Bedankt voor uw bezoek aan Nature.com. De browserversie die u gebruikt, biedt beperkte CSS-ondersteuning. Voor de beste ervaring raden we u aan een bijgewerkte browser te gebruiken (of de compatibiliteitsmodus in Internet Explorer uit te schakelen). Om de ondersteuning te kunnen blijven garanderen, zullen we de site in de tussentijd zonder stijlen en JavaScript weergeven.
De vruchtbaarheid van vogels hangt af van hun vermogen om voldoende levensvatbaar sperma gedurende langere tijd op te slaan in de spermaopslagbuisjes (SST). Het exacte mechanisme waarmee spermatozoa de SST binnenkomen, erin verblijven en verlaten, blijft controversieel. Het sperma van sharkasi-hennen vertoonde een sterke neiging tot agglutinatie, waarbij mobiele, filamenteuze bundels met veel cellen werden gevormd. Omdat het moeilijk was om de beweeglijkheid en het gedrag van spermatozoa in een ondoorzichtige eileider te observeren, gebruikten we een microfluïdisch apparaat met een microkanaaldoorsnede die vergelijkbaar is met die van spermatozoa om de agglutinatie en beweeglijkheid van spermatozoa te bestuderen. Deze studie bespreekt hoe spermabundels zich vormen, hoe ze bewegen en hun mogelijke rol bij het verlengen van de verblijfsduur van sperma in de SST. We onderzochten de snelheid en het reologisch gedrag van spermatozoa wanneer vloeistofstroom in een microfluïdisch kanaal werd gegenereerd door hydrostatische druk (stroomsnelheid = 33 µm/s). De spermatozoa hebben de neiging om tegen de stroom in te zwemmen (positieve reologie) en de snelheid van de spermatozoönbundel is aanzienlijk lager in vergelijking met die van individuele spermatozoa. Er is waargenomen dat spermabundels spiraalvormig bewegen en in lengte en dikte toenemen naarmate er meer individuele spermacellen worden aangetrokken. Er werd waargenomen dat spermabundels de zijwanden van de microfluïdische kanalen naderden en zich daaraan hechtten om te voorkomen dat ze werden meegesleurd met een vloeistofstroomsnelheid > 33 µm/s. Er werd waargenomen dat spermabundels de zijwanden van de microfluïdische kanalen naderden en zich daaraan hechtten om te voorkomen dat ze werden meegesleurd met een vloeistofstroomsnelheid > 33 µm/s. Als u dit wilt, kunt u het beste met uw geld verdienen en uw geld verdienen микрофлюидных каналов, чтобы избежать сметания со скоростью потока жидкости> 33 мкм / с. Er is waargenomen dat spermabundels de zijwanden van de microfluïdische kanalen naderen en zich daaraan hechten om te voorkomen dat ze worden meegesleurd bij een vloeistofstroomsnelheid > 33 µm/s.33 µm/s > 33 µm/s33 µm/s Als u dit wilt, kunt u het beste met uw geld verdienen en uw geld verdienen микрожидкостного канала, чтобы избежать de temperatuur bedraagt ​​> 33 мкм/с. Er is waargenomen dat spermabundels de zijwanden van het microfluïdische kanaal naderen en zich daaraan hechten om te voorkomen dat ze worden meegesleurd door de vloeistofstroom met een snelheid van >33 µm/s.Scanning- en transmissie-elektronenmicroscopie toonde aan dat de spermabundels werden ondersteund door overvloedig dicht materiaal. De verkregen gegevens tonen de unieke mobiliteit van Sharkazi-kipspermatozoa aan, evenals het vermogen van spermatozoa om te agglutineren en mobiele bundels te vormen, wat bijdraagt ​​aan een beter begrip van de langetermijnopslag van spermatozoa in SMT.
Om bevruchting bij mensen en de meeste dieren te bewerkstelligen, moeten sperma en eicellen op het juiste moment op de bevruchtingsplaats arriveren. Daarom moet de paring vóór of tijdens de ovulatie plaatsvinden. Aan de andere kant slaan sommige zoogdieren, zoals honden, en niet-zoogdieren zoals insecten, vissen, reptielen en vogels, sperma gedurende een langere periode op in hun voortplantingsorganen totdat hun eicellen klaar zijn voor bevruchting (asynchrone bevruchting1). Vogels kunnen de levensvatbaarheid van spermatozoa die eicellen kunnen bevruchten, 2-10 weken in stand houden2.
Dit is een uniek kenmerk dat vogels onderscheidt van andere dieren, omdat het een hoge kans op bevruchting biedt na een enkele inseminatie gedurende enkele weken zonder gelijktijdige paring en ovulatie. Het belangrijkste spermaopslagorgaan, de zogenaamde spermaopslagbuis (SST), bevindt zich in de interne slijmvliesplooien ter hoogte van de uterovaginale overgang. Tot op heden zijn de mechanismen waarmee sperma de spermabank binnenkomt, er verblijft en verlaat, nog niet volledig begrepen. Op basis van eerdere studies zijn er veel hypothesen geformuleerd, maar geen daarvan is bevestigd.
Forman4 veronderstelde dat spermatozoa hun verblijfplaats in de SST-holte behouden door continue oscillerende beweging tegen de richting van de vloeistofstroom in door eiwitkanalen op SST-epitheelcellen (reologie). ATP raakt uitgeput door de constante flagellaire activiteit die nodig is om het sperma in het SST-lumen te houden en de beweeglijkheid neemt uiteindelijk af totdat het sperma door de vloeistofstroom uit de spermabank wordt afgevoerd en een nieuwe reis door de opstijgende eileider begint om het sperma te bevruchten. Eicel (Forman4). Dit model van spermaopslag wordt ondersteund door de detectie, met behulp van immunocytochemie, van aquaporinen 2, 3 en 9, aanwezig in SST-epitheelcellen. Tot op heden ontbreken studies naar de reologie van kippensperma en de rol ervan in SST-opslag, vaginale spermaselectie en spermacompetitie. Bij kippen komt het sperma de vagina binnen na natuurlijke paring, maar meer dan 80% van de spermatozoa wordt kort na de paring uit de vagina verwijderd. Dit suggereert dat de vagina de primaire plaats is voor spermaselectie bij vogels. Bovendien is gerapporteerd dat minder dan 1% van de in de vagina bevruchte spermatozoa in SST's terechtkomt2. Bij kunstmatige inseminatie van kuikens in de vagina neemt het aantal spermatozoa dat SST bereikt 24 uur na inseminatie toe. Tot nu toe is het mechanisme van spermaselectie tijdens dit proces onduidelijk en de spermamotiliteit speelt mogelijk een belangrijke rol bij de opname van SST-sperma. Door de dikke en ondoorzichtige wanden van de eileiders is het moeilijk om de spermamotiliteit in de eileiders van vogels direct te monitoren. Daarom ontbreekt het ons aan basiskennis over hoe spermatozoa na bevruchting naar SST overgaan.
Reologie wordt recent erkend als een belangrijke factor die het spermatransport in de genitaliën van zoogdieren reguleert. Gebaseerd op het vermogen van beweeglijke spermatozoa om tegenstrooms te migreren, gebruikten Zaferani et al.8 een corra-microfluïdisch systeem om beweeglijke spermatozoa passief te isoleren uit ingesloten spermamonsters. Deze vorm van spermasortering is essentieel voor medische onvruchtbaarheidsbehandelingen en klinisch onderzoek en geniet de voorkeur boven traditionele methoden die tijdrovend en arbeidsintensief zijn en de morfologie en structurele integriteit van het sperma kunnen aantasten. Tot op heden zijn er echter nog geen studies uitgevoerd naar het effect van afscheidingen uit de geslachtsorganen van kippen op de spermamotiliteit.
Ongeacht het mechanisme dat sperma in de SST vasthoudt, hebben veel onderzoekers waargenomen dat residentiële spermatozoa kop-aan-kop agglutineren in de SST van kippen 9, 10, kwartels 2 en kalkoenen 11 om geagglutineerde spermabundels te vormen. De auteurs suggereren dat er een verband bestaat tussen deze agglutinatie en de langdurige opslag van spermatozoa in de SST.
Tingari en Lake12 rapporteerden een sterke associatie tussen spermatozoa in de sperma-ontvangende klier van de kip en vroegen zich af of spermatozoa bij vogels op dezelfde manier agglutineren als spermatozoa bij zoogdieren. Ze denken dat de diepe verbindingen tussen sperma in de zaadleiders te wijten kunnen zijn aan de stress die wordt veroorzaakt door de aanwezigheid van een groot aantal spermacellen in een kleine ruimte.
Bij het evalueren van het gedrag van spermatozoa op verse hangende objectglaasjes zijn tijdelijke tekenen van agglutinatie te zien, vooral aan de randen van de spermadruppels. De agglutinatie werd echter vaak verstoord door de rotatiebeweging die gepaard gaat met continue beweging, wat het tijdelijke karakter van dit fenomeen verklaart. De onderzoekers merkten ook op dat wanneer het verdunningsmiddel aan het sperma werd toegevoegd, er langwerpige, "draadachtige" celaggregaten ontstonden.
Vroege pogingen om een ​​spermatozoön na te bootsen werden gedaan door een dun draadje van een hangende druppel te verwijderen, wat resulteerde in een langwerpig sperma-achtig blaasje dat uit de spermadruppel stak. De spermatozoa schikten zich onmiddellijk parallel in het blaasje, maar de hele eenheid verdween al snel vanwege de 3D-beperking. Om de agglutinatie van spermatozoa te bestuderen, is het daarom noodzakelijk om de beweeglijkheid en het gedrag van spermatozoa direct in geïsoleerde spermaopslagbuisjes te observeren, wat moeilijk te bereiken is. Daarom is het noodzakelijk om een ​​instrument te ontwikkelen dat spermatozoa nabootst ter ondersteuning van onderzoek naar de beweeglijkheid en het agglutinatiegedrag van sperma. Brillard et al.13 rapporteerden dat de gemiddelde lengte van spermaopslagbuisjes bij volwassen kuikens 400-600 µm bedraagt, maar sommige SST's kunnen wel 2000 µm lang zijn. Mero en Ogasawara14 verdeelden de zaadklieren in vergrote en niet-vergrote spermaopslagbuisjes, die beide even lang (~500 µm) en even breed (~38 µm) waren. De gemiddelde diameter van het lumen van de buisjes was echter 56,6 en 56,6 µm, respectievelijk 11,2 µm. In de huidige studie gebruikten we een microfluïdisch apparaat met een kanaalgrootte van 200 µm × 20 µm (B × H), waarvan de doorsnede enigszins overeenkomt met die van de versterkte SST. Daarnaast onderzochten we de beweeglijkheid en het agglutinatiegedrag van sperma in stromende vloeistof, wat consistent is met Foremans hypothese dat vloeistof geproduceerd door SST-epitheelcellen sperma in een tegenstroom (reologische) richting in het lumen houdt.
Het doel van deze studie was om de problemen bij het observeren van de beweeglijkheid van spermatozoa in de eileider te overwinnen en de moeilijkheden bij het bestuderen van de reologie en het gedrag van spermatozoa in een dynamische omgeving te vermijden. Er werd gebruikgemaakt van een microfluïdisch apparaat dat hydrostatische druk creëert om de beweeglijkheid van spermatozoa in de geslachtsdelen van een kip te simuleren.
Wanneer een druppel van een verdund spermamonster (1:40) in het microkanaal werd geladen, konden twee soorten spermamotiliteit worden vastgesteld (geïsoleerd sperma en gebonden sperma). Bovendien hadden spermatozoa de neiging om tegen de stroom in te zwemmen (positieve reologie; video 1, 2). Hoewel spermabundels een lagere snelheid hadden dan die van eenzame spermacellen (p < 0,001), verhoogden ze het percentage spermacellen dat een positieve rheotaxis vertoonde (p < 0,001; Tabel 2). Hoewel spermabundels een lagere snelheid hadden dan die van eenzame spermacellen (p < 0,001), verhoogden ze het percentage spermacellen dat een positieve rheotaxis vertoonde (p < 0,001; Tabel 2). Als u een product wilt kopen, kunt u dit doen (p < 0,001), meer informatie сперматозоидов, демонстрирующих положительный реотаксис (p < 0,001; waarde 2). Hoewel de spermatozoabundels een lagere snelheid hadden dan die van afzonderlijke spermatozoa (p < 0,001), verhoogden ze het percentage spermatozoa dat een positieve rheotaxis vertoonde (p < 0,001; Tabel 2).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度（p < 0,001，但它们增加了显示阳性流变性的精子百分比（p < 0,001；表2）。尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 (p <0,001) ， 但 增加 了 显示 阳性 流变性 精子百分比 (p <0,001; 2。。。。。。）））））） Als u een lager percentage wilt, kunt u een lager percentage krijgen (p < 0,001), of увеличивали процент сперматозоидовс положительной реологией (p < 0,001; таблица 2). Hoewel de snelheid van spermabundels lager was dan die van individuele spermatozoa (p < 0,001), verhoogden ze het percentage spermatozoa met een positieve reologie (p < 0,001; Tabel 2).De positieve reologie voor afzonderlijke spermatozoa en toefjes wordt geschat op respectievelijk ongeveer 53% en 85%.
Er is waargenomen dat de spermatozoa van sharkasi-kippen direct na de ejaculatie lineaire bundels vormen, bestaande uit tientallen individuen. Deze plukjes nemen in de loop van de tijd in lengte en dikte toe en kunnen in vitro enkele uren blijven bestaan ​​voordat ze verdwijnen (video 3). Deze draadvormige bundels hebben de vorm van echidna-spermatozoa die zich aan het uiteinde van de bijbal vormen. Sperma van Sharkasi-kippen blijkt een sterke neiging te hebben om te agglutineren en in minder dan een minuut na verzameling een netvormige bundel te vormen. Deze bundels zijn dynamisch en kunnen zich hechten aan nabijgelegen wanden of statische objecten. Hoewel spermabundels de snelheid van spermacellen verminderen, is het duidelijk dat ze macroscopisch hun lineariteit vergroten. De lengte van de bundels varieert afhankelijk van het aantal in bundels verzamelde spermacellen. Twee delen van de bundel werden geïsoleerd: het eerste deel, inclusief de vrije kop van de geagglutineerde spermacel, en het laatste deel, inclusief de staart en het gehele distale uiteinde van de spermacel. Met behulp van een hogesnelheidscamera (950 fps) werden vrije koppen van geagglutineerde spermatozoa in het begin van de bundel waargenomen. Deze koppen zorgen voor de beweging van de bundel door hun oscillerende beweging, waarbij de resterende spermatozoa met een spiraalvormige beweging de bundel in worden getrokken (Video 4). Bij lange plukjes is echter waargenomen dat sommige vrije spermakoppen aan het lichaam blijven kleven en dat het uiteinde van de pluk als vinnen fungeert om de pluk voort te stuwen.
Terwijl de zaadcellen zich in een langzame vloeistofstroom parallel aan elkaar bewegen, beginnen ze elkaar echter te overlappen en hechten ze zich aan alles wat stilstaat, om te voorkomen dat ze door de stroming worden weggespoeld naarmate de stroomsnelheid toeneemt. De zaadcellen vormen zich wanneer een handvol zaadcellen elkaar nadert, synchroon begint te bewegen en zich om elkaar heen wikkelt, waarna ze aan een kleverige substantie blijven plakken. Figuur 1 en 2 laten zien hoe de zaadcellen elkaar naderen en een verbinding vormen wanneer de staarten zich om elkaar heen wikkelen.
De onderzoekers pasten hydrostatische druk toe om vloeistofstroming in een microkanaal te creëren om de reologie van sperma te bestuderen. Er werd een microkanaal gebruikt met een afmeting van 200 µm × 20 µm (B × H) en een lengte van 3,6 µm. Tussen de containers werden microkanalen geplaatst met spuiten aan de uiteinden. Er werd voedingskleurstof gebruikt om de kanalen beter zichtbaar te maken.
Bind verbindingskabels en accessoires aan de muur vast. De video is opgenomen met een fasecontrastmicroscoop. Bij elke afbeelding worden fasecontrastmicroscopie en mappingbeelden getoond. (A) De verbinding tussen twee stromen biedt weerstand tegen de stroming door de spiraalvormige beweging (rode pijl). (B) De verbinding tussen de buizenbundel en de kanaalwand (rode pijlen); tegelijkertijd zijn deze verbonden met twee andere bundels (gele pijlen). (C) De spermabundels in het microfluïdische kanaal beginnen zich met elkaar te verbinden (rode pijlen) en vormen een netwerk van spermabundels. (D) Vorming van een netwerk van spermabundels.
Toen een druppel verdund sperma in het microfluïdische apparaat werd geladen en er een stroming ontstond, werd waargenomen dat de spermabundel tegen de stroomrichting in bewoog. De bundels sluiten nauwsluitend aan op de wanden van de microkanalen en de vrije koppen in het begin van de bundels sluiten hier nauwsluitend op aan (video 5). Ze hechten zich ook aan stilstaande deeltjes op hun pad, zoals vuil, om te voorkomen dat ze door de stroom worden meegesleurd. Na verloop van tijd veranderen deze bundels in lange filamenten die andere, afzonderlijke spermatozoa en kortere bundels vasthouden (video 6). Naarmate de stroming afneemt, beginnen lange rijen spermacellen een netwerk van spermalijnen te vormen (video 7; figuur 2).
Bij een hoge stroomsnelheid (V > 33 µm/s) worden de spiraalvormige bewegingen van de draden groter. Dit is een poging om veel individuele spermabundels te vangen, zodat deze beter bestand zijn tegen de drijvende kracht van de stroming. Bij een hoge stroomsnelheid (V > 33 µm/s) worden de spiraalvormige bewegingen van de draden groter. Dit is een poging om veel individuele spermabundels te vangen, zodat deze beter bestand zijn tegen de drijvende kracht van de stroming. Hoge temperatuur (V > 33 мкм/с) они пытаются поймать множество Het is belangrijk dat u de juiste keuze maakt силе потока. Bij een hoge stroomsnelheid (V > 33 µm/s) nemen de spiraalvormige bewegingen van de strengen toe, omdat ze proberen veel individuele spermatozoa te vangen. Hierdoor ontstaan ​​bundels die beter bestand zijn tegen de drijvende kracht van de stroming.在高流速(V > 33 µm/s) Meer informatie Er zijn geen producten gevonden die aan je zoekcriteria voldoen.在 高 流速 (v> 33 µm/s) 时 的 螺旋 运动 增加 ， 以 试图 许多 形成 束 单 个 精子 ，从而 更 地 抵抗 的 漂移力。。。。。。。。。。 Hoge temperatuur (V > 33 мкм/с) захватить множество отдельных Zorg ervoor dat u de juiste keuze maakt. Bij hoge stroomsnelheden (V > 33 µm/s) neemt de spiraalvormige beweging van de filamenten toe in een poging om zoveel mogelijk individuele spermatozoa te vangen en bundels te vormen die beter bestand zijn tegen de driftkrachten van de stroming.Ze probeerden ook microkanalen aan de zijwanden te bevestigen.
Spermabundels werden met behulp van lichtmicroscopie (LM) geïdentificeerd als clusters van spermakoppen en gekrulde staarten. Spermabundels met verschillende aggregaten zijn ook geïdentificeerd als gedraaide koppen en flagellaire aggregaten, meerdere samengesmolten spermastaarten, spermakoppen aan een staart, en spermakoppen met gebogen kernen als meerdere samengesmolten kernen. Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) toonde aan dat de spermabundels omhulde aggregaten van spermakoppen waren en dat de spermaaggregaten een vastgehecht netwerk van gewikkelde staarten vertoonden.
De morfologie en ultrastructuur van spermatozoa, de vorming van spermatozoabundels werden bestudeerd met behulp van lichtmicroscopie (halve doorsnede), scanning elektronenmicroscopie (SEM) en transmissie elektronenmicroscopie (TEM), sperma-uitstrijkjes werden gekleurd met acridine-oranje en onderzocht met behulp van epifluorescentiemicroscopie.
Sperma-uitstrijkkleuring met acridine-oranje (Fig. 3B) toonde aan dat de spermakoppen aan elkaar vastgeplakt zaten en bedekt waren met secretoir materiaal, wat leidde tot de vorming van grote plukjes (Fig. 3D). De spermabundels bestonden uit spermaaggregaten met een netwerk van staarten (Fig. 4A-C). Spermabundels bestaan ​​uit de staarten van vele aan elkaar vastgeplakte spermatozoa (Fig. 4D). De koppen van de spermabundels waren bedekt met secretoir materiaal (Fig. 4E,F).
Vorming van de spermatozoabundel Met behulp van fasecontrastmicroscopie en sperma-uitstrijkjes gekleurd met acridine-oranje, werd aangetoond dat de koppen van spermatozoa aan elkaar plakken. (A) De vroege vorming van een sperma-bosje begint met één spermacel (witte cirkel) en drie spermacellen (gele cirkel), waarbij de spiraal begint bij de staart en eindigt bij het kopje. (B) Microfoto van een sperma-uitstrijkje gekleurd met acridine-oranje, waarop aan elkaar hechtende sperma-bosjes te zien zijn (pijlen). De ontlading bedekt het/de kopje(s). Vergroting × 1000. (C) Ontwikkeling van een grote bundel die door stroming in een microfluïdisch kanaal wordt getransporteerd (met behulp van een hogesnelheidscamera op 950 fps). (D) Microfoto van een sperma-uitstrijkje gekleurd met acridine-oranje, waarop grote bosjes te zien zijn (pijlen). Vergroting: × 200.
Scanning elektronenmicroscoopfoto van een spermabundel en een met acridine-oranje gekleurd sperma-uitstrijkje. (A, B, D, E) zijn digitale kleurenscanning elektronenmicroscoopfoto's van spermatozoa, en C en F zijn microfoto's van met acridine-oranje gekleurde sperma-uitstrijkjes die de hechting van meerdere spermatozoa laten zien die het staartvlies omhullen. (AC) Sperma-aggregaten worden weergegeven als een netwerk van aan elkaar vastgehechte staarten (pijlen). (D) Adhesie van meerdere spermatozoa (met kleefstof, roze omlijning, pijl) die zich om de staart wikkelen. (E en F) Sperma-kopaggregaten (pointers) bedekt met kleefstof (pointers). De spermatozoa vormden bundels met verschillende wervelachtige structuren (F). (C) Vergrotingen van ×400 en (F) ×200.
Met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie ontdekten we dat spermabundels staarten hadden (Fig. 6A, C), koppen aan staarten (Fig. 6B) of koppen aan staarten (Fig. 6D). De koppen van de spermatozoa in de bundel zijn gekromd en vertonen in doorsnede twee kerngebieden (Fig. 6D). In de incisiebundel hadden de spermatozoa een gedraaide kop met twee kerngebieden en meerdere flagellaire gebieden (Fig. 5A).
Digitale kleurenelektronenmicroscoopfoto van de verbindende uiteinden van de spermabundel en het agglutinerende materiaal dat de spermakoppen verbindt. (A) Aangehechte staart van een groot aantal spermatozoa. Let op hoe de staart eruitziet in zowel staande (pijl) als liggende (pijl) projecties. (B) De kop (pijl) van de spermacel is verbonden met de staart (pijl). (C) Meerdere spermastaarten (pijlen) zijn verbonden. (D) Agglutinerend materiaal (AS, blauw) verbindt vier spermakoppen (paars).
Scanning elektronenmicroscopie werd gebruikt om spermacellen te detecteren in spermabundels bedekt met secreties of membranen (Figuur 6B), wat aangeeft dat de spermabundels verankerd waren door extracellulair materiaal. Het geagglutineerde materiaal was geconcentreerd in de spermakop (een kwalachtige samenstelling; Fig. 5B) en distaal geëxpandeerd, wat een heldergele kleur gaf onder fluorescentiemicroscopie bij kleuring met acridineoranje (Fig. 6C). Deze substantie is duidelijk zichtbaar onder een scanningmicroscoop en wordt beschouwd als een bindmiddel. Semi-dunne coupes (Fig. 5C) en sperma-uitstrijkjes gekleurd met acridineoranje toonden spermabundels met dicht opeengepakte koppen en gekrulde staarten (Fig. 5D).
Verschillende microfoto's die de aggregatie van spermacellen en gevouwen staarten laten zien met behulp van verschillende methoden. (A) Digitale kleurentransmissie-elektronenmicrofoto van een spermabundel met een opgerolde spermacelkop met een tweedelige kern (blauw) en verschillende flagellaire delen (groen). (B) Digitale kleurenscan-elektronenmicrofoto van een cluster van kwalachtige spermacellen (pijlen) die bedekt lijken te zijn. (C) Halfdunne doorsnede met geaggregeerde spermacellen (pijlen) en gekrulde staarten (pijlen). (D) Microfoto van een sperma-uitstrijkje gekleurd met acridine-oranje met aggregaten van spermacellen (pijlen) en gekrulde, aan elkaar klevende staarten (pijlen). Merk op dat een kleverige substantie (S) de kop van de spermatozoön bedekt. ​​(D) Vergroting × 1000.
Met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie (fig. 7A) werd ook opgemerkt dat de spermacellen gedraaid waren en dat de kernen een spiraalvorm hadden. Dit werd bevestigd door sperma-uitstrijkjes die met acridine-oranje waren gekleurd en met behulp van fluorescentiemicroscopie werden onderzocht (fig. 7B).
(A) Digitale kleurentransmissie-elektronenmicroscoopfoto en (B) Acridine-oranje gekleurd sperma-uitstrijkje waarop opgerolde koppen en de aanhechting van koppen en staarten van spermacellen te zien zijn (pijlen). (B) Vergroting × 1000.
Een interessante bevinding is dat Sharkazi's sperma zich samenvoegt tot mobiele, filamenteuze bundels. De eigenschappen van deze bundels stellen ons in staat hun mogelijke rol bij de absorptie en opslag van spermatozoa in de SST te begrijpen.
Na de paring komen de zaadcellen de vagina binnen en ondergaan een intensief selectieproces, waardoor slechts een beperkt aantal zaadcellen de SST binnenkomt15,16. Tot op heden zijn de mechanismen waarmee zaadcellen de SST binnenkomen en verlaten onduidelijk. Bij pluimvee worden zaadcellen gedurende een langere periode van 2 tot 10 weken in de SST bewaard, afhankelijk van de soort6. Er bestaat nog steeds controverse over de conditie van het sperma tijdens de opslag in de SST. Zijn ze in beweging of in rust? Met andere woorden, hoe behouden zaadcellen hun positie in de SST zo lang?
Forman4 suggereerde dat de verblijfplaats en uitstoting van SST's verklaard konden worden in termen van spermamotiliteit. De auteurs veronderstellen dat spermacellen hun positie behouden door tegen de vloeistofstroom in te zwemmen die door het SST-epitheel wordt gecreëerd en dat spermacellen uit de SST worden uitgeworpen wanneer hun snelheid daalt tot onder het punt waarop ze achteruit beginnen te bewegen vanwege gebrek aan energie. Zaniboni5 bevestigde de aanwezigheid van aquaporines 2, 3 en 9 in het apicale deel van SST-epitheelcellen, wat indirect Foremans spermaopslagmodel zou kunnen ondersteunen. In de huidige studie ontdekten we dat bijna de helft van Sharkashi's spermatozoa een positieve reologie vertoont in de stromende vloeistof, en dat geagglutineerde spermabundels het aantal spermatozoa met een positieve reologie verhogen, hoewel agglutinatie ze vertraagt. Hoe spermacellen zich door de eileider van de vogel naar de bevruchtingsplaats verplaatsen, is nog niet volledig duidelijk. Bij zoogdieren trekt de folliculaire vloeistof spermatozoa chemoattractief aan. Echter, chemoattractanten worden verondersteld spermatozoa te dirigeren om grote afstanden te naderen7. Daarom zijn andere mechanismen verantwoordelijk voor spermatransport. Het vermogen van sperma om zich te oriënteren en tegen de eileidervloeistof in te stromen die vrijkomt na de paring, is naar verluidt een belangrijke factor bij het targeten van sperma bij muizen. Parker17 suggereerde dat spermatozoa de eileiders passeren door tegen de ciliaire stroom in te zwemmen bij vogels en reptielen. Hoewel het niet experimenteel is aangetoond bij vogels, was Adolphi18 de eerste die ontdekte dat vogelsperma positieve resultaten geeft wanneer een dunne laag vloeistof tussen een dekglaasje en een objectglaasje wordt gemaakt met een strook filterpapier. Reologie. Hino en Yanagimachi [19] plaatsten een muizenovarium-eileider-uteruscomplex in een perfusiering en injecteerden 1 µl inkt in de isthmus om de vloeistofstroom in de eileiders te visualiseren. Ze merkten een zeer actieve samentrekkings- en ontspanningsbeweging op in de eileider, waarbij alle inktballen gestaag naar de ampulla van de eileider bewogen. De auteurs benadrukken het belang van de vloeistofstroom van de eileider van de onderste naar de bovenste eileider voor de opwaartse beweging van sperma en bevruchting. Brillard20 rapporteerde dat bij kippen en kalkoenen spermatozoa door actieve beweging migreren van de vaginale ingang, waar ze worden opgeslagen, naar de uterovaginale overgang, waar ze worden opgeslagen. Deze beweging is echter niet vereist tussen de uterovaginale overgang en het infundibulum, omdat de spermatozoa door passieve verplaatsing worden getransporteerd. Gezien deze eerdere aanbevelingen en de resultaten van de huidige studie, kan worden aangenomen dat het vermogen van spermatozoa om stroomopwaarts te bewegen (reologie) een van de eigenschappen is waarop het selectieproces is gebaseerd. Dit bepaalt de passage van spermatozoa door de vagina en hun toegang tot de CCT voor opslag. Zoals Forman4 suggereerde, kan dit ook het proces vergemakkelijken waarbij sperma de SST en zijn leefomgeving voor een bepaalde tijd binnenkomt en vervolgens weer verlaat wanneer zijn snelheid afneemt.
Aan de andere kant suggereerden Matsuzaki en Sasanami 21 dat aviaire spermatozoa veranderingen in beweeglijkheid ondergaan van rust naar beweeglijkheid in de mannelijke en vrouwelijke voortplantingsorganen. Remming van de residentiële spermamotiliteit in de SST zou de lange bewaartijd van sperma en de daaropvolgende verjonging na het verlaten van de SST kunnen verklaren. Onder hypoxische omstandigheden rapporteerden Matsuzaki et al. 1 een hoge productie en afgifte van lactaat in de SST, wat kan leiden tot remming van de residentiële spermamotiliteit. In dit geval wordt het belang van de reologie van sperma weerspiegeld in de selectie en absorptie van spermatozoa, en niet in hun opslag.
Het spermaagglutinatiepatroon wordt beschouwd als een plausibele verklaring voor de lange bewaarperiode van sperma in de SST, aangezien dit een veelvoorkomend patroon is van spermaretentie bij pluimvee2,22,23. Bakst et al. 2 observeerden dat de meeste spermatozoa aan elkaar hechtten en bundelaggregaten vormden, en dat afzonderlijke spermatozoa zelden werden aangetroffen in kwartel-CCM. Aan de andere kant observeerden Wen et al. 24 meer verspreide spermatozoa en minder spermatozoa-polletjes in het SST-lumen bij kippen. Op basis van deze observaties kan worden aangenomen dat de neiging tot spermaagglutinatie verschilt tussen vogels en tussen spermatozoa in hetzelfde ejaculaat. Daarnaast suggereerden Van Krey et al. 9 dat willekeurige dissociatie van geagglutineerde spermatozoa verantwoordelijk is voor de geleidelijke penetratie van spermatozoa in het lumen van de eileider. Volgens deze hypothese zouden spermatozoa met een lager agglutinatievermogen eerst uit de SST moeten worden verwijderd. In deze context kan het vermogen van spermatozoa om te agglutineren een factor zijn die de uitkomst van spermacompetitie bij vuile vogels beïnvloedt. Bovendien geldt: hoe langer het geagglutineerde sperma uiteenvalt, hoe langer de vruchtbaarheid behouden blijft.
Hoewel aggregatie van spermatozoa en aggregatie tot bundels in verschillende studies zijn waargenomen2,22,24, zijn ze niet in detail beschreven vanwege de complexiteit van hun kinematische observatie binnen de SST. Er zijn verschillende pogingen gedaan om spermaagglutinatie in vitro te bestuderen. Uitgebreide maar voorbijgaande aggregatie werd waargenomen wanneer de dunne draad van de bungelende zaaddruppel werd verwijderd. Dit leidt ertoe dat een langwerpige bel uit de druppel steekt, die de zaadklier nabootst. Door 3D-beperkingen en korte druppeldroogtijden raakte het hele blok snel in verval9. In de huidige studie, met behulp van Sharkashi-kippen en microfluïdische chips, konden we beschrijven hoe deze plukjes zich vormen en hoe ze bewegen. Spermabundels vormden zich direct na spermaafname en bleken in een spiraal te bewegen, met een positieve reologie wanneer ze in de stroming aanwezig waren. Bovendien is bij macroscopisch onderzoek waargenomen dat spermabundels de lineariteit van de beweeglijkheid verhogen in vergelijking met geïsoleerde spermatozoa. Dit suggereert dat spermaagglutinatie kan optreden vóór de penetratie van de SST en dat de spermaproductie niet beperkt is tot een klein gebied door stress, zoals eerder werd gesuggereerd (Tingari en Lake12). Tijdens de vorming van de zaadpluim zwemmen de spermatozoa synchroon tot ze een verbinding vormen. Vervolgens wikkelen hun staarten zich om elkaar heen en blijft de kop van de spermatozoön vrij, maar de staart en het distale deel van de spermatozoön plakken aan elkaar met een kleverige substantie. De vrije kop van het ligament is dus verantwoordelijk voor de beweging en sleept de rest van het ligament mee. Scanning elektronenmicroscopie van de spermabundels toonde aan elkaar vastzittende spermakoppen bedekt met veel kleverig materiaal, wat suggereert dat de spermakoppen vastzaten in rustende bundels, wat mogelijk is gebeurd nadat ze de opslagplaats (SST) hadden bereikt.
Wanneer een sperma-uitstrijkje met acridine-oranje wordt gekleurd, is extracellulair kleefmateriaal rond de zaadcellen zichtbaar onder een fluorescentiemicroscoop. Deze stof zorgt ervoor dat spermabundels zich kunnen hechten aan omringende oppervlakken of deeltjes, zodat ze niet met de omringende stroming meedrijven. Onze waarnemingen tonen dus de rol aan van de adhesie van spermatozoa in de vorm van mobiele bundels. Hun vermogen om tegen de stroming in te zwemmen en zich aan nabijgelegen oppervlakken te hechten, zorgt ervoor dat sperma langer in de SST kan blijven.
Rothschild25 gebruikte een hemocytometriecamera om de zwevende verdeling van rundersperma in een druppel suspensie te bestuderen. Hierbij werden microfoto's gemaakt door een camera met zowel een verticale als horizontale optische as van de microscoop. De resultaten toonden aan dat de spermatozoa werden aangetrokken door het oppervlak van de kamer. De auteurs suggereren dat er mogelijk hydrodynamische interacties zijn tussen het sperma en het oppervlak. Rekening houdend met dit gegeven, in combinatie met het vermogen van Sharkashi-kuikensperma om kleverige plukjes te vormen, kan dit de kans vergroten dat sperma zich aan de SST-wand hecht en langdurig wordt bewaard.
Bccetti en Afzeliu26 rapporteerden dat de spermaglycocalyx nodig is voor gametenherkenning en -agglutinatie. Forman10 observeerde dat hydrolyse van α-glycosidische bindingen in glycoproteïne-glycolipidecoatings door behandeling van aviair sperma met neuraminidase resulteerde in verminderde vruchtbaarheid zonder de spermamotiliteit te beïnvloeden. De auteurs suggereren dat het effect van neuraminidase op de glycocalyx de sperma-sekwestratie bij de uterovaginale overgang belemmert, waardoor de vruchtbaarheid afneemt. Hun observaties kunnen de mogelijkheid niet negeren dat neuraminidasebehandeling de herkenning van sperma en eicellen kan verminderen. Forman en Engel10 ontdekten dat de vruchtbaarheid verminderde wanneer hennen intravaginaal werden geïnsemineerd met sperma behandeld met neuraminidase. IVF met neuraminidase-behandeld sperma had echter geen invloed op de vruchtbaarheid in vergelijking met controlekippen. De auteurs kwamen tot de conclusie dat veranderingen in de glycoproteïne-glycolipide coating rond het spermamembraan het vermogen van sperma om te bevruchten verminderden door de opname van sperma bij de utero-vaginale verbinding te belemmeren. Dit leidt vervolgens tot meer spermaverlies vanwege de snelheid van de utero-vaginale verbinding, maar heeft geen invloed op de herkenning van sperma en eicel.
Bij kalkoenen vonden Bakst en Bauchan 11 kleine blaasjes en membraanfragmenten in het lumen van de SST en observeerden dat sommige van deze korrels waren versmolten met het spermamembraan. De auteurs suggereren dat deze relaties kunnen bijdragen aan de langdurige opslag van spermatozoa in SST. De onderzoekers specificeerden echter niet de bron van deze deeltjes, of ze nu worden afgescheiden door CCT-epitheelcellen, geproduceerd en afgescheiden door het mannelijke voortplantingssysteem, of geproduceerd door het sperma zelf. Deze deeltjes zijn ook verantwoordelijk voor agglutinatie. Grützner et al27 rapporteerden dat epididymale epitheelcellen een specifiek eiwit produceren en afscheiden dat nodig is voor de vorming van zaadleiders met één porie. De auteurs rapporteren ook dat de verspreiding van deze bundels afhankelijk is van de interactie van epididymale eiwitten. Nixon et al28 ontdekten dat de adnexa een eiwit afscheiden, het zure cysteïnerijke osteonectine; SPARC is betrokken bij de vorming van spermabundels bij kortsnavelmierenegels en vogelbekdieren. De verstrooiing van deze bundels gaat gepaard met het verlies van dit eiwit.
In de huidige studie toonde ultrastructurele analyse met behulp van elektronenmicroscopie aan dat de spermatozoa zich hechtten aan een grote hoeveelheid dicht materiaal. Men denkt dat deze stoffen verantwoordelijk zijn voor de agglutinatie die condenseert tussen en rond de aanhechtende koppen, maar in lagere concentraties in de staartregio. We nemen aan dat deze agglutinerende stof samen met sperma wordt uitgescheiden uit het mannelijke voortplantingssysteem (bijbal of zaadleider), aangezien we vaak zien dat sperma zich tijdens de ejaculatie losmaakt van lymfe en spermaplasma. Er is gerapporteerd dat wanneer aviaire spermatozoa de bijbal en zaadleider passeren, ze rijpingsgerelateerde veranderingen ondergaan die hun vermogen ondersteunen om eiwitten te binden en plasmalemma-geassocieerde glycoproteïnen te verwerven. De persistentie van deze eiwitten op residentiële spermamembranen in de SST suggereert dat deze eiwitten de verwerving van de stabiliteit van het spermamembraan kunnen beïnvloeden 30 en hun vruchtbaarheid kunnen bepalen 31 . Ahammad et al32 meldden dat spermatozoa verkregen uit verschillende delen van het mannelijke voortplantingssysteem (van de testikels tot de distale zaadleider) een progressieve toename in levensvatbaarheid vertoonden onder vloeibare opslagomstandigheden, ongeacht de opslagtemperatuur. De levensvatbaarheid bij kippen neemt ook toe in de eileiders na kunstmatige inseminatie.
Spermabundels van Sharkashi-kippen hebben andere kenmerken en functies dan die van andere soorten, zoals mierenegels, vogelbekdieren, bosmuizen, hertenratten en cavia's. Bij Sharkasi-kippen verminderde de vorming van spermabundels hun zwemsnelheid in vergelijking met individuele spermabundels. Deze bundels verhoogden echter het percentage reologisch positieve spermabundels en verbeterden het vermogen van spermabundels om zich te stabiliseren in een dynamische omgeving. Onze resultaten bevestigen dus de eerdere suggestie dat spermaagglutinatie in SST geassocieerd is met langdurige spermaopslag. We veronderstellen ook dat de neiging van sperma om bundels te vormen de snelheid van spermaverlies in SST kan bepalen, wat de uitkomst van spermacompetitie kan beïnvloeden. Volgens deze aanname geven spermabundels met een laag agglutinatievermogen als eerste SST af, terwijl spermabundels met een hoog agglutinatievermogen de meeste nakomelingen produceren. De vorming van spermabundels met één porie is gunstig en beïnvloedt de ouder-kindverhouding, maar maakt gebruik van een ander mechanisme. Bij mierenegels en vogelbekdieren zijn de spermatozoa parallel aan elkaar gerangschikt om de voorwaartse snelheid van de straal te verhogen. Bundels mierenegels bewegen ongeveer drie keer sneller dan individuele spermatozoa. Men denkt dat de vorming van dergelijke spermapolletjes bij mierenegels een evolutionaire aanpassing is om dominantie te behouden, aangezien vrouwtjes promiscue zijn en meestal met meerdere mannetjes paren. Daarom concurreren spermatozoa uit verschillende ejaculaten hevig om de bevruchting van de eicel.
Geagglutineerde spermatozoa van sharkasi-kippen zijn gemakkelijk te visualiseren met behulp van fasecontrastmicroscopie, wat als voordelig wordt beschouwd omdat het een gemakkelijke studie van het gedrag van spermatozoa in vitro mogelijk maakt. Het mechanisme waarmee de vorming van spermatozoa de voortplanting bij sharkasi-kippen bevordert, verschilt ook van dat van sommige placentale zoogdieren die coöperatief spermagedrag vertonen, zoals bosmuizen, waarbij sommige spermatozoa de eitjes bereiken en andere verwante individuen helpen hun eitjes te bereiken en te beschadigen. om jezelf te bewijzen. altruïstisch gedrag. Zelfbevruchting 34. Een ander voorbeeld van coöperatief gedrag in spermatozoa werd gevonden bij hertenmuizen, waar spermatozoa in staat waren de genetisch meest verwante spermatozoa te identificeren en zich ermee te verenigen en coöperatieve groepen te vormen om hun snelheid te verhogen in vergelijking met niet-verwante spermatozoa35.
De resultaten verkregen in deze studie spreken Fomans theorie over langdurige opslag van spermatozoa in SWS niet tegen. De onderzoekers rapporteren dat spermacellen gedurende langere tijd blijven bewegen in de stroom van epitheelcellen die de SST bekleden, en na een bepaalde tijd raken de energievoorraden van de spermacellen uitgeput, wat resulteert in een afname van de snelheid, wat de uitdrijving van stoffen met een klein moleculair gewicht mogelijk maakt. energie van spermatozoa met de vloeistofstroom uit het lumen van de SST De holte van de eileider. In de huidige studie observeerden we dat de helft van de individuele spermacellen het vermogen vertoonde om tegen stromende vloeistoffen in te zwemmen, en hun adhesie in de bundel verhoogde hun vermogen om een ​​positieve reologie te vertonen. Bovendien komen onze gegevens overeen met die van Matsuzaki et al. 1 die rapporteerden dat verhoogde lactaatsecretie in SST de residentiële spermamotiliteit kan remmen. Onze resultaten beschrijven echter de vorming van beweeglijke ligamenten van spermacellen en hun reologisch gedrag in een dynamische omgeving binnen een microkanaal, in een poging hun gedrag in SST te verduidelijken. Toekomstig onderzoek zou zich kunnen richten op het bepalen van de chemische samenstelling en oorsprong van het agglutinerende middel, wat onderzoekers ongetwijfeld zal helpen bij het ontwikkelen van nieuwe manieren om vloeibaar sperma op te slaan en de duur van de vruchtbaarheid te verlengen.
Vijftien 30 weken oude mannelijke sharkasi's met blote hals (homozygoot dominant; Na Na) werden geselecteerd als spermadonoren in het onderzoek. De vogels werden grootgebracht op de onderzoekspluimveehouderij van de landbouwfaculteit van de Universiteit Ashit, in het gouvernement Ashit, Egypte. De vogels werden gehuisvest in individuele kooien (30 x 40 x 40 cm), onderworpen aan een lichtprogramma (16 uur licht en 8 uur duisternis) en kregen een dieet met 160 g ruw eiwit, 2800 kcal verteerbare energie en 35 g calcium per dier. 5 gram beschikbare fosfor per kilogram dieet.
Volgens gegevens 36 en 37 werd sperma van de mannetjes verzameld door middel van buikmassage. In totaal werden 45 spermamonsters van 15 mannen verzameld gedurende 3 dagen. Sperma (n = 15/dag) werd onmiddellijk verdund in een verhouding van 1:1 (v:v) met Belsville Poultry Semen Diluent, dat kaliumdifosfaat (1,27 g), mononatriumglutamaatmonohydraat (0,867 g), fructose (0,5 d), watervrij natriumacetaat (0,43 g), tris(hydroxymethyl)aminomethaan (0,195 g), kaliumcitraatmonohydraat (0,064 g), kaliummonofosfaat (0,065 g), magnesiumchloride (0,034 g) en H₂O (100 ml) bevat. pH = 7, 5, osmolariteit 333 mOsm/kg38. Verdunde spermamonsters werden eerst onder een lichtmicroscoop onderzocht om de goede kwaliteit (vochtigheid) van het sperma te garanderen. Vervolgens werden ze tot gebruik binnen een half uur na afname in een waterbad bij 37°C bewaard.
De kinematica en reologie van spermatozoa worden beschreven met behulp van een systeem van microfluïdische apparaten. Spermamonsters werden verder verdund tot 1:40 in Beltsville Avian Semen Diluent, geladen in een microfluïdisch apparaat (zie hieronder), en de kinetische parameters werden bepaald met behulp van een Computerized Semen Analysis (CASA)-systeem dat eerder was ontwikkeld voor microfluïdische karakterisering. [De zin "Computerized Semen Analysis" is onvolledig en is onvolledig en is onvolledig en is onvolledig en is onvolledig.] [De zin "Computerized Semen Analysis" is onvolledig en is onvolledig en is onvolledig.] ...)), [De zin "Computerized Semen Analysis" is onvolledig en is onvolledig.]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]))]}))]}))]}))]}, de kinematica en de reologie van spermatozoa]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]))]))]))]))]))]))]))]))]))))]))))]))))]))))]))))])), de kinematica en de reologie van spermatozoa]]]]]]]]]]]]]]]]]]))]]))]))]))]))]))]))))]))))]))))]))))]))))])), de kinematica en de Video's van spermatozoa werden opgenomen met een omgekeerde Optika XDS-3 fasecontrastmicroscoop (met 40x objectief) aangesloten op een Tucson ISH1000 camera met 30 fps gedurende 3 s. Gebruik de CASA-software om ten minste drie gebieden en 500 spermatrajecten per monster te bestuderen. De opgenomen video werd verwerkt met een zelfgemaakte CASA. De definitie van motiliteit in de CASA-plug-in is gebaseerd op de zwemsnelheid van het sperma in vergelijking met de stroomsnelheid en omvat geen andere parameters zoals zijwaartse beweging, omdat dit betrouwbaarder is gebleken bij vloeistofstroming. Reologische beweging wordt beschreven als de beweging van spermacellen tegen de richting van de vloeistofstroom in. Spermatozoa met reologische eigenschappen werden gedeeld door het aantal beweeglijke spermatozoa; spermatozoa in rust en convectief bewegende spermatozoa werden uitgesloten van de telling.
Alle gebruikte chemicaliën werden verkregen van Elgomhoria Pharmaceuticals (Caïro, Egypte), tenzij anders vermeld. Het apparaat werd vervaardigd zoals beschreven door El-sherry et al. 40 met enkele wijzigingen. De materialen die werden gebruikt om de microkanalen te vervaardigen, omvatten glasplaten (Howard Glass, Worcester, MA), SU-8-25 negatieve resist (MicroChem, Newton, CA), diacetonalcohol (Sigma Aldrich, Steinheim, Duitsland) en polyaceton. -184, Dow Corning, Midland, Michigan). Microkanalen worden vervaardigd met behulp van zachte lithografie. Eerst werd een helder beschermend gezichtsmasker met het gewenste microkanaalontwerp geprint op een hoge-resolutieprinter (Prismatic, Cairo, Egypte en Pacific Arts and Design, Markham, ON). De masters werden gemaakt met behulp van glasplaten als substraten. De platen werden gereinigd in aceton, isopropanol en gedeïoniseerd water en vervolgens gecoat met een 20 µm laag SU8-25 door middel van spincoating (3000 rpm, 1 min). De SU-8-lagen werden vervolgens voorzichtig gedroogd (2 min. 65 °C en 10 min. 95 °C) en 50 seconden blootgesteld aan uv-straling. Na de blootstelling werden ze 1 min. en 4 min. gebakken bij 65 °C en 95 °C om de blootgestelde SU-8-lagen te verbinden, gevolgd door ontwikkeling in diacetonalcohol gedurende 6,5 min. Bak de wafels hard (15 min. 200 °C) om de SU-8-laag verder te laten stollen.
PDMS werd bereid door het monomeer en de verharder te mengen in een gewichtsverhouding van 10:1. Vervolgens werd het ontgast in een vacuümexsiccator en uitgegoten op het SU-8-hoofdframe. Het PDMS werd uitgehard in een oven (120 °C, 30 min). Vervolgens werden de kanalen uitgesneden, van de master gescheiden en geperforeerd zodat buisjes aan de in- en uitlaat van het microkanaal konden worden bevestigd. Ten slotte werden de PDMS-microkanalen permanent bevestigd aan microscoopglaasjes met behulp van een draagbare coronaprocessor (Electro-Technic Products, Chicago, Illinois), zoals elders beschreven. Het in deze studie gebruikte microkanaal heeft een afmeting van 200 µm × 20 µm (B × H) en is 3,6 cm lang.
De vloeistofstroom die wordt veroorzaakt door de hydrostatische druk in het microkanaal wordt bereikt door het vloeistofniveau in het inlaatreservoir boven het hoogteverschil Δh39 in het uitlaatreservoir te houden (fig. 1).
waarbij f de wrijvingscoëfficiënt is, gedefinieerd als f = C/Re voor laminaire stroming in een rechthoekig kanaal, waarbij C een constante is die afhankelijk is van de aspectverhouding van het kanaal, L de lengte van het microkanaal is, Vav de gemiddelde snelheid in het microkanaal is, Dh de hydraulische diameter van het kanaal is, g de zwaartekrachtversnelling is. Met behulp van deze vergelijking kan de gemiddelde kanaalsnelheid worden berekend met behulp van de volgende vergelijking: