Diolch i chi am ymweld â Nature.com. Mae gan y fersiwn porwr rydych chi'n ei ddefnyddio gefnogaeth CSS gyfyngedig. I gael y profiad gorau, rydym yn argymell eich bod chi'n defnyddio porwr wedi'i ddiweddaru (neu'n analluogi Modd Cydnawsedd yn Internet Explorer). Yn y cyfamser, er mwyn sicrhau cefnogaeth barhaus, byddwn yn rendro'r wefan heb arddulliau a JavaScript.
Mae ffrwythlondeb adar yn dibynnu ar eu gallu i storio digon o sberm hyfyw am gyfnod estynedig o amser yn y tiwbynnau storio sberm (SST). Mae'r union fecanwaith y mae sbermatosoa yn mynd i mewn i'r SST, yn byw ynddo, ac yn gadael y SST yn parhau i fod yn ddadleuol. Dangosodd sberm ieir sharkasi duedd uchel i glymu, gan ffurfio bwndeli ffilamentog symudol sy'n cynnwys llawer o gelloedd. Oherwydd yr anhawster o arsylwi symudedd ac ymddygiad sbermatosoa mewn tiwb ffalopaidd afloyw, fe wnaethom ddefnyddio dyfais microfluidig ​​gyda thrawsdoriad microsianel tebyg i drawsdoriad sbermatosoa i astudio glymu a symudedd sbermatosoa. Mae'r astudiaeth hon yn trafod sut mae bwndeli sberm yn ffurfio, sut maen nhw'n symud, a'u rôl bosibl wrth ymestyn preswyliad sberm yn yr SST. Fe wnaethom ymchwilio i gyflymder sberm ac ymddygiad rheolegol pan gynhyrchwyd llif hylif o fewn sianel microfluidig ​​gan bwysau hydrostatig (cyfradd llif = 33 µm/s). Mae'r sbermatosoa yn tueddu i nofio yn erbyn y cerrynt (rheoleg gadarnhaol) ac mae cyflymder bwndel y sbermatosoa yn cael ei leihau'n sylweddol o'i gymharu â sbermatosoa sengl. Mae bwndeli sberm wedi cael eu gweld yn symud mewn troellog ac yn cynyddu o ran hyd a thrwch wrth i fwy o sberm sengl gael eu recriwtio. Gwelwyd bwndeli sberm yn agosáu at waliau ochr y sianeli microfluidig ​​ac yn glynu wrthynt er mwyn osgoi cael eu hysgubo â chyflymder llif hylif > 33 µm/s. Gwelwyd bwndeli sberm yn agosáu at waliau ochr y sianeli microfluidig ​​ac yn glynu wrthynt er mwyn osgoi cael eu hysgubo â chyflymder llif hylif > 33 µm/s. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрофлю идовлю чтобы избежать сметания со скоростью потока жидкости > 33 мкм / с. Gwelwyd bwndeli sberm yn agosáu at waliau ochr y sianeli microfluidig ​​ac yn glynu wrthynt er mwyn osgoi cael eu hysgubo i ffwrdd ar gyfraddau llif hylif >33 µm/s.观察到精子束接近并粘附在微流体通道的侧壁上，以避免被流体流速> 33 流速33 µm/s 扫过. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрожаются приближаются и прилипают к боковым стенкам микрожаютид избежать сметания потоком жидкости со скоростью > 33 мкм/с. Gwelwyd bwndeli sberm yn agosáu at waliau ochr y sianel microfluidig ​​ac yn glynu wrthynt er mwyn osgoi cael eu hysgubo i ffwrdd gan lif hylif ar >33 µm/s.Datgelodd microsgopeg sganio a microsgopeg electron trawsyrru fod bwndeli sberm yn cael eu cynnal gan ddeunydd trwchus toreithiog. Mae'r data a gafwyd yn dangos symudedd unigryw spermatozoa cyw iâr Sharkazi, yn ogystal â gallu spermatozoa i glymu a ffurfio bwndeli symudol, sy'n cyfrannu at well dealltwriaeth o storio spermatozoa hirdymor mewn SMT.
Er mwyn cyflawni ffrwythloni mewn bodau dynol a'r rhan fwyaf o anifeiliaid, rhaid i sberm ac wyau gyrraedd safle ffrwythloni ar yr amser iawn. Felly, rhaid i baru ddigwydd cyn neu ar adeg ofyliad. Ar y llaw arall, mae rhai mamaliaid, fel cŵn, yn ogystal â rhywogaethau nad ydynt yn famaliaid, fel pryfed, pysgod, ymlusgiaid ac adar, yn storio sberm yn eu horganau atgenhedlu am gyfnod estynedig o amser nes bod eu hwyau'n barod i'w ffrwythloni (ffrwythloni anghydamserol 1 ). Mae adar yn gallu cynnal hyfywedd sbermatozoa sy'n gallu ffrwythloni wyau am 2-10 wythnos 2 .
Mae hon yn nodwedd unigryw sy'n gwahaniaethu adar oddi wrth anifeiliaid eraill, gan ei bod yn darparu tebygolrwydd uchel o ffrwythloni ar ôl un ffrwythloniad am sawl wythnos heb baru ac ofyliad ar yr un pryd. Mae'r prif organ storio sberm, o'r enw'r tiwbyn storio sberm (SST), wedi'i leoli yn y plygiadau mwcosaidd mewnol wrth y gyffordd uterofaginal. Hyd yn hyn, nid yw'r mecanweithiau y mae sberm yn mynd i mewn i'r banc sberm, yn aros ynddo, ac yn gadael y banc sberm wedi'u deall yn llawn. Yn seiliedig ar astudiaethau blaenorol, mae llawer o ragdybiaethau wedi'u cyflwyno, ond nid oes yr un ohonynt wedi'i gadarnhau.
Rhagdybiodd Forman4 fod spermatozoa yn cynnal eu preswylfa yng ngheudod yr SST trwy symudiad osgiliadol parhaus yn erbyn cyfeiriad llif yr hylif trwy sianeli protein sydd wedi'u lleoli ar gelloedd epithelaidd SST (rheoleg). Mae ATP yn cael ei ddihysbyddu oherwydd y gweithgaredd fflagelaidd cyson sydd ei angen i gadw'r sberm yn lumen yr SST ac mae symudedd yn y pen draw yn lleihau nes bod y sberm yn cael ei gario allan o'r banc sberm gan lif hylif ac yn dechrau taith newydd i lawr y tiwb ffalopaidd esgynnol i ffrwythloni'r sberm. Wy (Forman4). Cefnogir y model hwn o storio sberm gan ganfod trwy imiwnocytochemeg acwaporinau 2, 3 a 9 sy'n bresennol mewn celloedd epithelaidd SST. Hyd yn hyn, mae astudiaethau ar reoleg semen cyw iâr a'i rôl mewn storio SST, dewis sberm fagina, a chystadleuaeth sberm yn brin. Mewn ieir, mae sberm yn mynd i mewn i'r fagina ar ôl paru naturiol, ond mae mwy nag 80% o'r spermatozoa yn cael eu taflu allan o'r fagina yn fuan ar ôl paru. Mae hyn yn awgrymu mai'r fagina yw'r prif safle ar gyfer dewis sberm mewn adar. Yn ogystal, adroddwyd bod llai nag 1% o spermatozoa sy'n cael eu ffrwythloni yn y fagina yn gorffen mewn SSTs2. Mewn ffrwythloni artiffisial cywion yn y fagina, mae nifer y spermatozoa sy'n cyrraedd SST yn tueddu i gynyddu 24 awr ar ôl ffrwythloni. Hyd yn hyn, nid yw mecanwaith dewis sberm yn ystod y broses hon yn glir, a gall symudedd sberm chwarae rhan bwysig yn y broses o gymryd sberm SST. Oherwydd waliau trwchus ac afloyw'r tiwbiau ffalopaidd, mae'n anodd monitro symudedd sberm yn uniongyrchol yn nhiwbiau ffalopaidd adar. Felly, nid oes gennym wybodaeth sylfaenol am sut mae spermatozoa yn trawsnewid i SST ar ôl ffrwythloni.
Yn ddiweddar, cydnabuwyd bod rheoleg yn ffactor pwysig sy'n rheoli cludo sberm yn organau cenhedlu mamaliaid. Yn seiliedig ar allu spermatozoa symudol i fudo'n wrthgyferbyniol, defnyddiodd Zaferani et al8 system ficrofluidig ​​corra i ynysu spermatozoa symudol yn oddefol o samplau semen wedi'u corlannu. Mae'r math hwn o ddidoli semen yn hanfodol ar gyfer triniaeth anffrwythlondeb feddygol ac ymchwil glinigol, ac mae'n cael ei ffafrio dros ddulliau traddodiadol sy'n ddwys o ran amser a llafur a all beryglu morffoleg a chyfanrwydd strwythurol sberm. Fodd bynnag, hyd yn hyn, ni chynhaliwyd unrhyw astudiaethau ar effaith secretiadau o organau cenhedlu ieir ar symudedd sberm.
Waeth beth fo'r mecanwaith sy'n cynnal sberm wedi'i storio yn yr SST, mae llawer o ymchwilwyr wedi sylwi bod spermatozoa preswyl yn glynu ben wrth ben yn SST ieir 9, 10, soflieir 2, a thyrcwn 11 i ffurfio bwndeli sberm wedi'u glynu. Mae'r awduron yn awgrymu bod cysylltiad rhwng y glynu hwn a storio spermatozoa hirdymor yn yr SST.
Adroddodd Tingari a Lake12 gysylltiad cryf rhwng sbermatosoa yn chwarren derbyn sberm y cyw iâr a chwestiynu a yw sbermatosoa adar yn glynu yn yr un ffordd â sbermatosoa mamaliaid. Maent yn credu y gallai'r cysylltiadau dwfn rhwng sberm yn y vas deferens fod oherwydd y straen a achosir gan bresenoldeb nifer fawr o sberm mewn lle bach.
Wrth werthuso ymddygiad spermatozoa ar sleidiau gwydr crog ffres, gellir gweld arwyddion dros dro o glymu, yn enwedig ar ymylon y diferion semen. Fodd bynnag, roedd y glymu yn aml yn cael ei aflonyddu gan y weithred gylchdroi sy'n gysylltiedig â symudiad parhaus, sy'n egluro natur dros dro'r ffenomen hon. Sylwodd yr ymchwilwyr hefyd, pan ychwanegwyd y teneuydd at y semen, fod crynhoadau celloedd hirgul "tebyg i edau" yn ymddangos.
Gwnaed ymdrechion cynnar i efelychu spermatozoa trwy dynnu gwifren denau o ddiferyn crog, a arweiniodd at fesigl hirgul tebyg i sberm yn ymwthio allan o'r diferyn semen. Leiniodd y spermatozoa i fyny ar unwaith mewn modd cyfochrog o fewn y fesigl, ond diflannodd yr uned gyfan yn gyflym oherwydd y cyfyngiad 3D. Felly, i astudio cydgysylltu spermatozoa, mae angen arsylwi symudedd ac ymddygiad spermatozoa yn uniongyrchol mewn tiwbynnau storio sberm ynysig, sy'n anodd ei gyflawni. Felly, mae angen datblygu offeryn sy'n dynwared spermatozoa i gefnogi astudiaethau o symudedd sberm ac ymddygiad cydgysylltu. Adroddodd Brillard et al13 fod hyd cyfartalog tiwbynnau storio sberm mewn cywion sy'n oedolion yn 400–600 µm, ond gall rhai SSTs fod mor hir â 2000 µm. Rhannodd Mero ac Ogasawara14 y chwarennau seminiferous yn diwbynnau storio sberm chwyddedig a di-chwyddedig, y ddau ohonynt yr un hyd (~500 µm) a lled y gwddf (~38 µm), ond diamedr lumen cymedrig y tiwbynnau oedd 56.6 a 56.6 µm. . , 11.2 μm yn y drefn honno. Yn yr astudiaeth gyfredol, defnyddiwyd dyfais microfluidig ​​gyda maint sianel o 200 µm × 20 µm (L × A), y mae ei thrawsdoriad braidd yn agos at drawsdoriad yr SST wedi'i fwyhau. Yn ogystal, archwiliwyd symudedd sberm ac ymddygiad glymu mewn hylif sy'n llifo, sy'n gyson â damcaniaeth Foreman bod hylif a gynhyrchir gan gelloedd epithelaidd SST yn cadw sberm yn y lumen mewn cyfeiriad gwrthgerrynt (rheolegol).
Nod yr astudiaeth hon oedd goresgyn y problemau o arsylwi symudedd spermatozoa yn y tiwb ffalopaidd ac osgoi'r anawsterau o astudio rheoleg ac ymddygiad spermatozoa mewn amgylchedd deinamig. Defnyddiwyd dyfais microfluidig ​​sy'n creu pwysau hydrostatig i efelychu symudedd sberm yn organau cenhedlu cyw iâr.
Pan lwythwyd diferyn o sampl sberm wedi'i wanhau (1:40) i'r ddyfais microsianel, gellid nodi dau fath o symudedd sberm (sberm wedi'i ynysu a sberm wedi'i rwymo). Yn ogystal, roedd sbermatosoa yn tueddu i nofio yn erbyn y cerrynt (rheoleg bositif; fideo 1, 2). Er bod gan fwndeli sberm gyflymder is na chyflymder sberm unig (p < 0.001), fe wnaethant gynyddu canran y sberm a oedd yn arddangos rheotacsis positif (p < 0.001; Tabl 2). Er bod gan fwndeli sberm gyflymder is na chyflymder sberm unig (p < 0.001), fe wnaethant gynyddu canran y sberm a oedd yn arddangos rheotacsis positif (p < 0.001; Tabl 2). Хотя пучки сперматозоидов имели более низкую скорость, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,0идов), < 0,0или процент сперматозоидов, демонстрирующих положительный реотаксис (p < 0,001; таблица 2). Er bod gan fwndeli spermatozoa gyflymder is na chyflymder spermatozoa sengl (p < 0.001), fe wnaethant gynyddu canran y spermatozoa a oedd yn dangos rheotacsis positif (p < 0.001; Tabl 2).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度（p < 0.001）,但它们增加了显示阳性流变性的精子百分比（p < 0.001；表2）。尽管 精子束的速度低于孤独的速度（p <0.001） ， 但增加了显示阳倧性性性性性性性性性性性性是百分比（p <0.001； 2。。。。。。）））） Хотя скорость пучков сперматозоидов была ниже, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), олничич сперматозоидов с положительной реологией (p < 0,001; таблица 2). Er bod cyflymder bwndeli sberm yn is na chyflymder spermatozoa sengl (p < 0.001), fe wnaethant gynyddu canran y spermatozoa â rheoleg bositif (p < 0.001; Tabl 2).Amcangyfrifir bod rheoleg bositif ar gyfer spermatozoa sengl a thwftiau tua 53% ac 85%, yn y drefn honno.
Sylwyd bod sbermatosoa ieir sharkasi yn syth ar ôl alldaflu yn ffurfio bwndeli llinol, sy'n cynnwys dwsinau o unigolion. Mae'r tyfiau hyn yn cynyddu o ran hyd a thrwch dros amser a gallant aros in vitro am sawl awr cyn gwasgaru (fideo 3). Mae'r bwndeli ffilamentog hyn wedi'u siapio fel sbermatosoa echidna sy'n ffurfio ar ddiwedd yr epididymis. Canfuwyd bod gan semen ieir Sharkashi duedd uchel i glynu a ffurfio bwndel reticwlaidd mewn llai nag un munud ar ôl ei gasglu. Mae'r trawstiau hyn yn ddeinamig ac yn gallu glynu wrth unrhyw waliau neu wrthrychau statig cyfagos. Er bod bwndeli sberm yn lleihau cyflymder celloedd sberm, mae'n amlwg eu bod yn cynyddu eu llinoledd yn macrosgopig. Mae hyd y bwndeli yn amrywio yn dibynnu ar nifer y sberm a gasglwyd mewn bwndeli. Ynyswyd dwy ran o'r bwndel: y rhan gychwynnol, gan gynnwys pen rhydd y sberm wedi'i glynu, a'r rhan derfynol, gan gynnwys y gynffon a phen distal cyfan y sberm. Gan ddefnyddio camera cyflymder uchel (950 fps), gwelwyd pennau rhydd spermatozoa wedi'u glynu yn rhan gyntaf y bwndel, a oedd yn gyfrifol am symudiad y bwndel oherwydd eu symudiad osgiliadol, gan lusgo'r rhai sy'n weddill i'r bwndel gyda symudiad troellog (Fideo 4). Fodd bynnag, mewn twftiau hir, gwelwyd bod rhai pennau sberm rhydd wedi glynu wrth y corff a bod rhan derfynol y twft yn gweithredu fel faniau i helpu i yrru'r twft.
Tra mewn llif araf o hylif, mae bwndeli'r sberm yn symud yn gyfochrog â'i gilydd, fodd bynnag, maent yn dechrau gorgyffwrdd a glynu wrth bopeth sy'n llonydd, er mwyn peidio â chael eu golchi i ffwrdd gan y llif cerrynt wrth i gyflymder y llif gynyddu. Mae'r bwndeli'n ffurfio pan fydd llond llaw o gelloedd sberm yn agosáu at ei gilydd, maent yn dechrau symud mewn cydamseriad a lapio o amgylch ei gilydd, ac yna'n glynu wrth sylwedd gludiog. Mae Ffigurau 1 a 2 yn dangos sut mae'r sberm yn agosáu at ei gilydd, gan ffurfio cyffordd wrth i'r cynffonau lapio o amgylch ei gilydd.
Defnyddiodd yr ymchwilwyr bwysau hydrostatig i greu llif hylif mewn microsianel i astudio rheoleg sberm. Defnyddiwyd microsianel maint o 200 µm × 20 µm (L × U) a hyd o 3.6 µm. Defnyddiwyd microsianel rhwng cynwysyddion gyda chwistrelli wedi'u gosod ar y pennau. Defnyddiwyd lliw bwyd i wneud y sianeli'n fwy gweladwy.
Clymwch geblau rhyng-gysylltu ac ategolion i'r wal. Tynnwyd y fideo gyda microsgop cyferbyniad cyfnod. Gyda phob delwedd, cyflwynir delweddau microsgopeg cyferbyniad cyfnod a mapio. (A) Mae'r cysylltiad rhwng dau nant yn gwrthsefyll y llif oherwydd symudiad troellog (saeth goch). (B) Y cysylltiad rhwng bwndel y tiwb a wal y sianel (saethau coch), ar yr un pryd maent wedi'u cysylltu â dau fwndel arall (saethau melyn). (C) Mae bwndeli sberm yn y sianel microfluidig ​​yn dechrau cysylltu â'i gilydd (saethau coch), gan ffurfio rhwyll o fwndeli sberm. (D) Ffurfiant rhwydwaith o fwndeli sberm.
Pan lwythwyd diferyn o sberm gwanedig i'r ddyfais microfluidig ​​a chreu llif, gwelwyd trawst y sberm yn symud yn erbyn cyfeiriad y llif. Mae'r bwndeli'n ffitio'n glyd yn erbyn waliau'r microsianeli, ac mae'r pennau rhydd yn rhan gychwynnol y bwndeli'n ffitio'n glyd yn eu herbyn (fideo 5). Maent hefyd yn glynu wrth unrhyw ronynnau llonydd yn eu llwybr, fel malurion, i wrthsefyll cael eu hysgubo i ffwrdd gan y cerrynt. Dros amser, mae'r twftiau hyn yn dod yn ffilamentau hir sy'n dal sbermatosoa sengl eraill a thwftiau byrrach (Fideo 6). Wrth i'r llif ddechrau arafu, mae llinellau hir o sberm yn dechrau ffurfio rhwydwaith o linellau sberm (Fideo 7; Ffigur 2).
Ar gyflymder llif uchel (V > 33 µm/s), mae symudiadau troellog edafedd yn cynyddu mewn ymgais i ddal llawer o fwndeli unigol sy'n ffurfio sberm i wrthsefyll grym drifftio'r llif yn well. Ar gyflymder llif uchel (V > 33 µm/s), mae symudiadau troellog edafedd yn cynyddu mewn ymgais i ddal llawer o fwndeli unigol sy'n ffurfio sberm i wrthsefyll grym drifftio'r llif yn well. При высокой скорости потока (V > 33 мкм/с) спиралевидные движения нитей усиливаются, посколькупо поймать множество отдельных сперматозоидов, образующих пучки, которые лучше противостойе противостойе противостойе потока. Ar gyfraddau llif uchel (V > 33 µm/s), mae symudiadau troellog y llinynnau'n cynyddu wrth iddynt geisio dal llawer o spermatozoa unigol gan ffurfio bwndeli sy'n gallu gwrthsefyll grym drifftio'r llif yn well.在高流速(V > 33 µm/s)时，螺纹的螺旋运动增加，以试图捕捉许多形成束的单个精子，从而更好地抵抗流动的漂移力。在 高流速 (v> 33 µm/s) 时，的螺旋运动增加，以试图许多形成束单加以试国更地抵抗的漂移力。。。。。。。。 При высоких скоростях потока (V > 33 мкм/с) спиральное движение нитей увеличивается в попытке Приральное движение нитей увеличивается в попытке При множество отдельных сперматозоидов, образующих пучки, чтобы лучше сопротивляться преома. Ar gyfraddau llif uchel (V > 33 µm/s), mae symudiad troellog y ffilamentau'n cynyddu mewn ymgais i ddal llawer o fwndeli ffurfio spermatozoa unigol er mwyn gwrthsefyll grymoedd drifft y llif yn well.Fe wnaethon nhw hefyd geisio atodi microsianeli i'r waliau ochr.
