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Die Fruchtbarkeit von Vögeln hängt von ihrer Fähigkeit ab, ausreichend lebensfähige Spermien über einen längeren Zeitraum in den Spermienspeicherkanälchen (SST) zu speichern. Der genaue Mechanismus, durch den Spermien in die SST gelangen, dort verbleiben und sie wieder verlassen, ist weiterhin Gegenstand der Forschung. Die Spermien von Sharkasi-Hennen zeigten eine hohe Neigung zur Agglutination und bildeten bewegliche, fadenförmige Bündel mit vielen Zellen. Da es schwierig ist, die Motilität und das Verhalten von Spermien in einem undurchsichtigen Eileiter zu beobachten, verwendeten wir ein mikrofluidisches System mit einem Mikrokanalquerschnitt, der dem der Spermien ähnelt, um die Agglutination und Motilität der Spermien zu untersuchen. Diese Studie erörtert die Bildung und Bewegung der Spermienbündel sowie deren mögliche Rolle bei der Verlängerung der Verweildauer der Spermien in den SST. Wir untersuchten die Geschwindigkeit und das rheologische Verhalten der Spermien, wenn in einem mikrofluidischen Kanal durch hydrostatischen Druck eine Strömung erzeugt wurde (Flussrate = 33 µm/s). Die Spermien schwimmen tendenziell gegen die Strömung (positive Rheologie), und die Geschwindigkeit des Spermienbündels ist im Vergleich zu einzelnen Spermien deutlich reduziert. Es wurde beobachtet, dass sich Spermienbündel spiralförmig bewegen und mit zunehmender Anzahl einzelner Spermien an Länge und Dicke zunehmen. Es wurde beobachtet, dass sich Spermienbündel den Seitenwänden der mikrofluidischen Kanäle näherten und an ihnen anhafteten, um nicht von der Flüssigkeitsströmungsgeschwindigkeit > 33 µm/s mitgerissen zu werden. Es wurde beobachtet, dass sich Spermienbündel den Seitenwänden der mikrofluidischen Kanäle näherten und an ihnen anhafteten, um nicht von der Flüssigkeitsströmungsgeschwindigkeit > 33 µm/s mitgerissen zu werden. Aus diesem Grund werden Spermien-Spermafilme mit vielen Kanälen von Mikrowellensendern verwendet und verwendet, sodass sie mit der Zeit verbunden sind потока жидкости> 33 мкм / с. Es wurde beobachtet, dass sich Spermienbündel den Seitenwänden der mikrofluidischen Kanäle annähern und anhaften, um nicht bei Flüssigkeitsströmungsgeschwindigkeiten >33 µm/s weggespült zu werden.Die Geschwindigkeit beträgt 33 µm/s.33 µm/s beträgt ca. Aus diesem Grund werden Spermien-Spritzpistolen in eine große Anzahl von Mikrokanälen eingebracht und verwendet, sodass sie eine geringe Belastung für die Gesundheit darstellen mit einer Geschwindigkeit von > 33 Millionen Kubikmetern pro Sekunde. Es wurde beobachtet, dass sich Spermienbündel den Seitenwänden des mikrofluidischen Kanals annähern und anhaften, um nicht von der Flüssigkeitsströmung mit einer Geschwindigkeit von >33 µm/s weggespült zu werden.Raster- und Transmissionselektronenmikroskopie zeigten, dass die Spermienbündel von reichlich dichtem Material gestützt wurden. Die gewonnenen Daten belegen die einzigartige Beweglichkeit der Spermien von Sharkazi-Hühnern sowie deren Fähigkeit zur Agglutination und Bildung mobiler Bündel. Dies trägt zu einem besseren Verständnis der Langzeitlagerung von Spermien in SMT bei.
Für eine erfolgreiche Befruchtung bei Menschen und den meisten Tieren müssen Spermien und Eizellen zum richtigen Zeitpunkt am Ort der Befruchtung eintreffen. Daher muss die Paarung vor oder zum Zeitpunkt des Eisprungs erfolgen. Einige Säugetiere, wie Hunde, sowie nicht-säugetierische Arten wie Insekten, Fische, Reptilien und Vögel speichern Spermien hingegen über einen längeren Zeitraum in ihren Fortpflanzungsorganen, bis die Eizellen befruchtungsbereit sind (asynchrone Befruchtung¹). Vögel können die Lebensfähigkeit befruchtungsfähiger Spermien für 2–10 Wochen aufrechterhalten².
Dies ist ein einzigartiges Merkmal, das Vögel von anderen Tieren unterscheidet, da es eine hohe Wahrscheinlichkeit der Befruchtung nach einer einzigen Besamung über mehrere Wochen hinweg ermöglicht, ohne dass es zu gleichzeitiger Paarung und Eisprung kommt. Das Hauptspeicherorgan für Spermien, der sogenannte Spermienspeichertubulus (SST), befindet sich in den inneren Schleimhautfalten am Übergang zwischen Gebärmutter und Vagina. Bislang sind die Mechanismen, durch die Spermien in den Spermienspeicher gelangen, dort verbleiben und ihn wieder verlassen, nicht vollständig erforscht. Basierend auf früheren Studien wurden zahlreiche Hypothesen aufgestellt, von denen jedoch keine bestätigt werden konnte.
Forman4 vermutete, dass Spermien ihren Verbleib in der Spermienscheide durch kontinuierliche oszillatorische Bewegungen entgegen der Strömungsrichtung durch Proteinkanäle auf den Epithelzellen der Spermienscheide aufrechterhalten (Rheologie). Der ATP-Verbrauch ist auf die ständige Geißelaktivität zurückzuführen, die notwendig ist, um die Spermien im Lumen der Spermienscheide zu halten. Die Motilität nimmt schließlich ab, bis die Spermien durch die Strömung aus der Spermienscheide transportiert werden und ihre Reise durch den aufsteigenden Eileiter zur Befruchtung der Eizelle antreten (Forman4). Dieses Modell der Spermienspeicherung wird durch den immunzytochemischen Nachweis von Aquaporinen 2, 3 und 9 in den Epithelzellen der Spermienscheide gestützt. Bislang fehlen Studien zur Rheologie des Hühnerspermas und seiner Rolle bei der Speicherung in der Spermienscheide, der vaginalen Spermienselektion und der Spermienkonkurrenz. Bei Hühnern gelangen die Spermien nach der natürlichen Paarung in die Vagina, jedoch werden mehr als 80 % der Spermien kurz nach der Paarung wieder ausgestoßen. Dies deutet darauf hin, dass die Vagina der primäre Ort der Spermienselektion bei Vögeln ist. Zudem wurde berichtet, dass weniger als 1 % der in der Vagina befruchteten Spermien in den SSTs enden. Bei der künstlichen Besamung von Küken in die Vagina steigt die Anzahl der Spermien, die die SSTs erreichen, tendenziell 24 Stunden nach der Besamung an. Der Mechanismus der Spermienselektion während dieses Prozesses ist bisher unklar, und die Spermienmotilität könnte eine wichtige Rolle bei der Spermienaufnahme in die SSTs spielen. Aufgrund der dicken und undurchsichtigen Wände der Eileiter ist es schwierig, die Spermienmotilität in den Eileitern von Vögeln direkt zu beobachten. Daher fehlen uns grundlegende Kenntnisse darüber, wie Spermien nach der Befruchtung in die SSTs gelangen.
Die Rheologie wurde kürzlich als wichtiger Faktor für den Spermientransport in den Säugetiergenitalien erkannt. Basierend auf der Fähigkeit beweglicher Spermien zur Gegenstrommigration nutzten Zaferani et al.⁸ ein Corra-Mikrofluidiksystem zur passiven Isolierung beweglicher Spermien aus gesammelten Samenproben. Diese Art der Samensortierung ist für die medizinische Unfruchtbarkeitsbehandlung und die klinische Forschung unerlässlich und wird traditionellen Methoden vorgezogen, die zeit- und arbeitsaufwändig sind und die Spermienmorphologie und -struktur beeinträchtigen können. Bislang wurden jedoch keine Studien zum Einfluss von Sekreten aus den Geschlechtsorganen von Hühnern auf die Spermienmotilität durchgeführt.
Ungeachtet des Mechanismus, der die im Spermienspeicher (SST) gespeicherten Spermien aufrechterhält, haben zahlreiche Forscher beobachtet, dass sich die Spermien im SST von Hühnern^9,10, Wachteln² und Puten¹¹ zu verklumpten Spermienbündeln zusammenlagern. Die Autoren vermuten einen Zusammenhang zwischen dieser Verklumpung und der Langzeitspeicherung von Spermien im SST.
Tingari und Lake¹² berichteten über eine starke Assoziation zwischen Spermien in der Spermienaufnahmedrüse des Huhns und stellten die Frage, ob Vogelspermien auf die gleiche Weise agglutinieren wie Säugetierspermien. Sie vermuten, dass die tiefen Verbindungen zwischen den Spermien im Samenleiter auf den Stress zurückzuführen sind, der durch die hohe Spermiendichte auf engstem Raum entsteht.
Bei der Untersuchung des Verhaltens von Spermien auf frischen, hängenden Objektträgern zeigten sich vorübergehende Anzeichen von Verklumpung, insbesondere an den Rändern der Samentröpfchen. Die Verklumpung wurde jedoch häufig durch die mit der kontinuierlichen Bewegung einhergehende Rotation gestört, was die vorübergehende Natur dieses Phänomens erklärt. Die Forscher beobachteten außerdem, dass nach Zugabe des Verdünnungsmittels zum Sperma längliche, fadenförmige Zellaggregate auftraten.
Frühe Versuche, ein Spermium nachzubilden, wurden unternommen, indem ein dünner Draht aus einem hängenden Tropfen entfernt wurde. Dadurch ragte ein längliches, spermienähnliches Vesikel aus dem Samentropfen heraus. Die Spermien ordneten sich sofort parallel innerhalb des Vesikels an, doch die gesamte Einheit verschwand aufgrund der dreidimensionalen Begrenzung schnell wieder. Um die Agglutination von Spermien zu untersuchen, ist es daher notwendig, die Motilität und das Verhalten von Spermien direkt in isolierten Spermienspeicherkanälchen zu beobachten, was schwierig zu realisieren ist. Daher ist die Entwicklung eines Instruments erforderlich, das Spermien nachbildet, um Studien zur Spermienmotilität und zum Agglutinationsverhalten zu unterstützen. Brillard et al.¹³ berichteten, dass die durchschnittliche Länge der Spermienspeicherkanälchen bei adulten Hühnern 400–600 µm beträgt, einige jedoch bis zu 2000 µm lang sein können. Mero und Ogasawara¹⁴ unterteilten die Samendrüsen in vergrößerte und nicht vergrößerte Spermienspeicherkanälchen. Beide waren gleich lang (~500 µm) und hatten die gleiche Halsweite (~38 µm), der mittlere Lumendurchmesser betrug jedoch 56,6 µm bzw. 11,2 µm. In der vorliegenden Studie verwendeten wir ein mikrofluidisches Gerät mit einem Kanalquerschnitt von 200 µm × 20 µm (B × H), der dem des vergrößerten Spermienspeicherkanälchens (SST) recht nahe kommt. Zusätzlich untersuchten wir die Spermienmotilität und das Agglutinationsverhalten in strömender Flüssigkeit. Dies steht im Einklang mit Foremans Hypothese, dass die von den Epithelzellen des SST produzierte Flüssigkeit die Spermien im Lumen in Gegenstromrichtung (rheologischer Richtung) hält.
Ziel dieser Studie war es, die Probleme bei der Beobachtung der Spermienmotilität im Eileiter zu überwinden und die Schwierigkeiten bei der Untersuchung der Rheologie und des Verhaltens von Spermien in einer dynamischen Umgebung zu umgehen. Dazu wurde ein mikrofluidisches Gerät verwendet, das hydrostatischen Druck erzeugt, um die Spermienmotilität in den Geschlechtsorganen eines Huhns zu simulieren.
Beim Einbringen eines Tropfens einer verdünnten Spermienprobe (1:40) in das Mikrokanalgerät konnten zwei Arten der Spermienmotilität identifiziert werden (isolierte und gebundene Spermien). Darüber hinaus schwammen die Spermien tendenziell gegen die Strömung (positive Rheologie; Video 1, 2). Obwohl Spermienbündel eine geringere Geschwindigkeit aufwiesen als einzelne Spermien (p < 0,001), erhöhten sie den Prozentsatz der Spermien, die eine positive Rheotaxis zeigten (p < 0,001; Tabelle 2). Obwohl Spermienbündel eine geringere Geschwindigkeit aufwiesen als einzelne Spermien (p < 0,001), erhöhten sie den Prozentsatz der Spermien, die eine positive Rheotaxis zeigten (p < 0,001; Tabelle 2). Bei den Spermienproben handelt es sich um mehr als nur eine geringe Anzahl von Spermien, die aus einer Reihe von Spermien hervorgegangen sind (p < 0,001). demonstrieren Polyreotaktik (p < 0,001; Tabelle 2). Obwohl die Spermienbündel eine geringere Geschwindigkeit aufwiesen als einzelne Spermien (p < 0,001), erhöhten sie den Prozentsatz der Spermien, die eine positive Rheotaxis zeigten (p < 0,001; Tabelle 2).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度（p < 0,001）, 但它们增加了显示阳性流变性的精子百分比（p < 0,001；表2）。尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 （p <0,001）, 但 增加 了 显示 阳性 流变性 精子百分比 （p <0,001 ； 2。。。。。））））） Die Untersuchung von Spermienproben war nicht sehr gut, da sie nur wenige Spermien (p < 0,001) enthielten und nur wenige Spermien auf der Grundlage der Analyse ergaben реологией (p < 0,001; Tabelle 2). Obwohl die Geschwindigkeit der Spermienbündel geringer war als die einzelner Spermien (p < 0,001), erhöhten sie den Prozentsatz der Spermien mit positiver Rheologie (p < 0,001; Tabelle 2).Die positive Rheologie für einzelne Spermien und Spermienbüschel wird auf etwa 53 % bzw. 85 % geschätzt.
Es wurde beobachtet, dass die Spermien von Sharkashi-Hühnern unmittelbar nach der Ejakulation lineare Bündel aus Dutzenden von Einzelspermien bilden. Diese Bündel nehmen mit der Zeit an Länge und Dicke zu und können in vitro mehrere Stunden bestehen bleiben, bevor sie sich auflösen (Video 3). Diese fadenförmigen Bündel ähneln in ihrer Form den Spermien von Ameisenigeln, die sich am Ende des Nebenhodens bilden. Es wurde festgestellt, dass Sharkashi-Hühnersperma eine hohe Neigung zur Agglutination aufweist und innerhalb von weniger als einer Minute nach der Gewinnung ein netzartiges Bündel bildet. Diese Bündel sind dynamisch und können an nahegelegenen Wänden oder statischen Objekten haften bleiben. Obwohl Spermienbündel die Geschwindigkeit der Spermien verringern, ist makroskopisch deutlich erkennbar, dass sie deren Linearität erhöhen. Die Länge der Bündel variiert je nach Anzahl der darin enthaltenen Spermien. Zwei Teile des Bündels wurden isoliert: der Anfangsteil, der den freien Kopf des agglutinierten Spermiums umfasst, und der Endteil, der den Schwanz und das gesamte distale Ende des Spermiums enthält. Mithilfe einer Hochgeschwindigkeitskamera (950 Bilder/s) wurden freie Köpfe agglutinierter Spermien im Anfangsbereich des Bündels beobachtet. Diese Köpfe sind aufgrund ihrer oszillatorischen Bewegung für die Fortbewegung des Bündels verantwortlich und ziehen die übrigen Spermien spiralförmig in das Bündel hinein (Video 4). Bei längeren Büscheln wurde jedoch beobachtet, dass einige freie Spermienköpfe am Körper haften und der Endbereich des Büschels wie Flügel wirkt und so zur Fortbewegung beiträgt.
In einer langsamen Flüssigkeitsströmung bewegen sich die Spermienbündel parallel zueinander. Bei zunehmender Strömungsgeschwindigkeit überlappen sie sich jedoch und haften an allem, was sich nicht bewegt, um nicht von der Strömung weggespült zu werden. Die Bündel bilden sich, wenn sich einige Spermien einander annähern, sich synchron bewegen, umeinander wickeln und dann an einer klebrigen Substanz haften bleiben. Abbildungen 1 und 2 zeigen, wie sich die Spermien annähern und durch das Umschlingen ihrer Schwänze eine Verbindungsstelle bilden.
Die Forscher nutzten hydrostatischen Druck, um in einem Mikrokanal eine Flüssigkeitsströmung zu erzeugen und so die Rheologie von Spermien zu untersuchen. Es wurde ein Mikrokanal mit den Abmessungen 200 µm × 20 µm (Breite × Höhe) und einer Länge von 3,6 µm verwendet. Die Mikrokanäle wurden zwischen Behältern mit an den Enden angebrachten Spritzen platziert. Lebensmittelfarbe diente dazu, die Kanäle besser sichtbar zu machen.
Verbinden Sie die Kabel und Zubehörteile mit einem Phasenkontrastmikroskop. Die Videoaufnahme erfolgte mit einem Phasenkontrastmikroskop. Zu jedem Bild werden Phasenkontrastmikroskopie- und Mapping-Aufnahmen präsentiert. (A) Die Verbindung zwischen zwei Strömen behindert den Fluss aufgrund der spiralförmigen Bewegung (roter Pfeil). (B) Die Verbindung zwischen dem Röhrenbündel und der Kanalwand (rote Pfeile) ist gleichzeitig mit zwei weiteren Bündeln verbunden (gelbe Pfeile). (C) Spermienbündel im mikrofluidischen Kanal beginnen sich miteinander zu verbinden (rote Pfeile) und bilden ein Netzwerk aus Spermienbündeln. (D) Bildung eines Netzwerks aus Spermienbündeln.
Als ein Tropfen verdünntes Sperma in das mikrofluidische Gerät gegeben und eine Strömung erzeugt wurde, bewegte sich der Spermienstrahl entgegen der Strömungsrichtung. Die Bündel schmiegen sich eng an die Wände der Mikrokanäle an, und die freien Köpfe im Anfangsbereich der Bündel liegen ebenfalls eng an ihnen an (Video 5). Sie haften zudem an stationären Partikeln wie Ablagerungen auf ihrem Weg, um nicht von der Strömung weggespült zu werden. Mit der Zeit entwickeln sich diese Bündel zu langen Filamenten, die weitere einzelne Spermien und kürzere Bündel einschließen (Video 6). Sobald die Strömung nachlässt, bilden sich lange Spermienstränge zu einem Netzwerk (Video 7; Abbildung 2).
Bei hohen Strömungsgeschwindigkeiten (V > 33 µm/s) verstärken sich die spiralförmigen Bewegungen der Fäden, da sie versuchen, viele einzelne Spermien einzufangen, die Bündel bilden, die der Driftkraft der Strömung besser widerstehen. Bei hohen Strömungsgeschwindigkeiten (V > 33 µm/s) verstärken sich die spiralförmigen Bewegungen der Fäden, da sie versuchen, viele einzelne Spermien einzufangen, die Bündel bilden, die der Driftkraft der Strömung besser widerstehen. Nach einer bestimmten Zeitspanne (V > 33 m²/s) ist die Wiedergabegeschwindigkeit nicht ausreichend, da nur wenige Geräte verwendet werden können Spermatozoiden, Durch die Verwendung von Stiften wird die Geschwindigkeit des Kabels erhöht. Bei hohen Strömungsgeschwindigkeiten (V > 33 µm/s) nehmen die spiralförmigen Bewegungen der Stränge zu, da sie versuchen, viele einzelne Spermien einzufangen und Bündel zu bilden, die der Driftkraft der Strömung besser widerstehen können.在高流速(V > 33 µm/s)时,螺纹的螺旋运动增加,以试图捕捉许多形成束的单个精子,从而更好地抵抗流动的漂移力.在 高 流速 (v> 33 µm/s) 时, 的 螺旋 运动 增加, 以 试图 许多 形成 束 单 个 精子, 从而 更 地抵抗 的 漂移力。。。。。。。。。。 Bei einer Aufnahmegeschwindigkeit (V > 33 m²/s) wird eine spiralförmige Bewegung durchgeführt, bevor mehrere andere Spermien entfernt werden. образующих пучки, чтобы лучше опротивляться силам дрейфа потока. Bei hohen Strömungsgeschwindigkeiten (V > 33 µm/s) verstärkt sich die spiralförmige Bewegung der Filamente, um möglichst viele einzelne Spermien einzufangen, die sich zu Bündeln zusammenschließen, um den Driftkräften der Strömung besser widerstehen zu können.Sie versuchten außerdem, Mikrokanäle an den Seitenwänden anzubringen.
Spermienbündel wurden mittels Lichtmikroskopie (LM) als Ansammlungen von Spermienköpfen und gekrümmten Schwänzen identifiziert. Spermienbündel mit verschiedenen Aggregaten wurden auch als verdrehte Köpfe und Flagellenaggregate, mehrfach fusionierte Spermienschwänze, an einem Schwanz anhaftende Spermienköpfe sowie Spermienköpfe mit gebogenen Kernen als mehrfach fusionierte Kerne identifiziert. Die Rasterelektronenmikroskopie (REM) zeigte, dass die Spermienbündel von Spermienköpfen umhüllte Aggregate bildeten, die wiederum ein Netzwerk aus umwickelten Schwänzen aufwiesen.
Die Morphologie und Ultrastruktur der Spermien sowie die Bildung von Spermienbündeln wurden mittels Lichtmikroskopie (Halbschnitt), Rasterelektronenmikroskopie (REM) und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) untersucht. Spermienabstriche wurden mit Acridinorange gefärbt und mittels Epifluoreszenzmikroskopie untersucht.
Die Färbung des Spermienausstrichs mit Acridinorange (Abb. 3B) zeigte, dass die Spermienköpfe verklebt und mit Sekretmaterial bedeckt waren, was zur Bildung großer Büschel führte (Abb. 3D). Die Spermienbündel bestanden aus Spermienaggregaten mit einem Netzwerk anhaftender Schwänze (Abb. 4A–C). Die Spermienbündel setzten sich aus den Schwänzen vieler verklebter Spermien zusammen (Abb. 4D). Sekrete (Abb. 4E,F) bedeckten die Köpfe der Spermienbündel.
Bildung des Spermienbündels: Mithilfe von Phasenkontrastmikroskopie und mit Acridinorange gefärbten Spermienpräparaten konnte gezeigt werden, dass die Spermienköpfe aneinanderhaften. (A) Die frühe Bildung eines Spermienbündels beginnt mit einem Spermium (weißer Kreis) und drei Spermien (gelber Kreis). Die Spirale beginnt am Schwanz und endet am Kopf. (B) Lichtmikroskopische Aufnahme eines mit Acridinorange gefärbten Spermienpräparats mit anhaftenden Spermienköpfen (Pfeile). Die Sekretion bedeckt den/die Kopf/Köpfe. Vergrößerung: × 1000. (C) Entwicklung eines großen, durch Strömung in einem mikrofluidischen Kanal transportierten Strahls (Aufnahme mit einer Hochgeschwindigkeitskamera bei 950 Bildern pro Sekunde). (D) Lichtmikroskopische Aufnahme eines mit Acridinorange gefärbten Spermienpräparats mit großen Bündeln (Pfeile). Vergrößerung: × 200.
Rasterelektronenmikroskopische Aufnahme eines Spermienbündels und eines mit Acridinorange gefärbten Spermienausstrichs. (A, B, D, E) sind digitale Farb-Rasterelektronenmikroskopaufnahmen von Spermien, C und F zeigen Aufnahmen von mit Acridinorange gefärbten Spermienausstrichen, die die Anhaftung mehrerer Spermien an das Schwanznetz darstellen. (AC) Spermienaggregate sind als Netzwerk anhaftender Schwänze (Pfeile) zu sehen. (D) Adhäsion mehrerer Spermien (mit Haftsubstanz, rosa Umrandung, Pfeil), die sich um den Schwanz winden. (E und F) Spermienkopfaggregate (Zeiger) sind mit Haftsubstanz bedeckt (Zeiger). Die Spermien bildeten Bündel mit mehreren wirbelartigen Strukturen (F). (C) 400-fache und (F) 200-fache Vergrößerung.
Mithilfe der Transmissionselektronenmikroskopie stellten wir fest, dass Spermienbündel entweder einen anhaftenden Schwanz (Abb. 6A, C), einen anhaftenden Kopf (Abb. 6B) oder einen anhaftenden Kopf (Abb. 6D) aufwiesen. Die Köpfe der Spermien im Bündel waren gekrümmt und zeigten im Schnitt zwei Kernregionen (Abb. 6D). Im Inzisionsbündel besaßen die Spermien einen verdrehten Kopf mit zwei Kernregionen und mehreren Geißelregionen (Abb. 5A).
Digitale Farbelektronenmikroskopie-Aufnahme der verbundenen Spermienschwänze im Spermienbündel und des die Spermienköpfe verbindenden Agglutinationsmaterials. (A) Anhaftender Schwanz einer großen Anzahl von Spermien. Beachten Sie, wie der Schwanz in Hoch- (Pfeil) und Querprojektion (Pfeil) aussieht. (B) Der Kopf (Pfeil) des Spermiums ist mit dem Schwanz (Pfeil) verbunden. (C) Mehrere Spermienschwänze (Pfeile) sind miteinander verbunden. (D) Agglutinationsmaterial (AS, blau) verbindet vier Spermienköpfe (lila).
Mithilfe der Rasterelektronenmikroskopie konnten Spermienköpfe in von Sekreten oder Membranen bedeckten Spermienbündeln nachgewiesen werden (Abb. 6B). Dies deutet darauf hin, dass die Spermienbündel durch extrazelluläres Material verankert sind. Das agglutinierte Material konzentrierte sich im Spermienkopf (quallenkopfartige Struktur; Abb. 5B) und dehnte sich distal aus. Nach Färbung mit Acridinorange erschien es unter dem Fluoreszenzmikroskop leuchtend gelb (Abb. 6C). Diese Substanz ist im Rasterelektronenmikroskop deutlich sichtbar und wird als Bindemittel betrachtet. Semidünne Schnitte (Abb. 5C) und mit Acridinorange gefärbte Spermienausstriche zeigten Spermienbündel mit dicht gepackten Köpfen und gekrümmten Schwänzen (Abb. 5D).
Verschiedene Mikrofotografien zeigen die Aggregation von Spermienköpfen und gefalteten Schwänzen, aufgenommen mit unterschiedlichen Methoden. (A) Querschnitts-Transmissionselektronenmikroskopie eines Spermienbündels mit einem aufgerollten Spermienkopf, der einen zweigeteilten Kern (blau) und mehrere Geißelteile (grün) aufweist. (B) Rasterelektronenmikroskopie mit Farbdarstellung eines Clusters quallenartiger Spermienköpfe (Pfeile), die bedeckt zu sein scheinen. (C) Semidünnschnitt mit aggregierten Spermienköpfen (Pfeile) und gekrümmten Schwänzen (Pfeile). (D) Mikrofotografie eines mit Acridinorange gefärbten Spermienausstrichs mit Aggregaten von Spermienköpfen (Pfeile) und anhaftenden, gekrümmten Schwänzen (Pfeile). Beachten Sie, dass eine klebrige Substanz (S) den Spermienkopf bedeckt. (D) 1000-fache Vergrößerung.
Mithilfe der Transmissionselektronenmikroskopie (Abb. 7A) wurde außerdem festgestellt, dass die Spermienköpfe verdreht waren und die Kerne eine Spiralform aufwiesen, was durch mit Acridinorange gefärbte und mittels Fluoreszenzmikroskopie untersuchte Spermienabstriche bestätigt wurde (Abb. 7B).
(A) Digitale Farb-Transmissionselektronenmikroskopieaufnahme und (B) mit Acridinorange gefärbter Spermienausstrich, der die aufgerollten Köpfe und die Verbindung von Spermienköpfen und -schwänzen (Pfeile) zeigt. (B) × 1000-fache Vergrößerung.
Ein interessanter Befund ist, dass sich die Spermien von Sharkazi zu beweglichen, fadenförmigen Bündeln zusammenlagern. Die Eigenschaften dieser Bündel ermöglichen es uns, ihre mögliche Rolle bei der Aufnahme und Speicherung von Spermien im SST zu verstehen.
Nach der Paarung gelangen die Spermien in die Vagina und durchlaufen einen intensiven Selektionsprozess, wodurch nur eine begrenzte Anzahl von Spermien in den Samenleiter (SST) gelangt.^15,16 Die Mechanismen, durch die Spermien in den Samenleiter gelangen und ihn wieder verlassen, sind bisher unklar. Bei Geflügel werden Spermien je nach Art für einen Zeitraum von 2 bis 10 Wochen im Samenleiter gespeichert.⁶ Der Zustand des Samens während dieser Zeit ist weiterhin umstritten. Sind die Spermien in Bewegung oder ruhen sie? Anders gefragt: Wie können die Spermien ihre Position im Samenleiter so lange beibehalten?
Forman⁴ schlug vor, dass Verweildauer und Ausstoß von Spermien im SST durch die Spermienmotilität erklärt werden könnten. Die Autoren vermuten, dass Spermien ihre Position halten, indem sie gegen die durch das SST-Epithel erzeugte Flüssigkeitsströmung schwimmen, und dass sie aus dem SST ausgestoßen werden, sobald ihre Geschwindigkeit unter den Punkt sinkt, an dem sie sich aufgrund von Energiemangel rückwärts bewegen. Zaniboni⁵ bestätigte das Vorhandensein von Aquaporinen 2, 3 und 9 im apikalen Bereich der SST-Epithelzellen, was Formans Modell der Spermienspeicherung indirekt stützen könnte. In der vorliegenden Studie fanden wir, dass fast die Hälfte der Sharkashi-Spermien in der strömenden Flüssigkeit eine positive Rheologie aufweisen und dass agglutinierte Spermienbündel die Anzahl der Spermien mit positiver Rheologie erhöhen, obwohl die Agglutination sie verlangsamt. Wie die Spermien durch den Eileiter des Vogels zum Ort der Befruchtung gelangen, ist noch nicht vollständig geklärt. Bei Säugetieren werden Spermien durch die Follikelflüssigkeit chemoattraktiv angelockt. Es wird jedoch angenommen, dass Chemoattraktanten Spermien dazu anregen, größere Entfernungen zurückzulegen⁷. Daher sind andere Mechanismen für den Spermientransport verantwortlich. Die Fähigkeit der Spermien, sich zu orientieren und gegen die nach der Paarung freigesetzte Flüssigkeit aus den Eileitern zu fließen, gilt bei Mäusen als wichtiger Faktor für die gezielte Spermienwanderung. Parker¹⁷ vermutete, dass Spermien bei Vögeln und Reptilien die Eileiter durch Schwimmen gegen die Flimmerströmung passieren. Obwohl dies bei Vögeln noch nicht experimentell nachgewiesen wurde, fand Adolphi¹⁸ als Erster heraus, dass Vogelspermien positive Ergebnisse liefern, wenn mit einem Filterpapierstreifen eine dünne Flüssigkeitsschicht zwischen Deckglas und Objektträger erzeugt wird. Rheologie: Hino und Yanagimachi¹⁹ platzierten einen Maus-Ovar-Tuben-Uterus-Komplex in einen Perfusionsring und injizierten 1 µl Tinte in den Isthmus, um den Flüssigkeitsfluss in den Eileitern sichtbar zu machen. Sie beobachteten eine sehr aktive Kontraktion und Entspannung im Eileiter, bei der sich alle Tintenkügelchen stetig in Richtung der Ampulle bewegten. Die Autoren betonen die Bedeutung des Flüssigkeitsflusses im Eileiter von den unteren zu den oberen Abschnitten für den Spermientransport und die Befruchtung. Brillard²⁰ berichtete, dass Spermien bei Hühnern und Puten aktiv vom Scheideneingang, wo sie gespeichert werden, zur uterovaginalen Verbindung wandern, wo sie ebenfalls gespeichert werden. Diese Bewegung ist jedoch zwischen der uterovaginalen Verbindung und dem Infundibulum nicht erforderlich, da die Spermien dort passiv transportiert werden. Angesichts dieser früheren Empfehlungen und der Ergebnisse der vorliegenden Studie kann angenommen werden, dass die Fähigkeit der Spermien zur aufsteigenden Bewegung (Rheologie) eine der Eigenschaften ist, auf denen der Selektionsprozess basiert. Dies bestimmt den Durchtritt der Spermien durch die Scheide und ihren Eintritt in den Sammelkanal (CCT) zur Speicherung. Wie Forman4 bereits angedeutet hat, könnte dies auch den Prozess erleichtern, dass Spermien für eine gewisse Zeit in den SST und seinen Lebensraum eindringen und ihn dann wieder verlassen, wenn sich ihre Geschwindigkeit verlangsamt.
Matsuzaki und Sasanami²¹ schlugen hingegen vor, dass Vogelspermien im männlichen und weiblichen Fortpflanzungstrakt einen Übergang von der Ruhephase zur aktiven Beweglichkeit durchlaufen. Die Hemmung der Spermienmotilität im Speicheldrüsengang (SST) wurde als Erklärung für die lange Speicherdauer der Spermien und deren anschließende Regeneration nach Verlassen des SST vorgeschlagen. Unter hypoxischen Bedingungen berichteten Matsuzaki et al.¹ von einer erhöhten Produktion und Freisetzung von Laktat im SST, was zur Hemmung der Spermienmotilität führen kann. In diesem Fall liegt die Bedeutung der Spermienrheologie in der Selektion und Absorption der Spermien, nicht aber in ihrer Speicherung.
Das Spermienagglutinationsmuster gilt als plausible Erklärung für die lange Verweildauer von Spermien im Sulcus sphenopalatinus (SST), da dies ein häufiges Muster der Spermienretention bei Geflügel ist^2,22,23. Bakst et al.² beobachteten, dass die meisten Spermien aneinanderhafteten und faszikuläre Aggregate bildeten, während einzelne Spermien im CCM von Wachteln selten vorkamen. Wen et al.²⁴ hingegen beobachteten bei Hühnern mehr verstreute Spermien und weniger Spermienbüschel im SST-Lumen. Basierend auf diesen Beobachtungen kann angenommen werden, dass die Neigung zur Spermienagglutination zwischen verschiedenen Vögeln und zwischen Spermien im selben Ejakulat variiert. Van Krey et al.⁹ vermuteten zudem, dass die zufällige Dissoziation agglutinierter Spermien für das allmähliche Eindringen der Spermien in das Lumen des Eileiters verantwortlich ist. Gemäß dieser Hypothese sollten Spermien mit geringerer Agglutinationsfähigkeit zuerst aus dem Spermien-Sexualtrakt ausgestoßen werden. In diesem Zusammenhang könnte die Agglutinationsfähigkeit der Spermien ein Faktor sein, der den Ausgang der Spermienkonkurrenz bei verschmutzten Vögeln beeinflusst. Zudem gilt: Je länger die agglutinierten Spermien dissoziieren, desto länger bleibt die Fruchtbarkeit erhalten.
Obwohl die Aggregation von Spermien und deren Bündelung in mehreren Studien beobachtet wurde^2,22,24, konnte sie aufgrund der komplexen kinematischen Beobachtung im Rahmen der Samenstromanalyse (SST) nicht detailliert beschrieben werden. Es wurden mehrere Versuche unternommen, die Spermienagglutination in vitro zu untersuchen. Eine ausgeprägte, aber vorübergehende Aggregation wurde beobachtet, als der dünne Draht vom hängenden Samentropfen entfernt wurde. Dies führte dazu, dass eine längliche Blase aus dem Tropfen herausragte und die Samendrüse imitierte. Aufgrund von Einschränkungen der 3D-Darstellung und kurzen Trocknungszeiten zerfiel der gesamte Block schnell⁹. In der vorliegenden Studie konnten wir mithilfe von Sharkashi-Hühnern und mikrofluidischen Chips beschreiben, wie sich diese Bündel bilden und wie sie sich bewegen. Spermienbündel bildeten sich unmittelbar nach der Samengewinnung und bewegten sich spiralförmig. Sie zeigten positive rheologische Eigenschaften, wenn sie in der Strömung vorhanden waren. Darüber hinaus wurde makroskopisch beobachtet, dass Spermienbündel die Linearität der Motilität im Vergleich zu isolierten Spermien erhöhten. Dies deutet darauf hin, dass die Spermienagglutination bereits vor dem Eindringen in den Speicherort (SST) stattfinden kann und die Spermienproduktion nicht, wie zuvor angenommen (Tingari und Lake12), stressbedingt auf einen kleinen Bereich beschränkt ist. Während der Bündelbildung schwimmen die Spermien synchron, bis sie sich verbinden. Dann umschlingen sich ihre Schwänze, während der Spermienkopf frei bleibt. Schwanz und distaler Teil des Spermiums haften jedoch durch eine klebrige Substanz aneinander. Der freie Kopf des Ligaments ist somit für die Bewegung verantwortlich und zieht den Rest des Ligaments mit. Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen der Spermienbündel zeigten anhaftende Spermienköpfe, die mit reichlich klebrigem Material bedeckt waren. Dies legt nahe, dass die Spermienköpfe in ruhenden Bündeln zusammengebunden waren, was möglicherweise nach Erreichen des Speicherorts (SST) geschah.
Färbt man einen Spermienabstrich mit Acridinorange, so ist unter dem Fluoreszenzmikroskop extrazelluläres Adhäsionsmaterial um die Spermienzellen sichtbar. Diese Substanz ermöglicht es den Spermienbündeln, an umgebenden Oberflächen oder Partikeln zu haften und sich so an diese anzuheften, sodass sie nicht mit der Strömung abdriften. Unsere Beobachtungen zeigen somit die Bedeutung der Spermienadhäsion in Form mobiler Bündel. Durch ihre Fähigkeit, gegen die Strömung zu schwimmen und an nahegelegenen Oberflächen zu haften, verweilen die Spermien länger im Oberflächenwasser.
Rothschild25 untersuchte mithilfe einer Hämozytometrie-Kamera die Verteilung von Rindersperma in einem Tropfen Suspension. Dazu fertigte er Mikrofotografien mit einer Kamera an, deren optische Achse sowohl vertikal als auch horizontal ausgerichtet war. Die Ergebnisse zeigten, dass die Spermien von der Oberfläche der Kammer angezogen wurden. Die Autoren vermuten hydrodynamische Wechselwirkungen zwischen den Spermien und der Oberfläche. In Anbetracht dessen und der Fähigkeit von Sharkashi-Hühnersperma, klebrige Klumpen zu bilden, könnte dies die Wahrscheinlichkeit erhöhen, dass Sperma an der Wand der SST-Kammer haftet und über längere Zeiträume gelagert werden kann.
Bccetti und Afzeliu²⁶ berichteten, dass die Spermien-Glykokalyx für die Gametenerkennung und -agglutination erforderlich ist. Forman¹⁰ beobachtete, dass die Hydrolyse von α-glykosidischen Bindungen in Glykoprotein-Glykolipid-Beschichtungen durch die Behandlung von Vogelsperma mit Neuraminidase zu einer verminderten Fruchtbarkeit führte, ohne die Spermienmotilität zu beeinträchtigen. Die Autoren vermuten, dass die Wirkung von Neuraminidase auf die Glykokalyx die Spermien-Sequestrierung am Übergang zwischen Uterus und Vagina beeinträchtigt und dadurch die Fruchtbarkeit reduziert. Ihre Beobachtungen schließen jedoch nicht aus, dass die Neuraminidase-Behandlung auch die Erkennung von Spermien und Oozyten verringern kann. Forman und Engel¹⁰ stellten fest, dass die Fruchtbarkeit von Hennen nach intravaginaler Besamung mit Neuraminidase-behandeltem Sperma reduziert war. Die In-vitro-Fertilisation (IVF) mit Neuraminidase-behandeltem Sperma hatte jedoch im Vergleich zu Kontrollhühnern keinen Einfluss auf die Fruchtbarkeit. Die Autoren kamen zu dem Schluss, dass Veränderungen der Glykoprotein-Glykolipid-Beschichtung um die Spermienmembran die Befruchtungsfähigkeit der Spermien verringern, indem sie die Sequestrierung der Spermien am Übergang zwischen Gebärmutter und Vagina beeinträchtigen, was wiederum den Spermienverlust aufgrund der Geschwindigkeit des Übergangs zwischen Gebärmutter und Vagina erhöht, die Erkennung von Spermien und Eizellen jedoch nicht beeinflusst.
Bakst und Bauchan¹¹ fanden bei Puten kleine Vesikel und Membranfragmente im Lumen des Samenleiters und beobachteten, dass einige dieser Granula mit der Spermienmembran fusioniert waren. Die Autoren vermuten, dass diese Zusammenhänge zur Langzeitspeicherung von Spermien im Samenleiter beitragen könnten. Die Forscher spezifizierten jedoch nicht die Quelle dieser Partikel – ob sie von Epithelzellen des Hodensackkanals sezerniert, vom männlichen Fortpflanzungssystem produziert und sezerniert oder von den Spermien selbst gebildet werden. Diese Partikel sind außerdem für die Agglutination verantwortlich. Grützner et al.²⁷ berichteten, dass Epithelzellen des Nebenhodens ein spezifisches Protein produzieren und sezernieren, das für die Bildung von Samenleitern mit einer einzigen Pore erforderlich ist. Die Autoren berichten auch, dass die Dispersion dieser Bündel von der Interaktion von Nebenhodenproteinen abhängt. Nixon et al.²⁸ fanden heraus, dass die Adnexe ein Protein sezernieren, das saure, cysteinreiche Osteonektin. SPARC ist an der Bildung von Spermienbüscheln bei Kurzschnabeligeln und Schnabeltieren beteiligt. Die Streuung dieser Strahlen ist mit dem Verlust dieses Proteins verbunden.
In der vorliegenden Studie zeigte die Ultrastrukturanalyse mittels Elektronenmikroskopie, dass die Spermien an einer großen Menge dichten Materials anhafteten. Diese Substanzen sind vermutlich für die Agglutination verantwortlich, die sich zwischen und um die anhaftenden Köpfe herum bildet, jedoch in geringerer Konzentration im Schwanzbereich. Wir nehmen an, dass diese agglutinierende Substanz zusammen mit dem Sperma aus dem männlichen Fortpflanzungssystem (Nebenhoden oder Samenleiter) ausgeschieden wird, da wir häufig eine Trennung des Spermas von Lymphe und Samenplasma während der Ejakulation beobachten. Es wurde berichtet, dass Vogelspermien beim Durchgang durch Nebenhoden und Samenleiter Reifungsprozesse durchlaufen, die ihre Fähigkeit zur Proteinbindung und zur Aufnahme von Plasmamembran-assoziierten Glykoproteinen fördern. Die Persistenz dieser Proteine ​​auf den residenten Spermienmembranen im SST deutet darauf hin, dass diese Proteine ​​die Stabilität der Spermienmembran beeinflussen³⁰ und deren Fertilität bestimmen könnten³¹. Ahammad et al.32 berichteten, dass Spermien, die aus verschiedenen Teilen des männlichen Fortpflanzungssystems (von den Hoden bis zum distalen Samenleiter) gewonnen wurden, unter flüssigen Lagerbedingungen unabhängig von der Lagertemperatur eine progressive Zunahme der Lebensfähigkeit zeigten und dass die Lebensfähigkeit bei Hühnern auch in den Eileitern nach künstlicher Besamung zunimmt.
Die Spermienbündel von Sharkashi-Hühnern unterscheiden sich in ihren Eigenschaften und Funktionen von denen anderer Arten wie Ameisenigel, Schnabeltiere, Waldmäuse, Hirschratten und Meerschweinchen. Bei Sharkashi-Hühnern verringert die Bildung von Spermienbündeln deren Schwimmgeschwindigkeit im Vergleich zu einzelnen Spermien. Diese Bündel erhöhen jedoch den Anteil rheologisch positiver Spermien und verbessern deren Fähigkeit, sich in einer dynamischen Umgebung zu stabilisieren. Unsere Ergebnisse bestätigen somit die frühere Annahme, dass die Spermienagglutination in Spermienspeicherflüssigkeit (SST) mit der langfristigen Spermienspeicherung zusammenhängt. Wir vermuten außerdem, dass die Neigung der Spermien zur Bündelbildung die Spermienverlustrate in SST reguliert und dadurch den Ausgang der Spermienkonkurrenz beeinflusst. Dieser Annahme zufolge werden Spermien mit geringer Agglutinationsfähigkeit zuerst in SST freigesetzt, während Spermien mit hoher Agglutinationsfähigkeit den Großteil der Nachkommen produzieren. Die Bildung von Spermienbündeln mit einer einzigen Pore ist vorteilhaft und beeinflusst das Eltern-Kind-Verhältnis, beruht aber auf einem anderen Mechanismus. Bei Ameisenigeln und Schnabeltieren sind die Spermien parallel zueinander angeordnet, um die Vorwärtsgeschwindigkeit des Samenstrahls zu erhöhen. Spermienbündel bei Ameisenigeln bewegen sich etwa dreimal schneller als einzelne Spermien. Man geht davon aus, dass die Bildung solcher Spermienbüschel bei Ameisenigeln eine evolutionäre Anpassung zur Aufrechterhaltung der Dominanz darstellt, da Weibchen promiskuitiv sind und sich üblicherweise mit mehreren Männchen paaren. Daher konkurrieren Spermien aus verschiedenen Ejakulaten heftig um die Befruchtung der Eizelle.
Agglutinierte Spermien von Scharkasi-Hühnern lassen sich mithilfe der Phasenkontrastmikroskopie leicht darstellen, was als vorteilhaft gilt, da es die Untersuchung des Spermienverhaltens in vitro erleichtert. Der Mechanismus, durch den die Spermienbüschelbildung die Fortpflanzung bei Scharkasi-Hühnern fördert, unterscheidet sich von dem bei einigen Plazentatieren, die kooperatives Spermienverhalten zeigen, wie beispielsweise Waldmäusen. Dort erreichen einige Spermien die Eier und helfen anderen verwandten Individuen, ihre Eier zu erreichen und zu beschädigen. Ein weiteres Beispiel für kooperatives Verhalten bei Spermien findet sich bei Hirschmäusen. Hier können Spermien die genetisch verwandtsten Spermien identifizieren, sich mit ihnen verbinden und kooperative Gruppen bilden, um ihre Geschwindigkeit im Vergleich zu nicht verwandten Spermien zu erhöhen.
Die in dieser Studie erzielten Ergebnisse widersprechen nicht Fomans Theorie der Langzeitspeicherung von Spermien im Weichteilgewebe (SWS). Die Forscher berichten, dass sich die Spermien über einen längeren Zeitraum im Fluss der Epithelzellen des Weichteilgewebes (SST) fortbewegen. Nach einer gewissen Zeit erschöpfen sich die Energiereserven der Spermien, was zu einer Geschwindigkeitsabnahme führt und die Ausstoßung niedermolekularer Substanzen ermöglicht. Die Energie der Spermien wird durch den Flüssigkeitsstrom aus dem Lumen des Weichteilgewebes (SST) – der Höhle des Eileiters – verbraucht. In der vorliegenden Studie beobachteten wir, dass die Hälfte der einzelnen Spermien gegen den Flüssigkeitsstrom schwimmen konnte und dass ihre Adhäsion im Bündel ihre Fähigkeit zu positiver Rheologie erhöhte. Unsere Daten stimmen zudem mit denen von Matsuzaki et al.¹ überein, die berichteten, dass eine erhöhte Laktatsekretion im Weichteilgewebe die Motilität der dort befindlichen Spermien hemmen kann. Unsere Ergebnisse beschreiben die Bildung beweglicher Spermienligamente und deren rheologisches Verhalten in einem dynamischen Mikrokanal, um deren Verhalten in der Spermien-Spin-Therapie (SST) zu erklären. Zukünftige Forschung könnte sich auf die Bestimmung der chemischen Zusammensetzung und des Ursprungs des Agglutinationsmittels konzentrieren, was zweifellos dazu beitragen wird, neue Methoden zur Lagerung von flüssigem Sperma und zur Verlängerung der Fruchtbarkeitsdauer zu entwickeln.
Fünfzehn 30 Wochen alte, nackthalsige männliche Sharkasi (homozygot dominant; Na Na) wurden als Samenspender für die Studie ausgewählt. Die Tiere wurden auf der Geflügelzuchtstation der Landwirtschaftlichen Fakultät der Universität Ashit im Gouvernement Ashit, Ägypten, gehalten. Sie wurden in Einzelkäfigen (30 x 40 x 40 cm) untergebracht, einem Lichtprogramm (16 Stunden Licht, 8 Stunden Dunkelheit) ausgesetzt und mit einem Futter gefüttert, das pro Kilogramm Futter 160 g Rohprotein, 2800 kcal umsetzbare Energie, 35 g Kalzium und 5 g verfügbaren Phosphor enthielt.
Laut den Daten 36 und 37 wurde Sperma durch Bauchmassage von Männern gewonnen. Insgesamt wurden über drei Tage 45 Spermaproben von 15 Männern gesammelt. Das Sperma (n = 15/Tag) wurde sofort 1:1 (v/v) mit Belsville Poultry Semen Diluent verdünnt. Dieses Verdünnungsmittel enthält Kaliumdiphosphat (1,27 g), Mononatriumglutamat-Monohydrat (0,867 g), Fructose (0,5 g), wasserfreies Natriumacetat (0,43 g), Tris(hydroxymethyl)aminomethan (0,195 g), Kaliumcitrat-Monohydrat (0,064 g), Kaliummonophosphat (0,065 g), Magnesiumchlorid (0,034 g) und Wasser (100 ml). Der pH-Wert beträgt 7,5, die Osmolarität 333 mOsm/kg. Die verdünnten Samenproben wurden zunächst unter einem Lichtmikroskop untersucht, um eine gute Samenqualität (Feuchtigkeit) sicherzustellen, und dann bis zur Verwendung innerhalb einer halben Stunde nach der Entnahme in einem Wasserbad bei 37 °C gelagert.
Die Kinematik und Rheologie von Spermien werden mithilfe eines mikrofluidischen Systems beschrieben. Samenproben wurden in Beltsville Avian Semen Diluent 1:40 verdünnt, in ein mikrofluidisches System (siehe unten) eingebracht und die kinetischen Parameter mit einem Computerized Semen Analysis (CASA)-System bestimmt, das zuvor für die Charakterisierung von Spermien in Mikrofluidik entwickelt wurde. Die Mobilität von Spermien in flüssigen Medien wurde untersucht (Institut für Maschinenbau, Fakultät für Ingenieurwissenschaften, Universität Assiut, Ägypten). Das Plugin kann unter http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39 heruntergeladen werden. Gemessen wurden die Kurvengeschwindigkeit (VCL, μm/s), die lineare Geschwindigkeit (VSL, μm/s) und die mittlere Trajektoriengeschwindigkeit (VAP, μm/s). Spermienvideos wurden mit einem inversen Optika XDS-3 Phasenkontrastmikroskop (40x Objektiv), das an eine Tucson ISH1000 Kamera angeschlossen war, mit 30 Bildern pro Sekunde über 3 Sekunden aufgenommen. Mithilfe der CASA-Software wurden mindestens drei Bereiche und 500 Spermienbahnen pro Probe analysiert. Die Videoaufzeichnungen wurden mit einem eigens entwickelten CASA-Plugin verarbeitet. Die Definition der Motilität im CASA-Plugin basiert auf der Schwimmgeschwindigkeit der Spermien im Verhältnis zur Strömungsgeschwindigkeit und berücksichtigt keine weiteren Parameter wie Seitwärtsbewegungen, da diese in Flüssigkeitsströmungen zuverlässiger sind. Rheologische Bewegung beschreibt die Bewegung der Spermien entgegen der Strömungsrichtung. Spermien mit rheologischen Eigenschaften wurden durch die Anzahl der beweglichen Spermien dividiert; ruhende und konvektiv bewegte Spermien wurden nicht gezählt.
Alle verwendeten Chemikalien wurden, sofern nicht anders angegeben, von Elgomhoria Pharmaceuticals (Kairo, Ägypten) bezogen. Die Vorrichtung wurde, mit einigen Modifikationen, nach der Beschreibung von El-Sherry et al.⁴⁰ hergestellt. Für die Herstellung der Mikrokanäle wurden Glasplatten (Howard Glass, Worcester, MA, USA), SU-8-25 Negativresist (MicroChem, Newton, CA, USA), Diacetonalkohol (Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland) und Polyaceton-184 (Dow Corning, Midland, Michigan, USA) verwendet. Die Mikrokanäle wurden mittels Weichlithografie hergestellt. Zunächst wurde eine transparente Schutzmaske mit dem gewünschten Mikrokanaldesign auf einem hochauflösenden Drucker (Prismatic, Kairo, Ägypten und Pacific Arts and Design, Markham, ON, USA) gedruckt. Die Master wurden aus Glasplatten als Substraten gefertigt. Die Platten wurden mit Aceton, Isopropanol und deionisiertem Wasser gereinigt und anschließend durch Spin-Coating (3000 U/min, 1 min) mit einer 20 µm dicken Schicht SU-8-25 beschichtet. Die SU-8-Schichten wurden anschließend schonend getrocknet (65 °C, 2 min und 95 °C, 10 min) und 50 s lang mit UV-Licht bestrahlt. Zur Vernetzung der belichteten SU-8-Schichten erfolgte ein Nachbacken bei 65 °C und 95 °C für 1 min bzw. 4 min, gefolgt von einer Entwicklung in Diacetonalkohol für 6,5 min. Abschließend wurden die Waffeln bei 200 °C für 15 min ausgehärtet, um die SU-8-Schicht weiter zu verfestigen.
PDMS wurde durch Mischen von Monomer und Härter im Gewichtsverhältnis 10:1 hergestellt, anschließend in einem Vakuumexsikkator entgast und auf den SU-8-Grundrahmen gegossen. Das PDMS wurde im Ofen (120 °C, 30 min) ausgehärtet. Anschließend wurden die Kanäle ausgeschnitten, vom Grundrahmen getrennt und perforiert, um die Anbringung von Schläuchen am Ein- und Auslass des Mikrokanals zu ermöglichen. Abschließend wurden die PDMS-Mikrokanäle mithilfe eines tragbaren Corona-Prozessors (Electro-Technic Products, Chicago, IL) wie bereits beschrieben dauerhaft auf Objektträger aufgebracht. Der in dieser Studie verwendete Mikrokanal misst 200 µm × 20 µm (B × H) und ist 3,6 cm lang.
Die durch den hydrostatischen Druck im Inneren des Mikrokanals hervorgerufene Flüssigkeitsströmung wird dadurch erreicht, dass der Flüssigkeitsspiegel im Einlassreservoir über der Höhendifferenz Δh39 im Auslassreservoir gehalten wird (Abb. 1).
Dabei ist f der Reibungskoeffizient, definiert als f = C/Re für laminare Strömung in einem rechteckigen Kanal. C ist eine Konstante, die vom Aspektverhältnis des Kanals abhängt. L ist die Länge des Mikrokanals, Vav die mittlere Strömungsgeschwindigkeit im Mikrokanal, Dh der hydraulische Durchmesser des Kanals und g die Erdbeschleunigung. Mithilfe dieser Gleichung lässt sich die mittlere Kanalgeschwindigkeit wie folgt berechnen: