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A fertilidade das aves depende da sua capacidade de armazenar espermatozoides viáveis ​​em quantidade suficiente por um período prolongado nos túbulos de armazenamento de espermatozoides (TAE). O mecanismo exato pelo qual os espermatozoides entram, permanecem e saem dos TAE ainda é controverso. Os espermatozoides de galinhas da raça Sharkasi apresentaram alta tendência à aglutinação, formando feixes filamentosos móveis contendo muitas células. Devido à dificuldade de observar a motilidade e o comportamento dos espermatozoides em uma tuba uterina opaca, utilizamos um dispositivo microfluídico com uma seção transversal de microcanal semelhante à dos espermatozoides para estudar a aglutinação e a motilidade espermática. Este estudo discute como os feixes de espermatozoides se formam, como se movem e seu possível papel na extensão da permanência dos espermatozoides nos TAE. Investigamos a velocidade e o comportamento reológico dos espermatozoides quando o fluxo de fluido foi gerado dentro de um canal microfluídico por pressão hidrostática (vazão = 33 µm/s). Os espermatozoides tendem a nadar contra a corrente (reologia positiva) e a velocidade do feixe de espermatozoides é significativamente reduzida em comparação com a de espermatozoides individuais. Observou-se que os feixes de espermatozoides se movem em espiral e aumentam em comprimento e espessura à medida que mais espermatozoides individuais são recrutados. Observou-se que os feixes de espermatozoides se aproximavam e aderiam às paredes laterais dos canais microfluídicos para evitar serem arrastados pela velocidade do fluxo de fluido > 33 µm/s. Observou-se que os feixes de espermatozoides se aproximavam e aderiam às paredes laterais dos canais microfluídicos para evitar serem arrastados pela velocidade do fluxo de fluido > 33 µm/s. Bem, isso é o que os espermatozoides usam para fornecer e usar canais de microfone, чтобы избежать сметания со скоростью потока жидкости> 33 мкм / с. Observou-se que os feixes de espermatozoides se aproximam e aderem às paredes laterais dos canais microfluídicos para evitar serem arrastados em taxas de fluxo de fluido superiores a 33 µm/s.观察到精子束接近并粘附在微流体通道的侧壁上，以避免被流体流速> 33 µm/s 扫过。33 µm/s Bem, isso é o que os espermatozoides usam para fornecer e usar o canal de microfone, чтобы избежать сметания pode ser maior que 33 мкм/s. Observou-se que os feixes de espermatozoides se aproximam e aderem às paredes laterais do canal microfluídico para evitar serem arrastados pelo fluxo de fluido a velocidades superiores a 33 µm/s.A microscopia eletrônica de varredura e de transmissão revelou que os feixes de espermatozoides eram sustentados por abundante material denso. Os dados obtidos demonstram a mobilidade singular dos espermatozoides de galinha Sharkazi, bem como a capacidade dos espermatozoides de se aglutinarem e formarem feixes móveis, o que contribui para uma melhor compreensão do armazenamento de longo prazo de espermatozoides no SMT.
Para que a fertilização ocorra em humanos e na maioria dos animais, os espermatozoides e os óvulos devem chegar ao local da fertilização no momento certo. Portanto, o acasalamento deve ocorrer antes ou durante a ovulação. Por outro lado, alguns mamíferos, como os cães, assim como espécies não mamíferas, como insetos, peixes, répteis e aves, armazenam espermatozoides em seus órgãos reprodutivos por um longo período até que seus óvulos estejam prontos para a fertilização (fertilização assíncrona¹). As aves são capazes de manter a viabilidade dos espermatozoides capazes de fertilizar os óvulos por 2 a 10 semanas².
Essa é uma característica única que distingue as aves de outros animais, pois proporciona uma alta probabilidade de fertilização após uma única inseminação por várias semanas, sem acasalamento e ovulação simultâneos. O principal órgão de armazenamento de espermatozoides, chamado túbulo de armazenamento de espermatozoides (TAE), está localizado nas pregas mucosas internas da junção uterovaginal. Até o momento, os mecanismos pelos quais os espermatozoides entram, permanecem e saem do banco de espermatozoides não são totalmente compreendidos. Com base em estudos anteriores, muitas hipóteses foram propostas, mas nenhuma delas foi confirmada.
Forman4 hipotetizou que os espermatozoides mantêm sua permanência na cavidade do SST por meio de movimentos oscilatórios contínuos contra a direção do fluxo de fluido, através de canais proteicos localizados nas células epiteliais do SST (reologia). O ATP é consumido devido à constante atividade flagelar necessária para manter os espermatozoides no lúmen do SST, e a motilidade eventualmente diminui até que os espermatozoides sejam transportados para fora do banco de espermatozoides pelo fluxo de fluido e iniciem uma nova jornada pela tuba uterina ascendente para fertilizar o óvulo (Forman4). Este modelo de armazenamento de espermatozoides é corroborado pela detecção, por imunocitoquímica, das aquaporinas 2, 3 e 9 presentes nas células epiteliais do SST. Até o momento, faltam estudos sobre a reologia do sêmen de galinha e seu papel no armazenamento no SST, na seleção vaginal de espermatozoides e na competição espermática. Em galinhas, os espermatozoides entram na vagina após o acasalamento natural, mas mais de 80% deles são ejetados da vagina logo após o acasalamento. Isso sugere que a vagina é o principal local de seleção de espermatozoides em aves. Além disso, foi relatado que menos de 1% dos espermatozoides fertilizados na vagina chegam aos SSTs2. Na inseminação artificial de pintinhos por via vaginal, o número de espermatozoides que atingem os SSTs tende a aumentar 24 horas após a inseminação. Até o momento, o mecanismo de seleção espermática durante esse processo não está claro, e a motilidade espermática pode desempenhar um papel importante na captação de espermatozoides pelos SSTs. Devido às paredes espessas e opacas das trompas de Falópio, é difícil monitorar diretamente a motilidade espermática nas trompas de Falópio de aves. Portanto, carecemos de conhecimento básico sobre como os espermatozoides transitam para os SSTs após a fertilização.