Nodwyd bwndeli sberm fel clystyrau o bennau sberm a chynffonau cyrliog gan ddefnyddio microsgopeg golau (LM). Mae bwndeli sberm gydag amrywiol agregau hefyd wedi'u nodi fel pennau troellog ac agregau fflangelar, cynffonau sberm wedi'u hasio lluosog, pennau sberm ynghlwm wrth gynffon, a phennau sberm â niwclysau plygedig fel niwclysau wedi'u hasio lluosog. microsgopeg electron trawsyrru (TEM). Dangosodd microsgopeg electron sganio (SEM) fod y bwndeli sberm yn agregau wedi'u gorchuddio â phennau sberm a bod yr agregau sberm yn dangos rhwydwaith ynghlwm o gynffonau wedi'u lapio.
Astudiwyd morffoleg ac uwchstrwythur spermatozoa, ffurfio bwndeli spermatozoa gan ddefnyddio microsgopeg golau (hanner adran), microsgopeg electron sganio (SEM) a microsgopeg electron trosglwyddo (TEM), staeniwyd samplau sberm ag oren acridine ac archwiliwyd hwy gan ddefnyddio microsgopeg epifflworoleuedd.
Dangosodd staenio sberm gydag oren acridine (Ffig. 3B) fod pennau'r sberm wedi'u glynu at ei gilydd ac wedi'u gorchuddio â deunydd secretyddol, a arweiniodd at ffurfio tyfiau mawr (Ffig. 3D). Roedd bwndeli'r sberm yn cynnwys agregau sberm gyda rhwydwaith o gynffonau ynghlwm (Ffig. 4A-C). Mae bwndeli sberm yn cynnwys cynffonau llawer o sbermatosoa wedi'u glynu at ei gilydd (Ffig. 4D). Roedd cyfrinachau (Ffig. 4E,F) yn gorchuddio pennau bwndeli'r sbermatosoa.
Ffurfiant bwndel y spermatozoa Gan ddefnyddio microsgopeg cyferbyniad cyfnod a phrofion sberm wedi'u staenio ag oren acridine, dangoswyd bod pennau'r spermatozoa yn glynu at ei gilydd. (A) Mae ffurfio tyfftiau sberm cynnar yn dechrau gydag un sberm (cylch gwyn) a thri sberm (cylch melyn), gyda'r troell yn dechrau wrth y gynffon ac yn gorffen wrth y pen. (B) Ffotomicrograff o smwt sberm wedi'i staenio ag oren acridine yn dangos pennau sberm ymlynol (saethau). Mae'r gollyngiad yn gorchuddio'r pen(nau). Chwyddiad × 1000. (C) Datblygiad trawst mawr a gludir gan lif mewn sianel microfluidig ​​(gan ddefnyddio camera cyflymder uchel ar 950 fps). (D) Micrograff o smwt sberm wedi'i staenio ag oren acridine yn dangos tyfftiau mawr (saethau). Chwyddiad: ×200.
Micrograff electron sganio o drawst sberm a smwtsh sberm wedi'i staenio ag acridine oren. Mae (A, B, D, E) yn ficrograffau electron sganio lliw digidol o spermatozoa, ac mae C ac F yn ficrograffau o smwtsh sberm wedi'i staenio ag acridine oren sy'n dangos ymlyniad spermatozoa lluosog yn lapio'r we gynffonol. (AC) Dangosir agregau sberm fel rhwydwaith o gynffonau ynghlwm (saethau). (D) Ymlyniad sawl spermatozoa (gyda sylwedd gludiog, amlinelliad pinc, saeth) yn lapio o amgylch y gynffon. (E ac F) Agregau pen sberm (pwyntyddion) wedi'u gorchuddio â deunydd gludiog (pwyntyddion). Ffurfiodd y spermatozoa fwndeli gyda sawl strwythur tebyg i fortecs (F). Chwyddiadau (C) ×400 a (F) ×200.
Gan ddefnyddio microsgopeg electron trawsyrru, gwelsom fod gan fwndeli sberm gynffonau ynghlwm (Ffig. 6A, C), pennau ynghlwm wrth gynffonau (Ffig. 6B), neu bennau ynghlwm wrth gynffonau (Ffig. 6D). Mae pennau'r spermatozoa yn y bwndel yn grwm, gan gyflwyno yn adran dau ranbarth niwclear (Ffig. 6D). Yn y bwndel toriad, roedd gan y spermatozoa ben troellog gyda dau ranbarth niwclear a rhanbarthau fflangellaidd lluosog (Ffig. 5A).
Micrograff electron lliw digidol yn dangos y cynffonau cysylltu ym mwndel y sberm a'r deunydd glymu sy'n cysylltu pennau'r sberm. (A) Cynffon ynghlwm nifer fawr o spermatozoa. Sylwch sut olwg sydd ar y gynffon mewn tafluniadau portread (saeth) a thirwedd (saeth). (B) Mae pen (saeth) y sberm wedi'i gysylltu â'r gynffon (saeth). (C) Mae sawl cynffon sberm (saethau) ynghlwm. (D) Mae deunydd glymu (AS, glas) yn cysylltu pedwar pen sberm (porffor).
Defnyddiwyd microsgopeg electron sganio i ganfod pennau sberm mewn bwndeli sberm wedi'u gorchuddio â secretiadau neu bilenni (Ffigur 6B), sy'n dangos bod y bwndeli sberm wedi'u hangori gan ddeunydd allgellog. Roedd y deunydd wedi'i glytio wedi'i grynhoi ym mhen y sberm (cynulliad tebyg i ben slefrod môr; Ffig. 5B) ac wedi ehangu'n distal, gan roi golwg melyn llachar o dan ficrosgopeg fflwroleuol pan gafodd ei staenio ag oren acridine (Ffig. 6C). Mae'r sylwedd hwn i'w weld yn glir o dan ficrosgop sganio ac fe'i hystyrir yn rhwymwr. Dangosodd adrannau lled-denau (Ffig. 5C) a smears sberm wedi'u staenio ag oren acridine fwndeli sberm yn cynnwys pennau wedi'u pacio'n ddwys a chynffonau cyrliog (Ffig. 5D).
Amrywiaeth o ffotomicrograffau yn dangos agregu pennau sberm a chynffonau plygedig gan ddefnyddio amrywiol ddulliau. (A) Micrograff electron trosglwyddo lliw digidol trawsdoriadol o fwndel sberm yn dangos pen sberm wedi'i goiledu gyda niwclews dwy ran (glas) a sawl rhan fflangelar (gwyrdd). (B) Micrograff electron sganio lliw digidol yn dangos clwstwr o bennau sberm tebyg i sglefrod môr (saethau) sy'n ymddangos fel pe baent wedi'u gorchuddio. (C) Toriad lled-denau yn dangos pennau sberm wedi'u hagregu (saethau) a chynffonau wedi'u cyrlio (saethau). (D) Micrograff o smwt sberm wedi'i staenio ag oren acridine yn dangos agregau o bennau sberm (saethau) a chynffonau glynu cyrliog (saethau). Sylwch fod sylwedd gludiog (S) yn gorchuddio pen y sbermatosoon. (D) × chwyddiad 1000.
Gan ddefnyddio microsgopeg electron trawsyrru (Ffig. 7A), nodwyd hefyd fod pennau'r sberm wedi'u troelli a bod gan y cnewyllyn siâp troellog, fel y cadarnhawyd gan brofion sberm wedi'u staenio ag oren acridine ac wedi'u harchwilio gan ddefnyddio microsgopeg fflwroleuol (Ffig. 7B).
(A) Micrograff electron trawsyrru lliw digidol a (B) smwt sberm wedi'i liwio ag oren acridine yn dangos pennau wedi'u coilio ac ymlyniad pennau a chynffonau sberm (saethau). (B) Chwyddiad × 1000.
Canfyddiad diddorol yw bod sberm Sharkazi yn crynhoi i ffurfio bwndeli ffilamentog symudol. Mae priodweddau'r bwndeli hyn yn caniatáu inni ddeall eu rôl bosibl yn amsugno a storio sbermatosoa yn yr SST.
Ar ôl paru, mae'r sberm yn mynd i mewn i'r fagina ac yn mynd trwy broses ddethol ddwys, gan arwain at nifer gyfyngedig o sberm yn unig yn mynd i mewn i'r SST15,16. Hyd yn hyn, nid yw'r mecanweithiau y mae sberm yn mynd i mewn ac allan o'r SST yn glir. Mewn dofednod, mae sbermatozoa yn cael eu storio yn yr SST am gyfnod estynedig o 2 i 10 wythnos, yn dibynnu ar y rhywogaeth6. Mae dadl yn parhau ynghylch cyflwr y semen yn ystod storio yn yr SST. A ydyn nhw'n symud neu'n gorffwys? Mewn geiriau eraill, sut mae celloedd sberm yn cynnal eu safle yn yr SST am gyhyd?
Awgrymodd Forman4 y gellid esbonio preswyliad a diarddeliad celloedd epitheliwm SST o ran symudedd sberm. Mae'r awduron yn damcaniaethu bod sberm yn cynnal eu safle trwy nofio yn erbyn llif yr hylif a grëir gan epitheliwm yr SST a bod sberm yn cael eu diarddel o'r SST pan fydd eu cyflymder yn disgyn islaw'r pwynt lle maent yn dechrau symud yn ôl oherwydd diffyg egni. Cadarnhaodd Zaniboni5 bresenoldeb acwaporinau 2, 3, a 9 yn rhan apigol celloedd epitheliwm yr SST, a all gefnogi model storio sberm Foreman yn anuniongyrchol. Yn yr astudiaeth gyfredol, gwelsom fod bron i hanner sbermatozoa Sharkashi yn dangos rheoleg gadarnhaol yn yr hylif sy'n llifo, a bod bwndeli sberm wedi'u glytio yn cynyddu nifer y sbermatozoa sy'n dangos rheoleg gadarnhaol, er bod glytio yn eu harafu. Nid yw sut mae celloedd sberm yn teithio i fyny tiwb ffalopaidd yr aderyn i safle ffrwythloni wedi'i ddeall yn llawn. Mewn mamaliaid, mae'r hylif ffoliglaidd yn cemoattractio sbermatozoa. Fodd bynnag, credir bod cemoattractants yn cyfeirio spermatozoa i agosáu at bellteroedd hir7. Felly, mae mecanweithiau eraill yn gyfrifol am gludo sberm. Adroddwyd bod gallu sberm i gyfeirio a llifo yn erbyn hylif y tiwb ffalopaidd a ryddheir ar ôl paru yn ffactor pwysig wrth dargedu sberm mewn llygod. Awgrymodd Parker17 fod spermatozoa yn croesi'r ofidwythiennau trwy nofio yn erbyn y cerrynt siliaidd mewn adar ac ymlusgiaid. Er nad yw wedi'i ddangos yn arbrofol mewn adar, Adolphi18 oedd y cyntaf i ddarganfod bod sberm adar yn rhoi canlyniadau cadarnhaol pan grëir haen denau o hylif rhwng gorchudd a sleid gyda stribed o bapur hidlo. Rheoleg. Gosododd Hino a Yanagimachi [19] gymhleth ofari-tiwban-groth llygoden mewn cylch perfusiwn a chwistrellu 1 µl o inc i'r isthmws i ddelweddu llif hylif yn y tiwbiau ffalopaidd. Sylwasant ar symudiad gweithredol iawn o gyfangiad ac ymlacio yn y tiwb ffalopaidd, lle'r oedd yr holl beli inc yn symud yn gyson tuag at ampwla'r tiwb ffalopaidd. Mae'r awduron yn pwysleisio pwysigrwydd llif hylif tiwbaidd o'r tiwbiau ffalopaidd isaf i'r uchaf ar gyfer codi sberm a ffrwythloni. Adroddodd Brillard20 fod spermatozoa mewn ieir a thwrcwn yn mudo trwy symudiad gweithredol o fynedfa'r fagina, lle cânt eu storio, i'r gyffordd groth-faginaidd, lle cânt eu storio. Fodd bynnag, nid oes angen y symudiad hwn rhwng y gyffordd groth-faginaidd a'r infundibulum oherwydd bod y spermatozoa yn cael eu cludo trwy ddadleoliad goddefol. Gan wybod yr argymhellion blaenorol hyn a'r canlyniadau a gafwyd yn yr astudiaeth gyfredol, gellir tybio mai gallu spermatozoa i symud i fyny'r afon (rheoleg) yw un o'r priodweddau y mae'r broses ddethol yn seiliedig arnynt. Mae hyn yn pennu taith spermatozoa trwy'r fagina a'u mynediad i'r CCT i'w storio. Fel yr awgrymodd Forman4, gall hyn hefyd hwyluso'r broses o sberm yn mynd i mewn i'r SST a'i gynefin am gyfnod o amser ac yna'n gadael pan fydd eu cyflymder yn dechrau arafu.
Ar y llaw arall, awgrymodd Matsuzaki a Sasanami 21 fod spermatozoa adar yn mynd trwy newidiadau symudedd o gysgadrwydd i symudedd yn y llwybrau atgenhedlu gwrywaidd a benywaidd. Cynigiwyd bod atal symudedd sberm preswyl yn yr SST yn egluro'r amser storio hir ar gyfer sberm ac yna'r adfywiad ar ôl gadael yr SST. O dan amodau hypocsig, adroddodd Matsuzaki et al. 1 am gynhyrchiad a rhyddhau lactad uchel yn yr SST, a all arwain at atal symudedd sberm preswyl. Yn yr achos hwn, adlewyrchir pwysigrwydd rheoleg sberm yn y broses o ddewis ac amsugno spermatozoa, ac nid yn eu storio.
Ystyrir bod y patrwm glynu sberm yn esboniad credadwy am y cyfnod storio hir ar gyfer sberm yn yr SST, gan fod hwn yn batrwm cyffredin o gadw sberm mewn dofednod2,22,23. Sylwodd Bakst et al.2 fod y rhan fwyaf o spermatozoa yn glynu wrth ei gilydd, gan ffurfio agregau ffasgiwlaidd, ac anaml y canfuwyd spermatozoa sengl mewn CCM soflieir. Ar y llaw arall, gwelodd Wen et al.24 fwy o spermatozoa gwasgaredig a llai o dyfiannau spermatozoa yn lumen yr SST mewn ieir. Yn seiliedig ar yr arsylwadau hyn, gellir tybio bod y duedd i glynu sberm yn wahanol rhwng adar a rhwng spermatozoa yn yr un alldafliad. Yn ogystal, awgrymodd Van Krey et al.9 fod daduniad ar hap o spermatozoa wedi'u glynu yn gyfrifol am dreiddiad graddol spermatozoa i lumen y tiwb ffalopaidd. Yn ôl y ddamcaniaeth hon, dylid diarddel spermatozoa â chynhwysedd glynu is o'r SST yn gyntaf. Yn y cyd-destun hwn, gall gallu spermatozoa i glymu fod yn ffactor sy'n dylanwadu ar ganlyniad cystadleuaeth sberm mewn adar budr. Yn ogystal, po hiraf y mae'r sberm glymu yn daduno, yr hiraf y cynhelir ffrwythlondeb.
Er bod agregu spermatozoa ac agregu i mewn i fwndeli wedi'u harsylwi mewn sawl astudiaeth2,22,24, nid ydynt wedi'u disgrifio'n fanwl oherwydd cymhlethdod eu harsylwad cinematig o fewn yr SST. Gwnaed sawl ymgais i astudio agglwtiniad sberm in vitro. Gwelwyd agregu helaeth ond dros dro pan dynnwyd y wifren denau o'r diferyn hadau crog. Mae hyn yn arwain at y ffaith bod swigod hirgul yn ymwthio allan o'r diferyn, gan efelychu'r chwarren seminaidd. Oherwydd cyfyngiadau 3D ac amseroedd sychu diferu byr, aeth y bloc cyfan i adfeiliad yn gyflym9. Yn yr astudiaeth gyfredol, gan ddefnyddio ieir Sharkashi a sglodion microfluidig, roeddem yn gallu disgrifio sut mae'r twftiau hyn yn ffurfio a sut maent yn symud. Ffurfiodd bwndeli sberm yn syth ar ôl casglu semen a chanfuwyd eu bod yn symud mewn troellog, gan ddangos rheoleg gadarnhaol pan oeddent yn bresennol yn y llif. Ar ben hynny, pan edrychwyd arnynt yn macrosgopig, mae bwndeli sberm wedi'u harsylwi i gynyddu llinoledd symudedd o'i gymharu â spermatozoa ynysig. Mae hyn yn awgrymu y gall clymau sberm ddigwydd cyn treiddiad SST ac nad yw cynhyrchu sberm wedi'i gyfyngu i ardal fach oherwydd straen fel yr awgrymwyd yn flaenorol (Tingari a Lake12). Yn ystod ffurfio tyfftiau, mae'r spermatozoa yn nofio mewn cydamseriad nes eu bod yn ffurfio cyffordd, yna mae eu cynffonau'n lapio o amgylch ei gilydd ac mae pen y spermatozoa yn aros yn rhydd, ond mae cynffon a rhan distal y spermatozoa yn glynu at ei gilydd gyda sylwedd gludiog. Felly, pen rhydd y ligament sy'n gyfrifol am y symudiad, gan lusgo gweddill y ligament. Dangosodd microsgopeg electron sganio o'r bwndeli sberm bennau sberm ynghlwm wedi'u gorchuddio â llawer o ddeunydd gludiog, gan awgrymu bod pennau'r sberm ynghlwm mewn bwndeli gorffwys, a allai fod wedi digwydd ar ôl cyrraedd y safle storio (SST).
Pan fydd sberm wedi'i staenio ag oren acridine, gellir gweld deunydd gludiog allgellog o amgylch y celloedd sberm o dan ficrosgop fflwroleuol. Mae'r sylwedd hwn yn caniatáu i fwndeli sberm lynu wrth unrhyw arwynebau neu ronynnau cyfagos fel nad ydynt yn drifftio gyda'r llif cyfagos. Felly, mae ein harsylwadau'n dangos rôl adlyniad spermatozoa ar ffurf bwndeli symudol. Mae eu gallu i nofio yn erbyn y cerrynt a glynu wrth arwynebau cyfagos yn caniatáu i sberm aros yn hirach yn yr SST.
Defnyddiodd Rothschild25 gamera hemocytometreg i astudio dosbarthiad arnofiol semen gwartheg mewn diferyn o ataliad, gan dynnu ffotomicrograffau trwy gamera gydag echelin optegol fertigol a llorweddol y microsgop. Dangosodd y canlyniadau fod y spermatozoa wedi'u denu at wyneb y siambr. Mae'r awduron yn awgrymu y gallai fod rhyngweithiadau hydrodynamig rhwng y sberm a'r wyneb. Gan ystyried hyn, ynghyd â gallu semen cywion Sharkashi i ffurfio tyfiau gludiog, gall gynyddu'r tebygolrwydd y bydd semen yn glynu wrth wal yr SST ac yn cael ei storio am gyfnodau hir.
Adroddodd Bccetti ac Afzeliu26 fod angen glycocalyx y sberm ar gyfer adnabod ac agglutination gametau. Sylwodd Forman10 fod hydrolysis bondiau α-glycosidig mewn haenau glycoprotein-glycolipid trwy drin semen adar â niwraminidase wedi arwain at ostyngiad mewn ffrwythlondeb heb effeithio ar symudedd sberm. Mae'r awduron yn awgrymu bod effaith niwraminidase ar y glycocalyx yn amharu ar atafaelu sberm wrth y gyffordd rhwng y groth a'r fagina, a thrwy hynny'n lleihau ffrwythlondeb. Ni all eu harsylwadau anwybyddu'r posibilrwydd y gallai triniaeth niwraminidase leihau adnabyddiaeth sberm ac oocytes. Canfu Forman ac Engel10 fod ffrwythlondeb wedi'i leihau pan gafodd ieir eu semenu'n fewnfaginaidd â semen wedi'i drin â niwraminidase. Fodd bynnag, ni effeithiodd IVF gyda sberm wedi'i drin â niwraminidase ar ffrwythlondeb o'i gymharu ag ieir rheoli. Daeth yr awduron i'r casgliad bod newidiadau yn yr haen glycoprotein-glycolipid o amgylch pilen y sberm wedi lleihau gallu sberm i ffrwythloni trwy amharu ar atafaelu sberm wrth y gyffordd rhwng y groth a'r fagina, a oedd yn ei dro yn cynyddu colli sberm oherwydd cyflymder y gyffordd rhwng y groth a'r fagina, ond nid oedd yn effeithio ar adnabyddiaeth sberm ac wyau.
Mewn twrcwn, canfu Bakst a Bauchan 11 fesiglau bach a darnau pilen yn lumen yr SST a sylwi bod rhai o'r gronynnau hyn wedi uno â philen y sberm. Mae'r awduron yn awgrymu y gallai'r perthnasoedd hyn gyfrannu at storio sbermatozoa yn y tymor hir yn SST. Fodd bynnag, ni nododd yr ymchwilwyr ffynhonnell y gronynnau hyn, p'un a ydynt yn cael eu secretu gan gelloedd epithelaidd CCT, yn cael eu cynhyrchu a'u secretu gan y system atgenhedlu gwrywaidd, neu'n cael eu cynhyrchu gan y sberm ei hun. Hefyd, mae'r gronynnau hyn yn gyfrifol am glynu. Adroddodd Grützner et al27 fod celloedd epithelaidd epididymaidd yn cynhyrchu ac yn secretu protein penodol sy'n ofynnol ar gyfer ffurfio llwybrau seminaidd un mandwll. Mae'r awduron hefyd yn adrodd bod gwasgariad y bwndeli hyn yn dibynnu ar ryngweithio proteinau epididymaidd. Canfu Nixon et al28 fod yr adnexa yn secretu protein, yr osteonectin asidig sy'n gyfoethog mewn cystein; mae SPARC yn rhan o ffurfio tyfiau sberm mewn echidnas a platypws pig byr. Mae gwasgariad y trawstiau hyn yn gysylltiedig â cholli'r protein hwn.
Yn yr astudiaeth gyfredol, dangosodd dadansoddiad uwchstrwythurol gan ddefnyddio microsgopeg electron fod y spermatozoa wedi glynu wrth lawer iawn o ddeunydd dwys. Credir bod y sylweddau hyn yn gyfrifol am y glynu sy'n cyddwyso rhwng ac o amgylch y pennau glynu, ond ar grynodiadau is yn rhanbarth y gynffon. Rydym yn tybio bod y sylwedd glynu hwn yn cael ei ysgarthu o'r system atgenhedlu gwrywaidd (epididymis neu vas deferens) ynghyd â semen, gan ein bod yn aml yn gweld semen yn gwahanu oddi wrth lymff a plasma seminaidd yn ystod alldafliad. Adroddwyd, wrth i spermatozoa adar basio trwy'r epididymis a'r vas deferens, eu bod yn mynd trwy newidiadau sy'n gysylltiedig ag aeddfedu sy'n cefnogi eu gallu i rwymo proteinau a chaffael glycoproteinau sy'n gysylltiedig â lemma plasma. Mae parhad y proteinau hyn ar bilenni sberm preswyl yn yr SST yn awgrymu y gallai'r proteinau hyn ddylanwadu ar gaffael sefydlogrwydd pilen sberm 30 a phennu eu ffrwythlondeb 31. Adroddodd Ahammad et al32 fod spermatozoa a gafwyd o wahanol rannau o'r system atgenhedlu gwrywaidd (o'r ceilliau i'r vas deferens distal) wedi dangos cynnydd graddol mewn hyfywedd o dan amodau storio hylif, waeth beth fo'r tymheredd storio, ac mae hyfywedd mewn ieir hefyd yn cynyddu yn y tiwbiau ffalopaidd ar ôl ffrwythloni artiffisial.
Mae gan dympiau sberm cyw iâr Sharkashi nodweddion a swyddogaethau gwahanol i rywogaethau eraill fel echidnas, platypuses, llygod coed, llygod mawr ceirw, a moch cwta. Mewn ieir sharkasi, roedd ffurfio bwndeli sbermatozoa yn lleihau eu cyflymder nofio o'i gymharu â sbermatozoa sengl. Fodd bynnag, cynyddodd y bwndeli hyn ganran y sbermatozoa positif yn rheolegol a chynyddu gallu sbermatozoa i sefydlogi eu hunain mewn amgylchedd deinamig. Felly, mae ein canlyniadau'n cadarnhau'r awgrym blaenorol bod agglutination sberm mewn SST yn gysylltiedig â storio sberm tymor hir. Rydym hefyd yn rhagdybio y gallai tueddiad sberm i ffurfio tympiau reoli cyfradd colli sberm yn SST, a all newid canlyniad cystadleuaeth sberm. Yn ôl y dybiaeth hon, mae sbermatozoa â chapasiti agglutination isel yn rhyddhau SST yn gyntaf, tra bod sbermatozoa â chapasiti agglutination uchel yn cynhyrchu'r rhan fwyaf o'r epil. Mae ffurfio bwndeli sberm mandwll sengl yn fuddiol ac yn effeithio ar y gymhareb rhiant-plentyn, ond mae'n defnyddio mecanwaith gwahanol. Mewn echidnas a platypusiaid, mae'r spermatozoa wedi'u trefnu'n gyfochrog â'i gilydd i gynyddu cyflymder ymlaen y trawst. Mae bwndeli o echidnas yn symud tua thair gwaith yn gyflymach na spermatozoa sengl. Credir bod ffurfio tyfiau sberm o'r fath mewn echidnas yn addasiad esblygiadol i gynnal goruchafiaeth, gan fod benywod yn anllad ac fel arfer yn paru â sawl gwryw. Felly, mae spermatozoa o wahanol alldafliad yn cystadlu'n ffyrnig am ffrwythloni'r wy.
Mae spermatozoa wedi'u glytio o ieir sharkasi yn hawdd i'w delweddu gan ddefnyddio microsgopeg cyferbyniad cyfnod, a ystyrir yn fanteisiol oherwydd ei fod yn caniatáu astudiaeth hawdd o ymddygiad spermatozoa in vitro. Mae'r mecanwaith y mae ffurfio tyfiannau sberm yn hyrwyddo atgenhedlu mewn ieir sharkasi hefyd yn wahanol i'r hyn a welir mewn rhai mamaliaid brych sy'n cynrychioli ymddygiad sberm cydweithredol fel llygod coed, lle mae rhai spermatozoa yn cyrraedd yr wyau, gan helpu unigolion cysylltiedig eraill i gyrraedd a difrodi eu hwyau. i brofi eich hun. ymddygiad anhunanol. Hunan-ffrwythloni 34. Cafwyd enghraifft arall o ymddygiad cydweithredol mewn spermatozoa mewn llygod ceirw, lle'r oedd spermatozoa yn gallu adnabod a chyfuno â'r spermatozoa mwyaf cysylltiedig yn enetig a ffurfio grwpiau cydweithredol i gynyddu eu cyflymder o'i gymharu â spermatozoa digyswllt35.
Nid yw'r canlyniadau a gafwyd yn yr astudiaeth hon yn gwrth-ddweud damcaniaeth Foman o storio sbermatozoa yn y tymor hir mewn SWS. Mae'r ymchwilwyr yn adrodd bod celloedd sberm yn parhau i symud yn llif y celloedd epithelaidd sy'n leinio'r SST am gyfnod estynedig o amser, ac ar ôl cyfnod penodol o amser, mae storfeydd ynni'r celloedd sberm yn cael eu disbyddu, gan arwain at ostyngiad mewn cyflymder, sy'n caniatáu diarddel sylweddau pwysau moleciwlaidd bach. ynni sbermatozoa gyda llif yr hylif o lumen yr SST i geudod y tiwb ffalopaidd. Yn yr astudiaeth gyfredol, gwelsom fod hanner y sberm sengl yn dangos y gallu i nofio yn erbyn hylifau sy'n llifo, a chynyddodd eu glynu yn y bwndel eu gallu i ddangos rheoleg gadarnhaol. Ar ben hynny, mae ein data yn gyson â data Matsuzaki et al. 1 a adroddodd y gallai secretiad lactad cynyddol mewn SST atal symudedd sberm preswyl. Fodd bynnag, mae ein canlyniadau'n disgrifio ffurfio gewynnau symudol sberm a'u hymddygiad rheolegol ym mhresenoldeb amgylchedd deinamig o fewn microsianel mewn ymgais i egluro eu hymddygiad mewn SST. Efallai y bydd ymchwil yn y dyfodol yn canolbwyntio ar bennu cyfansoddiad cemegol a tharddiad yr asiant glynu, a fydd yn ddiamau yn helpu ymchwilwyr i ddatblygu ffyrdd newydd o storio semen hylif a chynyddu hyd ffrwythlondeb.
Dewiswyd pymtheg o sharkasi gwrywaidd gwddf noeth 30 wythnos oed (homosygaidd dominyddol; Na Na) fel rhoddwyr sberm yn yr astudiaeth. Magwyd yr adar ar Fferm Dofednod Ymchwil Cyfadran Amaethyddiaeth, Prifysgol Ashit, Llywodraethiaeth Ashit, yr Aifft. Cafodd yr adar eu lletya mewn cewyll unigol (30 x 40 x 40 cm), eu rhoi dan raglen olau (16 awr o olau ac 8 awr o dywyllwch) a'u bwydo â diet yn cynnwys 160 g o brotein crai, 2800 kcal o egni metaboladwy, 35 g o galsiwm yr un. 5 gram o ffosfforws ar gael fesul cilogram o ddeiet.
Yn ôl data 36, ​​37, casglwyd semen gan wrywod trwy dylino'r abdomen. Casglwyd cyfanswm o 45 o samplau semen gan 15 o ddynion dros 3 diwrnod. Cafodd semen (n = 15/dydd) ei wanhau ar unwaith 1:1 (v:v) gyda Belsville Poultry Semen Diluent, sy'n cynnwys potasiwm difosffad (1.27 g), monohydrad monosodiwm glwtamad (0.867 g), ffrwctos (0.5 d) asetat sodiwm anhydrus (0.43 g), tris(hydroxymethyl)aminomethane (0.195 g), monohydrad potasiwm sitrad (0.064 g), monoffosffad potasiwm (0.065 g), clorid magnesiwm (0.034 g) a H2O (100 ml), pH = 7, 5, osmolaredd 333 mOsm/kg38. Archwiliwyd samplau semen wedi'u gwanhau yn gyntaf o dan ficrosgop golau i sicrhau ansawdd da semen (lleithder) ac yna eu storio mewn baddon dŵr ar 37°C nes eu defnyddio o fewn hanner awr ar ôl eu casglu.
Disgrifir cinemateg a rheoleg spermatozoa gan ddefnyddio system o ddyfeisiau microfluidig. Cafodd samplau semen eu gwanhau ymhellach i 1:40 mewn Beltsville Avian Semen Diluent, eu llwytho i ddyfais microfluidig ​​(gweler isod), a phennwyd paramedrau cinetig gan ddefnyddio system Dadansoddi Semen Cyfrifiadurol (CASA) a ddatblygwyd yn flaenorol ar gyfer nodweddu microfluidig. ar symudedd spermatozoa mewn cyfryngau hylif (Adran Peirianneg Fecanyddol, Cyfadran Peirianneg, Prifysgol Assiut, yr Aifft). Gellir lawrlwytho'r ategyn yn: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39. Mesurwyd cyflymder cromlin (VCL, μm/s), cyflymder llinol (VSL, μm/s) a chyflymder trajectory cyfartalog (VAP, μm/s). Cymerwyd fideos o spermatozoa gan ddefnyddio microsgop cyferbyniad Optika XDS-3 cam gwrthdro (gyda amcan 40x) wedi'i gysylltu â chamera Tucson ISH1000 ar 30 fps am 3 eiliad. Defnyddiwch y feddalwedd CASA i astudio o leiaf dair ardal a 500 o lwybrau sberm fesul sampl. Proseswyd y fideo a recordiwyd gan ddefnyddio CASA cartref. Mae'r diffiniad o symudedd yn yr ategyn CASA yn seiliedig ar gyflymder nofio'r sberm o'i gymharu â'r gyfradd llif, ac nid yw'n cynnwys paramedrau eraill fel symudiad o ochr i ochr, gan y canfuwyd bod hyn yn fwy dibynadwy mewn llif hylif. Disgrifir symudiad rheolegol fel symudiad celloedd sberm yn erbyn cyfeiriad llif yr hylif. Rhannwyd spermatozoa â phriodweddau rheolegol â nifer y spermatozoa symudol; eithriwyd spermatozoa a oedd yn gorffwys a spermatozoa sy'n symud yn gyfnewidiol o'r cyfrif.
Cafwyd yr holl gemegau a ddefnyddiwyd gan Elgomhoria Pharmaceuticals (Cairo, Yr Aifft) oni nodir yn wahanol. Cynhyrchwyd y ddyfais fel y disgrifiwyd gan El-sherry et al. 40 gyda rhai addasiadau. Roedd y deunyddiau a ddefnyddiwyd i gynhyrchu'r microsianeli yn cynnwys platiau gwydr (Howard Glass, Worcester, MA), gwrthydd negyddol SU-8-25 (MicroChem, Newton, CA), alcohol diacetone (Sigma Aldrich, Steinheim, Yr Almaen), a polyacetone. -184, Dow Corning, Midland, Michigan). Cynhyrchir microsianeli gan ddefnyddio lithograffeg feddal. Yn gyntaf, argraffwyd mwgwd wyneb amddiffynnol clir gyda'r dyluniad microsianel a ddymunir ar argraffydd cydraniad uchel (Prismatic, Cairo, Yr Aifft a Pacific Arts and Design, Markham, ON). Gwnaed y meistri gan ddefnyddio platiau gwydr fel swbstradau. Glanhawyd y platiau mewn aseton, isopropanol a dŵr wedi'i ddad-ïoneiddio ac yna eu gorchuddio â haen 20 µm o SU8-25 trwy orchuddio nyddu (3000 rpm, 1 munud). Yna sychwyd yr haenau SU-8 yn ysgafn (65°C, 2 funud a 95°C, 10 munud) a'u hamlygu i ymbelydredd UV am 50 eiliad. Pobwch ar ôl yr amlygiad ar 65°C a 95°C am 1 funud a 4 munud i groesgysylltu'r haenau SU-8 agored, ac yna datblygwch nhw mewn alcohol diacetone am 6.5 munud. Pobwch y wafflau'n galed (200°C am 15 munud) i galedu'r haen SU-8 ymhellach.
Paratowyd PDMS trwy gymysgu'r monomer a'r caledwr mewn cymhareb pwysau o 10:1, yna ei ddadnwyo mewn sychwr gwactod a'i dywallt ar brif ffrâm y SU-8. Cafodd y PDMS ei wella mewn popty (120°C, 30 munud), yna torrwyd y sianeli allan, eu gwahanu oddi wrth y prif ffrâm, a'u tyllu i ganiatáu i diwbiau gael eu cysylltu wrth fewnfa ac allfa'r microsianel. Yn olaf, cafodd microsianel PDMS eu cysylltu'n barhaol â sleidiau microsgop gan ddefnyddio prosesydd corona cludadwy (Electro-Technic Products, Chicago, IL) fel y disgrifiwyd mewn man arall. Mae'r microsianel a ddefnyddiwyd yn yr astudiaeth hon yn mesur 200 µm × 20 µm (L × A) ac mae'n 3.6 cm o hyd.
Cyflawnir y llif hylif a achosir gan bwysau hydrostatig y tu mewn i'r microsianel trwy gynnal lefel yr hylif yn y gronfa fewnfa uwchlaw'r gwahaniaeth uchder Δh39 yn y gronfa allfa (Ffig. 1).
lle mae f yn gyfernod ffrithiant, a ddiffinnir fel f = C/Re ar gyfer llif laminar mewn sianel betryal, lle mae C yn gysonyn sy'n dibynnu ar gymhareb agwedd y sianel, L yw hyd y microsianel, Vav yw'r cyflymder cyfartalog y tu mewn i'r microsianel, Dh yw diamedr hydrolig y sianel, g – cyflymiad disgyrchiant. Gan ddefnyddio'r hafaliad hwn, gellir cyfrifo cyflymder cyfartalog y sianel gan ddefnyddio'r hafaliad canlynol: