °C、10 分）、50 秒間 UV 照射した。露光後、65 °C および 95 °C で 1 分および 4 分ベーキングして、露光された SU-8 層を架橋し、続いてジアセトンアルコールで 6.5 分間現像した。ワッフルをハードベーキング（200 °C、15 分）して、SU-8 層をさらに固化させた。
PDMSは、モノマーと硬化剤を重量比10:1で混合し、真空デシケーターで脱気した後、SU-8メインフレームに流し込んで作製した。PDMSはオーブン（120℃、30分）で硬化させ、その後、チャネルを切り出し、マスターから分離し、マイクロチャネルの入口と出口にチューブを取り付けられるように穴を開けた。最後に、PDMSマイクロチャネルは、他の文献に記載されているように、ポータブルコロナプロセッサ（Electro-Technic Products、シカゴ、イリノイ州）を使用して顕微鏡スライドに永久的に接着した。本研究で使用したマイクロチャネルは、200 µm × 20 µm（幅×高さ）で、長さは3.6 cmである。
マイクロチャネル内の静水圧によって誘発される流体の流れは、入口リザーバー内の液面を出口リザーバー内の高さの差Δh39よりも高く維持することによって実現される（図1）。
ここで、f は摩擦係数であり、矩形チャネル内の層流の場合、f = C/Re と定義されます。ここで、C はチャネルのアスペクト比に依存する定数、L はマイクロチャネルの長さ、Vav はマイクロチャネル内の平均速度、Dh はチャネルの水力直径、g は重力加速度です。この式を使用すると、次の式を使用して平均チャネル速度を計算できます。