Recentemente, a reologia foi reconhecida como um fator importante no controle do transporte de espermatozoides nos órgãos genitais de mamíferos. Com base na capacidade dos espermatozoides móveis de migrarem em contracorrente, Zaferani et al.⁸ utilizaram um sistema microfluídico Corra para isolar passivamente espermatozoides móveis de amostras de sêmen coletadas em baias. Esse tipo de triagem seminal é essencial para o tratamento da infertilidade e para a pesquisa clínica, sendo preferível aos métodos tradicionais, que são demorados, trabalhosos e podem comprometer a morfologia e a integridade estrutural dos espermatozoides. No entanto, até o momento, não foram realizados estudos sobre o efeito das secreções dos órgãos genitais de galinhas na motilidade espermática.
Independentemente do mecanismo que mantém os espermatozoides armazenados no SST, muitos pesquisadores observaram que os espermatozoides residentes se aglutinam cabeça a cabeça no SST de galinhas 9, 10, codornas 2 e perus 11, formando feixes de espermatozoides aglutinados. Os autores sugerem que existe uma ligação entre essa aglutinação e o armazenamento de longo prazo de espermatozoides no SST.
Tingari e Lake12 relataram uma forte associação entre espermatozoides na glândula receptora de espermatozoides da galinha e questionaram se os espermatozoides aviários se aglutinam da mesma forma que os espermatozoides de mamíferos. Eles acreditam que as profundas conexões entre os espermatozoides no ducto deferente podem ser devidas ao estresse causado pela presença de um grande número de espermatozoides em um espaço pequeno.
Ao avaliar o comportamento dos espermatozoides em lâminas de vidro recém-preparadas, observaram-se sinais transitórios de aglutinação, especialmente nas bordas das gotas de sêmen. No entanto, a aglutinação era frequentemente interrompida pela ação rotacional associada ao movimento contínuo, o que explica a natureza transitória desse fenômeno. Os pesquisadores também notaram que, com a adição do diluente ao sêmen, surgiam agregados celulares alongados, semelhantes a fios.
As primeiras tentativas de imitar um espermatozoide foram feitas removendo-se um fio fino de uma gota suspensa, o que resultou em uma vesícula alongada semelhante a um espermatozoide projetando-se da gota de sêmen. Os espermatozoides imediatamente se alinharam paralelamente dentro da vesícula, mas a unidade inteira desapareceu rapidamente devido à limitação tridimensional. Portanto, para estudar a aglutinação de espermatozoides, é necessário observar a motilidade e o comportamento dos espermatozoides diretamente em túbulos de armazenamento de espermatozoides isolados, o que é difícil de se conseguir. Assim, é necessário desenvolver um instrumento que imite os espermatozoides para apoiar estudos de motilidade e comportamento de aglutinação espermática. Brillard et al.¹³ relataram que o comprimento médio dos túbulos de armazenamento de espermatozoides em pintinhos adultos é de 400–600 µm, mas alguns TSEs podem chegar a 2000 µm de comprimento. Mero e Ogasawara¹⁴ dividiram as glândulas seminíferas em túbulos de armazenamento de espermatozoides dilatados e não dilatados, ambos com o mesmo comprimento (~500 µm) e largura do colo (~38 µm), mas com diâmetro luminal médio de 56,6 µm e 11,2 µm, respectivamente. No presente estudo, utilizamos um dispositivo microfluídico com canal de 200 µm × 20 µm (L × A), cuja seção transversal é semelhante à do túbulo de armazenamento de espermatozoides (TAE) ampliado. Além disso, examinamos a motilidade e o comportamento de aglutinação dos espermatozoides em fluido circulante, o que está de acordo com a hipótese de Foreman de que o fluido produzido pelas células epiteliais do TAE mantém os espermatozoides no lúmen em uma direção de contracorrente (reológica).
O objetivo deste estudo foi superar os problemas de observação da motilidade dos espermatozoides na tuba uterina e evitar as dificuldades de estudar a reologia e o comportamento dos espermatozoides em um ambiente dinâmico. Foi utilizado um dispositivo microfluídico que cria pressão hidrostática para simular a motilidade dos espermatozoides nos órgãos genitais de uma galinha.
Ao adicionar uma gota de uma amostra de esperma diluída (1:40) ao dispositivo de microcanais, foi possível identificar dois tipos de motilidade espermática (espermatozoides isolados e espermatozoides aderidos). Além disso, os espermatozoides tenderam a nadar contra a corrente (reologia positiva; vídeos 1 e 2). Embora os feixes de espermatozoides apresentassem velocidade inferior à dos espermatozoides isolados (p < 0,001), eles aumentaram a porcentagem de espermatozoides que exibiam reotaxia positiva (p < 0,001; Tabela 2). Embora os feixes de espermatozoides apresentassem velocidade inferior à dos espermatozoides isolados (p < 0,001), eles aumentaram a porcentagem de espermatozoides que exibiam reotaxia positiva (p < 0,001; Tabela 2). Хотя пучки сперматозоидов имели более низкую скорость, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), они увеличивали процент сперматозоидов, демонстрирующих положительный реотаксис (p < 0,001; tabela 2). Embora os feixes de espermatozoides apresentassem velocidade inferior à dos espermatozoides individuais (p < 0,001), eles aumentaram a porcentagem de espermatozoides que apresentaram reotaxia positiva (p < 0,001; Tabela 2).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度（p < 0,001），但它们增加了显示阳性流变性的精子百分比（p < 0,001；表2）。尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 （p <0.001） , 但 增加 了 显示 阳性 流变性 精子百分比 （p <0,001 ； 2。。。。。。）））））） A pontuação dos espermatozóides é pequena, o que significa que os espermatozoides são bons (p < 0,001), o que é positivo процент сперматозоидов с положительной реологией (p < 0,001; tabela 2). Embora a velocidade dos feixes de espermatozoides fosse menor do que a dos espermatozoides individuais (p < 0,001), eles aumentaram a porcentagem de espermatozoides com reologia positiva (p < 0,001; Tabela 2).A reologia positiva para espermatozoides isolados e tufos é estimada em aproximadamente 53% e 85%, respectivamente.
Observou-se que os espermatozoides de galinhas da raça Sharkashi, imediatamente após a ejaculação, formam feixes lineares compostos por dezenas de indivíduos. Esses tufos aumentam em comprimento e espessura ao longo do tempo e podem permanecer in vitro por várias horas antes de se dissiparem (vídeo 3). Esses feixes filamentosos têm formato semelhante ao dos espermatozoides de equidna, que se formam na extremidade do epidídimo. O sêmen de galinhas da raça Sharkashi apresenta alta tendência à aglutinação e à formação de feixes reticulados em menos de um minuto após a coleta. Esses feixes são dinâmicos e capazes de aderir a paredes próximas ou objetos estáticos. Embora os feixes de espermatozoides reduzam a velocidade das células espermáticas, é evidente que, macroscopicamente, aumentam sua linearidade. O comprimento dos feixes varia de acordo com o número de espermatozoides coletados em cada feixe. Duas partes do feixe foram isoladas: a parte inicial, incluindo a cabeça livre do espermatozoide aglutinado, e a parte terminal, incluindo a cauda e toda a extremidade distal do espermatozoide. Utilizando uma câmera de alta velocidade (950 fps), observou-se a presença de cabeças livres de espermatozoides aglutinados na parte inicial do feixe, responsáveis ​​pelo movimento do mesmo devido ao seu movimento oscilatório, arrastando os demais para dentro do feixe com um movimento helicoidal (Vídeo 4). Contudo, em tufos longos, observou-se que algumas cabeças de espermatozoides livres aderem ao corpo e à porção terminal do tufo, atuando como pás para auxiliar na propulsão do mesmo.
Em um fluxo lento de fluido, os feixes de espermatozoides movem-se paralelamente uns aos outros; no entanto, começam a se sobrepor e a aderir a tudo o que estiver parado, para não serem arrastados pela corrente à medida que a velocidade do fluxo aumenta. Os feixes se formam quando um punhado de espermatozoides se aproxima, começam a se mover em sincronia, se enrolam uns nos outros e aderem a uma substância pegajosa. As Figuras 1 e 2 mostram como os espermatozoides se aproximam, formando uma junção à medida que suas caudas se enrolam.
Os pesquisadores aplicaram pressão hidrostática para criar fluxo de fluido em um microcanal para estudar a reologia dos espermatozoides. Foi utilizado um microcanal com dimensões de 200 µm × 20 µm (L × A) e comprimento de 3,6 µm. Os microcanais foram colocados entre recipientes com seringas acopladas nas extremidades. Corante alimentício foi utilizado para tornar os canais mais visíveis.
Prenda os cabos de interconexão e acessórios à parede. O vídeo foi gravado com um microscópio de contraste de fase. Cada imagem apresenta imagens de microscopia de contraste de fase e mapeamento. (A) A conexão entre dois fluxos oferece resistência ao fluxo devido ao movimento helicoidal (seta vermelha). (B) A conexão entre o feixe de tubos e a parede do canal (setas vermelhas), que simultaneamente se conectam a outros dois feixes (setas amarelas). (C) Os feixes de espermatozoides no canal microfluídico começam a se conectar uns aos outros (setas vermelhas), formando uma malha de feixes de espermatozoides. (D) Formação de uma rede de feixes de espermatozoides.
Quando uma gota de esperma diluído foi introduzida no dispositivo microfluídico e um fluxo foi criado, observou-se que o feixe de espermatozoides se movia contra a direção do fluxo. Os feixes se encaixam perfeitamente contra as paredes dos microcanais, e as cabeças livres na parte inicial dos feixes também se encaixam firmemente contra elas (vídeo 5). Eles também aderem a quaisquer partículas estacionárias em seu caminho, como detritos, para resistir a serem arrastados pela corrente. Com o tempo, esses tufos se tornam longos filamentos que aprisionam outros espermatozoides individuais e tufos menores (vídeo 6). À medida que o fluxo começa a diminuir a velocidade, longas fileiras de espermatozoides começam a formar uma rede (vídeo 7; Figura 2).
Em altas velocidades de fluxo (V > 33 µm/s), os movimentos espirais dos filamentos aumentam na tentativa de capturar muitos espermatozoides individuais, formando feixes que resistem melhor à força de deriva do fluxo. Em altas velocidades de fluxo (V > 33 µm/s), os movimentos espirais dos filamentos aumentam na tentativa de capturar muitos espermatozoides individuais, formando feixes que resistem melhor à força de deriva do fluxo. Para uma maior velocidade (V > 33 мкм/s) спиралевидные движения нитей усиливаются, поскольку они пытаются поймать множество отдельных сперматозоидов, образующих пучки, которые лучше противостоят дрейфующей силе потока. Em altas taxas de fluxo (V > 33 µm/s), os movimentos helicoidais dos filamentos aumentam à medida que tentam capturar muitos espermatozoides individuais, formando feixes que são mais capazes de resistir à força de deriva do fluxo.Velocidade máxima(V > 33 µm/s)时,螺纹的螺旋运动增加,以试图捕捉许多形成束的单个精子, 从而更好地抵抗流动的漂移力。在 高 流速 (v> 33 µm/s) 时 , 的 螺旋 运动 增加 , 以 试图 许多 形成 束 单 个 精子 , 从而 更地 抵抗 的 漂移力。。。。。。。。。。 Quando a quantidade de água for maior (V > 33 мкм/s) множество отдельных сперматозоидов, образующих пучки, чтобы лучше сопротивляться силам дрейфа потока. Em altas taxas de fluxo (V > 33 µm/s), o movimento helicoidal dos filamentos aumenta na tentativa de capturar muitos espermatozoides individuais, formando feixes para melhor resistir às forças de deriva do fluxo.Eles também tentaram fixar microcanais nas paredes laterais.
Os feixes de espermatozoides foram identificados como aglomerados de cabeças de espermatozoides e caudas enroladas por meio de microscopia óptica (MO). Feixes de espermatozoides com diversos agregados também foram identificados como cabeças torcidas e agregados flagelares, múltiplas caudas de espermatozoides fundidas, cabeças de espermatozoides presas a uma cauda e cabeças de espermatozoides com núcleos curvados, bem como múltiplos núcleos fundidos. A microscopia eletrônica de transmissão (MET) revelou que os feixes de espermatozoides eram agregados de cabeças de espermatozoides envoltas por bainhas e que os agregados de espermatozoides apresentavam uma rede de caudas enroladas.
A morfologia e a ultraestrutura dos espermatozoides, bem como a formação de feixes espermáticos, foram estudadas por meio de microscopia óptica (secção hemisférica), microscopia eletrônica de varredura (MEV) e microscopia eletrônica de transmissão (MET). Esfregaços espermáticos foram corados com laranja de acridina e examinados por microscopia de epifluorescência.
A coloração do esfregaço de esperma com laranja de acridina (Fig. 3B) mostrou que as cabeças dos espermatozoides estavam aderidas umas às outras e cobertas por material secretor, o que levou à formação de grandes aglomerados (Fig. 3D). Os feixes de espermatozoides consistiam em agregados de espermatozoides com uma rede de caudas aderidas (Fig. 4A-C). Os feixes de espermatozoides são compostos pelas caudas de muitos espermatozoides aderidas umas às outras (Fig. 4D). Secreções (Fig. 4E,F) cobriam as cabeças dos feixes de espermatozoides.
Formação do feixe de espermatozoides. Utilizando microscopia de contraste de fase e esfregaços de esperma corados com laranja de acridina, observou-se que as cabeças dos espermatozoides se aderem umas às outras. (A) A formação inicial do feixe de espermatozoides começa com um espermatozoide (círculo branco) e três espermatozoides (círculo amarelo), com a espiral iniciando na cauda e terminando na cabeça. (B) Fotomicrografia de um esfregaço de esperma corado com laranja de acridina mostrando cabeças de espermatozoides aderentes (setas). A secreção cobre a(s) cabeça(s). Ampliação × 1000. (C) Desenvolvimento de um feixe amplo transportado por fluxo em um canal microfluídico (utilizando uma câmera de alta velocidade a 950 fps). (D) Micrografia de um esfregaço de esperma corado com laranja de acridina mostrando grandes feixes (setas). Ampliação: ×200.
Micrografia eletrônica de varredura de um feixe de espermatozoides e de um esfregaço de espermatozoides corado com laranja de acridina. (A, B, D, E) são micrografias eletrônicas de varredura coloridas digitais de espermatozoides, e C e F são micrografias de esfregaços de espermatozoides corados com laranja de acridina mostrando a adesão de múltiplos espermatozoides envolvendo a membrana caudal. (AC) Os agregados de espermatozoides são mostrados como uma rede de caudas aderidas (setas). (D) Adesão de vários espermatozoides (com substância adesiva, contorno rosa, seta) envolvendo a cauda. (E e F) Agregados de cabeças de espermatozoides (indicadores) cobertos com material adesivo (indicadores). Os espermatozoides formaram feixes com várias estruturas semelhantes a vórtices (F). (C) Ampliação de 400x e (F) ampliação de 200x.
Utilizando microscopia eletrônica de transmissão, descobrimos que os feixes de espermatozoides apresentavam caudas aderidas (Fig. 6A, C), cabeças aderidas às caudas (Fig. 6B) ou cabeças aderidas às caudas (Fig. 6D). As cabeças dos espermatozoides no feixe são curvas, apresentando, em corte transversal, duas regiões nucleares (Fig. 6D). No feixe incisado, os espermatozoides apresentavam cabeça torcida com duas regiões nucleares e múltiplas regiões flagelares (Fig. 5A).
Micrografia eletrônica digital colorida mostrando as caudas conectadas no feixe de espermatozoides e o material aglutinante conectando as cabeças dos espermatozoides. (A) Cauda conectada de um grande número de espermatozoides. Observe como a cauda aparece nas projeções vertical (seta) e horizontal (seta). (B) A cabeça (seta) do espermatozoide está conectada à cauda (seta). (C) Várias caudas de espermatozoides (setas) estão conectadas. (D) Material aglutinante (AS, azul) conecta quatro cabeças de espermatozoides (roxo).
A microscopia eletrônica de varredura foi utilizada para detectar cabeças de espermatozoides em feixes espermáticos cobertos por secreções ou membranas (Figura 6B), indicando que os feixes de espermatozoides estavam ancorados por material extracelular. O material aglutinado estava concentrado na cabeça do espermatozoide (aglomerado semelhante à cabeça de uma água-viva; Fig. 5B) e expandia-se distalmente, apresentando uma coloração amarela brilhante sob microscopia de fluorescência quando corado com laranja de acridina (Fig. 6C). Essa substância é claramente visível sob um microscópio de varredura e é considerada um aglutinante. Cortes semifinos (Fig. 5C) e esfregaços de espermatozoides corados com laranja de acridina mostraram feixes espermáticos contendo cabeças densamente compactadas e caudas enroladas (Fig. 5D).
Diversas fotomicrografias mostrando a agregação de cabeças de espermatozoides e caudas dobradas, obtidas por diferentes métodos. (A) Micrografia eletrônica de transmissão digital colorida em corte transversal de um feixe de espermatozoides, mostrando uma cabeça de espermatozoide enrolada com um núcleo bipartido (azul) e várias partes flagelares (verde). (B) Micrografia eletrônica de varredura digital colorida mostrando um aglomerado de cabeças de espermatozoides com aspecto de água-viva (setas) que parecem estar cobertas. (C) Corte semifino mostrando cabeças de espermatozoides agregadas (setas) e caudas enroladas (setas). (D) Micrografia de um esfregaço de esperma corado com laranja de acridina, mostrando agregados de cabeças de espermatozoides (setas) e caudas enroladas e aderentes (setas). Observe que uma substância pegajosa (S) cobre a cabeça do espermatozoide. (D) Ampliação de 1000x.
Utilizando microscopia eletrônica de transmissão (Fig. 7A), também foi observado que as cabeças dos espermatozoides estavam torcidas e os núcleos tinham formato espiral, conforme confirmado por esfregaços de esperma corados com laranja de acridina e examinados por microscopia de fluorescência (Fig. 7B).
(A) Micrografia eletrônica de transmissão colorida digital e (B) esfregaço de espermatozoides corado com laranja de acridina mostrando cabeças enroladas e a junção das cabeças e caudas dos espermatozoides (setas). (B) Ampliação de 1000×.
Uma descoberta interessante é que os espermatozoides de Sharkazi se agregam para formar feixes filamentosos móveis. As propriedades desses feixes nos permitem entender seu possível papel na absorção e armazenamento de espermatozoides no SST.
Após o acasalamento, os espermatozoides entram na vagina e passam por um intenso processo de seleção, resultando em um número limitado de espermatozoides entrando no SST15,16. Até o momento, os mecanismos pelos quais os espermatozoides entram e saem do SST não estão claros. Em aves, os espermatozoides são armazenados no SST por um período prolongado de 2 a 10 semanas, dependendo da espécie6. Persistem controvérsias sobre a condição do sêmen durante o armazenamento no SST. Eles estão em movimento ou em repouso? Em outras palavras, como as células espermáticas mantêm sua posição no SST por tanto tempo?
Forman⁴ sugeriu que a permanência e a ejeção dos espermatozoides no trato reprodutivo feminino (TRF) poderiam ser explicadas em termos de motilidade espermática. Os autores levantam a hipótese de que os espermatozoides mantêm sua posição nadando contra o fluxo de fluido criado pelo epitélio do TRF e que são ejetados quando sua velocidade cai abaixo do ponto em que começam a se mover para trás devido à falta de energia. Zaniboni⁵ confirmou a presença de aquaporinas 2, 3 e 9 na porção apical das células epiteliais do TRF, o que pode corroborar indiretamente o modelo de armazenamento de espermatozoides de Forman. No presente estudo, observamos que quase metade dos espermatozoides de Sharkashi apresenta reologia positiva no fluido em fluxo e que os feixes de espermatozoides aglutinados aumentam o número de espermatozoides com reologia positiva, embora a aglutinação os retarde. A forma como os espermatozoides percorrem a tuba uterina da ave até o local da fertilização ainda não é totalmente compreendida. Em mamíferos, o fluido folicular exerce uma ação quimioatrativa sobre os espermatozoides. No entanto, acredita-se que os quimioatraentes direcionem os espermatozoides a percorrerem longas distâncias7. Portanto, outros mecanismos são responsáveis ​​pelo transporte de espermatozoides. A capacidade dos espermatozoides de se orientarem e fluírem contra o fluido liberado pelas trompas de Falópio após o acasalamento tem sido relatada como um fator importante no direcionamento dos espermatozoides em camundongos. Parker 17 sugeriu que os espermatozoides atravessam as trompas de Falópio nadando contra a corrente ciliar em aves e répteis. Embora não tenha sido demonstrado experimentalmente em aves, Adolphi18 foi o primeiro a constatar que os espermatozoides de aves produzem resultados positivos quando uma fina camada de líquido é criada entre uma lamínula e uma lâmina com uma tira de papel de filtro. Reologia. Hino e Yanagimachi [19] colocaram um complexo ovário-tuba-útero de camundongo em um anel de perfusão e injetaram 1 µl de tinta no istmo para visualizar o fluxo de fluido nas trompas de Falópio. Eles observaram um movimento muito ativo de contração e relaxamento na tuba uterina, no qual todas as partículas de tinta se moviam continuamente em direção à ampola da tuba. Os autores enfatizam a importância do fluxo do fluido tubário da porção inferior para a superior da tuba uterina para a ascensão dos espermatozoides e a fertilização. Brillard²⁰ relatou que, em galinhas e perus, os espermatozoides migram por movimento ativo da entrada vaginal, onde são armazenados, até a junção útero-vaginal, onde também são armazenados. No entanto, esse movimento não é necessário entre a junção útero-vaginal e o infundíbulo, pois os espermatozoides são transportados por deslocamento passivo. Considerando essas recomendações anteriores e os resultados obtidos no presente estudo, pode-se presumir que a capacidade dos espermatozoides de se moverem contra a corrente (reologia) é uma das propriedades em que se baseia o processo de seleção. Isso determina a passagem dos espermatozoides pela vagina e sua entrada no trato corticoespinhal para armazenamento. Como sugerido por Forman4, isso também pode facilitar o processo de entrada dos espermatozoides no SST e em seu habitat por um período de tempo, e sua posterior saída quando sua velocidade começa a diminuir.
Por outro lado, Matsuzaki e Sasanami²¹ sugeriram que os espermatozoides de aves sofrem alterações de motilidade, passando da dormência para a motilidade, nos tratos reprodutivos masculino e feminino. A inibição da motilidade dos espermatozoides residentes no SST foi proposta para explicar o longo tempo de armazenamento dos espermatozoides e o subsequente rejuvenescimento após a saída do SST. Em condições de hipóxia, Matsuzaki et al.¹ relataram alta produção e liberação de lactato no SST, o que pode levar à inibição da motilidade dos espermatozoides residentes. Nesse caso, a importância da reologia espermática se reflete na seleção e absorção dos espermatozoides, e não em seu armazenamento.
O padrão de aglutinação espermática é considerado uma explicação plausível para o longo período de armazenamento dos espermatozoides no trato reprodutivo masculino (TRM), visto que esse é um padrão comum de retenção espermática em aves^2,22,23. Bakst et al.² observaram que a maioria dos espermatozoides aderiu uns aos outros, formando agregados fasciculares, e que espermatozoides isolados foram raramente encontrados no fluido cervicovaginal (FCV) de codornas. Por outro lado, Wen et al.²⁴ observaram espermatozoides mais dispersos e menos tufos de espermatozoides no lúmen do TRM em galinhas. Com base nessas observações, pode-se presumir que a propensão à aglutinação espermática difere entre as aves e entre os espermatozoides no mesmo ejaculado. Além disso, Van Krey et al.⁹ sugeriram que a dissociação aleatória dos espermatozoides aglutinados é responsável pela penetração gradual dos espermatozoides no lúmen da tuba uterina. De acordo com essa hipótese, os espermatozoides com menor capacidade de aglutinação devem ser expelidos do TRM primeiro. Nesse contexto, a capacidade dos espermatozoides de se aglutinarem pode ser um fator que influencia o resultado da competição espermática em aves sujas. Além disso, quanto maior o tempo de dissociação dos espermatozoides aglutinados, maior o tempo de manutenção da fertilidade.
Embora a agregação de espermatozoides e sua formação de feixes tenham sido observadas em diversos estudos2,22,24, elas não foram descritas em detalhes devido à complexidade da observação cinemática dentro do SST (Sistema de Teste de Espermatozoides). Várias tentativas foram feitas para estudar a aglutinação de espermatozoides in vitro. Observou-se agregação extensa, porém transitória, quando o fio fino foi removido da gota de sêmen suspensa. Isso leva à formação de uma bolha alongada que se projeta da gota, imitando a glândula seminal. Devido às limitações tridimensionais e aos curtos tempos de secagem por gotejamento, todo o bloco se deteriorou rapidamente9. No presente estudo, utilizando galinhas Sharkashi e chips microfluídicos, conseguimos descrever como esses tufos se formam e como se movem. Os feixes de espermatozoides se formaram imediatamente após a coleta do sêmen e apresentaram movimento espiral, demonstrando reologia positiva quando presentes no fluxo. Além disso, em observação macroscópica, os feixes de espermatozoides apresentaram maior linearidade de motilidade em comparação com os espermatozoides isolados. Isso sugere que a aglutinação espermática pode ocorrer antes da penetração no SST e que a produção de espermatozoides não se limita a uma pequena área devido ao estresse, como sugerido anteriormente (Tingari e Lake12). Durante a formação do feixe, os espermatozoides nadam em sincronia até formarem uma junção; então, suas caudas se enrolam umas nas outras e a cabeça do espermatozoide permanece livre, mas a cauda e a parte distal do espermatozoide aderem uma à outra por meio de uma substância pegajosa. Portanto, a cabeça livre do feixe é responsável pelo movimento, arrastando o restante do feixe. A microscopia eletrônica de varredura dos feixes de espermatozoides mostrou cabeças de espermatozoides aderidas e cobertas com uma grande quantidade de material pegajoso, sugerindo que as cabeças dos espermatozoides estavam aderidas em feixes em repouso, o que pode ter ocorrido após atingirem o local de armazenamento (SST).
Quando um esfregaço de sêmen é corado com laranja de acridina, o material adesivo extracelular ao redor dos espermatozoides pode ser visualizado sob um microscópio de fluorescência. Essa substância permite que os feixes de espermatozoides se adiram e se fixem a quaisquer superfícies ou partículas circundantes, de modo que não sejam levados pela correnteza. Assim, nossas observações demonstram o papel da adesão dos espermatozoides na forma de feixes móveis. Sua capacidade de nadar contra a corrente e aderir a superfícies próximas permite que os espermatozoides permaneçam por mais tempo no tanque de natação contra a corrente.
Rothschild25 utilizou uma câmara de hemocitometria para estudar a distribuição de sêmen bovino em suspensão, obtendo fotomicrografias através de uma câmara com eixos ópticos vertical e horizontal do microscópio. Os resultados mostraram que os espermatozoides foram atraídos para a superfície da câmara. Os autores sugerem que podem existir interações hidrodinâmicas entre os espermatozoides e a superfície. Levando isso em consideração, juntamente com a capacidade do sêmen de galinha Sharkashi de formar tufos pegajosos, pode aumentar a probabilidade de o sêmen aderir à parede do tubo de armazenamento e ser armazenado por longos períodos.
Bccetti e Afzeliu²⁶ relataram que o glicocálice espermático é necessário para o reconhecimento e aglutinação dos gametas. Forman¹⁰ observou que a hidrólise das ligações α-glicosídicas nos revestimentos glicoproteicos-glicolipídicos, pelo tratamento do sêmen de aves com neuraminidase, resultou em redução da fertilidade sem afetar a motilidade espermática. Os autores sugerem que o efeito da neuraminidase no glicocálice prejudica o sequestro espermático na junção útero-vaginal, reduzindo, assim, a fertilidade. Suas observações não podem ignorar a possibilidade de que o tratamento com neuraminidase possa reduzir o reconhecimento entre espermatozoides e oócitos. Forman e Engel¹⁰ constataram que a fertilidade foi reduzida quando galinhas foram inseminadas intravaginalmente com sêmen tratado com neuraminidase. No entanto, a fertilização in vitro (FIV) com sêmen tratado com neuraminidase não afetou a fertilidade em comparação com galinhas do grupo controle. Os autores concluíram que alterações no revestimento glicoproteico-glicolipídico ao redor da membrana espermática reduzem a capacidade dos espermatozoides de fertilizar, prejudicando o sequestro dos espermatozoides na junção útero-vaginal, o que, por sua vez, aumenta a perda de espermatozoides devido à velocidade de trânsito nessa junção, mas não afeta o reconhecimento entre espermatozoides e óvulos.
Em perus, Bakst e Bauchan¹¹ encontraram pequenas vesículas e fragmentos de membrana no lúmen do trato seminal e observaram que alguns desses grânulos haviam se fundido com a membrana espermática. Os autores sugerem que essas relações podem contribuir para o armazenamento de longo prazo dos espermatozoides no trato seminal. No entanto, os pesquisadores não especificaram a origem dessas partículas, se são secretadas pelas células epiteliais do trato corticoespinhal, produzidas e secretadas pelo sistema reprodutor masculino ou produzidas pelo próprio espermatozoide. Além disso, essas partículas são responsáveis ​​pela aglutinação. Grützner et al.²⁷ relataram que as células epiteliais do epidídimo produzem e secretam uma proteína específica necessária para a formação de tratos seminais de poro único. Os autores também relatam que a dispersão desses feixes depende da interação de proteínas epididimárias. Nixon et al.²⁸ descobriram que os anexos secretam uma proteína, a osteonectina ácida rica em cisteína; A proteína SPARC está envolvida na formação de tufos de espermatozoides em equidnas e ornitorrincos. A dispersão desses feixes está associada à perda dessa proteína.
No presente estudo, a análise ultraestrutural por microscopia eletrônica mostrou que os espermatozoides aderiram a uma grande quantidade de material denso. Acredita-se que essas substâncias sejam responsáveis ​​pela aglutinação que se condensa entre e ao redor das cabeças aderentes, porém em concentrações menores na região da cauda. Supomos que essa substância aglutinante seja excretada do sistema reprodutor masculino (epidídimo ou ducto deferente) juntamente com o sêmen, visto que frequentemente observamos a separação do sêmen da linfa e do plasma seminal durante a ejaculação. Foi relatado que, à medida que os espermatozoides de aves passam pelo epidídimo e pelo ducto deferente, sofrem alterações relacionadas à maturação que contribuem para sua capacidade de se ligarem a proteínas e adquirirem glicoproteínas associadas à membrana plasmática. A persistência dessas proteínas nas membranas espermáticas residentes no SST sugere que elas podem influenciar a aquisição da estabilidade da membrana espermática³⁰ e determinar sua fertilidade³¹. Ahammad et al32 relataram que os espermatozoides obtidos de várias partes do sistema reprodutor masculino (dos testículos ao ducto deferente distal) mostraram um aumento progressivo na viabilidade em condições de armazenamento líquido, independentemente da temperatura de armazenamento, e a viabilidade em galinhas também aumenta nas trompas de Falópio após inseminação artificial.
Os aglomerados de espermatozoides em galinhas sharkashi apresentam características e funções diferentes das de outras espécies, como equidnas, ornitorrincos, ratos-do-campo, ratos-veado e porquinhos-da-índia. Em galinhas sharkashi, a formação de aglomerados de espermatozoides reduziu sua velocidade de natação em comparação com espermatozoides isolados. No entanto, esses aglomerados aumentaram a porcentagem de espermatozoides reologicamente positivos e a capacidade dos espermatozoides de se estabilizarem em um ambiente dinâmico. Assim, nossos resultados confirmam a sugestão anterior de que a aglutinação de espermatozoides no SST está associada ao armazenamento de espermatozoides a longo prazo. Também hipotetizamos que a propensão dos espermatozoides a formar aglomerados pode controlar a taxa de perda de espermatozoides no SST, o que pode alterar o resultado da competição espermática. De acordo com essa hipótese, os espermatozoides com baixa capacidade de aglutinação liberam o SST primeiro, enquanto os espermatozoides com alta capacidade de aglutinação produzem a maior parte da prole. A formação de aglomerados de espermatozoides com poro único é benéfica e afeta a proporção entre pais e filhos, mas utiliza um mecanismo diferente. Em equidnas e ornitorrincos, os espermatozoides estão dispostos paralelamente uns aos outros para aumentar a velocidade de propulsão do feixe. Feixes de espermatozoides em equidnas movem-se cerca de três vezes mais rápido do que espermatozoides individuais. Acredita-se que a formação desses tufos de espermatozoides em equidnas seja uma adaptação evolutiva para manter a dominância, visto que as fêmeas são promíscuas e geralmente acasalam com vários machos. Portanto, os espermatozoides de diferentes ejaculados competem ferozmente pela fertilização do óvulo.
Os espermatozoides aglutinados de galinhas sharkasi são facilmente visualizados por microscopia de contraste de fase, o que é considerado vantajoso por permitir o estudo facilitado do comportamento dos espermatozoides in vitro. O mecanismo pelo qual a formação de tufos de espermatozoides promove a reprodução em galinhas sharkasi também difere daquele observado em alguns mamíferos placentários, representando um comportamento cooperativo de espermatozoides, como os ratos-do-campo, onde alguns espermatozoides alcançam os óvulos, auxiliando outros indivíduos relacionados a alcançá-los e danificá-los. Outro exemplo de comportamento cooperativo em espermatozoides foi encontrado em ratos-do-campo, onde os espermatozoides foram capazes de identificar e se combinar com os espermatozoides geneticamente mais relacionados, formando grupos cooperativos para aumentar sua velocidade em comparação com espermatozoides não relacionados.
Os resultados obtidos neste estudo não contradizem a teoria de Foman sobre o armazenamento de longo prazo de espermatozoides em SWS. Os pesquisadores relatam que os espermatozoides continuam a se mover no fluxo das células epiteliais que revestem o SST por um período prolongado e, após certo tempo, as reservas de energia dos espermatozoides se esgotam, resultando em uma diminuição da velocidade, o que permite a expulsão de substâncias de baixo peso molecular. A energia dos espermatozoides é liberada pelo fluxo de fluido do lúmen do SST, na cavidade da tuba uterina. No presente estudo, observamos que metade dos espermatozoides individuais apresentou capacidade de nadar contra o fluxo de fluidos, e sua adesão em feixes aumentou sua capacidade de apresentar reologia positiva. Além disso, nossos dados são consistentes com os de Matsuzaki et al.¹, que relataram que o aumento da secreção de lactato no SST pode inibir a motilidade dos espermatozoides residentes. No entanto, nossos resultados descrevem a formação de ligamentos móveis espermáticos e seu comportamento reológico na presença de um ambiente dinâmico dentro de um microcanal, numa tentativa de elucidar seu comportamento no SST. Pesquisas futuras poderão se concentrar em determinar a composição química e a origem do agente aglutinante, o que sem dúvida ajudará os pesquisadores a desenvolver novas maneiras de armazenar sêmen líquido e aumentar a duração da fertilidade.
Quinze machos de sharkasi de pescoço nu, com 30 semanas de idade (homozigotos dominantes; Na Na), foram selecionados como doadores de esperma para o estudo. As aves foram criadas na Fazenda Avícola de Pesquisa da Faculdade de Agricultura da Universidade de Ashit, Província de Ashit, Egito. Os animais foram alojados em gaiolas individuais (30 x 40 x 40 cm), submetidos a um programa de iluminação (16 horas de luz e 8 horas de escuridão) e alimentados com uma dieta contendo 160 g de proteína bruta, 2800 kcal de energia metabolizável, 35 g de cálcio e 5 gramas de fósforo disponível por quilograma de ração.
De acordo com os dados 36, ​​37, o sêmen foi coletado de machos por massagem abdominal. Um total de 45 amostras de sêmen foram coletadas de 15 homens ao longo de 3 dias. O sêmen (n = 15/dia) foi imediatamente diluído 1:1 (v:v) com o Diluente de Sêmen de Aves Belsville, que contém difosfato de potássio (1,27 g), glutamato monossódico monoidratado (0,867 g), frutose (0,5 g), acetato de sódio anidro (0,43 g), tris(hidroximetil)aminometano (0,195 g), citrato de potássio monoidratado (0,064 g), monofosfato de potássio (0,065 g), cloreto de magnésio (0,034 g) e H2O (100 ml), pH = 7,5, osmolaridade 333 mOsm/kg38. As amostras de sêmen diluídas foram inicialmente examinadas ao microscópio óptico para garantir a boa qualidade do sêmen (umidade) e, em seguida, armazenadas em banho-maria a 37 °C até serem utilizadas em até meia hora após a coleta.
A cinemática e a reologia dos espermatozoides são descritas utilizando um sistema de dispositivos microfluídicos. Amostras de sêmen foram diluídas a 1:40 em Diluente de Sêmen Aviário Beltsville, carregadas em um dispositivo microfluídico (ver abaixo) e os parâmetros cinéticos foram determinados utilizando um sistema de Análise Computadorizada de Sêmen (CASA) previamente desenvolvido para caracterização microfluídica. A mobilidade dos espermatozoides em meio líquido foi estudada pelo Departamento de Engenharia Mecânica, Faculdade de Engenharia, Universidade de Assiut, Egito. O plugin pode ser baixado em: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39. Foram medidas a velocidade da curva (VCL, μm/s), a velocidade linear (VSL, μm/s) e a velocidade média da trajetória (VAP, μm/s). Vídeos de espermatozoides foram obtidos utilizando um microscópio de contraste de fase invertido Optika XDS-3 (com objetiva de 40x) conectado a uma câmera Tucson ISH1000 a 30 fps durante 3 segundos. O software CASA foi utilizado para estudar pelo menos três áreas e 500 trajetórias de espermatozoides por amostra. O vídeo gravado foi processado utilizando um sistema CASA desenvolvido internamente. A definição de motilidade no plug-in CASA baseia-se na velocidade de natação do espermatozoide em relação à taxa de fluxo, e não inclui outros parâmetros como o movimento lateral, visto que este se mostrou mais confiável em fluxos de fluido. O movimento reológico é descrito como o movimento dos espermatozoides contra a direção do fluxo do fluido. Os espermatozoides com propriedades reológicas foram divididos pelo número de espermatozoides móveis; espermatozoides em repouso e espermatozoides em movimento convectivo foram excluídos da contagem.
Todos os produtos químicos utilizados foram obtidos da Elgomhoria Pharmaceuticals (Cairo, Egito), salvo indicação em contrário. O dispositivo foi fabricado conforme descrito por El-sherry et al.⁴⁰, com algumas modificações. Os materiais utilizados para a fabricação dos microcanais incluíram placas de vidro (Howard Glass, Worcester, MA), resina negativa SU-8-25 (MicroChem, Newton, CA), álcool diacetona (Sigma Aldrich, Steinheim, Alemanha) e poliacetona-184 (Dow Corning, Midland, Michigan). Os microcanais foram fabricados utilizando litografia suave. Primeiramente, uma máscara facial protetora transparente com o desenho desejado dos microcanais foi impressa em uma impressora de alta resolução (Prismatic, Cairo, Egito e Pacific Arts and Design, Markham, ON). Os moldes foram feitos utilizando placas de vidro como substratos. As placas foram limpas em acetona, isopropanol e água deionizada e, em seguida, revestidas com uma camada de 20 µm de SU8-25 por revestimento por rotação (3000 rpm, 1 min). As camadas de SU-8 foram então suavemente secas (65 °C, 2 min e 95 °C, 10 min) e expostas à radiação UV por 50 s. Após a exposição, foram levadas ao forno a 65 °C e 95 °C por 1 min e 4 min, respectivamente, para promover a reticulação das camadas de SU-8 expostas, seguidas de revelação em álcool diacetona por 6,5 min. Os waffles foram então levados ao forno a 200 °C por 15 min para solidificar ainda mais a camada de SU-8.
O PDMS foi preparado misturando o monômero e o endurecedor na proporção de 10:1 em peso, sendo posteriormente desgaseificado em um dessecador a vácuo e vertido sobre a estrutura principal de SU-8. O PDMS foi curado em estufa (120 °C, 30 min), e então os canais foram recortados, separados do molde mestre e perfurados para permitir a fixação de tubos na entrada e na saída do microcanal. Finalmente, os microcanais de PDMS foram fixados permanentemente em lâminas de microscópio utilizando um processador corona portátil (Electro-Technic Products, Chicago, IL), conforme descrito em outra publicação. O microcanal utilizado neste estudo mede 200 µm × 20 µm (L × A) e tem 3,6 cm de comprimento.
O fluxo de fluido induzido pela pressão hidrostática dentro do microcanal é obtido mantendo o nível do fluido no reservatório de entrada acima da diferença de altura Δh39 no reservatório de saída (Fig. 1).
onde f é o coeficiente de atrito, definido como f = C/Re para escoamento laminar em um canal retangular, onde C é uma constante que depende da relação de aspecto do canal, L é o comprimento do microcanal, Vav é a velocidade média dentro do microcanal, Dh é o diâmetro hidráulico do canal e g é a aceleração da gravidade. Usando esta equação, a velocidade média do canal pode ser calculada pela seguinte equação: