Nature.com saytiga tashrif buyurganingiz uchun tashakkur. Siz foydalanayotgan brauzer versiyasida CSS qo'llab-quvvatlashi cheklangan. Eng yaxshi tajriba uchun sizga yangilangan brauzerdan foydalanishingizni tavsiya qilamiz (yoki Internet Explorer-da moslik rejimini o'chirib qo'ying). Shu bilan birga, uzluksiz qo'llab-quvvatlashni ta'minlash uchun biz saytni uslublar va JavaScriptsiz renderlaymiz.
Qushlarning unumdorligi ularning sperma saqlash naychalarida (SST) uzoq vaqt davomida yetarli miqdorda yashovchan spermani saqlash qobiliyatiga bog'liq. Spermatozoidlarning SSTga kirishi, joylashishi va chiqishining aniq mexanizmi bahsli bo'lib qolmoqda. Sharkasi tovuqlarining spermasi agglyutinatsiyaga yuqori moyillikni ko'rsatdi va ko'plab hujayralarni o'z ichiga olgan harakatchan filamentli bog'lamlarni hosil qildi. Shaffof bo'lmagan bachadon naychasida spermatozoidlarning harakatchanligi va xatti-harakatlarini kuzatish qiyinligi sababli, biz spermatozoidlarning agglyutinatsiyasi va harakatchanligini o'rganish uchun spermatozoidlarnikiga o'xshash mikrokanal kesimiga ega mikrofluidik qurilmadan foydalandik. Ushbu tadqiqotda sperma bog'lamlari qanday shakllanishi, ularning qanday harakatlanishi va SSTda sperma yashash muddatini uzaytirishdagi mumkin bo'lgan roli muhokama qilinadi. Biz gidrostatik bosim (oqim tezligi = 33 µm/s) orqali mikrofluidik kanal ichida suyuqlik oqimi hosil bo'lganda sperma tezligi va reologik xatti-harakatlarini o'rganib chiqdik. Spermatozoidlar oqimga qarshi suzishga moyil (ijobiy reologiya) va spermatozoid bog'lamining tezligi yakka spermatozoidlarga nisbatan sezilarli darajada kamayadi. Spermatozoid bog'lamlari spiral shaklida harakatlanishi va ko'proq yakka spermatozoidlar jalb qilinganligi sababli uzunligi va qalinligi oshishi kuzatilgan. Sperma bog'lamlari > 33 µm/s suyuqlik oqimi tezligi bilan to'lib ketmaslik uchun mikrofluidik kanallarning yon devorlariga yaqinlashib, ularga yopishib qolgani kuzatildi. Sperma bog'lamlari > 33 µm/s suyuqlik oqimi tezligi bilan to'lib ketmaslik uchun mikrofluidik kanallarning yon devorlariga yaqinlashib, ularga yopishib qolgani kuzatildi. Bylo zamecheno, chto puchki spermatozoidov qabul qilinadi va prilipayut k bokovym stenkam mikroflyuidnyx kanalov, chtoby izbejat smetaniya so skorostyu potoka jidkosti> 33 mkm / s. Sperma bog'lamlari suyuqlik oqimi tezligi >33 µm/s da olib ketilishining oldini olish uchun mikrofluidik kanallarning yon devorlariga yaqinlashishi va ularga yopishishi kuzatilgan.língíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíníngíngínīm/s 3333 mkm/s. Bylo zamecheno, chto puchki spermatozoidov qabul qilinadi va prilipayut k bokovym stenkam mikrojidkostnogo kanala, chtoby izbejat smetaniya potokom jidkosti so skorostyu > 33 mkm/s. Sperma bog'lamlari >33 µm/s tezlikda suyuqlik oqimi tomonidan olib ketilmaslik uchun mikrofluidik kanalning yon devorlariga yaqinlashishi va yopishishi kuzatilgan.Skanerlash va transmissiya elektron mikroskopiyasi shuni ko'rsatdiki, sperma bog'lamlari zich material bilan ta'minlangan. Olingan ma'lumotlar Sharkazi tovuq spermatozoidlarining noyob harakatchanligini, shuningdek, spermatozoidlarning aglutinatsiya qilish va harakatlanuvchi bog'lamlarni hosil qilish qobiliyatini namoyish etadi, bu esa SMTda spermatozoidlarning uzoq muddatli saqlanishini yaxshiroq tushunishga yordam beradi.
Odamlarda va ko'pgina hayvonlarda urug'lantirishga erishish uchun sperma va tuxum hujayralari urug'lantirish joyiga kerakli vaqtda yetib borishi kerak. Shuning uchun juftlashish ovulyatsiyadan oldin yoki vaqtida sodir bo'lishi kerak. Boshqa tomondan, ba'zi sutemizuvchilar, masalan, itlar, shuningdek, hasharotlar, baliqlar, sudralib yuruvchilar va qushlar kabi sutemizuvchi bo'lmagan turlar spermani tuxumlari urug'lantirishga tayyor bo'lguncha uzoq vaqt davomida reproduktiv organlarida saqlaydi (asinxron urug'lantirish 1). Qushlar tuxumlarni urug'lantirishga qodir spermatozoidlarning hayotiyligini 2-10 hafta davomida saqlab turishga qodir2.
Bu qushlarni boshqa hayvonlardan ajratib turadigan noyob xususiyatdir, chunki u bir necha hafta davomida bir vaqtning o'zida juftlashish va ovulyatsiyasiz bitta urug'lantirishdan keyin urug'lanishning yuqori ehtimolini ta'minlaydi. Sperma saqlash naychasi (SST) deb ataladigan asosiy sperma saqlash organi bachadon-qizuv bo'g'imidagi ichki shilliq qavat burmalarida joylashgan. Bugungi kunga qadar spermaning sperma bankiga kirishi, joylashishi va chiqishi mexanizmlari to'liq tushunilmagan. Avvalgi tadqiqotlarga asoslanib, ko'plab farazlar ilgari surilgan, ammo ularning hech biri tasdiqlanmagan.
Forman4 spermatozoidlar SST bo'shlig'ida SST epitelial hujayralarida joylashgan oqsil kanallari orqali suyuqlik oqimi yo'nalishiga qarshi doimiy tebranish harakati orqali o'z o'rnini saqlab qolishini taxmin qildi (reologiya). Spermatozoidlarni SST lümeninde ushlab turish uchun zarur bo'lgan doimiy flagellar faolligi tufayli ATF kamayadi va harakatchanlik oxir-oqibat spermatozoidlar suyuqlik oqimi orqali sperma bankidan olib chiqilgunga qadar va spermatozoidlarni urug'lantirish uchun ko'tarilayotgan fallop naychasi bo'ylab yangi sayohatni boshlamaguncha pasayadi. Tuxum (Forman4). Sperma saqlashning bu modeli SST epitelial hujayralarida mavjud bo'lgan 2, 3 va 9 akvaporinlarning immunotsitokimyoviy aniqlash orqali qo'llab-quvvatlanadi. Bugungi kunga qadar tovuq spermasining reologiyasi va uning SST saqlashdagi roli, vaginal sperma tanlash va sperma raqobati bo'yicha tadqiqotlar yetarli emas. Tovuqlarda sperma tabiiy juftlashishdan keyin vaginaga kiradi, ammo juftlashishdan ko'p o'tmay, spermatozoidlarning 80% dan ortig'i vaginadan chiqariladi. Bu shuni ko'rsatadiki, vagina qushlarda sperma tanlash uchun asosiy joy hisoblanadi. Bundan tashqari, vaginada urug'lantirilgan spermatozoidlarning 1% dan kamrog'i SSTs2 ga aylanishi haqida xabar berilgan. Vaginada jo'jalarni sun'iy urug'lantirishda SST ga yetib boradigan spermatozoidlar soni urug'lantirilgandan keyin 24 soat ichida ko'payadi. Hozircha bu jarayonda spermatozoidlarni tanlash mexanizmi noma'lum va spermatozoidlarning harakatchanligi SST spermani qabul qilishda muhim rol o'ynashi mumkin. Bachadon naychalarining qalin va noaniq devorlari tufayli qushlarning bachadon naychalarida spermatozoidlarning harakatchanligini bevosita kuzatish qiyin. Shuning uchun, bizda urug'lantirilgandan keyin spermatozoidlarning SST ga qanday o'tishi haqida asosiy bilimlar yetishmaydi.
Reologiya yaqinda sutemizuvchilar jinsiy a'zolarida sperma tashishni boshqaruvchi muhim omil sifatida tan olindi. Harakatlanuvchi spermatozoidlarning qarama-qarshi oqimga migratsiya qilish qobiliyatiga asoslanib, Zaferani va boshqalar8 harakatlanuvchi spermatozoidlarni qadoqlangan sperma namunalaridan passiv ravishda ajratish uchun corra mikrofluidik tizimidan foydalanganlar. Spermani saralashning bu turi tibbiy bepushtlikni davolash va klinik tadqiqotlar uchun juda muhimdir va vaqt va mehnat talab qiladigan hamda sperma morfologiyasi va strukturaviy yaxlitligini buzishi mumkin bo'lgan an'anaviy usullarga qaraganda afzalroqdir. Biroq, hozirgi kunga qadar tovuqlarning jinsiy a'zolaridan chiqadigan sekretsiyalarning sperma harakatchanligiga ta'siri bo'yicha hech qanday tadqiqotlar o'tkazilmagan.
Spermatozoidlarning SSTda saqlanishini ta'minlaydigan mexanizmdan qat'i nazar, ko'plab tadqiqotchilar rezident spermatozoidlar tovuqlar 9, 10, bedana 2 va kurka 11 ning SSTda boshma-yuz agglyutinatsiyalanishini va agglyutinatsiyalangan spermatozoid to'plamlarini hosil qilishini kuzatdilar. Mualliflar bu agglyutinatsiya va SSTda spermatozoidlarning uzoq muddatli saqlanishi o'rtasida bog'liqlik borligini ta'kidlaydilar.
Tingari va Lake12 tovuqning sperma qabul qiluvchi bezidagi spermatozoidlar o'rtasida kuchli bog'liqlik borligini xabar qilishdi va parranda spermatozoidlari sutemizuvchilar spermatozoidlari bilan bir xil tarzda aglutinatsiyalanadimi yoki yo'qmi degan savolga javob berishdi. Ularning fikricha, vas deferensdagi spermatozoidlar orasidagi chuqur bog'liqliklar kichik joyda ko'p miqdordagi spermatozoidlarning mavjudligi tufayli yuzaga keladigan stress tufayli bo'lishi mumkin.
Yangi osilgan shisha slaydlarda spermatozoidlarning xatti-harakatlarini baholashda, ayniqsa sperma tomchilarining chekkalarida aglutinatsiyaning vaqtinchalik belgilarini ko'rish mumkin. Biroq, aglutinatsiya ko'pincha uzluksiz harakat bilan bog'liq aylanish harakati bilan buzilgan, bu esa bu hodisaning vaqtinchalik xususiyatini tushuntiradi. Tadqiqotchilar shuningdek, erituvchi spermaga qo'shilganda, cho'zilgan "ipsimon" hujayra agregatlari paydo bo'lishini payqashdi.
Spermatozoidni taqlid qilishga dastlabki urinishlar osilgan tomchidan ingichka simni olib tashlash orqali amalga oshirildi, natijada sperma tomchisidan uzun spermatozoidga o'xshash pufakcha chiqib turdi. Spermatozoidlar darhol pufakcha ichida parallel ravishda joylashdi, ammo 3D cheklovi tufayli butun birlik tezda yo'q bo'lib ketdi. Shuning uchun, spermatozoidlarning agglyutinatsiyasini o'rganish uchun spermatozoidlarning harakatchanligi va xatti-harakatlarini to'g'ridan-to'g'ri ajratilgan spermatozoidlarni saqlash naychalarida kuzatish kerak, bunga erishish qiyin. Shuning uchun, spermatozoidlarning harakatchanligi va agglyutinatsiya xatti-harakatlarini o'rganishni qo'llab-quvvatlash uchun spermatozoidlarni taqlid qiluvchi asbobni ishlab chiqish zarur. Brillard va boshqalar13 kattalar jo'jalarida spermatozoidlarni saqlash naychalarining o'rtacha uzunligi 400-600 µm ekanligini, ammo ba'zi SSTlar 2000 µm gacha bo'lishi mumkinligini xabar qilishdi. Mero va Ogasawara14 urug' bezlarini kattalashgan va kattalashmagan sperma saqlash naychalariga ajratdilar, ularning ikkalasi ham uzunligi (~500 µm) va bo'yin kengligi (~38 µm) bo'yicha bir xil edi, ammo naychalarning o'rtacha lümen diametri mos ravishda 56,6 va 56,6 µm ni tashkil etdi. . , mos ravishda 11,2 µm. Ushbu tadqiqotda biz kanal o'lchami 200 µm × 20 µm (W × H) bo'lgan mikrofluidik qurilmadan foydalandik, uning ko'ndalang kesimi kuchaytirilgan SST ga biroz yaqin. Bundan tashqari, biz oqayotgan suyuqlikda sperma harakatchanligi va aglutinatsiya xatti-harakatlarini o'rganib chiqdik, bu Foremanning SST epitelial hujayralari tomonidan ishlab chiqarilgan suyuqlik spermani lümenda qarshi oqim (reologik) yo'nalishda ushlab turishi haqidagi gipotezasiga mos keladi.
Ushbu tadqiqotning maqsadi fallop naychasida spermatozoidlarning harakatchanligini kuzatish muammolarini bartaraf etish va dinamik muhitda spermatozoidlarning reologiyasi va xatti-harakatlarini o'rganishdagi qiyinchiliklardan qochish edi. Tovuq jinsiy a'zolarida spermatozoidlarning harakatchanligini simulyatsiya qilish uchun gidrostatik bosim yaratadigan mikrofluidik qurilma ishlatilgan.
Suyultirilgan sperma namunasining bir tomchisi (1:40) mikrokanal qurilmasiga yuklanganda, sperma harakatchanligining ikki turini aniqlash mumkin edi (ajratilgan sperma va bog'langan sperma). Bundan tashqari, spermatozoidlar oqimga qarshi suzishga moyil edi (ijobiy reologiya; 1, 2-video). Sperma bog'lamlarining tezligi yolg'iz spermanikiga qaraganda pastroq bo'lsa-da (p < 0,001), ular ijobiy reotaksis ko'rsatadigan sperma foizini oshirdi (p < 0,001; 2-jadval). Sperma bog'lamlarining tezligi yolg'iz spermanikiga qaraganda pastroq bo'lsa-da (p < 0,001), ular ijobiy reotaksis ko'rsatadigan sperma foizini oshirdi (p < 0,001; 2-jadval). Xotya puchki spermatozoidov imeli bolee nizkuyu skorost, chem u odinochnyx spermatozoidov (p < 0,001), oni uvelichivali protsent spermatozoidov, demonstiruyushchix polojitelnyy reotaksis (p < 0,001; tablitsa). Spermatozoidlar bog'lamlari bitta spermatozoidlarnikiga qaraganda pastroq tezlikka ega bo'lsa-da (p < 0,001), ular spermatozoidlarning reotaksisga ijobiy ta'sir ko'rsatish foizini oshirdi (p < 0,001; 2-jadval).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度（p < 0.001），mīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngjīngjīngīngčičičiičijīngī (p < 0.001； 2）。līngīngčičičičičičičičičiči (p <0.001) , yēngčičičiči língì (p <0,001 ； 2。。。。。）））））) Xotya skorost puchkov spermatozoidov byla nije, chem u odinochnyx spermatozoidov (p < 0,001), oni uvelichivali protsent spermatozoidov s polojitelnoy reologie (p < 0,001; tablitsa 2). Spermatozoidlar bog'lamlarining tezligi bitta spermatozoidlarnikidan pastroq bo'lsa-da (p < 0,001), ular ijobiy reologiyaga ega spermatozoidlar foizini oshirdi (p < 0,001; 2-jadval).Yagona spermatozoidlar va tutamlar uchun ijobiy reologiya mos ravishda taxminan 53% va 85% deb baholanmoqda.
Sharkasi tovuqlarining spermatozoidlari eyakulyatsiyadan so'ng darhol o'nlab shaxslardan iborat chiziqli bog'lamlarni hosil qilishi kuzatilgan. Bu bog'lamlar vaqt o'tishi bilan uzunligi va qalinligi oshadi va tarqalib ketgunga qadar bir necha soat davomida in vitroda qolishi mumkin (3-video). Bu filamentli bog'lamlar epididimisning oxirida hosil bo'ladigan exidna spermatozoidlariga o'xshaydi. Sharkashi tovuq spermasi yig'ilgandan keyin bir daqiqadan kamroq vaqt ichida agglyutinatsiyaga va to'rsimon bog'lam hosil qilishga moyilligi yuqori ekanligi aniqlandi. Bu nurlar dinamik va yaqin atrofdagi har qanday devorlarga yoki statik narsalarga yopishib olishi mumkin. Sperma bog'lamlari sperma hujayralarining tezligini pasaytirsa-da, makroskopik jihatdan ularning chiziqliligini oshirishi aniq. Bog'lamlarning uzunligi bog'lamlarda to'plangan sperma soniga qarab o'zgaradi. Bog'lamning ikki qismi ajratilgan: agglyutinlangan spermaning erkin boshini o'z ichiga olgan boshlang'ich qism va spermaning dumini va butun distal uchini o'z ichiga olgan terminal qism. Yuqori tezlikdagi kamera (950 fps) yordamida bog'lamning boshlang'ich qismida aglutinatsiyalangan spermatozoidlarning erkin boshlari kuzatildi, ular tebranuvchi harakati tufayli bog'lamning harakatlanishi uchun javobgar bo'lib, qolganlarini spiral harakat bilan bog'lam ichiga tortadi (4-video). Biroq, uzun bog'lamlarda ba'zi erkin spermatozoid boshlari tanaga yopishganligi va bog'lamning terminal qismi bog'lamni harakatlantirishga yordam beradigan qanot vazifasini bajarishi kuzatildi.
Suyuqlikning sekin oqimida sperma bog'lamlari bir-biriga parallel ravishda harakatlanadi, ammo ular oqim tezligi oshgani sayin oqim tomonidan yuvilib ketmasligi uchun bir-birining ustiga chiqib, harakatsiz turgan hamma narsaga yopishib qoladi. Bog'lamlar bir hovuch sperma hujayralari bir-biriga yaqinlashganda hosil bo'ladi, ular sinxron harakatlana boshlaydi va bir-birini o'rab oladi, keyin esa yopishqoq moddaga yopishadi. 1 va 2-rasmlarda sperma qanday qilib bir-biriga yaqinlashishi, dumlar bir-birini o'rab olganda birikma hosil qilishi ko'rsatilgan.
Tadqiqotchilar sperma reologiyasini o'rganish uchun mikrokanalda suyuqlik oqimini yaratish uchun gidrostatik bosim o'tkazdilar. O'lchami 200 µm × 20 µm (E × Balandligi) va uzunligi 3,6 µm bo'lgan mikrokanal ishlatilgan. Uchlariga shpritslar o'rnatilgan idishlar orasida mikrokanallardan foydalaning. Kanallarni ko'proq ko'rinadigan qilish uchun oziq-ovqat rang berish vositasidan foydalanilgan.
Devorga o'zaro ulash kabellari va aksessuarlarini bog'lang. Video fazali kontrastli mikroskop yordamida olingan. Har bir tasvirda fazali kontrastli mikroskopiya va xaritalash tasvirlari taqdim etiladi. (A) Ikki oqim orasidagi bog'lanish spiral harakat tufayli oqimga qarshilik ko'rsatadi (qizil strelka). (B) Naycha bog'lamasi va kanal devori orasidagi bog'lanish (qizil strelkalar), ayni paytda ular boshqa ikkita bog'lamaga ulanadi (sariq strelkalar). (C) Mikrofluidik kanaldagi sperma bog'lamalari bir-biri bilan bog'lana boshlaydi (qizil strelkalar) va sperma bog'lamalari to'rini hosil qiladi. (D) Sperma bog'lamalari tarmog'ining shakllanishi.
Mikrofluidik qurilmaga bir tomchi suyultirilgan sperma solinganida va oqim hosil qilinganda, sperma nuri oqim yo'nalishiga qarshi harakatlanayotgani kuzatildi. Tugunlar mikrokanallar devorlariga mahkam o'rnashadi va tugunlarning boshlang'ich qismidagi bo'sh boshlar ularga mahkam o'rnashadi (5-video). Ular, shuningdek, oqim tomonidan olib ketilishiga qarshi turish uchun yo'llarida turgan har qanday harakatsiz zarrachalarga, masalan, chiqindilarga yopishadi. Vaqt o'tishi bilan bu tutamlar boshqa bitta spermatozoidlarni va qisqaroq tutamlarni ushlab turadigan uzun filamentlarga aylanadi (6-video). Oqim sekinlasha boshlaganda, spermaning uzun chiziqlari sperma chiziqlari tarmog'ini hosil qila boshlaydi (7-video; 2-rasm).
Yuqori oqim tezligida (V > 33 µm/s), oqimning siljish kuchiga yaxshiroq qarshilik ko'rsatish uchun ko'plab alohida sperma hosil qiluvchi bog'lamlarni ushlashga urinish sifatida iplarning spiral harakatlari kuchayadi. Yuqori oqim tezligida (V > 33 µm/s), oqimning siljish kuchiga yaxshiroq qarshilik ko'rsatish uchun ko'plab alohida sperma hosil qiluvchi bog'lamlarni ushlashga urinish sifatida iplarning spiral harakatlari kuchayadi. Pri vysokoy skorosti potoka (V > 33 mkm/s) spiralevidnye dvijeniya nitey usilivyutsya, poskolku oni pytayutsya poymat mnojestvo otdelnyh spermatozoidov, obrazuyushchix puchki, kotorye lychshe protivostyyat dreyfuyushchey. Yuqori oqim tezligida (V > 33 µm/s), iplarning spiral harakatlari kuchayadi, chunki ular oqimning siljish kuchiga yaxshiroq qarshilik ko'rsatishga qodir bo'lgan ko'plab individual spermatozoidlarni ushlashga harakat qiladi.língíngín (V > 33 µm/s) língčičičičnīngīngīngīngīngīngčičičičičnė língíngíngínǐ, míngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngjíngíngjíngíngíngíngíngíngíngíng.līngčiči (v> 33 µm/s) lín ， līngīnīnīng līngīīn ， līngčiči ， līngčičičičičiči mēngčičičičičičičičiči. Pri vysokix skorostyax potoka (V > 33 mkm/s) spiralnoe dvijenie nitey uvelichivaetsya v popytke zahvatit mnojestvo otdelnyx spermatozoidov, obrazuyushchix puchki, chtoby luchshe soprotivlyatsya silam dreyfa. Yuqori oqim tezligida (V > 33 µm/s), filamentlarning spiral harakati oqimning siljish kuchlariga yaxshiroq qarshilik ko'rsatish uchun ko'plab individual spermatozoidlarni hosil qiluvchi bog'lamlarni ushlashga urinishda kuchayadi.Ular shuningdek, yon devorlarga mikrokanallarni ulashga harakat qilishdi.
Sperma to'plamlari yorug'lik mikroskopi (LM) yordamida sperma boshlari va jingalak dumlar klasterlari sifatida aniqlandi. Turli agregatlarga ega sperma to'plamlari, shuningdek, buralgan boshlar va flagella agregatlari, bir nechta birlashgan sperma dumlari, dumga biriktirilgan sperma boshlari va egilgan yadrolarga ega sperma boshlari bir nechta birlashgan yadrolar sifatida aniqlandi. Transmission elektron mikroskopiyasi (TEM). Skanerlash elektron mikroskopiyasi (SEM) sperma to'plamlari sperma boshlarining qin bilan qoplangan agregatlari ekanligini va sperma agregatlari o'ralgan dumlarning biriktirilgan tarmog'ini ko'rsatdi.
Spermatozoidlarning morfologiyasi va ultrastrukturasi, spermatozoid bog'lamlarining shakllanishi yorug'lik mikroskopiyasi (yarim kesim), skanerlovchi elektron mikroskopiyasi (SEM) va transmissiya elektron mikroskopiyasi (TEM) yordamida o'rganildi, sperma surtmalari akridin apelsin bilan bo'yaldi va epifloresans mikroskopiyasi yordamida tekshirildi.
Sperma surtmasini akridin apelsin rangi bilan bo'yash (3B-rasm) sperma boshlari bir-biriga yopishib qolgan va sekretor material bilan qoplanganligini ko'rsatdi, bu esa katta tugunchalar hosil bo'lishiga olib keldi (3D-rasm). Sperma bog'lamlari bir-biriga bog'langan dumlar tarmog'iga ega sperma agregatlaridan iborat edi (4A-C-rasm). Sperma bog'lamlari bir-biriga yopishib qolgan ko'plab spermatozoidlarning dumlaridan iborat (4D-rasm). Sperma bog'lamlarining boshlarini sekretlar qoplagan (4E,F-rasm).
Spermatozoidlar to'plamining shakllanishi Fazali kontrastli mikroskopiya va akridin to'q sariq rang bilan bo'yalgan sperma surtmalari yordamida spermatozoidlarning boshlari bir-biriga yopishib qolishi ko'rsatildi. (A) Spermatozoidlarning dastlabki shakllanishi sperma (oq doira) va uchta sperma (sariq doira) bilan boshlanadi, spiral dumdan boshlanib, boshida tugaydi. (B) Akridin to'q sariq rang bilan bo'yalgan sperma surtmasining yopishgan sperma boshlarini ko'rsatuvchi mikroskopiyasi (strelkalar). Ajratish bosh(lar)ni qoplaydi. Kattalashtirish × 1000. (C) Mikrofluidik kanalda oqim orqali tashiladigan katta nurning rivojlanishi (950 fps tezlikdagi yuqori tezlikdagi kamera yordamida). (D) Akridin to'q sariq rang bilan bo'yalgan sperma surtmasining mikroskopiyasida katta tutamlar (strelkalar) ko'rsatiladi. Kattalashtirish: ×200.
Sperma nuri va akridin apelsin bilan bo'yalgan sperma surtmasining skanerlovchi elektron mikrografiyasi. (A, B, D, E) spermatozoidlarning raqamli rangli skanerlovchi elektron mikrografiyasi, C va F esa kaudal to'rni o'rab turgan bir nechta spermatozoidlarning birikishini ko'rsatuvchi akridin apelsin bilan bo'yalgan sperma surtmalarining mikrografiyasi. (AC) Sperma agregatlari biriktirilgan dumlar tarmog'i sifatida ko'rsatilgan (strelkalar). (D) Bir nechta spermatozoidlarning (yopishqoq modda, pushti kontur, strelka bilan) dum atrofida o'ralgan holda yopishishi. (E va F) Yopishqoq material bilan qoplangan sperma boshi agregatlari (ko'rsatkichlar). Spermatozoidlar bir nechta girdobga o'xshash tuzilmalarga ega bo'laklarni hosil qilgan (F). (C) ×400 va (F) ×200 kattalashtirish.
Transmissiya elektron mikroskopiyasi yordamida biz spermatozoidlar bog'lamlarining dumlari (6A, C-rasm), boshlari dumlarga (6B-rasm) yoki boshlari dumlarga (6D-rasm) biriktirilganligini aniqladik. Bog'lamdagi spermatozoidlarning boshlari egri bo'lib, kesilgan qismida ikkita yadro mintaqasi mavjud (6D-rasm). Kesilgan bog'lamda spermatozoidlar ikkita yadro mintaqasi va bir nechta flagella mintaqalari bo'lgan buralgan boshga ega edi (5A-rasm).
Spermatozoidlar bog'lamidagi bog'lovchi dumlarni va spermatozoidlar boshlarini bog'lovchi aglutinatsiyalovchi materialni ko'rsatuvchi raqamli rangli elektron mikrograf. (A) Ko'p sonli spermatozoidlarning biriktirilgan dumi. Dumning ham portret (strelka), ham landshaft (strelka) proektsiyalarida qanday ko'rinishiga e'tibor bering. (B) Spermatozoidlarning boshi (strelka) dumga (strelka) ulangan. (C) Bir nechta spermatozoidlar dumlari (strelkalar) ulangan. (D) Aglutinatsiya materiali (AS, ko'k) to'rtta spermatozoidlar boshini (binafsha rang) bog'laydi.
Skanerlovchi elektron mikroskopiyasi sekretsiyalar yoki membranalar bilan qoplangan sperma bog'lamlaridagi sperma boshlarini aniqlash uchun ishlatilgan (6B-rasm), bu sperma bog'lamlari hujayradan tashqari material bilan bog'langanligini ko'rsatadi. Agglyutinlangan material sperma boshida (meduza boshiga o'xshash birikma; 5B-rasm) to'plangan va distal tomonga kengaygan, akridin apelsin bilan bo'yalganida lyuminestsent mikroskopiya ostida yorqin sariq ko'rinish bergan (6C-rasm). Bu modda skanerlovchi mikroskop ostida aniq ko'rinadi va bog'lovchi hisoblanadi. Yarim yupqa kesmalar (5C-rasm) va akridin apelsin bilan bo'yalgan sperma surtmalarida zich joylashgan boshlar va jingalak dumlar bo'lgan sperma bog'lamlari ko'rsatilgan (5D-rasm).
Turli usullar yordamida sperma boshlari va bukilgan dumlarning agregatsiyasini ko'rsatadigan turli xil fotomikrograflar. (A) Ikki qismli yadro (ko'k) va bir nechta flagella qismlari (yashil) bo'lgan o'ralgan sperma boshini ko'rsatuvchi sperma bog'lamining kesma raqamli rangli uzatuvchi elektron mikrografiyasi. (B) Qoplangan ko'rinadigan meduzaga o'xshash sperma boshlari klasterini (strelkalar) ko'rsatuvchi raqamli rangli skanerlash elektron mikrografiyasi. (C) Agregatsiyalangan sperma boshlari (strelkalar) va bukilgan dumlarni (strelkalar) ko'rsatuvchi yarim yupqa kesma. (D) Akridin to'q sariq rang bilan bo'yalgan sperma surtmasining mikrografiyasi, sperma boshlari (strelkalar) va bukilgan yopishqoq dumlarning agregatsiyalarini (strelkalar) ko'rsatadi. E'tibor bering, yopishqoq modda (S) spermatozoid boshini qoplaydi. (D) × 1000 kattalashtirish.
Transmissiya elektron mikroskopiyasi yordamida (7A-rasm), shuningdek, sperma boshlari burishganligi va yadrolari spiral shaklga ega ekanligi qayd etildi, bu akridin apelsin rangi bilan bo'yalgan va lyuminestsent mikroskopiya yordamida tekshirilgan sperma surtmalari bilan tasdiqlandi (7B-rasm).
(A) Raqamli rangli elektron mikrograf va (B) Akridin to'q sariq rangga bo'yalgan sperma surtmasi, o'ralgan boshlar va sperma boshlari va dumlarining birikishini ko'rsatadi (strelkalar). (B) × 1000 kattalashtirish.
Qiziqarli topilma shundaki, Sharkazining spermasi birlashib, harakatchan filamentsimon bog'lamlarni hosil qiladi. Bu bog'lamlarning xususiyatlari bizga ularning SSTda spermatozoidlarning so'rilishi va saqlanishidagi mumkin bo'lgan rolini tushunishga imkon beradi.
Juftlashgandan so'ng, spermatozoidlar vaginaga kiradi va intensiv tanlov jarayonidan o'tadi, natijada SSTga cheklangan miqdordagi spermatozoidlar kiradi15,16. Bugungi kunga qadar spermatozoidlarning SSTga kirishi va chiqishi mexanizmlari noma'lum. Parrandalarda spermatozoidlar SSTda turga qarab 2 dan 10 haftagacha uzoq vaqt saqlanadi6. SSTda saqlash paytida spermaning holati haqida bahslar davom etmoqda. Ular harakatdami yoki tinch holatdami? Boshqacha qilib aytganda, spermatozoidlar SSTdagi o'z o'rnini qanday qilib shuncha vaqt saqlab qoladi?
Forman4 SSTning joylashishi va chiqarilishini sperma harakatchanligi nuqtai nazaridan tushuntirish mumkinligini ta'kidladi. Mualliflar sperma SST epiteliysi tomonidan yaratilgan suyuqlik oqimiga qarshi suzish orqali o'z pozitsiyasini saqlab qolishini va sperma tezligi energiya yetishmasligi tufayli orqaga harakatlana boshlagan nuqtadan pastga tushganda SSTdan chiqarib yuborilishini taxmin qilishadi. Zaniboni5 SST epiteliy hujayralarining apikal qismida 2, 3 va 9 akvaporinlar mavjudligini tasdiqladi, bu esa Foremanning sperma saqlash modelini bilvosita qo'llab-quvvatlashi mumkin. Ushbu tadqiqotda biz Sharkashi spermatozoidlarining deyarli yarmi oqayotgan suyuqlikda ijobiy reologiyani ko'rsatishini va agglyutinatsiyalangan sperma bog'lamlari ijobiy reologiyani ko'rsatuvchi spermatozoidlar sonini ko'paytirishini aniqladik, garchi agglyutinatsiya ularni sekinlashtirsa ham. Sperma hujayralari qushning fallop naychasi bo'ylab urug'lanish joyiga qanday o'tishi to'liq tushunilmagan. Sutemizuvchilarda follikulyar suyuqlik xemoattraksiyasi spermatozoidlarni o'ziga tortadi. Biroq, kimyoattraktantlar spermatozoidlarni uzoq masofalarga yaqinlashishga yo'naltiradi deb ishoniladi7. Shuning uchun, sperma tashish uchun boshqa mexanizmlar ham javobgardir. Spermaning juftlashgandan keyin ajralib chiqadigan bachadon naychasi suyuqligiga qarshi yo'naltirilishi va oqishi qobiliyati sichqonlarda spermani nishonga olishda asosiy omil ekanligi xabar qilingan. Parker 17 spermatozoidlar qushlar va sudralib yuruvchilarda kirpiksimon oqimga qarshi suzish orqali tuxum yo'llarini kesib o'tishini taklif qildi. Garchi bu qushlarda eksperimental ravishda namoyish etilmagan bo'lsa-da, Adolphi18 birinchi bo'lib filtr qog'ozi chizig'i bilan qopqoq va slayd o'rtasida yupqa suyuqlik qatlami hosil qilinganda parranda spermasi ijobiy natijalar berishini aniqladi. Reologiya. Hino va Yanagimachi [19] sichqoncha tuxumdon-naycha-bachadon kompleksini perfuziya halqasiga joylashtirdilar va bachadon naychalaridagi suyuqlik oqimini ko'rish uchun ismusga 1 µl siyoh yubordilar. Ular bachadon naychasida juda faol qisqarish va relaksatsiya harakatini payqashdi, bunda barcha siyoh sharlari bachadon naychasi ampulasi tomon barqaror harakatlanardi. Mualliflar sperma ko'tarilishi va urug'lantirilishi uchun bachadon naychalari suyuqligining pastki qismdan yuqori qismga oqib o'tishi muhimligini ta'kidlaydilar. Brillard20 tovuq va kurkalarda spermatozoidlar vaginal kirish joyidan bachadon-vaginal birikmaga faol harakat orqali ko'chib o'tishini xabar qildi, u yerda ular saqlanadi. Biroq, bu harakat bachadon-vaginal birikma va infundibulum o'rtasida talab qilinmaydi, chunki spermatozoidlar passiv siljish orqali tashiladi. Ushbu avvalgi tavsiyalarni va hozirgi tadqiqotda olingan natijalarni bilib, spermatozoidlarning yuqoriga harakatlanish qobiliyati (reologiya) tanlov jarayoni asoslangan xususiyatlardan biri deb taxmin qilish mumkin. Bu spermatozoidlarning vagina orqali o'tishini va ularning saqlash uchun CCTga kirishini belgilaydi. Forman4 ta'kidlaganidek, bu spermatozoidlarning ma'lum vaqt davomida SST va uning yashash muhitiga kirishi va keyin ularning tezligi pasaya boshlaganda chiqib ketishi jarayonini ham osonlashtirishi mumkin.
Boshqa tomondan, Matsuzaki va Sasanami 21 parranda spermatozoidlari erkak va urg'ochi reproduktiv traktlarida uyqu holatidan harakatchanlikka o'tishini ta'kidladilar. SSTda rezident spermatozoidlar harakatchanligining inhibatsiyasi spermaning uzoq vaqt saqlanishini va SSTdan chiqqandan keyin yosharishni tushuntirish uchun taklif qilingan. Gipoksik sharoitlarda Matsuzaki va boshqalar 1 SSTda laktatning yuqori ishlab chiqarilishi va ajralib chiqishi haqida xabar berishdi, bu esa rezident spermatozoidlar harakatchanligining inhibatsiyasiga olib kelishi mumkin. Bu holda, sperma reologiyasining ahamiyati spermatozoidlarni saqlashda emas, balki ularning tanlanishi va so'rilishida aks etadi.
Sperma agglyutinatsiyasi shakli SSTda spermaning uzoq vaqt saqlanishi uchun asosli tushuntirish hisoblanadi, chunki bu parrandalarda spermani ushlab turishning keng tarqalgan shakli2,22,23. Bakst va boshqalar 2 ko'pgina spermatozoidlar bir-biriga yopishib, fastsikulyar agregatlarni hosil qilishini va bedana CCMda yakka spermatozoidlar kamdan-kam hollarda topilganini kuzatdilar. Boshqa tomondan, Wen va boshqalar 24 tovuqlarda SST lümenida ko'proq tarqoq spermatozoidlar va kamroq spermatozoidlar to'plamlarini kuzatdilar. Ushbu kuzatishlarga asoslanib, sperma agglyutinatsiyasiga moyillik qushlar orasida va bir xil ejakulyatsiyadagi spermatozoidlar orasida farq qiladi deb taxmin qilish mumkin. Bundan tashqari, Van Krey va boshqalar 9 agglyutinatsiyalangan spermatozoidlarning tasodifiy dissotsiatsiyasi spermatozoidlarning fallop naychasi lümeniga asta-sekin kirib borishi uchun javobgar ekanligini ta'kidladilar. Ushbu gipotezaga ko'ra, avval agglyutinatsiya qobiliyati pastroq bo'lgan spermatozoidlar SSTdan chiqarib yuborilishi kerak. Shu nuqtai nazardan, spermatozoidlarning agglyutinatsiya qilish qobiliyati iflos qushlarda sperma raqobatining natijasiga ta'sir qiluvchi omil bo'lishi mumkin. Bundan tashqari, agglyutinatsiyalangan sperma qancha uzoq vaqt ajralsa, unumdorlik shuncha uzoq saqlanadi.
Spermatozoidlarning agregatsiyasi va bog'lamlarga to'planishi bir nechta tadqiqotlarda kuzatilgan bo'lsa-da2,22,24, ammo SST ichidagi kinematik kuzatuvlarining murakkabligi sababli ular batafsil tavsiflanmagan. In vitro sharoitida spermatozoidlarning agglyutinatsiyasini o'rganishga bir nechta urinishlar qilingan. Osilib turgan urug' tomchisidan ingichka sim chiqarilganda keng, ammo vaqtinchalik agregatsiya kuzatildi. Bu tomchidan cho'zilgan pufakcha chiqib, urug' bezini taqlid qilishiga olib keladi. 3D cheklovlari va tomchilatib quritish vaqtining qisqaligi tufayli butun blok tezda yaroqsiz holga keldi9. Ushbu tadqiqotda Sharkashi tovuqlari va mikrofluidik chiplardan foydalanib, biz bu bog'lamlarning qanday shakllanishini va qanday harakatlanishini tasvirlab bera oldik. Spermatozoid bog'lamlari sperma to'plangandan so'ng darhol hosil bo'lgan va spiral shaklida harakatlanishi aniqlangan, oqimda mavjud bo'lganda ijobiy reologiyani ko'rsatgan. Bundan tashqari, makroskopik jihatdan qaraganda, spermatozoid bog'lamlari ajratilgan spermatozoidlarga nisbatan harakatlanishning chiziqliligini oshirishi kuzatilgan. Bu shuni ko'rsatadiki, sperma agglyutinatsiyasi SST penetratsiyasidan oldin sodir bo'lishi mumkin va sperma ishlab chiqarish avvalroq taklif qilinganidek (Tingari va Lake12) stress tufayli kichik bir maydon bilan cheklanib qolmaydi. Tugun hosil bo'lishi paytida spermatozoidlar birlashma hosil qilguncha sinxron ravishda suzadilar, keyin ularning dumlari bir-biriga o'raladi va spermatozoidning boshi erkin qoladi, ammo dumi va spermatozoidning distal qismi yopishqoq modda bilan bir-biriga yopishadi. Shuning uchun, ligamentning erkin boshi harakat uchun javobgar bo'lib, ligamentning qolgan qismini sudrab boradi. Sperma bog'lamlarini skanerlash elektron mikroskopiyasida biriktirilgan sperma boshlari ko'p yopishqoq material bilan qoplanganligi ko'rsatildi, bu sperma boshlari dam olish bog'lamlarida biriktirilganligini ko'rsatadi, bu esa saqlash joyiga (SST) yetib borgandan keyin sodir bo'lishi mumkin.
Sperma surtmasi akridin apelsin bilan bo'yalganida, sperma hujayralari atrofidagi hujayradan tashqari yopishqoq materialni lyuminestsent mikroskop ostida ko'rish mumkin. Bu modda sperma bog'lamlarining atrofdagi har qanday sirtlarga yoki zarrachalarga yopishib olishiga va ularga yopishib olishiga imkon beradi, shunda ular atrofdagi oqim bilan birga suzib ketmaydi. Shunday qilib, bizning kuzatishlarimiz spermatozoidlarning yopishishining harakatlanuvchi bog'lamlar shaklidagi rolini ko'rsatadi. Ularning oqimga qarshi suzish va yaqin sirtlarga yopishish qobiliyati spermaning SSTda uzoqroq turishiga imkon beradi.
Rothschild25 sigir spermasining suspenziya tomchisidagi suzuvchi tarqalishini o'rganish uchun gemotsitometriya kamerasidan foydalangan holda, mikroskopning vertikal va gorizontal optik o'qlariga ega kamera orqali fotomikrograflar olgan. Natijalar shuni ko'rsatdiki, spermatozoidlar kameraning yuzasiga tortilgan. Mualliflar sperma va sirt o'rtasida gidrodinamik o'zaro ta'sirlar bo'lishi mumkinligini ta'kidlaydilar. Buni, Sharkashi jo'ja spermasining yopishqoq tuklar hosil qilish qobiliyati bilan birga, spermaning SST devoriga yopishib qolish va uzoq vaqt davomida saqlanish ehtimolini oshirishi mumkin.
Bccetti va Afzeliu26 sperma glikokaliks gametlarni aniqlash va aglutinatsiya qilish uchun zarurligini xabar qilishdi. Forman10 parranda spermasini neyraminidaza bilan davolash orqali glikoprotein-glikolipid qoplamalaridagi α-glikozidik bog'lanishlarning gidrolizi sperma harakatchanligiga ta'sir qilmasdan unumdorlikning pasayishiga olib kelganini kuzatdi. Mualliflar neyraminidazaning glikokaliksga ta'siri bachadon-vaginal birikmada sperma sekvestratsiyasini buzadi va shu bilan unumdorlikni pasaytiradi, deb ta'kidlashadi. Ularning kuzatuvlari neyraminidaza bilan davolash sperma va ootsitlarni aniqlashni kamaytirishi mumkinligini inkor eta olmaydi. Forman va Engel10 tovuqlar neyraminidaza bilan ishlov berilgan sperma bilan intravaginal ravishda urug'lantirilganda unumdorlik pasayganini aniqladilar. Biroq, neyraminidaza bilan ishlov berilgan sperma bilan IVF nazorat tovuqlariga nisbatan unumdorlikka ta'sir qilmadi. Mualliflar sperma membranasi atrofidagi glikoprotein-glikolipid qoplamasidagi o'zgarishlar bachadon-vaginal birikmada sperma sekvestratsiyasini buzish orqali spermaning urug'lanish qobiliyatini pasaytiradi, bu esa o'z navbatida bachadon-vaginal birikmaning tezligi tufayli sperma yo'qotilishini oshiradi, ammo sperma va tuxumni aniqlashga ta'sir qilmaydi, degan xulosaga kelishdi.
Bakst va Bauchan 11 kurkalarida SST lümeninde kichik pufakchalar va membrana parchalarini topdilar va bu granulalarning ba'zilari spermatozoid membranasi bilan birlashganini kuzatdilar. Mualliflar bu munosabatlar SSTda spermatozoidlarning uzoq muddatli saqlanishiga hissa qo'shishi mumkinligini ta'kidlaydilar. Biroq, tadqiqotchilar bu zarrachalarning manbasini, ular CCT epitelial hujayralari tomonidan ajralib chiqadimi, erkak reproduktiv tizimi tomonidan ishlab chiqariladimi yoki spermatozoidning o'zi tomonidan ishlab chiqariladimi, aniqlamadilar. Shuningdek, bu zarrachalar aglutinatsiya uchun javobgardir. Grützner va boshqalar27 epididimal epitelial hujayralar bitta teshikli urug' yo'llarini shakllantirish uchun zarur bo'lgan o'ziga xos oqsilni ishlab chiqarishi va ajratishi haqida xabar berishdi. Mualliflar shuningdek, bu bog'lamlarning tarqalishi epididimal oqsillarning o'zaro ta'siriga bog'liqligini xabar qilishdi. Nikson va boshqalar28 adnexa oqsil, kislotali sisteinga boy osteonektinni ajratishini aniqladilar; SPARC kalta tumshuqli exidnalar va platypuslarda spermatozoidlar to'plamlarini shakllantirishda ishtirok etadi. Bu nurlarning sochilishi bu oqsilning yo'qolishi bilan bog'liq.
Joriy tadqiqotda elektron mikroskopiya yordamida o'tkazilgan ultrastrukturaviy tahlil shuni ko'rsatdiki, spermatozoidlar ko'p miqdordagi zich materialga yopishgan. Bu moddalar yopishgan boshlar orasida va atrofida kondensatsiyalanadigan, ammo dum mintaqasida pastroq konsentratsiyalarda bo'lgan agglyutinatsiya uchun javobgar deb hisoblanadi. Biz bu agglyutinatsiya qiluvchi modda sperma bilan birga erkak reproduktiv tizimidan (epididimis yoki vas deferens) ajralib chiqadi deb taxmin qilamiz, chunki biz ko'pincha eyakulyatsiya paytida spermaning limfa va urug' plazmasidan ajralishini kuzatamiz. Qush spermatozoidlari epididimis va vas deferens orqali o'tganda, ular oqsillarni bog'lash va plazma lemmasi bilan bog'liq glikoproteinlarni olish qobiliyatini qo'llab-quvvatlaydigan yetilish bilan bog'liq o'zgarishlarga uchraydi, deb xabar berilgan. Ushbu oqsillarning SSTdagi doimiy sperma membranalarida saqlanib qolishi, bu oqsillar sperma membranasining barqarorligini olishga 30 ta'sir qilishi va ularning unumdorligini 31 aniqlashi mumkinligini ko'rsatadi. Ahmad va boshqalar32 erkak reproduktiv tizimining turli qismlaridan (moyaklardan distal vas deferensgacha) olingan spermatozoidlar, saqlash haroratidan qat'i nazar, suyuq saqlash sharoitida yashovchanlikning progressiv oshishini ko'rsatganini va tovuqlarda sun'iy urug'lantirishdan keyin fallop naychalarida ham yashovchanlik oshganini xabar qilishdi.
Sharkashi tovuq sperma tutamlari echidnalar, platypuslar, o'rmon sichqonlari, kiyik kalamushlari va dengiz cho'chqalari kabi boshqa turlarga qaraganda boshqacha xususiyat va funktsiyalarga ega. Sharkasi tovuqlarida spermatozoidlar to'plamlarining shakllanishi ularning suzish tezligini bitta spermatozoidlarga nisbatan pasaytirdi. Biroq, bu to'plamlar reologik jihatdan ijobiy spermatozoidlar foizini oshirdi va spermatozoidlarning dinamik muhitda o'zini barqarorlashtirish qobiliyatini oshirdi. Shunday qilib, bizning natijalarimiz SSTdagi sperma agglyutinatsiyasi spermani uzoq muddatli saqlash bilan bog'liq degan oldingi taklifni tasdiqlaydi. Shuningdek, biz spermaning tutamlarni hosil qilishga moyilligi SSTdagi sperma yo'qotish tezligini boshqarishi mumkin, bu esa sperma raqobatining natijasini o'zgartirishi mumkin, degan farazni ilgari suramiz. Ushbu taxminga ko'ra, agglyutinatsiya qobiliyati past bo'lgan spermatozoidlar avval SSTni chiqaradi, yuqori agglyutinatsiya qobiliyatiga ega spermatozoidlar esa naslning ko'p qismini ishlab chiqaradi. Bir teshikli sperma tutamlarining shakllanishi foydalidir va ota-ona va bola nisbatiga ta'sir qiladi, ammo boshqa mexanizmdan foydalanadi. Echidna va platypuslarda spermatozoidlar bir-biriga parallel ravishda joylashtirilgan bo'lib, nurning oldinga siljish tezligini oshiradi. Echidna to'plamlari bitta spermatozoidlarga qaraganda uch baravar tezroq harakatlanadi. Echidnalarda bunday spermatozoidlar to'plamlarining shakllanishi dominantlikni saqlab qolish uchun evolyutsion moslashuv deb hisoblanadi, chunki urg'ochilar tartibsiz ravishda yashaydilar va odatda bir nechta erkaklar bilan juftlashadilar. Shuning uchun turli xil ejakulyatsiyalardan olingan spermatozoidlar tuxumni urug'lantirish uchun qattiq raqobatlashadilar.
Sharkasi tovuqlarining aglutinlangan spermatozoidlarini fazali kontrastli mikroskopiya yordamida tasavvur qilish oson, bu esa foydali deb hisoblanadi, chunki u in vitro spermatozoidlarning xatti-harakatlarini oson o'rganish imkonini beradi. Sharkasi tovuqlarida sperma to'plamining shakllanishi ko'payishni rag'batlantiradigan mexanizm, shuningdek, ba'zi platsenta sutemizuvchilarda kuzatiladigan mexanizmdan farq qiladi, masalan, o'rmon sichqonlari kabi hamkorlikdagi sperma xatti-harakatlarini ifodalaydi, bu yerda ba'zi spermatozoidlar tuxumlarga yetib boradi va boshqa qarindosh shaxslarga tuxumlariga yetib borishi va ularga zarar yetkazishiga yordam beradi. o'zingizni isbotlash uchun. altruistik xatti-harakatlar. O'z-o'zini urug'lantirish 34. Spermatozoidlardagi hamkorlikdagi xatti-harakatlarning yana bir misoli kiyik sichqonlarida topilgan, bu yerda spermatozoidlar genetik jihatdan eng yaqin bo'lgan spermatozoidlarni aniqlab, birlashtira olgan va bog'liq bo'lmagan spermatozoidlarga nisbatan tezligini oshirish uchun hamkorlikdagi guruhlarni tashkil qilgan35.
Ushbu tadqiqotda olingan natijalar Fomanning SWSda spermatozoidlarni uzoq muddatli saqlash nazariyasiga zid kelmaydi. Tadqiqotchilarning ta'kidlashicha, sperma hujayralari SSTni qoplaydigan epitelial hujayralar oqimida uzoq vaqt davomida harakatlanishda davom etadi va ma'lum vaqtdan so'ng sperma hujayralarining energiya zaxiralari kamayadi, bu esa tezlikning pasayishiga olib keladi, bu esa kichik molekulyar og'irlikdagi moddalarni chiqarib yuborish imkonini beradi. SST lümeninden suyuqlik oqimi bilan spermatozoidlarning energiyasi Fallop naychasining bo'shlig'i. Ushbu tadqiqotda biz bitta spermatozoidning yarmi oqayotgan suyuqliklarga qarshi suzish qobiliyatini ko'rsatganini va ularning bog'lamdagi yopishishi ularning ijobiy reologiyani ko'rsatish qobiliyatini oshirganini kuzatdik. Bundan tashqari, bizning ma'lumotlarimiz Matsuzaki va boshqalarning SSTda laktat sekretsiyasining ortishi rezident spermatozoidlarning harakatchanligini inhibe qilishi mumkinligi haqida xabar bergan ma'lumotlariga mos keladi. Biroq, bizning natijalarimiz SSTdagi xatti-harakatlarini aniqlashga urinishda mikrokanal ichida dinamik muhit mavjudligida sperma harakatchan ligamentlarining shakllanishini va ularning reologik xatti-harakatlarini tasvirlaydi. Kelajakdagi tadqiqotlar aglutinatsiya qiluvchi vositaning kimyoviy tarkibi va kelib chiqishini aniqlashga qaratilishi mumkin, bu shubhasiz tadqiqotchilarga suyuq spermani saqlashning yangi usullarini ishlab chiqish va tug'ish davomiyligini oshirishga yordam beradi.
Tadqiqotda sperma donorlari sifatida 30 haftalik yalang'och bo'yinli o'n beshta erkak sharkasi (gomozigota dominant; Na Na) tanlab olindi. Qushlar Misrning Ashit gubernatorligi, Ashit universiteti qishloq xo'jaligi fakultetining Tadqiqot parrandachilik fermasida boqildi. Qushlar alohida qafaslarda (30 x 40 x 40 sm) saqlandi, yorug'lik dasturiga (16 soat yorug'lik va 8 soat qorong'ulik) duchor qilindi va har biri 160 g xom oqsil, 2800 kkal metabolizmga uchraydigan energiya, 35 g kaltsiydan iborat parhez bilan oziqlantirildi. Har bir kilogramm parhez uchun 5 gramm mavjud fosfor miqdorida.
36, 37-ma'lumotlarga ko'ra, erkaklardan sperma qorin massaji orqali olingan. 15 erkakdan 3 kun davomida jami 45 ta sperma namunalari olingan. Sperma (n = 15/kun) darhol kaliy difosfat (1,27 g), mononatriy glutamat monohidrat (0,867 g), fruktoza (0,5 kun) suvsiz natriy asetat (0,43 g), tris(gidroksimetil)aminometan (0,195 g), kaliy sitrat monohidrat (0,064 g), kaliy monofosfat (0,065 g), magniy xlorid (0,034 g) va H2O (100 ml) ni o'z ichiga olgan Belsville Poultry Semen Erituvchisi bilan 1:1 (v:v) nisbatda suyultirildi, pH = 7,5, osmolyarlik 333 mOsm/kg38. Suyultirilgan sperma namunalari avval sperma sifati (namligi) yaxshi ekanligiga ishonch hosil qilish uchun yorug'lik mikroskopi ostida tekshirildi va keyin yig'ilgandan keyin yarim soat ichida ishlatilgunga qadar 37°C haroratda suv hammomida saqlandi.
Spermatozoidlarning kinematikasi va reologiyasi mikrofluidik qurilmalar tizimi yordamida tasvirlangan. Sperma namunalari Beltsville qushlarning sperma suyultirgichida 1:40 gacha suyultirildi, mikrofluidik qurilmaga yuklandi (pastga qarang) va kinetik parametrlar mikrofluidiklarni tavsiflash uchun ilgari ishlab chiqilgan kompyuterlashtirilgan sperma tahlili (CASA) tizimi yordamida aniqlandi. suyuq muhitda spermatozoidlarning harakatchanligi (Mexanika muhandisligi kafedrasi, Muhandislik fakulteti, Assiut universiteti, Misr). Plaginni quyidagi manzildan yuklab olish mumkin: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39. Egri tezlik (VCL, μm/s), chiziqli tezlik (VSL, μm/s) va o'rtacha traektoriya tezligi (VAP, μm/s) o'lchandi. Spermatozoidlarning videolari Tucson ISH1000 kamerasiga 30 fps tezlikda 3 soniya davomida ulangan teskari Optika XDS-3 fazali kontrastli mikroskop (40x obyektivli) yordamida suratga olindi. CASA dasturidan foydalanib, har bir namunada kamida uchta soha va 500 ta sperma traektoriyasini o'rganing. Yozib olingan video uyda tayyorlangan CASA yordamida qayta ishlangan. CASA plaginidagi harakatchanlik ta'rifi spermaning oqim tezligiga nisbatan suzish tezligiga asoslangan va yonma-yon harakatlanish kabi boshqa parametrlarni o'z ichiga olmaydi, chunki bu suyuqlik oqimida ishonchliroq ekanligi aniqlangan. Reologik harakat sperma hujayralarining suyuqlik oqimi yo'nalishiga qarshi harakati sifatida tavsiflanadi. Reologik xususiyatlarga ega spermatozoidalar harakatchan spermatozoidalar soniga bo'lingan; tinch holatda bo'lgan va konvektiv harakatlanadigan spermatozoidalar hisobdan chiqarilgan.
Amaldagi barcha kimyoviy moddalar, agar boshqacha ko'rsatilmagan bo'lsa, Elgomhoria Pharmaceuticals (Qohira, Misr) kompaniyasidan olingan. Qurilma El-sherry va boshqalar tomonidan tavsiflanganidek, ba'zi o'zgartirishlar bilan ishlab chiqarilgan. 40. Mikrokanallarni tayyorlash uchun ishlatilgan materiallar shisha plitalar (Howard Glass, Worcester, MA), SU-8-25 salbiy qarshilik (MicroChem, Newton, CA), diaseton spirti (Sigma Aldrich, Steinheim, Germaniya) va poliatsetonni o'z ichiga olgan. -184, Dow Corning, Midland, Michigan). Mikrokanallar yumshoq litografiya yordamida ishlab chiqariladi. Birinchidan, kerakli mikrokanal dizayniga ega shaffof himoya niqobi yuqori aniqlikdagi printerda chop etildi (Prismatic, Cairo, Egypt and Pacific Arts and Design, Markham, ON). Ustalar substrat sifatida shisha plitalardan foydalangan holda tayyorlangan. Plitalar aseton, izopropanol va deionlangan suvda tozalangan va keyin spin qoplamasi (3000 rpm, 1 daqiqa) yordamida 20 µm SU8-25 qatlami bilan qoplangan. Keyin SU-8 qatlamlari muloyimlik bilan quritildi (65°C, 2 daqiqa va 95°C, 10 daqiqa) va 50 soniya davomida UB nurlari ta'sirida qoldirildi. Ta'sirdan keyin SU-8 qatlamlarini o'zaro bog'lash uchun 65°C va 95°C da 1 daqiqa va 4 daqiqa davomida pishiring, so'ngra 6,5 ​​daqiqa davomida diaseton spirtida ishlab chiqaring. SU-8 qatlamini yanada qattiqlashtirish uchun vaflilarni qattiq pishiring (200°C da 15 daqiqa).
PDMS monomer va sertleştiricini 10:1 og'irlik nisbatida aralashtirish orqali tayyorlandi, so'ngra vakuumli eksikatorda gazsizlantirildi va SU-8 asosiy ramkasiga quyildi. PDMS pechda (120°C, 30 daqiqa) quritildi, so'ngra kanallar kesildi, asosiydan ajratildi va naychalarni mikrokanalning kirish va chiqish joylariga ulash uchun teshildi. Nihoyat, PDMS mikrokanallari boshqa joyda tasvirlanganidek, ko'chma korona protsessori (Electro-Technic Products, Chikago, IL) yordamida mikroskop slaydlariga doimiy ravishda biriktirildi. Ushbu tadqiqotda ishlatilgan mikrokanalning o'lchami 200 µm × 20 µm (W × H) va uzunligi 3,6 sm.
Mikrokanal ichidagi gidrostatik bosim natijasida hosil bo'lgan suyuqlik oqimi kirish rezervuaridagi suyuqlik sathini chiqish rezervuaridagi Δh39 balandlik farqidan yuqori darajada ushlab turish orqali erishiladi (1-rasm).
bu yerda f - ishqalanish koeffitsienti, to'rtburchaklar kanaldagi laminar oqim uchun f = C/Re sifatida aniqlanadi, bu yerda C kanalning tomonlar nisbatiga bog'liq bo'lgan doimiy qiymat, L - mikrokanal uzunligi, Vav - mikrokanal ichidagi o'rtacha tezlik, Dh - kanalning gidravlik diametri, g - tortishish tezlanishi. Ushbu tenglama yordamida o'rtacha kanal tezligini quyidagi tenglama yordamida hisoblash mumkin: