Bedankt voor uw bezoek aan Nature.com. De browserversie die u gebruikt, biedt beperkte CSS-ondersteuning. Voor de beste ervaring raden we u aan een bijgewerkte browser te gebruiken (of de compatibiliteitsmodus in Internet Explorer uit te schakelen). Om de ondersteuning te blijven garanderen, zullen we de site in de tussentijd zonder stijlen en JavaScript weergeven.
De vruchtbaarheid van vogels hangt af van hun vermogen om voldoende levensvatbaar sperma gedurende een langere periode op te slaan in de spermaopslagbuisjes (SST). Het precieze mechanisme waarmee sperma de SST binnenkomt, erin verblijft en deze verlaat, is nog steeds controversieel. Het sperma van sharkasi-kippen vertoonde een sterke neiging tot agglutinatie, waarbij beweeglijke, draadachtige bundels met veel cellen werden gevormd. Omdat het moeilijk is om de beweeglijkheid en het gedrag van sperma in een ondoorzichtige eileider te observeren, gebruikten we een microfluïdisch apparaat met een microkanaaldoorsnede die vergelijkbaar is met die van sperma om de agglutinatie en beweeglijkheid van sperma te bestuderen. Deze studie bespreekt hoe spermabundels zich vormen, hoe ze bewegen en hun mogelijke rol bij het verlengen van de verblijfsduur van sperma in de SST. We onderzochten de snelheid en het reologische gedrag van sperma wanneer vloeistofstroming werd gegenereerd in een microfluïdisch kanaal door hydrostatische druk (stroomsnelheid = 33 µm/s). De zaadcellen hebben de neiging om tegen de stroom in te zwemmen (positieve reologie) en de snelheid van de zaadcelbundel is aanzienlijk lager dan die van individuele zaadcellen. Er is waargenomen dat zaadcelbundels in een spiraal bewegen en in lengte en dikte toenemen naarmate er meer individuele zaadcellen bij betrokken raken. Er werd waargenomen dat spermabundels de zijwanden van de microfluïdische kanalen naderden en zich eraan vasthechtten om te voorkomen dat ze door de vloeistofstroom met een snelheid van > 33 µm/s werden meegesleurd. Er werd waargenomen dat spermabundels de zijwanden van de microfluïdische kanalen naderden en zich eraan vasthechtten om te voorkomen dat ze door de vloeistofstroom met een snelheid van > 33 µm/s werden meegesleurd. Als u dit wilt, kunt u het beste met uw geld verdienen en uw geld verdienen микрофлюидных каналов, чтобы избежать сметания со скоростью потока жидкости> 33 мкм / с. Er is waargenomen dat spermabundels de zijwanden van de microfluïdische kanalen naderen en eraan vastkleven om te voorkomen dat ze worden meegesleurd bij vloeistofstroomsnelheden van meer dan 33 µm/s.33 µm/s > 33 µm/s33 µm/s Als u dit wilt, kunt u het beste met uw geld verdienen en uw geld verdienen микрожидкостного канала, чтобы en збежать сметания waterverbruik > 33 мкм/с. Er is waargenomen dat spermabundels de zijwanden van het microfluïdische kanaal naderen en eraan vastkleven om te voorkomen dat ze door de vloeistofstroom met een snelheid van >33 µm/s worden meegesleurd.Scanning- en transmissie-elektronenmicroscopie onthulden dat de spermabundels werden ondersteund door overvloedig dicht materiaal. De verkregen gegevens tonen de unieke beweeglijkheid van Sharkazi-kippensperma aan, evenals het vermogen van sperma om te agglutineren en beweeglijke bundels te vormen, wat bijdraagt ​​aan een beter begrip van de langdurige opslag van sperma in SMT.
Om bevruchting bij mensen en de meeste dieren te bewerkstelligen, moeten zaadcellen en eicellen op het juiste moment op de bevruchtingsplaats aankomen. Daarom moet de paring plaatsvinden vóór of tijdens de ovulatie. Aan de andere kant slaan sommige zoogdieren, zoals honden, maar ook niet-zoogdiersoorten, zoals insecten, vissen, reptielen en vogels, zaadcellen gedurende een langere periode op in hun voortplantingsorganen totdat hun eicellen klaar zijn voor bevruchting (asynchrone bevruchting 1). Vogels kunnen de levensvatbaarheid van zaadcellen die eicellen kunnen bevruchten gedurende 2 tot 10 weken behouden 2.
Dit is een uniek kenmerk dat vogels onderscheidt van andere dieren, omdat het een hoge kans op bevruchting biedt na een enkele inseminatie gedurende meerdere weken, zonder gelijktijdige paring en ovulatie. Het belangrijkste orgaan voor spermaopslag, de spermaopslagbuis (SST), bevindt zich in de interne slijmvliesplooien bij de overgang tussen baarmoeder en vagina. Tot op heden zijn de mechanismen waarmee sperma de spermabank binnenkomt, er verblijft en deze verlaat nog niet volledig begrepen. Op basis van eerdere studies zijn veel hypothesen geopperd, maar geen enkele daarvan is bevestigd.
Forman4 opperde de hypothese dat zaadcellen hun verblijf in de SST-holte behouden door continue oscillerende beweging tegen de richting van de vloeistofstroom in via eiwitkanalen in de epitheelcellen van de SST (reologie). ATP raakt uitgeput door de constante flagellaire activiteit die nodig is om de zaadcellen in het lumen van de SST te houden, en de beweeglijkheid neemt uiteindelijk af totdat de zaadcellen door de vloeistofstroom uit de spermabank worden meegevoerd en aan een nieuwe reis door de opstijgende eileider beginnen om de eicel te bevruchten (Forman4). Dit model van spermaopslag wordt ondersteund door de detectie, via immunocytochemie, van aquaporinen 2, 3 en 9 in de epitheelcellen van de SST. Tot op heden ontbreken studies naar de reologie van kippensperma en de rol ervan bij SST-opslag, vaginale spermaselectie en spermacompetitie. Bij kippen komt sperma na natuurlijke paring in de vagina terecht, maar meer dan 80% van de zaadcellen wordt kort na de paring weer uit de vagina verwijderd. Dit suggereert dat de vagina de primaire plaats is voor spermaselectie bij vogels. Bovendien is gerapporteerd dat minder dan 1% van de in de vagina bevruchte zaadcellen uiteindelijk in de SST's terechtkomt². Bij kunstmatige inseminatie van kuikens in de vagina neemt het aantal zaadcellen dat de SST bereikt toe 24 uur na de inseminatie. Tot nu toe is het mechanisme van spermaselectie tijdens dit proces onduidelijk, en de beweeglijkheid van zaadcellen speelt mogelijk een belangrijke rol bij de opname van zaadcellen in de SST. Vanwege de dikke en ondoorzichtige wanden van de eileiders is het moeilijk om de beweeglijkheid van zaadcellen in de eileiders van vogels direct te monitoren. Daarom ontbreekt het ons aan fundamentele kennis over hoe zaadcellen na de bevruchting de SST bereiken.
Reologie is recentelijk erkend als een belangrijke factor die het spermatransport in de geslachtsorganen van zoogdieren beïnvloedt. Gebaseerd op het vermogen van beweeglijke zaadcellen om tegen de stroom in te migreren, gebruikten Zaferani et al.⁸ een Corra-microfluidisch systeem om beweeglijke zaadcellen passief te isoleren uit verzamelde spermamonsters. Dit type spermasortering is essentieel voor de medische behandeling van onvruchtbaarheid en klinisch onderzoek, en heeft de voorkeur boven traditionele methoden die tijdrovend en arbeidsintensief zijn en de morfologie en structurele integriteit van zaadcellen kunnen aantasten. Tot op heden zijn er echter geen studies uitgevoerd naar het effect van afscheidingen uit de geslachtsorganen van kippen op de beweeglijkheid van zaadcellen.
Ongeacht het mechanisme dat ervoor zorgt dat sperma in de SST wordt opgeslagen, hebben veel onderzoekers waargenomen dat aanwezige spermatozoën in de SST van kippen 9, 10, kwartels 2 en kalkoenen 11 kop-aan-kop agglutineren en zo agglutinerende spermabundels vormen. De auteurs suggereren dat er een verband bestaat tussen deze agglutinatie en de langdurige opslag van spermatozoën in de SST.
Tingari en Lake12 rapporteerden een sterke associatie tussen zaadcellen in de zaadontvangende klier van de kip en vroegen zich af of vogelzaadcellen op dezelfde manier agglutineren als zoogdierzaadcellen. Zij zijn van mening dat de diepe verbindingen tussen zaadcellen in de zaadleider te wijten kunnen zijn aan de stress die wordt veroorzaakt door de aanwezigheid van een groot aantal zaadcellen in een kleine ruimte.
Bij het bestuderen van het gedrag van zaadcellen op verse, hangende objectglaasjes zijn tijdelijke tekenen van agglutinatie te zien, vooral aan de randen van de zaaddruppels. De agglutinatie werd echter vaak verstoord door de rotatiebeweging die gepaard gaat met continue beweging, wat de tijdelijke aard van dit fenomeen verklaart. De onderzoekers merkten ook op dat er langwerpige, draadachtige celaggregaten ontstonden wanneer er een verdunningsmiddel aan het sperma werd toegevoegd.
Vroege pogingen om een ​​zaadcel na te bootsen werden gedaan door een dunne draad uit een hangende druppel te verwijderen, waardoor een langwerpige, zaadcelachtige blaas uit de druppel sperma stak. De zaadcellen schikten zich onmiddellijk parallel in de blaas, maar de hele eenheid verdween snel door de 3D-beperking. Om de agglutinatie van zaadcellen te bestuderen, is het daarom noodzakelijk om de beweeglijkheid en het gedrag van zaadcellen rechtstreeks in geïsoleerde zaadcelopslagbuisjes te observeren, wat moeilijk te realiseren is. Het is daarom nodig om een ​​instrument te ontwikkelen dat zaadcellen nabootst ter ondersteuning van onderzoek naar de beweeglijkheid en het agglutinatiegedrag van zaadcellen. Brillard et al.13 rapporteerden dat de gemiddelde lengte van zaadcelopslagbuisjes bij volwassen kuikens 400-600 µm is, maar dat sommige SST's wel 2000 µm lang kunnen zijn. Mero en Ogasawara14 verdeelden de zaadbuisjes in vergrote en niet-vergrote zaadopslagbuisjes, die beide dezelfde lengte (~500 µm) en halsbreedte (~38 µm) hadden, maar de gemiddelde lumendiameter van de buisjes was respectievelijk 56,6 en 11,2 µm. In de huidige studie gebruikten we een microfluïdisch apparaat met een kanaalgrootte van 200 µm × 20 µm (B × H), waarvan de dwarsdoorsnede enigszins overeenkomt met die van de vergrote SST. Daarnaast onderzochten we de beweeglijkheid en agglutinatie van sperma in een stromende vloeistof, wat consistent is met de hypothese van Foreman dat de vloeistof die door de epitheelcellen van de SST wordt geproduceerd, het sperma in het lumen vasthoudt in een tegenstroomse (reologische) richting.
Het doel van deze studie was om de problemen bij het observeren van de beweeglijkheid van zaadcellen in de eileider te overwinnen en de moeilijkheden bij het bestuderen van de reologie en het gedrag van zaadcellen in een dynamische omgeving te vermijden. Er werd gebruik gemaakt van een microfluïdisch apparaat dat hydrostatische druk genereert om de beweeglijkheid van zaadcellen in de geslachtsorganen van een kip te simuleren.
Toen een druppel van een verdund spermamonster (1:40) in het microkanaalapparaat werd gebracht, konden twee soorten sperma-motiliteit worden geïdentificeerd (geïsoleerd sperma en gebonden sperma). Bovendien hadden de zaadcellen de neiging om tegen de stroom in te zwemmen (positieve reologie; video 1, 2). Hoewel spermabundels een lagere snelheid hadden dan individuele zaadcellen (p < 0,001), verhoogden ze het percentage zaadcellen met positieve rheotaxis (p < 0,001; Tabel 2). Hoewel spermabundels een lagere snelheid hadden dan individuele zaadcellen (p < 0,001), verhoogden ze het percentage zaadcellen met positieve rheotaxis (p < 0,001; Tabel 2). Als u een product wilt kopen, kunt u dit doen (p < 0,001), met een indicatie van de waarde, демонстрирующих положительный реотаксис (p < 0,001; таблица 2). Hoewel de spermabundels een lagere snelheid hadden dan die van individuele zaadcellen (p < 0,001), verhoogden ze het percentage zaadcellen dat positieve rheotaxis vertoonde (p < 0,001; Tabel 2).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度（p < 0,001，但它们增加了显示阳性流变性的精子百分比（p < 0,001；表2）。尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 (p <0,001) ， 但 增加 了 显示 阳性 流变性 精子百分比 (p <0,001; 2。。。。。。）））））） Als u een lager percentage wilt, kunt u een lager percentage krijgen (p < 0,001), of увеличивали процент сперматозоидовс положительной реологией (p < 0,001; таблица 2). Hoewel de snelheid van spermabundels lager was dan die van individuele zaadcellen (p < 0,001), verhoogden ze het percentage zaadcellen met positieve reologie (p < 0,001; Tabel 2).De kans op positieve reologie voor individuele zaadcellen en zaadcelbundels wordt geschat op respectievelijk ongeveer 53% en 85%.
Er is waargenomen dat de zaadcellen van sharkashi-kippen direct na de ejaculatie lineaire bundels vormen, bestaande uit tientallen individuen. Deze bundels nemen in de loop van de tijd in lengte en dikte toe en kunnen in vitro enkele uren blijven bestaan ​​voordat ze uiteenvallen (video 3). Deze draadachtige bundels hebben de vorm van echidna-zaadcellen die zich aan het einde van de epididymis vormen. Het sperma van sharkashi-kippen blijkt een sterke neiging te hebben tot agglutinatie en vormt binnen een minuut na de verzameling een netvormige bundel. Deze bundels zijn dynamisch en kunnen zich hechten aan nabijgelegen wanden of statische objecten. Hoewel spermabundels de snelheid van de zaadcellen verminderen, is het duidelijk dat ze macroscopisch gezien hun lineariteit vergroten. De lengte van de bundels varieert afhankelijk van het aantal zaadcellen dat in de bundels wordt verzameld. Twee delen van de bundel werden geïsoleerd: het beginstuk, inclusief de vrije kop van de geagglutineerde zaadcel, en het eindstuk, inclusief de staart en het gehele distale uiteinde van de zaadcel. Met behulp van een hogesnelheidscamera (950 fps) werden vrije koppen van samengeklonterde zaadcellen waargenomen in het begin van de bundel. Deze koppen waren verantwoordelijk voor de beweging van de bundel door hun oscillerende beweging, waarbij ze de overige zaadcellen met een spiraalvormige beweging de bundel in trokken (Video 4). Bij langere bundels werd echter waargenomen dat sommige vrije zaadcelkoppen aan het lichaam en het eindgedeelte van de bundel vastzaten en als schoepen fungeerden om de bundel voort te stuwen.
In een langzaam stromende vloeistof bewegen de spermabundels parallel aan elkaar. Naarmate de stroomsnelheid toeneemt, beginnen ze elkaar echter te overlappen en aan alles wat stilstaat te kleven, zodat ze niet door de stroming worden meegesleurd. De bundels ontstaan ​​wanneer een handvol spermacellen elkaar nadert, synchroon begint te bewegen, zich om elkaar heen wikkelt en zich vervolgens aan een kleverige substantie hecht. Figuur 1 en 2 laten zien hoe de spermacellen elkaar naderen en een verbinding vormen doordat de staarten zich om elkaar heen wikkelen.
De onderzoekers pasten hydrostatische druk toe om vloeistofstroming in een microkanaal te creëren en zo de reologie van sperma te bestuderen. Er werd gebruikgemaakt van een microkanaal met een afmeting van 200 µm × 20 µm (breedte × hoogte) en een lengte van 3,6 µm. De microkanalen werden geplaatst tussen containers met spuiten aan de uiteinden. Voedingskleurstof werd gebruikt om de kanalen beter zichtbaar te maken.
Bevestig de verbindingskabels en accessoires aan de muur. De video is opgenomen met een fasecontrastmicroscoop. Bij elke afbeelding worden fasecontrastmicroscopie- en mappingbeelden getoond. (A) De verbinding tussen twee stromen biedt weerstand aan de stroming door de spiraalvormige beweging (rode pijl). (B) De verbinding tussen de buizenbundel en de kanaalwand (rode pijlen), die tegelijkertijd verbonden zijn met twee andere bundels (gele pijlen). (C) Spermabundels in het microfluïdische kanaal beginnen zich met elkaar te verbinden (rode pijlen) en vormen een netwerk van spermabundels. (D) Vorming van een netwerk van spermabundels.
Toen een druppel verdund sperma in het microfluïdische apparaat werd gebracht en er een stroming werd gecreëerd, werd waargenomen dat de spermabundel zich tegen de stroomrichting in bewoog. De bundels sloten nauw aan op de wanden van de microkanalen, en de vrije koppen in het begin van de bundels sloten er nauw tegenaan (video 5). Ze hechtten zich ook vast aan stationaire deeltjes op hun pad, zoals vuil, om te voorkomen dat ze door de stroming werden meegesleurd. Na verloop van tijd werden deze plukjes lange filamenten die andere individuele zaadcellen en kortere plukjes insloten (video 6). Naarmate de stroming vertraagde, begonnen lange slierten sperma een netwerk van spermalijnen te vormen (video 7; figuur 2).
Bij een hoge stroomsnelheid (V > 33 µm/s) nemen de spiraalvormige bewegingen van de draden toe in een poging om veel individuele zaadcellen te vangen en zo bundels te vormen die beter bestand zijn tegen de drijvende kracht van de stroming. Bij een hoge stroomsnelheid (V > 33 µm/s) nemen de spiraalvormige bewegingen van de draden toe in een poging om veel individuele zaadcellen te vangen en zo bundels te vormen die beter bestand zijn tegen de drijvende kracht van de stroming. Hoge temperatuur (V > 33 мкм/с) dit is een goede oplossing Zorg ervoor dat u de juiste keuze maakt. Bij hoge stroomsnelheden (V > 33 µm/s) nemen de spiraalvormige bewegingen van de strengen toe, omdat ze proberen veel individuele zaadcellen te vangen en bundels te vormen die beter bestand zijn tegen de drijvende kracht van de stroming.在高流速(V > 33 µm/s) Meer informatie Er zijn geen producten gevonden die aan je zoekcriteria voldoen.在 高 流速 (v> 33 µm/s) 时 的 螺旋 运动 增加 ， 以 试图 许多 形成 束 单 个 精子 ，从而 更 地 抵抗 的 漂移力。。。。。。。。。。 Hoge temperatuur (V > 33 мкм/с) захватить множество отдельных Zorg ervoor dat u de juiste keuze maakt. Bij hoge stroomsnelheden (V > 33 µm/s) neemt de spiraalvormige beweging van de filamenten toe in een poging om veel individuele zaadcellen te vangen en bundels te vormen om de driftkrachten van de stroming beter te weerstaan.Ze probeerden ook microkanalen aan de zijwanden te bevestigen.
Spermabundels werden met behulp van lichtmicroscopie (LM) geïdentificeerd als clusters van spermakoppen en gekrulde staarten. Spermabundels met verschillende aggregaten werden ook geïdentificeerd als gedraaide koppen en flagellaire aggregaten, meerdere vergroeide spermastaarten, spermakoppen die aan een staart vastzaten, en spermakoppen met gebogen kernen als meerdere vergroeide kernen. Scanningelektronenmicroscopie (SEM) toonde aan dat de spermabundels omhulde aggregaten van spermakoppen waren en dat de sperma-aggregaten een aangehecht netwerk van opgerolde staarten vertoonden.
De morfologie en ultrastructuur van zaadcellen, evenals de vorming van zaadcelbundels, werden bestudeerd met behulp van lichtmicroscopie (halve doorsnede), scanningelektronenmicroscopie (SEM) en transmissie-elektronenmicroscopie (TEM). Spermapreparaten werden gekleurd met acridine-oranje en onderzocht met behulp van epifluorescentiemicroscopie.
Sperma-uitstrijkjes die gekleurd werden met acridine-oranje (Fig. 3B) lieten zien dat de spermakoppen aan elkaar vastzaten en bedekt waren met secretoir materiaal, wat leidde tot de vorming van grote plukjes (Fig. 3D). De spermabundels bestonden uit sperma-aggregaten met een netwerk van aangehechte staarten (Fig. 4A-C). Spermabundels zijn samengesteld uit de staarten van vele aan elkaar vastzittende spermatozoa (Fig. 4D). Secretoir materiaal (Fig. 4E,F) bedekte de koppen van de spermabundels.
Vorming van de spermabundel. Met behulp van fasecontrastmicroscopie en sperma-uitstrijkjes gekleurd met acridine-oranje werd aangetoond dat de koppen van de spermatozoën aan elkaar kleven. (A) De vroege vorming van een spermabundel begint met één spermacel (witte cirkel) en drie spermacellen (gele cirkel), waarbij de spiraal begint bij de staart en eindigt bij de kop. (B) Microfoto van een sperma-uitstrijkje gekleurd met acridine-oranje, waarop aan elkaar klevende spermakoppen te zien zijn (pijlen). De ontlading bedekt de kop(pen). Vergroting × 1000. (C) Ontwikkeling van een grote bundel die door stroming in een microfluïdisch kanaal wordt getransporteerd (met behulp van een hogesnelheidscamera met 950 fps). (D) Microfoto van een sperma-uitstrijkje gekleurd met acridine-oranje, waarop grote bundels te zien zijn (pijlen). Vergroting: × 200.
Scanning elektronenmicroscopische opname van een spermabundel en een sperma-uitstrijkje gekleurd met acridine-oranje. (A, B, D, E) zijn digitale kleurenscanning elektronenmicroscopische opnamen van zaadcellen, en C en F zijn microscopische opnamen van met acridine-oranje gekleurde sperma-uitstrijkjes die de hechting van meerdere zaadcellen rond het staartweb laten zien. (AC) Sperma-aggregaten worden weergegeven als een netwerk van aangehechte staarten (pijlen). (D) Hechting van meerdere zaadcellen (met kleefstof, roze omlijning, pijl) die zich rond de staart wikkelen. (E en F) Aggregaten van spermakoppen (aanwijzers) bedekt met kleefmateriaal (aanwijzers). De zaadcellen vormden bundels met verschillende wervelachtige structuren (F). (C) vergroting ×400 en (F) ×200.
Met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie ontdekten we dat spermabundels staarten hadden die eraan vastzaten (Fig. 6A, C), koppen die aan staarten vastzaten (Fig. 6B), of koppen die aan staarten vastzaten (Fig. 6D). De koppen van de zaadcellen in de bundel zijn gebogen en vertonen in doorsnede twee kerngebieden (Fig. 6D). In de incisiebundel hadden de zaadcellen een gedraaide kop met twee kerngebieden en meerdere flagellaire gebieden (Fig. 5A).
Digitale kleurenelektronenmicroscoopafbeelding die de verbindende staarten in de spermabundel en het agglutinerende materiaal dat de spermakoppen verbindt, laat zien. (A) Aangehechte staart van een groot aantal zaadcellen. Let op hoe de staart eruitziet in zowel portret- (pijl) als landschapsprojectie (pijl). (B) De kop (pijl) van de zaadcel is verbonden met de staart (pijl). (C) Verschillende spermastaarten (pijlen) zijn aan elkaar bevestigd. (D) Agglutinerend materiaal (AS, blauw) verbindt vier spermakoppen (paars).
Scanningelektronenmicroscopie werd gebruikt om spermakoppen te detecteren in spermabundels die bedekt waren met secreties of membranen (Figuur 6B), wat erop wijst dat de spermabundels verankerd waren door extracellulair materiaal. Het geagglutineerde materiaal was geconcentreerd in de spermakop (een soort kwalkopachtige structuur; Fig. 5B) en breidde zich distaal uit, waardoor het een heldergele kleur kreeg onder fluorescentiemicroscopie na kleuring met acridine-oranje (Fig. 6C). Deze substantie is duidelijk zichtbaar onder een scanningelektronenmicroscoop en wordt beschouwd als een bindmiddel. Semidunne coupes (Fig. 5C) en spermapreparaten gekleurd met acridine-oranje toonden spermabundels met dicht opeengepakte koppen en gekrulde staarten (Fig. 5D).
Verschillende fotomicrografieën die de aggregatie van spermakoppen en opgevouwen staarten laten zien, gemaakt met diverse methoden. (A) Doorsnede digitale kleuren transmissie-elektronenmicroscoopafbeelding van een spermabundel met een opgerolde spermakop met een tweedelige kern (blauw) en verschillende flagellaire delen (groen). (B) Digitale kleuren scanning-elektronenmicroscoopafbeelding van een cluster van kwalachtige spermakoppen (pijlen) die bedekt lijken te zijn. (C) Semi-dunne doorsnede met geaggregeerde spermakoppen (pijlen) en gekrulde staarten (pijlen). (D) Microfoto van een sperma-uitstrijkje gekleurd met acridine-oranje met aggregaten van spermakoppen (pijlen) en gekrulde, vastzittende staarten (pijlen). Merk op dat een kleverige substantie (S) de kop van de spermatozoïde bedekt. ​​(D) Vergroting × 1000.
Met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie (Fig. 7A) werd ook vastgesteld dat de spermakoppen gedraaid waren en de kernen een spiraalvorm hadden, zoals bevestigd door spermapreparaten gekleurd met acridine-oranje en onderzocht met behulp van fluorescentiemicroscopie (Fig. 7B).
(A) Digitale kleurentransmissie-elektronenmicroscoopafbeelding en (B) met acridine-oranje gekleurd spermapreparaat met opgerolde koppen en de aanhechting van spermakoppen en -staarten (pijlen). (B) Vergroting × 1000.
Een interessante bevinding is dat het sperma van Sharkazi zich samenvoegt tot beweeglijke, draadachtige bundels. De eigenschappen van deze bundels stellen ons in staat hun mogelijke rol te begrijpen bij de absorptie en opslag van zaadcellen in de SST.
Na de paring komen de zaadcellen in de vagina terecht en ondergaan ze een intensief selectieproces, waardoor slechts een beperkt aantal zaadcellen de SST bereikt15,16. Tot op heden zijn de mechanismen waarmee zaadcellen de SST binnenkomen en verlaten onduidelijk. Bij pluimvee worden zaadcellen gedurende een langere periode van 2 tot 10 weken in de SST bewaard, afhankelijk van de soort6. Er bestaat nog steeds controverse over de toestand van het sperma tijdens de opslag in de SST. Zijn ze in beweging of in rust? Met andere woorden, hoe behouden zaadcellen hun positie in de SST zo lang?
Forman4 suggereerde dat het verblijf en de uitstoting van sperma in de SST verklaard kunnen worden in termen van de beweeglijkheid van het sperma. De auteurs veronderstellen dat sperma zijn positie behoudt door tegen de vloeistofstroom in te zwemmen die door het SST-epitheel wordt gecreëerd en dat sperma uit de SST wordt gestoten wanneer de snelheid onder het punt daalt waarop het door energiegebrek achteruit begint te bewegen. Zaniboni5 bevestigde de aanwezigheid van aquaporinen 2, 3 en 9 in het apicale gedeelte van de SST-epitheelcellen, wat Foremans model voor spermaopslag indirect zou kunnen ondersteunen. In de huidige studie vonden we dat bijna de helft van Sharkashi's spermatozoa een positieve reologie vertoont in de stromende vloeistof en dat geagglutineerde spermabundels het aantal spermatozoa met een positieve reologie verhogen, hoewel agglutinatie ze vertraagt. Hoe spermacellen door de eileider van de vogel naar de bevruchtingsplaats reizen, is nog niet volledig duidelijk. Bij zoogdieren trekt het follikelvocht spermatozoa chemoattractief aan. Er wordt echter aangenomen dat chemoattractanten zaadcellen ertoe aanzetten om lange afstanden af ​​te leggen7. Daarom zijn er andere mechanismen verantwoordelijk voor het transport van zaadcellen. Het vermogen van zaadcellen om zich te oriënteren en tegen de vloeistof in de eileiders in te stromen die vrijkomt na de paring, is een belangrijke factor gebleken bij het gericht transporteren van zaadcellen bij muizen. Parker 17 suggereerde dat zaadcellen de eileiders passeren door tegen de trilhaarstroom in te zwemmen bij vogels en reptielen. Hoewel dit niet experimenteel is aangetoond bij vogels, was Adolphi18 de eerste die ontdekte dat vogelzaadcellen positieve resultaten opleveren wanneer een dunne laag vloeistof tussen een dekglaasje en een objectglas wordt gecreëerd met een strook filtreerpapier. Reologie. Hino en Yanagimachi [19] plaatsten een muizen-ovarium-eileider-baarmoedercomplex in een perfusiering en injecteerden 1 µl inkt in de isthmus om de vloeistofstroom in de eileiders te visualiseren. Ze observeerden een zeer actieve beweging van samentrekking en ontspanning in de eileider, waarbij alle inktbolletjes zich gestaag naar de ampulla van de eileider bewogen. De auteurs benadrukken het belang van de vloeistofstroom in de eileider van het onderste naar het bovenste deel voor het opstijgen van sperma en de bevruchting. Brillard20 rapporteerde dat bij kippen en kalkoenen spermatozoën door actieve beweging migreren van de vaginale ingang, waar ze worden opgeslagen, naar de utero-vaginale overgang, waar ze worden opgeslagen. Deze beweging is echter niet nodig tussen de utero-vaginale overgang en het infundibulum, omdat de spermatozoën daar door passieve verplaatsing worden getransporteerd. Gezien deze eerdere aanbevelingen en de resultaten van het huidige onderzoek, kan worden aangenomen dat het vermogen van spermatozoën om stroomopwaarts te bewegen (reologie) een van de eigenschappen is waarop het selectieproces is gebaseerd. Dit bepaalt de passage van spermatozoën door de vagina en hun toegang tot de CCT voor opslag. Zoals Forman4 suggereerde, kan dit er ook voor zorgen dat spermacellen de SST en de bijbehorende omgeving gedurende een bepaalde tijd binnengaan en er vervolgens weer uitstromen wanneer hun snelheid afneemt.
Aan de andere kant suggereerden Matsuzaki en Sasanami 21 dat aviaire zaadcellen veranderingen in hun beweeglijkheid ondergaan, van een rusttoestand naar een beweeglijke toestand, in de mannelijke en vrouwelijke voortplantingsorganen. Remming van de beweeglijkheid van aanwezige zaadcellen in de SST is voorgesteld als verklaring voor de lange bewaartijd van zaadcellen en de daaropvolgende verjonging na het verlaten van de SST. Onder hypoxische omstandigheden rapporteerden Matsuzaki et al. 1 een hoge productie en afgifte van lactaat in de SST, wat kan leiden tot remming van de beweeglijkheid van aanwezige zaadcellen. In dit geval komt het belang van de reologie van zaadcellen tot uiting in de selectie en absorptie van zaadcellen, en niet in hun opslag.
Het agglutinatiepatroon van sperma wordt beschouwd als een plausibele verklaring voor de lange bewaartijd van sperma in de SST, aangezien dit een veelvoorkomend patroon van spermaretentie is bij pluimvee2,22,23. Bakst et al. 2 observeerden dat de meeste spermatozoa aan elkaar kleefden en fasciculaire aggregaten vormden, en dat individuele spermatozoa zelden werden aangetroffen in het CCM van kwartels. Aan de andere kant observeerden Wen et al. 24 meer verspreide spermatozoa en minder spermatozoënbundels in het lumen van de SST bij kippen. Op basis van deze observaties kan worden aangenomen dat de neiging tot sperma-agglutinatie verschilt tussen vogels en tussen spermatozoa in hetzelfde ejaculaat. Daarnaast suggereerden Van Krey et al. 9 dat willekeurige dissociatie van geagglutineerde spermatozoa verantwoordelijk is voor de geleidelijke penetratie van spermatozoa in het lumen van de eileider. Volgens deze hypothese zouden spermatozoa met een lagere agglutinatiecapaciteit als eerste uit de SST worden verwijderd. In deze context kan het vermogen van zaadcellen om te agglutineren een factor zijn die de uitkomst van spermacompetitie bij vuile vogels beïnvloedt. Bovendien geldt: hoe langer de geagglutineerde zaadcellen uiteenvallen, hoe langer de vruchtbaarheid behouden blijft.
Hoewel sperma-aggregatie en de vorming van bundels in verschillende studies zijn waargenomen2,22,24, zijn deze niet gedetailleerd beschreven vanwege de complexiteit van de kinematische waarneming ervan binnen de SST. Er zijn verschillende pogingen gedaan om sperma-agglutinatie in vitro te bestuderen. Uitgebreide maar tijdelijke aggregatie werd waargenomen toen de dunne draad van de hangende zaaddruppel werd verwijderd. Dit leidde ertoe dat een langwerpige bel uit de druppel stak, die de zaadklier nabootste. Door 3D-beperkingen en korte droogtijden viel het hele blok snel uiteen9. In de huidige studie, met behulp van Sharkashi-kippen en microfluïdische chips, konden we beschrijven hoe deze bundels zich vormen en hoe ze bewegen. Spermabundels vormden zich direct na het verzamelen van sperma en bleken in een spiraal te bewegen, waarbij ze een positieve reologie vertoonden in de stroming. Bovendien werd macroscopisch waargenomen dat spermabundels een grotere lineariteit van de beweeglijkheid vertoonden in vergelijking met geïsoleerde spermatozoën. Dit suggereert dat sperma-agglutinatie kan optreden vóór de penetratie van de SST en dat de spermaproductie niet beperkt is tot een klein gebied als gevolg van stress, zoals eerder werd gesuggereerd (Tingari en Lake12). Tijdens de vorming van de bundel zwemmen de spermatozoa synchroon totdat ze een verbinding vormen, waarna hun staarten zich om elkaar heen wikkelen en de kop van de spermatozo vrij blijft, terwijl de staart en het distale deel van de spermatozo aan elkaar kleven met een kleverige substantie. De vrije kop van het ligament is dus verantwoordelijk voor de beweging en sleept de rest van het ligament mee. Scanningelektronenmicroscopie van de spermabundels toonde aangehechte spermakoppen bedekt met veel kleverig materiaal, wat suggereert dat de spermakoppen aan elkaar vastzaten in rustende bundels, wat mogelijk is gebeurd nadat de opslagplaats (SST) was bereikt.
Wanneer een spermapreparaat wordt gekleurd met acridine-oranje, is onder een fluorescentiemicroscoop extracellulair adhesief materiaal rond de spermacellen zichtbaar. Deze substantie zorgt ervoor dat spermabundels zich kunnen hechten aan omringende oppervlakken of deeltjes, zodat ze niet met de stroming meedrijven. Onze waarnemingen tonen dus de rol aan van de adhesie van spermatozoën in de vorm van beweeglijke bundels. Hun vermogen om tegen de stroom in te zwemmen en zich aan nabijgelegen oppervlakken te hechten, stelt spermatozoën in staat langer in de zeewateroppervlaktetemperatuur (SST) te blijven.
Rothschild25 gebruikte een hemocytometriecamera om de zwevende verdeling van rundersperma in een druppel suspensie te bestuderen, waarbij fotomicrografieën werden gemaakt met een camera met zowel een verticale als een horizontale optische as van de microscoop. De resultaten toonden aan dat de zaadcellen werden aangetrokken tot het oppervlak van de kamer. De auteurs suggereren dat er mogelijk hydrodynamische interacties zijn tussen het sperma en het oppervlak. Rekening houdend hiermee, samen met het vermogen van Sharkashi-kippensperma om kleverige plukjes te vormen, zou dit de kans kunnen vergroten dat sperma aan de wand van de SST hecht en gedurende langere tijd kan worden bewaard.
Bccetti en Afzeliu26 rapporteerden dat de glycocalyx van sperma nodig is voor gametenherkenning en agglutinatie. Forman10 observeerde dat hydrolyse van α-glycosidische bindingen in glycoproteïne-glycolipidecoatings door behandeling van vogelzaad met neuraminidase resulteerde in verminderde vruchtbaarheid zonder de beweeglijkheid van het sperma te beïnvloeden. De auteurs suggereren dat het effect van neuraminidase op de glycocalyx de afzetting van sperma in de baarmoeder-vaginale overgang belemmert, waardoor de vruchtbaarheid afneemt. Hun observaties kunnen de mogelijkheid niet uitsluiten dat behandeling met neuraminidase de herkenning van sperma en eicel kan verminderen. Forman en Engel10 ontdekten dat de vruchtbaarheid afnam wanneer hennen intravaginaal werden geïnsemineerd met sperma behandeld met neuraminidase. IVF met met neuraminidase behandeld sperma had echter geen invloed op de vruchtbaarheid in vergelijking met controlekippen. De auteurs concludeerden dat veranderingen in de glycoproteïne-glycolipide-coating rond het spermamembraan het vermogen van sperma om te bevruchten verminderden door de afzetting van sperma bij de overgang tussen baarmoeder en vagina te belemmeren. Dit leidde op zijn beurt tot meer spermaverlies als gevolg van de snelheid waarmee de overgang plaatsvindt, maar had geen invloed op de herkenning tussen sperma en eicel.
Bij kalkoenen vonden Bakst en Bauchan 11 kleine blaasjes en membraanfragmenten in het lumen van de zaadbuis en observeerden dat sommige van deze korrels waren versmolten met het spermamembraan. De auteurs suggereren dat deze relaties kunnen bijdragen aan de langdurige opslag van spermatozoa in de zaadbuis. De onderzoekers specificeerden echter niet de bron van deze deeltjes, of ze worden afgescheiden door epitheelcellen van de zaadbuis, geproduceerd en afgescheiden door het mannelijke voortplantingssysteem, of geproduceerd door het sperma zelf. Deze deeltjes zijn ook verantwoordelijk voor agglutinatie. Grützner et al27 rapporteerden dat epididymale epitheelcellen een specifiek eiwit produceren en afscheiden dat nodig is voor de vorming van zaadbuizen met één porie. De auteurs melden ook dat de verspreiding van deze bundels afhangt van de interactie van epididymale eiwitten. Nixon et al28 ontdekten dat de adnexa een eiwit afscheiden, het zure cysteïnerijke osteonectine; SPARC speelt een rol bij de vorming van spermabundels bij kortsnuitige miereneters en vogelbekdieren. De verstrooiing van deze bundels wordt in verband gebracht met het verlies van dit eiwit.
In de huidige studie toonde ultrastructurele analyse met behulp van elektronenmicroscopie aan dat de zaadcellen zich hechtten aan een grote hoeveelheid dicht materiaal. Men vermoedt dat deze stoffen verantwoordelijk zijn voor de agglutinatie die condenseert tussen en rond de hechtende koppen, maar in lagere concentraties in het staartgebied. We nemen aan dat deze agglutinerende stof samen met het sperma wordt uitgescheiden door het mannelijke voortplantingssysteem (epididymis of zaadleider), aangezien we vaak zien dat sperma zich scheidt van lymfe en zaadplasma tijdens de ejaculatie. Er is gerapporteerd dat vogelzaadcellen, wanneer ze de epididymis en zaadleider passeren, rijpingsgerelateerde veranderingen ondergaan die hun vermogen ondersteunen om eiwitten te binden en plasma-lemma-geassocieerde glycoproteïnen te verwerven. De persistentie van deze eiwitten op de aanwezige spermamembranen in de SST suggereert dat deze eiwitten de verwerving van spermamembraanstabiliteit kunnen beïnvloeden 30 en hun vruchtbaarheid kunnen bepalen 31. Ahammad et al32 rapporteerden dat zaadcellen verkregen uit verschillende delen van het mannelijke voortplantingssysteem (van de testikels tot de distale zaadleider) een progressieve toename in levensvatbaarheid vertoonden onder vloeibare bewaarcondities, ongeacht de bewaartemperatuur, en dat de levensvatbaarheid bij kippen ook toeneemt in de eileiders na kunstmatige inseminatie.
Spermabundels van Sharkashi-kippen hebben andere kenmerken en functies dan die van andere soorten, zoals echidna's, vogelbekdieren, bosmuizen, hertenratten en cavia's. Bij Sharkashi-kippen verminderde de vorming van spermabundels hun zwemsnelheid in vergelijking met individuele zaadcellen. Deze bundels verhoogden echter het percentage reologisch positieve zaadcellen en verbeterden het vermogen van zaadcellen om zichzelf te stabiliseren in een dynamische omgeving. Onze resultaten bevestigen dus de eerdere suggestie dat sperma-agglutinatie in SST (Surface Storage Technology) verband houdt met langdurige spermaopslag. We veronderstellen ook dat de neiging van sperma om bundels te vormen de snelheid van spermaverlies in SST kan beïnvloeden, wat de uitkomst van spermacompetitie kan veranderen. Volgens deze veronderstelling verlaten zaadcellen met een lage agglutinatiecapaciteit de SST het eerst, terwijl zaadcellen met een hoge agglutinatiecapaciteit het grootste deel van het nageslacht produceren. De vorming van spermabundels met één porie is gunstig en beïnvloedt de ouder-kindverhouding, maar gebruikt een ander mechanisme. Bij mierenegels en vogelbekdieren zijn de zaadcellen parallel aan elkaar gerangschikt om de voorwaartse snelheid van de bundel te verhogen. Bundels zaadcellen bewegen bij mierenegels ongeveer drie keer sneller dan afzonderlijke zaadcellen. Men vermoedt dat de vorming van dergelijke zaadcelbundels bij mierenegels een evolutionaire aanpassing is om dominantie te behouden, aangezien vrouwtjes promiscue zijn en meestal met meerdere mannetjes paren. Zaadcellen uit verschillende zaadlozingen concurreren daarom fel om de bevruchting van de eicel.
Geagglutineerde zaadcellen van sharkasi-kippen zijn gemakkelijk te visualiseren met behulp van fasecontrastmicroscopie, wat als een voordeel wordt beschouwd omdat het een gemakkelijke studie van het gedrag van zaadcellen in vitro mogelijk maakt. Het mechanisme waarmee de vorming van zaadcelklompjes de voortplanting bij sharkasi-kippen bevordert, verschilt ook van dat bij sommige placentale zoogdieren die coöperatief zaadcelgedrag vertonen, zoals bosmuizen, waar sommige zaadcellen de eicellen bereiken en andere verwante individuen helpen om hun eicellen te bereiken en te beschadigen. Dit is altruïstisch gedrag. Zelfbevruchting 34. Een ander voorbeeld van coöperatief gedrag bij zaadcellen werd gevonden bij hertenmuizen, waar zaadcellen in staat waren om de meest genetisch verwante zaadcellen te identificeren en zich ermee te combineren en coöperatieve groepen te vormen om hun snelheid te verhogen ten opzichte van niet-verwante zaadcellen35.
De resultaten van deze studie spreken Fomans theorie over de langdurige opslag van zaadcellen in SWS niet tegen. De onderzoekers melden dat zaadcellen gedurende een langere periode blijven bewegen in de stroom van epitheelcellen die de SST bekleden, en dat na verloop van tijd de energiereserves van de zaadcellen uitgeput raken, wat resulteert in een afname van de snelheid. Dit maakt de uitstoting van kleine moleculaire stoffen mogelijk, waardoor de energie van de zaadcellen wordt overgedragen door de vloeistofstroom vanuit het lumen van de SST, de holte van de eileider. In de huidige studie observeerden we dat de helft van de individuele zaadcellen het vermogen vertoonde om tegen de vloeistofstroom in te zwemmen, en dat hun adhesie in een bundel hun vermogen tot positieve reologie vergrootte. Bovendien komen onze gegevens overeen met die van Matsuzaki et al. 1, die rapporteerden dat een verhoogde lactaatsecretie in SST de beweeglijkheid van aanwezige zaadcellen kan remmen. Onze resultaten beschrijven echter de vorming van beweeglijke ligamenten van zaadcellen en hun reologisch gedrag in een dynamische omgeving binnen een microkanaal, in een poging om hun gedrag in SST te verklaren. Toekomstig onderzoek kan zich richten op het bepalen van de chemische samenstelling en oorsprong van het agglutinerende middel, wat onderzoekers ongetwijfeld zal helpen bij het ontwikkelen van nieuwe manieren om vloeibaar sperma te bewaren en de vruchtbaarheidsduur te verlengen.
Vijftien 30 weken oude mannelijke sharkasi-kippen zonder halsband (homozygoot dominant; Na Na) werden geselecteerd als spermadonoren voor het onderzoek. De vogels werden gefokt op de onderzoeksboerderij van de Faculteit Landbouw van de Universiteit van Ashit, gouvernement Ashit, Egypte. De vogels werden individueel gehuisvest in kooien (30 x 40 x 40 cm), onderworpen aan een lichtprogramma (16 uur licht en 8 uur donker) en gevoed met een dieet dat 160 g ruw eiwit, 2800 kcal metaboliseerbare energie, 35 g calcium en 5 gram beschikbaar fosfor per kilogram voer bevatte.
Volgens gegevens 36, 37 werd sperma verzameld van mannetjes door middel van abdominale massage. In totaal werden 45 spermamonsters verzameld van 15 mannetjes gedurende 3 dagen. Het sperma (n = 15/dag) werd onmiddellijk 1:1 (v:v) verdund met Belsville Poultry Semen Diluent, dat kaliumdifosfaat (1,27 g), mononatriumglutamaatmonohydraat (0,867 g), fructose (0,5 g), watervrij natriumacetaat (0,43 g), tris(hydroxymethyl)aminomethaan (0,195 g), kaliumcitraatmonohydraat (0,064 g), kaliummonofosfaat (0,065 g), magnesiumchloride (0,034 g) en H2O (100 ml) bevat, pH = 7,5, osmolariteit 333 mOsm/kg38. Verdunde spermamonsters werden eerst onder een lichtmicroscoop onderzocht om een ​​goede spermakwaliteit (vochtgehalte) te garanderen en vervolgens in een waterbad van 37 °C bewaard tot gebruik binnen een half uur na afname.
De kinematica en reologie van zaadcellen worden beschreven met behulp van een systeem van microfluïdische apparaten. Spermamonsters werden verder verdund tot 1:40 in Beltsville Avian Semen Diluent, in een microfluïdisch apparaat geladen (zie hieronder) en kinetische parameters werden bepaald met behulp van een Computerized Semen Analysis (CASA)-systeem dat eerder is ontwikkeld voor microfluïdische karakterisering van de mobiliteit van zaadcellen in vloeibare media (Afdeling Werktuigbouwkunde, Faculteit Ingenieurswetenschappen, Universiteit van Assiut, Egypte). De plugin kan worden gedownload op: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39. De curvesnelheid (VCL, μm/s), lineaire snelheid (VSL, μm/s) en gemiddelde trajectsnelheid (VAP, μm/s) werden gemeten. Video's van zaadcellen werden opgenomen met een omgekeerde Optika XDS-3 fasecontrastmicroscoop (met 40x objectief) aangesloten op een Tucson ISH1000 camera met 30 beelden per seconde gedurende 3 seconden. Met behulp van de CASA-software werden minimaal drie gebieden en 500 zaadcelbanen per monster bestudeerd. De opgenomen video werd verwerkt met een zelfontwikkelde CASA-software. De definitie van beweeglijkheid in de CASA-plug-in is gebaseerd op de zwemsnelheid van de zaadcellen ten opzichte van de stroomsnelheid en omvat geen andere parameters zoals zijwaartse beweging, aangezien dit betrouwbaarder is gebleken bij vloeistofstroming. Reologische beweging wordt beschreven als de beweging van zaadcellen tegen de richting van de vloeistofstroom in. Het aantal zaadcellen met reologische eigenschappen werd gedeeld door het aantal beweeglijke zaadcellen; zaadcellen in rust en zaadcellen die convectief bewogen, werden niet meegeteld.
Alle gebruikte chemicaliën werden, tenzij anders vermeld, verkregen van Elgomhoria Pharmaceuticals (Caïro, Egypte). Het apparaat werd vervaardigd zoals beschreven door El-sherry et al. 40 met enkele aanpassingen. De materialen die werden gebruikt voor de fabricage van de microkanalen omvatten glasplaten (Howard Glass, Worcester, MA), SU-8-25 negatieve resist (MicroChem, Newton, CA), diacetonalcohol (Sigma Aldrich, Steinheim, Duitsland) en polyaceton (Dow Corning, Midland, Michigan). Microkanalen worden vervaardigd met behulp van zachte lithografie. Eerst werd een transparant beschermend gezichtsmasker met het gewenste microkanaalontwerp afgedrukt op een printer met hoge resolutie (Prismatic, Caïro, Egypte en Pacific Arts and Design, Markham, ON). De mallen werden gemaakt met glasplaten als substraat. De platen werden gereinigd in aceton, isopropanol en gedemineraliseerd water en vervolgens bedekt met een laag SU8-25 van 20 µm door middel van spincoating (3000 rpm, 1 min). De SU-8-lagen werden vervolgens voorzichtig gedroogd (65 °C, 2 min en 95 °C, 10 min) en gedurende 50 s blootgesteld aan UV-straling. Na de blootstelling werden ze gebakken bij 65 °C en 95 °C gedurende respectievelijk 1 min en 4 min om de blootgestelde SU-8-lagen te crosslinken, gevolgd door ontwikkeling in diacetonalcohol gedurende 6,5 min. De wafels werden vervolgens uitgehard (200 °C gedurende 15 min) om de SU-8-laag verder te verstevigen.
PDMS werd bereid door het monomeer en de harder in een gewichtsverhouding van 10:1 te mengen, vervolgens te ontgassen in een vacuüm desiccator en op het SU-8-hoofdframe te gieten. De PDMS werd uitgehard in een oven (120 °C, 30 min), waarna de kanalen werden uitgesneden, van de mal werden gescheiden en geperforeerd om buisjes aan de in- en uitgang van het microkanaal te kunnen bevestigen. Ten slotte werden de PDMS-microkanalen permanent op microscoopglaasjes bevestigd met behulp van een draagbare coronaprocessor (Electro-Technic Products, Chicago, IL), zoals elders beschreven. Het in deze studie gebruikte microkanaal meet 200 µm × 20 µm (B × H) en is 3,6 cm lang.
De vloeistofstroom die wordt opgewekt door de hydrostatische druk in het microkanaal wordt bereikt door het vloeistofniveau in het inlaatreservoir boven het hoogteverschil Δh39 in het uitlaatreservoir te houden (Fig. 1).
waarbij f de wrijvingscoëfficiënt is, gedefinieerd als f = C/Re voor laminaire stroming in een rechthoekig kanaal, waarbij C een constante is die afhangt van de aspectverhouding van het kanaal, L de lengte van het microkanaal is, Vav de gemiddelde snelheid in het microkanaal is, Dh de hydraulische diameter van het kanaal is en g de zwaartekrachtversnelling. Met behulp van deze vergelijking kan de gemiddelde kanaalsnelheid worden berekend met de volgende formule: