Tack för att du besöker Nature.com. Webbläsarversionen du använder har begränsat CSS-stöd. För bästa möjliga upplevelse rekommenderar vi att du använder en uppdaterad webbläsare (eller inaktiverar kompatibilitetsläge i Internet Explorer). Under tiden, för att säkerställa fortsatt stöd, kommer vi att rendera webbplatsen utan stilar och JavaScript.
Fåglars fertilitet beror på deras förmåga att lagra tillräckligt med livskraftiga spermier under en längre tid i spermielagringskanalerna (SST). Den exakta mekanismen genom vilken spermier kommer in i, vistas i och lämnar SST är fortfarande kontroversiell. Spermierna från sharkasi-höns visade en hög tendens till agglutination och bildade rörliga filamentösa buntar innehållande många celler. På grund av svårigheten att observera spermiernas rörlighet och beteende i en ogenomskinlig äggledare, använde vi en mikrofluidisk anordning med ett mikrokanaltvärsnitt som liknar spermiernas för att studera spermiernas agglutination och rörlighet. Denna studie diskuterar hur spermieknippen bildas, hur de rör sig och deras möjliga roll i att förlänga spermiernas vistelse i SST. Vi undersökte spermiernas hastighet och reologiska beteende när vätskeflöde genererades i en mikrofluidisk kanal genom hydrostatiskt tryck (flödeshastighet = 33 µm/s). Spermierna tenderar att simma mot strömmen (positiv reologi) och spermieknippets hastighet är signifikant reducerad jämfört med enskilda spermier. Spermieknippen har observerats röra sig i en spiral och öka i längd och tjocklek allt eftersom fler enskilda spermier rekryteras. Spermieknippen observerades närma sig och vidhäfta till sidoväggarna av de mikrofluidiska kanalerna för att undvika att svepas med med vätskeflödeshastighet > 33 µm/s. Spermieknippen observerades närma sig och vidhäfta till sidoväggarna av de mikrofluidiska kanalerna för att undvika att svepas med med vätskeflödeshastighet > 33 µm/s. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрофлюидных, избежать сметания со скоростью потока жидкости> 33 мкм / с. Spermieknippen har observerats närma sig och fästa vid sidoväggarna i de mikrofluidiska kanalerna för att undvika att svepas bort vid vätskeflödeshastigheter >33 µm/s.观察到精子束接近并粘附在微流体通道的侧壁上，以避免被流体流速>/33 sサs33 µm/s 扫过. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрожидкостног, микрожидкостног избежать сметания потоком жидкости со скоростью > 33 мкм/с. Spermieknippen har observerats närma sig och fästa vid sidoväggarna i den mikrofluidiska kanalen för att undvika att svepas bort av vätskeflödet vid >33 µm/s.Svepelektronmikroskopi och transmissionselektronmikroskopi visade att spermieknippena stöddes av rikligt med tätt material. De erhållna uppgifterna visar den unika rörligheten hos Sharkazi-kycklingspermierna, såväl som spermiernas förmåga att agglutinera och bilda mobila buntar, vilket bidrar till en bättre förståelse av långtidslagringen av spermier i SMT.
För att uppnå befruktning hos människor och de flesta djur måste spermier och ägg anlända till befruktningsstället vid rätt tidpunkt. Därför måste parning ske före eller vid tidpunkten för ägglossning. Å andra sidan lagrar vissa däggdjur, såsom hundar, såväl som icke-däggdjursarter, såsom insekter, fiskar, reptiler och fåglar, spermier i sina reproduktionsorgan under en längre tid tills deras ägg är redo för befruktning (asynkron befruktning 1 ). Fåglar kan bibehålla livskraften hos spermier som kan befrukta ägg i 2–10 veckor 2 .
Detta är en unik egenskap som skiljer fåglar från andra djur, eftersom den ger en hög sannolikhet för befruktning efter en enda insemination i flera veckor utan samtidig parning och ägglossning. Det huvudsakliga spermielagringsorganet, kallat spermielagringstubuli (SST), är beläget i de inre slemhinnevecken vid den uterovaginala övergången. Hittills är mekanismerna genom vilka spermier kommer in i, finns kvar i och lämnar spermabanken inte helt klarlagda. Baserat på tidigare studier har många hypoteser framförts, men ingen av dem har bekräftats.
Forman4 antog att spermier bibehåller sin vistelse i SST-håligheten genom kontinuerlig oscillerande rörelse mot vätskeflödets riktning genom proteinkanaler belägna på SST-epitelceller (reologi). ATP utarmas på grund av den konstanta flagellära aktivitet som behövs för att hålla spermierna i SST-lumen och motiliteten minskar så småningom tills spermierna transporteras ut ur spermabanken med vätskeflöde och påbörjar en ny resa ner i den uppåtgående äggledaren för att befrukta spermierna. Ägg (Forman4). Denna modell för spermielagring stöds av detektion genom immuncytokemi av akvaporinerna 2, 3 och 9 som finns i SST-epitelceller. Hittills saknas studier om kycklingspermiereologi och dess roll i SST-lagring, vaginal spermieselektion och spermiekonkurrens. Hos kycklingar kommer spermier in i slidan efter naturlig parning, men mer än 80 % av spermierna stöts ut ur slidan kort efter parning. Detta tyder på att slidan är den primära platsen för spermieselektion hos fåglar. Dessutom har det rapporterats att mindre än 1 % av de spermier som befruktas i slidan hamnar i SST2. Vid artificiell insemination av kycklingar i slidan tenderar antalet spermier som når SST att öka 24 timmar efter insemination. Hittills är mekanismen för spermieselektion under denna process oklar, och spermierörlighet kan spela en viktig roll i spermieupptaget från SST. På grund av äggledarnas tjocka och ogenomskinliga väggar är det svårt att direkt övervaka spermierörligheten i fåglarnas äggledare. Därför saknar vi grundläggande kunskaper om hur spermier övergår till SST efter befruktning.
Reologi har nyligen erkänts som en viktig faktor som kontrollerar spermietransport i däggdjurs könsorgan. Baserat på rörliga spermiernas förmåga att migrera motströms, använde Zaferani et al8 ett corra-mikrofluidsystem för att passivt isolera rörliga spermier från inhägnade spermaprover. Denna typ av spermasortering är avgörande för medicinsk infertilitetsbehandling och klinisk forskning, och är att föredra framför traditionella metoder som är tids- och arbetsintensiva och kan äventyra spermiernas morfologi och strukturella integritet. Emellertid har inga studier hittills genomförts om effekten av sekret från kycklingars könsorgan på spermierörlighet.
Oavsett mekanismen som lagrar spermier i SST har många forskare observerat att residenta spermier agglutinerar huvud mot huvud i SST hos kycklingar 9, 10, vaktlar 2 och kalkoner 11 för att bilda agglutinerade spermieknippen. Författarna föreslår att det finns ett samband mellan denna agglutination och långtidslagring av spermier i SST.
Tingari och Lake12 rapporterade ett starkt samband mellan spermier i kycklingens spermiemottagande körtel och ifrågasatte om fågelspermier agglutinerar på samma sätt som däggdjursspermier. De tror att de djupa kopplingarna mellan spermier i sädesledaren kan bero på den stress som orsakas av närvaron av ett stort antal spermier i ett litet utrymme.
Vid utvärdering av spermiernas beteende på färska hängande objektglas kan övergående tecken på agglutination ses, särskilt vid kanterna av spermadropparna. Agglutinationen stördes dock ofta av den rotationsrörelse som är förknippad med kontinuerlig rörelse, vilket förklarar den övergående naturen hos detta fenomen. Forskarna noterade också att när utspädningsmedlet tillsattes sperman uppstod avlånga "trådliknande" cellaggregat.
Tidiga försök att imitera en spermie gjordes genom att ta bort en tunn tråd från en hängande droppe, vilket resulterade i en avlång spermieliknande vesikel som stack ut från spermadroppen. Spermierna radade omedelbart upp sig parallellt inuti vesikeln, men hela enheten försvann snabbt på grund av 3D-begränsningen. För att studera spermiernas agglutination är det därför nödvändigt att observera spermiernas rörlighet och beteende direkt i isolerade spermielagringskanaler, vilket är svårt att uppnå. Därför är det nödvändigt att utveckla ett instrument som imiterar spermier för att stödja studier av spermierörlighet och agglutinationsbeteende. Brillard et al13 rapporterade att den genomsnittliga längden på spermielagringskanaler hos vuxna kycklingar är 400–600 µm, men vissa spermielagringskanaler kan vara så långa som 2000 µm. Mero och Ogasawara14 delade in sädeskörtlarna i förstorade och icke-förstorade spermielagringskanaler, vilka båda var lika långa (~500 µm) och lika stora i halsbredd (~38 µm), men den genomsnittliga lumendiametern för kanalerna var 56,6 respektive 56,6 µm, och 11,2 µm. I den aktuella studien använde vi en mikrofluidisk anordning med en kanalstorlek på 200 µm × 20 µm (B × H), vars tvärsnitt ligger något nära det för den amplifierade SST:n. Dessutom undersökte vi spermierörlighet och agglutinationsbeteende i flödande vätska, vilket överensstämmer med Foremans hypotes att vätska som produceras av SST-epitelceller håller spermier i lumen i en motströms (reologisk) riktning.
Syftet med denna studie var att övervinna problemen med att observera spermierörlighet i äggledaren och att undvika svårigheterna med att studera spermiernas reologi och beteende i en dynamisk miljö. En mikrofluidisk anordning användes som skapar hydrostatiskt tryck för att simulera spermierörlighet i en kycklings könsorgan.
När en droppe av ett utspätt spermieprov (1:40) laddades i mikrokanalanordningen kunde två typer av spermierörlighet identifieras (isolerade spermier och bundna spermier). Dessutom tenderade spermierna att simma mot strömmen (positiv reologi; video 1, 2). Även om spermieknippen hade lägre hastighet än ensamma spermier (p < 0,001), ökade de andelen spermier som uppvisade positiv reotaxis (p < 0,001; tabell 2). Även om spermieknippen hade lägre hastighet än ensamma spermier (p < 0,001), ökade de andelen spermier som uppvisade positiv reotaxis (p < 0,001; tabell 2). Хотя пучки сперматозоидов имели более низкую скорость, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), ливенич сперматозоидов, демонстрирующих положительный реотаксис (p < 0,001; таблица 2). Även om spermiebuntarna hade en lägre hastighet än den hos enskilda spermier (p < 0,001), ökade de andelen spermier som uppvisade positiv reotaxi (p < 0,001; tabell 2).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度（p < 0,001），但它们增加了显示阳性流变性的精子百分比（p < 0,001；表2）。尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 （p <0,001） ， 但 增加 昧 倧徲 示 逳百分比 （p <0,001 ； 2。。。。。。)）))) Хотя скорость пучков сперматозоидов была ниже, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), они увелитичив сперматозоидов с положительной реологией (p < 0,001; таблица 2). Även om spermieknippens hastighet var lägre än för enskilda spermier (p < 0,001), ökade de andelen spermier med positiv reologi (p < 0,001; tabell 2).Positiv reologi för enskilda spermier och tuftor uppskattas till cirka 53 % respektive 85 %.
Det har observerats att spermierna hos Sharkashi-kycklingar omedelbart efter utlösning bildar linjära buntar, bestående av dussintals individer. Dessa tuvor ökar i längd och tjocklek över tid och kan finnas kvar in vitro i flera timmar innan de försvinner (video 3). Dessa trådformade buntar är formade som echidna-spermier som bildas i slutet av bitestiklarna. Sharkashi-hönssperma har visat sig ha en hög tendens att agglutinera och bilda ett nätformigt bunt på mindre än en minut efter insamling. Dessa strålar är dynamiska och kan fastna på närliggande väggar eller statiska föremål. Även om spermiebuntar minskar spermiecellernas hastighet, är det tydligt att de makroskopiskt ökar deras linjäritet. Buntarnas längd varierar beroende på antalet spermier som samlats in i buntarna. Två delar av bunten isolerades: den initiala delen, inklusive det fria huvudet på den agglutinerade spermien, och den terminala delen, inklusive svansen och hela den distala änden av spermien. Med hjälp av en höghastighetskamera (950 fps) observerades fria huvuden av agglutinerade spermier i den första delen av bunten. Dessa huvuden är ansvariga för buntens rörelse på grund av deras oscillerande rörelse, och drar in de återstående spermierna i bunten med en spiralformad rörelse (Video 4). I långa tuvor har det dock observerats att vissa fria spermiehuvuden fäster vid kroppen och att den terminala delen av tuftan fungerar som vingar för att driva tuftan framåt.
Medan spermiebuntarna rör sig parallellt med varandra i ett långsamt vätskeflöde, börjar de dock överlappa varandra och fastna vid allt som står stilla, för att inte sköljas bort av strömmen när flödeshastigheten ökar. Buntarna bildas när en handfull spermieceller närmar sig varandra, de börjar röra sig synkront och lindas runt varandra, och fastnar sedan vid en klibbig substans. Figur 1 och 2 visar hur spermierna närmar sig varandra och bildar en förbindelse när svansarna lindas runt varandra.
Forskarna tillämpade hydrostatiskt tryck för att skapa vätskeflöde i en mikrokanal för att studera spermiernas reologi. En mikrokanal med en storlek på 200 µm × 20 µm (B × H) och en längd på 3,6 µm användes. Mikrokanaler mellan behållare med sprutor monterade i ändarna användes. Karamellfärg användes för att göra kanalerna mer synliga.
Fäst sammankopplingskablar och tillbehör på väggen. Videon togs med ett faskontrastmikroskop. Med varje bild presenteras faskontrastmikroskopi- och mappningsbilder. (A) Förbindelsen mellan två strömmar motstår flödet på grund av spiralformad rörelse (röd pil). (B) Förbindelsen mellan rörknippet och kanalväggen (röda pilar), samtidigt som de är anslutna till två andra buntar (gula pilar). (C) Spermieknippen i den mikrofluidiska kanalen börjar ansluta till varandra (röda pilar) och bildar ett nät av spermieknippen. (D) Bildandet av ett nätverk av spermieknippen.
När en droppe utspädd sperma laddades i mikrofluidanordningen och ett flöde skapades, observerades spermiestrålen röra sig mot flödesriktningen. Buntarna passade tätt mot mikrokanalernas väggar, och de fria huvudena i den första delen av buntarna passade tätt mot dem (video 5). De fastnar också vid eventuella stationära partiklar i sin väg, såsom skräp, för att motstå att svepas bort av strömmen. Med tiden blir dessa tuftar långa filament som fångar andra enskilda spermier och kortare tuftar (video 6). När flödet börjar sakta ner börjar långa spermierader bilda ett nätverk av spermierader (video 7; figur 2).
Vid hög flödeshastighet (V > 33 µm/s) ökar trådarnas spiralrörelser i ett försök att fånga många individuella spermiebildande buntar för att bättre motstå flödets drivande kraft. Vid hög flödeshastighet (V > 33 µm/s) ökar trådarnas spiralrörelser i ett försök att fånga många individuella spermiebildande buntar för att bättre motstå flödets drivande kraft. При высокой скорости потока (V > 33 мкм/с) спиралевидные движения нитей усиливаются, поскольку опытаю множество отдельных сперматозоидов, образующих пучки, которые лучше противостоят дрейфующих силей. Vid höga flödeshastigheter (V > 33 µm/s) ökar strängarnas spiralformade rörelser när de försöker fånga många individuella spermier och bilda buntar som bättre kan motstå flödets drivande kraft.在高流速(V > 33 µm/s)时，螺纹的螺旋运动增加，以试图捕捉许多形成束的单个精子，从而更好地抵抗流动的漂移力。在 高 流速 (v> 33 µm/s) 时 ， 的 螺旋 运动 增加 ， 以 试图 许多 形成 缾 坸从而 更 地 抵抗 的 漂移力。。。。。。。。。。 При высоких скоростях потока (V > 33 мкм/с) спиральное движение нитей увеличивается в попытке захть отдельных сперматозоидов, образующих пучки, чтобы лучше сопротивляться силам дрейфа потока. Vid höga flödeshastigheter (V > 33 µm/s) ökar filamentens spiralformade rörelse i ett försök att fånga många individuella spermier som bildar buntar för att bättre motstå flödets driftkrafter.De försökte också fästa mikrokanaler på sidoväggarna.
Spermieknippen identifierades som kluster av spermiehuvuden och böjda svansar med hjälp av ljusmikroskopi (LM). Spermieknippen med olika aggregat har också identifierats som vridna huvuden och flagellära aggregat, multipla sammansmälta spermiesvansar, spermiehuvuden fästa vid en svans och spermiehuvuden med böjda kärnor som multipla sammansmälta kärnor. Transmissionselektronmikroskopi (TEM). Svepelektronmikroskopi (SEM) visade att spermieknippena var mantlade aggregat av spermiehuvuden och spermieaggregaten uppvisade ett vidhäftande nätverk av lindade svansar.
Spermies morfologi och ultrastruktur, bildandet av spermiebuntar studerades med hjälp av ljusmikroskopi (halv sektion), svepelektronmikroskopi (SEM) och transmissionselektronmikroskopi (TEM), spermieutstryk färgades med akridinorange och undersöktes med epifluorescensmikroskopi.
Färgning av spermieutstryk med akridinorange (Fig. 3B) visade att spermiehuvudena var sammansatta och täckta med sekretoriskt material, vilket ledde till bildandet av stora tofsar (Fig. 3D). Spermieknippena bestod av spermieaggregat med ett nätverk av fästa svansar (Fig. 4A-C). Spermieknippena består av svansarna från många spermier som är sammansatta (Fig. 4D). Sekret (Fig. 4E,F) täckte spermieknippenas huvuden.
Bildning av spermieknippet Med hjälp av faskontrastmikroskopi och spermieutstryk färgade med akridinorange visades att spermiehuvudena håller ihop. (A) Tidig spermietovsbildning börjar med en spermie (vit cirkel) och tre spermier (gul cirkel), där spiralen börjar vid stjärtfenan och slutar vid huvudet. (B) Mikrofotografi av ett spermieutstryk färgat med akridinorange som visar vidhäftande spermiehuvuden (pilar). Utsöndringen täcker huvudet/huvudena. Förstoring × 1000. (C) Utveckling av en stor stråle som transporteras av flöde i en mikrofluidisk kanal (med en höghastighetskamera vid 950 fps). (D) Mikrofotografi av ett spermieutstryk färgat med akridinorange som visar stora tofsar (pilar). Förstoring: ×200.
Svepelektronmikrografi av en spermiestråle och ett spermieutstryk färgat med akridinorange. (A, B, D, E) är digitala färgsvepelektronmikrografier av spermier, och C och F är mikrografer av akridinorange-färgade spermieutstryk som visar vidhäftning av flera spermier som omsluter stjärtfenan. (AC) Spermieaggregat visas som ett nätverk av vidhäftande svansar (pilar). (D) Vidhäftning av flera spermier (med vidhäftande substans, rosa kontur, pil) som omsluter svansen. (E och F) Spermiehuvudaggregat (pekare) täckta med vidhäftande material (pekare). Spermieerna bildade buntar med flera virvelliknande strukturer (F). (C) ×400 och (F) ×200 förstoringsgrader.
Med hjälp av transmissionselektronmikroskopi fann vi att spermieknippena hade fästa svansar (Fig. 6A, C), huvuden fästa vid svansar (Fig. 6B) eller huvuden fästa vid svansar (Fig. 6D). Spermieknippets huvuden är böjda och presenteras i sektion två kärnregioner (Fig. 6D). I incisionsknippet hade spermierna ett vridet huvud med två kärnregioner och flera flagellära regioner (Fig. 5A).
Digitalt elektronmikrografi i färg som visar de sammankopplande svansarna i spermieknippet och det agglutinerande materialet som förbinder spermiehuvudena. (A) Fästande svans på ett stort antal spermier. Lägg märke till hur svansen ser ut i både stående (pil) och liggande (pil) projektioner. (B) Spermiehuvudet (pil) är sammankopplat med svansen (pil). (C) Flera spermiesvansar (pilar) är fästa. (D) Agglutinationsmaterial (AS, blått) förbinder fyra spermiehuvuden (lila).
Svepelektronmikroskopi användes för att detektera spermiehuvuden i spermieknippen täckta med sekret eller membran (Figur 6B), vilket indikerar att spermieknippena var förankrade av extracellulärt material. Det agglutinerade materialet koncentrerades i spermiehuvudet (manethuvudliknande sammansättning; Fig. 5B) och expanderade distalt, vilket gav ett lysande gult utseende under fluorescensmikroskopi när det färgades med akridinorange (Fig. 6C). Denna substans är tydligt synlig under ett svepmikroskop och anses vara ett bindemedel. Halvtunna snitt (Fig. 5C) och spermieutstryk färgade med akridinorange visade spermieknippen innehållande tätt packade huvuden och böjda svansar (Fig. 5D).
Olika fotomikrografer som visar aggregering av spermiehuvuden och vikta svansar med hjälp av olika metoder. (A) Tvärsnitts digital färgtransmissionselektronmikrografi av ett spermieknippe som visar ett spiralformat spermiehuvud med en tvådelad kärna (blå) och flera flagellära delar (grön). (B) Digital färgsvepelektronmikrografi som visar ett kluster av manetliknande spermiehuvuden (pilar) som verkar vara täckta. (C) Halvtunn sektion som visar aggregerade spermiehuvuden (pilar) och böjda svansar (pilar). (D) Mikrograf av ett spermieutstryk färgat med akridinorange som visar aggregat av spermiehuvuden (pilar) och böjda vidhäftande svansar (pilar). Observera att en klibbig substans (S) täcker spermiens huvud. (D) × 1000 förstoring.
Med hjälp av transmissionselektronmikroskopi (fig. 7A) noterades det också att spermiehuvudena var vridna och att kärnorna hade en spiralform, vilket bekräftades av spermieutstryk färgade med akridinorange och undersökta med fluorescensmikroskopi (fig. 7B).
(A) Digital färgelektronmikrografi och (B) Spermieutstryk färgat med akridinorange som visar spiralformade huvuden och fästning av spermiehuvuden och -svansar (pilar). (B) × 1000 förstoring.
Ett intressant fynd är att Sharkazis spermier aggregerar och bildar rörliga filamentösa buntar. Egenskaperna hos dessa buntar gör det möjligt för oss att förstå deras möjliga roll i absorptionen och lagringen av spermier i SST.
Efter parning kommer spermierna in i slidan och genomgår en intensiv urvalsprocess, vilket resulterar i att endast ett begränsat antal spermier kommer in i SST15,16. Hittills är mekanismerna genom vilka spermier kommer in i och ut ur SST oklara. Hos fjäderfä lagras spermier i SST under en längre period på 2 till 10 veckor, beroende på art6. Det råder fortfarande kontroverser om spermans tillstånd under lagring i SST. Är de i rörelse eller i vila? Med andra ord, hur behåller spermiecellerna sin position i SST så länge?
Forman4 föreslog att SST-residens och utstötning kunde förklaras i termer av spermierörlighet. Författarna antar att spermier bibehåller sin position genom att simma mot vätskeflödet som skapas av SST-epitelet och att spermier stöts ut från SST när deras hastighet sjunker under den punkt där de börjar röra sig bakåt på grund av brist på energi. Zaniboni5 bekräftade närvaron av akvaporiner 2, 3 och 9 i den apikala delen av SST-epitelceller, vilket indirekt kan stödja Foremans spermielagringsmodell. I den aktuella studien fann vi att nästan hälften av Sharkashis spermier uppvisar positiv reologi i den flödande vätskan, och att agglutinerade spermieknippen ökar antalet spermier som uppvisar positiv reologi, även om agglutination saktar ner dem. Hur spermier färdas uppför fågelns äggledare till befruktningsstället är inte helt förstådd. Hos däggdjur kemoattraherar follikulärvätskan spermier. Emellertid tros kemoattraktanter styra spermier att närma sig långa avstånd7. Därför är andra mekanismer ansvariga för spermietransport. Spermiernas förmåga att orientera och flöda mot äggledarvätskan som frigörs efter parning har rapporterats vara en viktig faktor för att rikta in sig på spermier hos möss. Parker17 föreslog att spermier korsar äggledarna genom att simma mot ciliärströmmen hos fåglar och reptiler. Även om det inte har visats experimentellt hos fåglar, var Adolphi18 den första som fann att fågelspermier ger positiva resultat när ett tunt lager vätska mellan ett täckglas och ett objektglas skapas med en remsa filterpapper. Reologi. Hino och Yanagimachi [19] placerade ett äggstock-tubal-livmoder-komplex från mus i en perfusionsring och injicerade 1 µl bläck i isthmus för att visualisera vätskeflödet i äggledarna. De noterade en mycket aktiv rörelse av sammandragning och avslappning i äggledaren, där alla bläckbollar stadigt rörde sig mot äggledarens ampull. Författarna betonar vikten av flödet av äggledare från de nedre till de övre äggledarna för spermieupptag och befruktning. Brillard20 rapporterade att hos kycklingar och kalkoner migrerar spermier genom aktiv rörelse från vaginalöppningen, där de förvaras, till den utero-vaginala övergången, där de förvaras. Denna rörelse krävs dock inte mellan den uterovaginala övergången och infundibulum eftersom spermierna transporteras genom passiv förskjutning. Med kännedom om dessa tidigare rekommendationer och resultaten som erhållits i den aktuella studien kan man anta att spermiernas förmåga att röra sig uppströms (reologi) är en av de egenskaper som urvalsprocessen bygger på. Detta avgör spermiernas passage genom vaginan och deras inträde i CCT för lagring. Som Forman4 föreslog kan detta också underlätta processen för spermier att komma in i SST och dess livsmiljö under en tidsperiod och sedan lämna när deras hastighet börjar sakta ner.
Å andra sidan föreslog Matsuzaki och Sasanami21 att fågelspermier genomgår motilitetsförändringar från vila till motilitet i de hanliga och honliga reproduktionsvägarna. Hämning av spermierörlighet i SST har föreslagits förklara den långa lagringstiden för spermier och sedan föryngring efter att de lämnat SST. Under hypoxiska förhållanden rapporterade Matsuzaki et al.1 hög produktion och frisättning av laktat i SST, vilket kan leda till hämning av spermierörlighet. I detta fall återspeglas spermiernas reologis betydelse i urvalet och absorptionen av spermier, och inte i deras lagring.
Spermieagglutinationsmönstret anses vara en rimlig förklaring till den långa lagringsperioden för spermier i SST, eftersom detta är ett vanligt mönster för spermieretention hos fjäderfän2,22,23. Bakst et al.2 observerade att de flesta spermier fäste vid varandra och bildade fascikulära aggregat, och enskilda spermier hittades sällan i vaktel-CCM. Å andra sidan observerade Wen et al.24 mer spridda spermier och färre spermatozoa-tuftor i SST-lumen hos kycklingar. Baserat på dessa observationer kan man anta att benägenheten för spermieagglutination skiljer sig mellan fåglar och mellan spermier i samma ejakulat. Dessutom föreslog Van Krey et al.9 att slumpmässig dissociation av agglutinerade spermier är ansvarig för den gradvisa penetrationen av spermier in i äggledarens lumen. Enligt denna hypotes bör spermier med lägre agglutinationskapacitet först utstötas från SST. I detta sammanhang kan spermiernas förmåga att agglutinera vara en faktor som påverkar resultatet av spermiekonkurrens hos smutsiga fåglar. Dessutom, ju längre den agglutinerade spermien dissocierar, desto längre bibehålls fertiliteten.
Även om spermieaggregation och aggregation till buntar har observerats i flera studier2,22,24, har de inte beskrivits i detalj på grund av komplexiteten i deras kinematiska observation inom SST. Flera försök har gjorts för att studera spermieagglutination in vitro. Omfattande men övergående aggregation observerades när den tunna tråden togs bort från den dinglande frödroppen. Detta leder till att en långsträckt bubbla sticker ut från droppen och imiterar sädeskörteln. På grund av 3D-begränsningar och korta dropptorkningstider förföll hela blocket snabbt9. I den aktuella studien, med hjälp av Sharkashi-kycklingar och mikrofluidiska chips, kunde vi beskriva hur dessa tofsar bildas och hur de rör sig. Spermieknippen bildades omedelbart efter spermainsamling och befanns röra sig i en spiral, vilket uppvisade positiv reologi när de fanns i flödet. Dessutom, vid makroskopisk granskning har spermieknippen observerats öka linjäriteten i rörligheten jämfört med isolerade spermier. Detta tyder på att spermieagglutination kan ske före SST-penetration och att spermieproduktionen inte är begränsad till ett litet område på grund av stress som tidigare föreslagits (Tingari och Lake12). Under tofsbildning simmar spermierna synkront tills de bildar en förbindelse, sedan lindas deras svansar runt varandra och spermiens huvud förblir fritt, men svansen och den distala delen av spermien fastnar ihop med en klibbig substans. Därför är det ligamentets fria huvud som ansvarar för rörelsen och drar med sig resten av ligamentet. Svepelektronmikroskopi av spermieknippena visade vidhäftande spermiehuvuden täckta med mycket klibbigt material, vilket tyder på att spermiehuvudena var fästa i vilande buntar, vilket kan ha inträffat efter att de nått lagringsplatsen (SST).
När ett spermieutstryk färgas med akridinorange kan extracellulärt adhesivt material runt spermiecellerna ses under ett fluorescerande mikroskop. Detta ämne gör att spermieknippen kan fästa vid och klamra sig fast vid omgivande ytor eller partiklar så att de inte driver med det omgivande flödet. Våra observationer visar således vilken roll spermierna spelar i form av rörliga knippen. Deras förmåga att simma mot strömmen och fastna vid närliggande ytor gör att spermier kan stanna längre i spermiekärlen.
Rothschild25 använde en hemocytometrikamera för att studera den flytande fördelningen av nötkreaturssperma i en droppe suspension, genom att ta mikroskopiska bilder genom en kamera med både vertikal och horisontell optisk axel i mikroskopet. Resultaten visade att spermierna attraherades till kammarens yta. Författarna föreslår att det kan finnas hydrodynamiska interaktioner mellan spermierna och ytan. Med hänsyn till detta, tillsammans med Sharkashi-kycklingspermaens förmåga att bilda klibbiga tofsar, kan det öka sannolikheten för att sperma fäster vid SST-väggen och lagras under långa perioder.
Bccetti och Afzeliu26 rapporterade att spermiernas glykokalyx krävs för gametigenkänning och agglutination. Forman10 observerade att hydrolys av α-glykosidbindningar i glykoprotein-glykolipidbeläggningar genom behandling av fågelsperma med neuraminidas resulterade i minskad fertilitet utan att påverka spermierörligheten. Författarna föreslår att effekten av neuraminidas på glykokalyxen försämrar spermiebindningen vid utero-vaginal övergång, vilket minskar fertiliteten. Deras observationer kan inte ignorera möjligheten att neuraminidasbehandling kan minska spermie- och oocytigenkänningen. Forman och Engel10 fann att fertiliteten minskade när höns inseminerades intravaginalt med sperma behandlad med neuraminidas. IVF med neuraminidasbehandlade spermier påverkade dock inte fertiliteten jämfört med kontrollkycklingar. Författarna drog slutsatsen att förändringar i glykoprotein-glykolipid-beläggningen runt spermiemembranet minskade spermiernas förmåga att befruktas genom att försämra spermielagringen vid utero-vaginal övergången, vilket i sin tur ökade spermieförlusten på grund av hastigheten hos utero-vaginal övergången, men inte påverkar spermier och äggigenkänning.
Hos kalkoner fann Bakst och Bauchan11 små vesiklar och membranfragment i lumen av SST och observerade att några av dessa granuler hade smält samman med spermiemembranet. Författarna föreslår att dessa förhållanden kan bidra till långtidslagring av spermier i SST. Forskarna specificerade dock inte källan till dessa partiklar, huruvida de utsöndras av CCT-epitelceller, produceras och utsöndras av det manliga reproduktionssystemet, eller produceras av själva spermierna. Dessa partiklar är också ansvariga för agglutination. Grützner et al27 rapporterade att epididymala epitelceller producerar och utsöndrar ett specifikt protein som krävs för bildandet av enporiga sädeskanaler. Författarna rapporterar också att spridningen av dessa buntar beror på interaktionen mellan epididymala proteiner. Nixon et al28 fann att adnexa utsöndrar ett protein, det sura cysteinrika osteonektinet; SPARC är involverat i bildandet av spermietuvor hos kortnäbbade myrpiggsvin och näbbdjur. Spridningen av dessa strålar är förknippad med förlusten av detta protein.
I den aktuella studien visade ultrastrukturanalys med elektronmikroskopi att spermierna vidhäftade till en stor mängd tätt material. Dessa ämnen tros vara ansvariga för agglutinationen som kondenserar mellan och runt de vidhäftande huvudena, men vid lägre koncentrationer i stjärtregionen. Vi antar att denna agglutinerande substans utsöndras från det manliga reproduktionssystemet (bistikeln eller sädesledaren) tillsammans med sperma, eftersom vi ofta observerar sperma som separerar från lymfa och sädesplasma under ejakulation. Det har rapporterats att när fågelspermierna passerar genom bistikeln och sädesledaren genomgår de mognadsrelaterade förändringar som stöder deras förmåga att binda proteiner och förvärva plasmalemma-associerade glykoproteiner. Persistensen av dessa proteiner på residenta spermiemembran i SST tyder på att dessa proteiner kan påverka förvärvandet av spermiemembranstabilitet 30 och bestämma deras fertilitet 31. Ahammad et al32 rapporterade att spermier erhållna från olika delar av det manliga reproduktionssystemet (från testiklarna till den distala sädesledaren) uppvisade en progressiv ökning av livskraften under flytande lagringsförhållanden, oavsett lagringstemperatur, och livskraften hos kycklingar ökar även i äggledarna efter artificiell insemination.
Sharkashi-kycklingars spermiebuntar har andra egenskaper och funktioner än andra arter som myrpiggsvin, näbbdjur, skogsmöss, rådjursråttor och marsvin. Hos sharkasi-kycklingar minskade bildandet av spermiebuntar deras simhastighet jämfört med enskilda spermier. Dessa buntar ökade dock andelen reologiskt positiva spermier och ökade spermiernas förmåga att stabilisera sig i en dynamisk miljö. Våra resultat bekräftar således det tidigare förslaget att spermieagglutination i SST är förknippat med långvarig spermilagring. Vi antar också att spermiernas benägenhet att bilda tuvor kan kontrollera hastigheten på spermieförlusten i SST, vilket kan förändra resultatet av spermiekonkurrensen. Enligt detta antagande frisätter spermier med låg agglutinationskapacitet SST först, medan spermier med hög agglutinationskapacitet producerar merparten av avkomman. Bildningen av spermiebuntar med en por är fördelaktig och påverkar föräldra-barn-förhållandet, men använder en annan mekanism. Hos myrpiggsvin och näbbdjur är spermierna arrangerade parallellt med varandra för att öka strålens framåthastighet. Buntar av myrpiggsvin rör sig ungefär tre gånger snabbare än enskilda spermier. Man tror att bildandet av sådana spermieknippen hos myrpiggsvin är en evolutionär anpassning för att upprätthålla dominans, eftersom honor är promiskuösa och vanligtvis parar sig med flera hanar. Därför konkurrerar spermier från olika ejakulat hårt om befruktningen av ägget.
Agglutinerade spermier från sharkashikycklingar är lätta att visualisera med hjälp av faskontrastmikroskopi, vilket anses fördelaktigt eftersom det möjliggör enkel studier av spermiernas beteende in vitro. Mekanismen genom vilken spermietuvabildning främjar reproduktion hos sharkashikycklingar skiljer sig också från den som ses hos vissa placentala däggdjur som representerar kooperativt spermiebeteende, såsom skogsmöss, där vissa spermier når äggen och hjälper andra besläktade individer att nå och skada sina ägg. att bevisa sig själv. altruistiskt beteende. Självbefruktning 34. Ett annat exempel på kooperativt beteende hos spermier hittades hos hjortmöss, där spermier kunde identifiera och kombinera med de mest genetiskt besläktade spermierna och bilda kooperativa grupper för att öka sin hastighet jämfört med obesläktade spermier 35.
Resultaten som erhållits i denna studie motsäger inte Fomans teori om långtidslagring av spermier i SWS. Forskarna rapporterar att spermieceller fortsätter att röra sig i flödet av epitelceller som bekläder SST under en längre tid, och efter en viss tid töms spermiecellernas energilager, vilket resulterar i en minskning av hastigheten, vilket möjliggör utstötning av ämnen med låg molekylvikt. Spermieenergin utstöts med vätskeflödet från SST:s lumen till äggledarens hålighet. I den aktuella studien observerade vi att hälften av de enskilda spermierna visade förmågan att simma mot strömmande vätskor, och deras vidhäftning i bunten ökade deras förmåga att visa positiv reologi. Dessutom överensstämmer våra data med Matsuzaki et al.1 som rapporterade att ökad laktattesöndring i SST kan hämma den residenta spermierörligheten. Våra resultat beskriver dock bildandet av spermierörligament och deras reologiska beteende i närvaro av en dynamisk miljö inom en mikrokanal i ett försök att belysa deras beteende i SST. Framtida forskning kan komma att fokusera på att bestämma den kemiska sammansättningen och ursprunget för det agglutinerande medlet, vilket utan tvekan kommer att hjälpa forskare att utveckla nya sätt att lagra flytande sperma och öka fertilitetsvaraktigheten.
Femton 30 veckor gamla barhalsade hanar av typen sharkasi (homozygot dominant; NaNa) valdes ut som spermadonatorer i studien. Fåglarna föddes upp på forskningsfjäderfäfarmen vid fakulteten för jordbruk, Ashit University, Ashit Governorate, Egypten. Fåglarna hölls i individuella burar (30 x 40 x 40 cm), utsattes för ett ljusprogram (16 timmar ljus och 8 timmar mörker) och utfodrades med en diet innehållande 160 g råprotein, 2800 kcal metaboliserbar energi, 35 g kalcium per kilogram diet och 5 gram tillgängligt fosfor per kilogram diet.
Enligt data 36, ​​37 samlades sperma in från hanar genom magmassage. Totalt 45 spermaprover samlades in från 15 män under 3 dagar. Sperma (n = 15/dag) späddes omedelbart 1:1 (v:v) med Belsville Poultry Semen Diluent, som innehåller kaliumdifosfat (1,27 g), mononatriumglutamatmonohydrat (0,867 g), fruktos (0,5 d), vattenfritt natriumacetat (0,43 g), tris(hydroximetyl)aminometan (0,195 g), kaliumcitratmonohydrat (0,064 g), kaliummonofosfat (0,065 g), magnesiumklorid (0,034 g) och H2O (100 ml), pH = 7, 5, osmolaritet 333 mOsm/kg38. Utspädda spermaprover undersöktes först under ett ljusmikroskop för att säkerställa god spermakvalitet (fuktighet) och förvarades sedan i ett vattenbad vid 37 °C tills de användes inom en halvtimme efter insamling.
Spermies kinematik och reologi beskrivs med hjälp av ett system av mikrofluidiska anordningar. Spermienprover späddes ytterligare till 1:40 i Beltsville Avian Semen Diluent, laddades i en mikrofluidisk anordning (se nedan), och kinetiska parametrar bestämdes med hjälp av ett datoriserat spermanalyssystem (CASA) som tidigare utvecklats för mikrofluidisk karakterisering, om rörligheten hos spermier i flytande medier (Institutionen för maskinteknik, Tekniska fakulteten, Assiut University, Egypten). Plugin-programmet kan laddas ner på: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39. Kurvhastighet (VCL, μm/s), linjär hastighet (VSL, μm/s) och genomsnittlig banhastighet (VAP, μm/s) mättes. Videor av spermier togs med ett inverterat Optika XDS-3-faskontrastmikroskop (med 40x objektiv) anslutet till en Tucson ISH1000-kamera vid 30 fps i 3 sekunder. Använd CASA-programvaran för att studera minst tre områden och 500 spermiebanor per prov. Den inspelade videon bearbetades med hjälp av en hemmagjord CASA. Definitionen av rörlighet i CASA-pluginet baseras på spermiernas simhastighet jämfört med flödeshastigheten och inkluderar inte andra parametrar som rörelse från sida till sida, eftersom detta har visat sig vara mer tillförlitligt vid vätskeflöde. Reologisk rörelse beskrivs som spermiernas rörelse mot vätskeflödets riktning. Spermierna med reologiska egenskaper dividerades med antalet rörliga spermier; spermier som var i vila och konvektivt rörliga spermier exkluderades från räkningen.
Alla kemikalier som användes erhölls från Elgomhoria Pharmaceuticals (Kairo, Egypten) om inget annat anges. Anordningen tillverkades enligt beskrivningen av El-sherry et al. 40 med vissa modifieringar. Materialen som användes för att tillverka mikrokanalerna inkluderade glasplattor (Howard Glass, Worcester, MA), SU-8-25 negativ resist (MicroChem, Newton, CA), diacetonalkohol (Sigma Aldrich, Steinheim, Tyskland) och polyaceton. -184, Dow Corning, Midland, Michigan). Mikrokanalerna tillverkas med mjuk litografi. Först trycktes en klar skyddande ansiktsmask med önskad mikrokanaldesign på en högupplösande skrivare (Prismatic, Cairo, Egypt och Pacific Arts and Design, Markham, ON). Masterna tillverkades med glasplattor som substrat. Plattorna rengjordes i aceton, isopropanol och avjoniserat vatten och belades sedan med ett 20 µm lager av SU8-25 genom spinnbeläggning (3000 rpm, 1 min). SU-8-skikten torkades sedan försiktigt (65 °C, 2 min och 95 °C, 10 min) och exponerades för UV-strålning i 50 sekunder. Efterexponering bakades vid 65 °C och 95 °C i 1 min och 4 min för att tvärbinda exponerade SU-8-skikt, följt av framkallning i diacetonalkohol i 6,5 min. Hårdgräddade våfflorna (200 °C i 15 min) för att ytterligare stelna SU-8-skiktet.
PDMS framställdes genom att blanda monomeren och härdaren i ett viktförhållande på 10:1, sedan avgasades i en vakuumexsickator och hälldes på SU-8-huvudramen. PDMS härdades i en ugn (120 °C, 30 min), sedan skars kanalerna ut, separerades från mastern och perforerades för att tillåta att rören kunde fästas vid inloppet och utloppet till mikrokanalen. Slutligen fästes PDMS-mikrokanaler permanent på objektglas med hjälp av en bärbar koronaprocessor (Electro-Technic Products, Chicago, IL) enligt beskrivning på annat håll. Mikrokanalen som användes i denna studie mäter 200 µm × 20 µm (B × H) och är 3,6 cm lång.
Vätskeflödet som induceras av hydrostatiskt tryck inuti mikrokanalen uppnås genom att hålla vätskenivån i inloppsbehållaren över höjdskillnaden Δh39 i utloppsbehållaren (Fig. 1).
där f är friktionskoefficienten, definierad som f = C/Re för laminärt flöde i en rektangulär kanal, där C är en konstant beroende på kanalens sidförhållande, L är mikrokanalens längd, Vav är medelhastigheten inuti mikrokanalen, Dh är kanalens hydrauliska diameter, g – tyngdaccelerationen. Med hjälp av denna ekvation kan den genomsnittliga kanalhastigheten beräknas med följande ekvation: