Nature.com saytına daxil olduğunuz üçün təşəkkür edirik. İstifadə etdiyiniz brauzer versiyasında məhdud CSS dəstəyi var. Ən yaxşı təcrübə üçün yenilənmiş brauzerdən istifadə etməyinizi (və ya Internet Explorer-də Uyğunluq Rejimini deaktiv etməyinizi) tövsiyə edirik. Bu vaxt ərzində davamlı dəstəyi təmin etmək üçün saytı stillər və JavaScript olmadan render edəcəyik.
Quşların məhsuldarlığı, sperma saxlama borucuqlarında (SST) uzun müddət kifayət qədər canlı sperma saxlamaq qabiliyyətindən asılıdır. Spermatozoidlərin SST-yə daxil olması, orada qalması və oradan çıxmasının dəqiq mexanizmi mübahisəli olaraq qalır. Sharkasi toyuqlarının sperması çoxlu hüceyrə ehtiva edən mobil filamentli dəstələr əmələ gətirərək aglütinasiyaya yüksək meyl göstərmişdir. Qeyri-şəffaf fallop borusunda spermatozoidlərin hərəkətliliyini və davranışını müşahidə etməyin çətinliyinə görə, spermatozoidlərin aglütinasiyasını və hərəkətliliyini öyrənmək üçün spermatozoidlərə bənzər mikrokanal kəsiyi olan mikrofluidik cihazdan istifadə etdik. Bu tədqiqatda sperma dəstələrinin necə əmələ gəldiyi, necə hərəkət etdiyi və SST-də spermanın yerləşməsinin uzadılmasındakı mümkün rolu müzakirə olunur. Mikrofluidik kanalda maye axını hidrostatik təzyiqlə (axın sürəti = 33 µm/s) yarandıqda sperma sürətini və reoloji davranışını araşdırdıq. Spermatozoidlər cərəyana qarşı üzməyə meyllidirlər (müsbət reologiya) və spermatozoid dəstəsinin sürəti tək spermatozoidlərlə müqayisədə əhəmiyyətli dərəcədə azalır. Spermatozoid dəstələrinin spiral şəklində hərəkət etdiyi və daha çox tək sperma cəlb olunduqca uzunluğu və qalınlığının artdığı müşahidə edilmişdir. Sperma dəstələrinin maye axını sürəti > 33 µm/s ilə süpürülməməsi üçün mikrofluidik kanalların yan divarlarına yaxınlaşdığı və yapışdığı müşahidə edilmişdir. Sperma dəstələrinin maye axını sürəti > 33 µm/s ilə süpürülməməsi üçün mikrofluidik kanalların yan divarlarına yaxınlaşdığı və yapışdığı müşahidə edilmişdir. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрофлюидных каналов, чтобы избежать сметания со скоростью потока жидкости> 33 мкм / s. Maye axını sürəti >33 µm/s olduqda sperma dəstələrinin mikrofluidik kanalların yan divarlarına yaxınlaşdığı və yapışdığı müşahidə edilmişdir ki, bu da onların süpürülməsinin qarşısını almağa kömək etmişdir.观察到精子束接近并粘附在微流体通道的侧壁上，以避免被流体流速/s 3333 µm/s 扫过。 Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрожидкостного канала, чтобы избежать сметания потоком жидкости со скоростью > 33 мкм/s. Sperma dəstələrinin >33 µm/s sürətlə maye axınının təsirindən qaçınmaq üçün mikrofluidik kanalın yan divarlarına yaxınlaşdığı və yapışdığı müşahidə edilmişdir.Skan və ötürücü elektron mikroskopiyası sperma dəstələrinin bol sıx materialla dəstəkləndiyini aşkar etdi. Əldə edilən məlumatlar, Sharkazi toyuq spermatozoidlərinin unikal hərəkətliliyini, eləcə də spermatozoidlərin iltihaplanma və mobil dəstələr əmələ gətirmə qabiliyyətini nümayiş etdirir ki, bu da SMT-də spermatozoidlərin uzunmüddətli saxlanmasının daha yaxşı başa düşülməsinə kömək edir.
İnsanlarda və əksər heyvanlarda mayalanmaya nail olmaq üçün sperma və yumurta hüceyrələri mayalanma yerinə doğru zamanda çatmalıdır. Buna görə də, cütləşmə yumurtlamadan əvvəl və ya ovulyasiya zamanı baş verməlidir. Digər tərəfdən, itlər kimi bəzi məməlilər, eləcə də həşəratlar, balıqlar, sürünənlər və quşlar kimi məməli olmayan növlər yumurtaları mayalanmaya hazır olana qədər (asinxron mayalanma 1) spermaları uzun müddət reproduktiv orqanlarında saxlayırlar. Quşlar yumurtaları mayalandırmağa qadir olan spermatozoidlərin canlılığını 2-10 həftə ərzində saxlaya bilirlər2.
Bu, quşları digər heyvanlardan fərqləndirən unikal bir xüsusiyyətdir, çünki eyni vaxtda cütləşmə və yumurtlama olmadan bir neçə həftə ərzində tək mayalanmadan sonra mayalanma ehtimalını yüksək səviyyədə təmin edir. Sperma saxlama borusu (SST) adlanan əsas sperma saxlama orqanı, uşaqlıq yolu qovşağındakı daxili selikli qişa qıvrımlarında yerləşir. Bu günə qədər spermanın sperma bankına daxil olması, yerləşməsi və çıxması mexanizmləri tam olaraq aydın deyil. Əvvəlki tədqiqatlara əsasən, bir çox fərziyyə irəli sürülmüş, lakin onlardan heç biri təsdiqlənməmişdir.
Forman4, spermatozoidlərin SST epitel hüceyrələrində yerləşən zülal kanalları vasitəsilə maye axını istiqamətində davamlı salınım hərəkəti ilə SST boşluğunda qaldığını fərz etdi (reologiya). Spermanı SST lümenində saxlamaq üçün lazım olan daimi flagellar aktivliyə görə ATF tükənir və hərəkətlilik nəticədə sperma maye axını ilə sperma bankından çıxarılana və spermanı mayalandırmaq üçün yüksələn fallop tüpü boyunca yeni bir səyahətə başlayana qədər azalır. Yumurta (Forman4). Sperma saxlamasının bu modeli, SST epitel hüceyrələrində mövcud olan 2, 3 və 9 akvaporinlərinin immunositokimyası ilə aşkarlanması ilə dəstəklənir. Bu günə qədər toyuq spermasının reologiyası və onun SST saxlanmasında, vaginal sperma seçimində və sperma rəqabətində rolu ilə bağlı tədqiqatlar yoxdur. Toyuqlarda sperma təbii cütləşmədən sonra vaginaya daxil olur, lakin spermatozoidlərin 80%-dən çoxu cütləşmədən qısa müddət sonra vaginadan xaric olur. Bu, quşlarda sperma seçimi üçün əsas yer vaginanın olduğunu göstərir. Bundan əlavə, vaginada mayalanmış spermatozoidlərin 1%-dən azı SST-lərdə2-yə çevrildiyi bildirilib. Vaginada balaların süni mayalanması zamanı SST-yə çatan spermatozoidlərin sayı mayalanmadan 24 saat sonra artmağa meyllidir. İndiyə qədər bu proses zamanı sperma seçmə mexanizmi aydın deyil və sperma hərəkətliliyi SST spermasının mənimsənilməsində mühüm rol oynaya bilər. Fallop borularının qalın və qeyri-şəffaf divarları səbəbindən quşların fallop borularında sperma hərəkətliliyini birbaşa izləmək çətindir. Buna görə də, mayalanmadan sonra spermatozoidlərin SST-yə necə keçdiyi barədə əsas biliklərimiz yoxdur.
Reologiya son zamanlar məməlilərin cinsiyyət orqanlarında sperma daşınmasını idarə edən mühüm amil kimi qəbul edilmişdir. Hərəkətli spermatozoidlərin əks-cərəyanla miqrasiya qabiliyyətinə əsaslanaraq, Zaferani və digərləri hərəkətli spermatozoidləri qəfəsdə saxlanılan sperma nümunələrindən passiv şəkildə təcrid etmək üçün corra mikrofluidik sistemindən istifadə etmişlər. Bu tip sperma çeşidlənməsi tibbi sonsuzluğun müalicəsi və klinik tədqiqatlar üçün vacibdir və vaxt və əmək tələb edən, sperma morfologiyasını və struktur bütövlüyünü poza bilən ənənəvi metodlara nisbətən üstünlük təşkil edir. Lakin, bu günə qədər toyuqların cinsiyyət orqanlarından gələn ifrazatın sperma hərəkətliliyinə təsiri ilə bağlı heç bir tədqiqat aparılmamışdır.
Spermanın SST-də saxlanılmasını təmin edən mexanizmdən asılı olmayaraq, bir çox tədqiqatçı rezident spermatozoidlərin 9, 10, bildirçin 2 və hinduşka 11-in SST-də baş-başa birləşərək birləşərək birləşmiş sperma dəstələri əmələ gətirdiyini müşahidə etmişdir. Müəlliflər bu birləşmə ilə SST-də spermanın uzun müddət saxlanması arasında əlaqə olduğunu irəli sürürlər.
Tingari və Lake12, toyuğun sperma qəbul edən vəzisindəki spermatozoidlər arasında güclü bir əlaqə olduğunu bildirdilər və quş spermatozoidlərinin məməli spermatozoidləri ilə eyni şəkildə birləşib-birləşmədiyini soruşdular. Onlar inanırlar ki, vas deferensdəki sperma arasındakı dərin əlaqələr kiçik bir məkanda çox sayda spermanın olması səbəbindən yaranan stressdən qaynaqlana bilər.
Təzə asılmış şüşə slaydlarda spermatozoidlərin davranışı qiymətləndirilərkən, xüsusən də sperma damlacıqlarının kənarlarında keçici iltihaplanma əlamətləri müşahidə edilə bilər. Lakin, iltihaplanma tez-tez davamlı hərəkətlə əlaqəli fırlanma hərəkəti ilə pozulur ki, bu da bu fenomenin keçici təbiətini izah edir. Tədqiqatçılar həmçinin seyreltici spermaya əlavə edildikdə uzunsov "sap kimi" hüceyrə aqreqatlarının əmələ gəldiyini də müşahidə etdilər.
Spermatozoidi təqlid etmək üçün ilk cəhdlər, asılmış damcıdan nazik bir məftil çıxarmaqla edildi və nəticədə sperma damcısından uzunsov spermaya bənzər bir vezikül çıxdı. Spermatozoidlər dərhal vezikülün içərisində paralel şəkildə düzüldülər, lakin 3D məhdudiyyəti səbəbindən bütün vahid tez bir zamanda yox oldu. Buna görə də, spermatozoidlərin aqqlütinasiyasını öyrənmək üçün spermatozoidlərin hərəkətliliyini və davranışını birbaşa təcrid olunmuş sperma saxlama borucuqlarında müşahidə etmək lazımdır ki, bu da əldə etmək çətindir. Buna görə də, sperma hərəkətliliyi və aqqlütinasiya davranışı tədqiqatlarını dəstəkləmək üçün spermatozoidləri təqlid edən bir cihaz hazırlamaq lazımdır. Brillard və digərləri13, yetkin cücələrdə sperma saxlama borucuqlarının orta uzunluğunun 400-600 µm olduğunu, lakin bəzi SST-lərin 2000 µm-ə qədər uzun ola biləcəyini bildirdilər. Mero və Ogasawara14 toxum bezlərini böyümüş və böyüməmiş sperma saxlama borucuqlarına ayırdılar, hər ikisi uzunluğu (~500 µm) və boyun eni (~38 µm) eyni idi, lakin borucuqların orta lümen diametri müvafiq olaraq 56,6 və 56,6 µm, müvafiq olaraq 11,2 µm idi. Hazırkı tədqiqatda, kanal ölçüsü 200 µm × 20 µm (W × H) olan mikrofluidik cihazdan istifadə etdik ki, onun en kəsiyi gücləndirilmiş SST-nin eninə bir qədər yaxındır. Bundan əlavə, axan mayedə sperma hərəkətliliyini və aqqlütinasiya davranışını araşdırdıq ki, bu da Foremanın SST epitel hüceyrələri tərəfindən istehsal olunan mayenin spermanı lümendə əks cərəyan (reoloji) istiqamətdə saxladığı fərziyyəsi ilə uyğun gəlir.
Bu tədqiqatın məqsədi, fallopiya borusunda spermatozoidlərin hərəkətliliyini müşahidə etmək problemlərini aradan qaldırmaq və dinamik mühitdə spermatozoidlərin reologiyasını və davranışını öyrənməkdə çətinliklərin qarşısını almaq idi. Toyuğun cinsiyyət orqanlarında sperma hərəkətliliyini simulyasiya etmək üçün hidrostatik təzyiq yaradan mikrofluidik cihaz istifadə edilmişdir.
Seyreltilmiş sperma nümunəsinin bir damcısı (1:40) mikrokanal cihazına yükləndikdə, iki növ sperma hərəkətliliyi müəyyən edilə bildi (təcrid olunmuş sperma və bağlı sperma). Bundan əlavə, spermatozoidlər cərəyana qarşı üzməyə meylli idilər (müsbət reologiya; video 1, 2). Sperma dəstələrinin sürəti tək spermalara nisbətən daha aşağı olsa da (p < 0,001), onlar müsbət reotaksis göstərən sperma faizini artırdı (p < 0,001; Cədvəl 2). Sperma dəstələrinin sürəti tək spermalara nisbətən daha aşağı olsa da (p < 0,001), onlar müsbət reotaksis göstərən sperma faizini artırdı (p < 0,001; Cədvəl 2). Хотя пучки сперматозоидов имели более низкую скорость, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), on увеличивали процент сперматозоидов, демонстрирующих положительный реотаксис (p < 0,001; таблица). Spermatozoid dəstələrinin sürəti tək spermatozoidlərə nisbətən daha aşağı olsa da (p < 0,001), onlar müsbət reotaksis göstərən spermatozoidlərin faizini artırmışdır (p < 0,001; Cədvəl 2).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度（p < 0.001），但它们增加了显示阳性流变性的精子百分比（p < 0.001；表2）。尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 （p <0.001） ， 但 增加 了 显示 阀显示百分比 （p <0.001 ； 2。。。。。。）））））） Хотя скорость пучков сперматозоидов bla nije, chem u одиночных сперматозоидов (p < 0,001), on увеличивали процент сперматозоидов с положительной реологией (p < 0,001; таблица 2). Sperma dəstələrinin sürəti tək spermatozoidlərin sürətindən aşağı olsa da (p < 0,001), müsbət reologiyaya malik spermatozoidlərin faizini artırdılar (p < 0,001; Cədvəl 2).Tək spermatozoidlər və dəstələr üçün müsbət reologiya müvafiq olaraq təxminən 53% və 85% olaraq qiymətləndirilir.
Sharkasi toyuqlarının spermatozoidlərinin boşalmadan dərhal sonra onlarla fərddən ibarət xətti dəstələr əmələ gətirdiyi müşahidə edilmişdir. Bu dəstələr zamanla uzunluğu və qalınlığı artır və dağılmadan əvvəl bir neçə saat in vitro olaraq qala bilər (video 3). Bu sapvari dəstələr epididimin sonunda əmələ gələn exidna spermatozoidləri formasındadır. Sharkashi toyuq spermasının toplandıqdan sonra bir dəqiqədən az müddətdə ilişməyə və tor dəstəsi əmələ gətirməyə meylli olduğu aşkar edilmişdir. Bu şüalar dinamikdir və yaxınlıqdakı divarlara və ya statik obyektlərə yapışa bilir. Sperma dəstələri sperma hüceyrələrinin sürətini azaltsa da, makroskopik olaraq onların xəttiliyini artırdığı aydındır. Dəstələrin uzunluğu dəstələrdə toplanan sperma sayından asılı olaraq dəyişir. Dəstənin iki hissəsi təcrid olunmuşdur: ilişmiş spermanın sərbəst başı daxil olmaqla ilkin hissə və quyruğu və spermanın bütün distal ucu daxil olmaqla terminal hissəsi. Yüksək sürətli kamera (950 kadr/saniyə) istifadə edərək, dəstənin ilkin hissəsində sərbəst ilişmiş spermatozoid başlıqları müşahidə edildi ki, bu da onların salınım hərəkəti səbəbindən dəstənin hərəkətindən məsuldur və qalanları spiral hərəkətlə dəstənin içinə sürükləyir (Video 4). Lakin uzun dəstələrdə bəzi sərbəst spermatozoid başlıqlarının gövdəyə yapışdığı və dəstənin son hissəsinin dəstəni hərəkətə gətirməyə kömək etmək üçün qanad kimi çıxış etdiyi müşahidə edilmişdir.
Sperma dəstələri mayenin yavaş axınında olarkən bir-birinə paralel hərəkət edir, lakin axın sürəti artdıqca cərəyan tərəfindən yuyulmamaq üçün üst-üstə düşməyə və hərəkətsiz olan hər şeyə yapışmağa başlayırlar. Dəstələr bir ovuc sperma hüceyrəsi bir-birinə yaxınlaşdıqda əmələ gəlir, sinxron hərəkət etməyə başlayır və bir-birinin ətrafına sarılır, sonra isə yapışqan bir maddəyə yapışır. Şəkil 1 və 2-də spermanın bir-birinə necə yaxınlaşdığı və quyruqların bir-birinə sarılması zamanı birləşmə əmələ gətirdiyi göstərilir.
Tədqiqatçılar sperma reologiyasını öyrənmək üçün mikrokanalda maye axını yaratmaq üçün hidrostatik təzyiq tətbiq etdilər. Ölçüsü 200 µm × 20 µm (E × H) və uzunluğu 3,6 µm olan mikrokanal istifadə edildi. Uclarında şprislər olan qablar arasında mikrokanallardan istifadə edin. Kanalları daha görünən etmək üçün qida boyası istifadə edildi.
Birləşdirici kabelləri və aksesuarları divara bağlayın. Video fazalı kontrast mikroskopla çəkilib. Hər görüntüdə fazalı kontrast mikroskopiyası və xəritələşdirmə şəkilləri təqdim olunur. (A) İki axın arasındakı əlaqə spiral hərəkət səbəbindən axına müqavimət göstərir (qırmızı ox). (B) Boru dəstəsi ilə kanal divarı arasındakı əlaqə (qırmızı oxlar), eyni zamanda onlar iki digər dəstəyə qoşulur (sarı oxlar). (C) Mikrofluidik kanaldakı sperma dəstələri bir-biri ilə birləşməyə başlayır (qırmızı oxlar) və sperma dəstələrindən ibarət bir tor əmələ gətirir. (D) Sperma dəstələri şəbəkəsinin əmələ gəlməsi.
Mikrofluidik cihaza bir damla durulaşdırılmış sperma yükləndikdə və axın yaradıldıqda, sperma şüasının axın istiqamətinə qarşı hərəkət etdiyi müşahidə edildi. Dəstələr mikrokanalların divarlarına möhkəm oturur və dəstlərin ilkin hissəsindəki sərbəst başlıqlar onlara möhkəm oturur (video 5). Onlar həmçinin cərəyanın süpürülməsinə qarşı durmaq üçün yollarındakı hər hansı hərəkətsiz hissəciklərə, məsələn, zibillərə yapışırlar. Zamanla bu dəstələr digər tək spermatozoidləri və daha qısa dəstələri tutan uzun filamentlərə çevrilir (Video 6). Axın yavaşlamağa başladıqca, uzun sperma xətləri sperma xətləri şəbəkəsi yaratmağa başlayır (Video 7; Şəkil 2).
Yüksək axın sürətində (V > 33 µm/s), bir çox fərdi sperma dəstəsini tutmaq və axının sürüşmə qüvvəsinə daha yaxşı müqavimət göstərmək cəhdi olaraq sapların spiral hərəkətləri artır. Yüksək axın sürətində (V > 33 µm/s), bir çox fərdi sperma dəstəsini tutmaq və axının sürüşmə qüvvəsinə daha yaxşı müqavimət göstərmək cəhdi olaraq sapların spiral hərəkətləri artır. При высокой скорости потока (V > 33 mkm/s) spiralevidnыe dvijeniya nitey usilivayutsya, poskolku on pytayutsya pomaty mnojestvo otdelnıx spermatozoidov, obrazuyuschyh puçki, kotorыe лучше противостоят дрейфуюю. Yüksək axın sürətində (V > 33 µm/s), tellərin spiral hərəkətləri artır, çünki onlar bir çox fərdi spermatozoidləri tutmağa çalışır və axının sürüşmə qüvvəsinə daha yaxşı müqavimət göstərə bilən dəstələr əmələ gətirir.在高流速(V > 33 µm/s)时，螺纹的螺旋运动增加，以试图捕捉许多形成束的单个精子，从而更好地抵抗流动的漂移力。在 高 流速 (v> 33 µm/s) 时 ， 的 螺旋 运动 增加 ， 以 试图 许多 形成 束 南从而 更 地 抵抗 的 漂移力。。。。。。。。。。. При высоких скоростях потока (V > 33 mkm/s) spiralnoe движение нитей увеличивается в попытке захватить множество отделных сперматозоидов, образующих пучки, чтобы лючше сопротивляться silam dreyfa. Yüksək axın sürətlərində (V > 33 µm/s), filamentlərin spiral hərəkəti axının sürüşmə qüvvələrinə daha yaxşı müqavimət göstərmək üçün dəstələr əmələ gətirən bir çox fərdi spermatozoidi tutmaq cəhdində artır.Onlar həmçinin yan divarlara mikrokanallar bağlamağa çalışdılar.
Sperma dəstələri işıq mikroskopiyası (LM) istifadə edərək sperma başlarının və qıvrılmış quyruqların qrupları kimi müəyyən edilmişdir. Müxtəlif aqreqatlara malik sperma dəstələri də bükülmüş başlar və bayraqvari aqreqatlar, çoxlu əridilmiş sperma quyruqları, quyruğa birləşdirilmiş sperma başları və əyilmiş nüvələri olan sperma başları çoxlu əridilmiş nüvələr kimi müəyyən edilmişdir. Transmissiya elektron mikroskopiyası (TEM). Skanerləmə elektron mikroskopiyası (SEM) sperma dəstələrinin örtüklü sperma başlarının aqreqatları olduğunu və sperma aqreqatlarının bükülmüş quyruqların bağlı şəbəkəsini göstərdiyini göstərmişdir.
Spermatozoidlərin morfologiyası və ultrastrukturu, spermatozoid dəstələrinin əmələ gəlməsi işıq mikroskopiyası (yarım kəsik), skanedici elektron mikroskopiyası (SEM) və transmissiya elektron mikroskopiyası (TEM) istifadə edilərək öyrənilmiş, sperma yaxmaları akridin portağalı ilə boyanmış və epiflüoresans mikroskopiyası istifadə edilərək müayinə edilmişdir.
Akridin portağalı ilə sperma yaxmasının boyanması (Şəkil 3B) sperma başlarının bir-birinə yapışmış və ifrazat materialı ilə örtüldüyünü, bunun da böyük dəstələrin əmələ gəlməsinə səbəb olduğunu göstərdi (Şəkil 3D). Sperma dəstələri bir-birinə yapışmış quyruq şəbəkəsi olan sperma aqreqatlarından ibarət idi (Şəkil 4A-C). Sperma dəstələri bir-birinə yapışmış bir çox spermatozoidin quyruqlarından ibarətdir (Şəkil 4D). Sirrlər (Şəkil 4E,F) spermatozoid dəstələrinin başlarını örtmüşdü.
Spermatozoid dəstəsinin əmələ gəlməsi Fazalı kontrast mikroskopiya və akridin narıncı ilə boyanmış sperma yaxmalarından istifadə edərək, spermatozoid başlarının bir-birinə yapışdığı göstərildi. (A) Erkən sperma dəstəsinin əmələ gəlməsi bir sperma (ağ dairə) və üç sperma (sarı dairə) ilə başlayır, spiral quyruqdan başlayır və başda bitir. (B) Akridin narıncı ilə boyanmış sperma yaxmasının yapışqan sperma başlarını göstərən fotomikroqrafiyası (oxlar). Axıntı başı(ları) əhatə edir. Böyütmə × 1000. (C) Mikrofluidik kanalda axınla daşınan böyük bir şüanın inkişafı (950 fps-də yüksək sürətli kamera istifadə etməklə). (D) Böyük dəstələri göstərən akridin narıncı ilə boyanmış sperma yaxmasının mikroqrafikası (oxlar). Böyütmə: ×200.
Akridin narıncı ilə boyanmış sperma şüasının və sperma yaxmasının skan edən elektron mikroqrafı. (A, B, D, E) spermatozoidlərin rəqəmsal rəngli skan edən elektron mikroqraflarıdır və C və F, quyruq torunu bürüyən çoxsaylı spermatozoidlərin yapışmasını göstərən akridin narıncı ilə boyanmış sperma yaxmalarının mikroqraflarıdır. (AC) Sperma aqreqatları birləşdirilmiş quyruqlar şəbəkəsi (oxlar) kimi göstərilir. (D) Quyruğun ətrafına bükülmüş bir neçə spermatozoidin (yapışqan maddə, çəhrayı kontur, ox ilə) yapışması. (E və F) Yapışqan materialla örtülmüş sperma başı aqreqatları (göstəricilər). Spermatozoidlər bir neçə burulğana bənzər strukturlu dəstələr əmələ gətirir (F). (C) ×400 və (F) ×200 böyütmə.
Transmissiya elektron mikroskopiyasından istifadə edərək, sperma dəstələrinin quyruqlarının (Şəkil 6A, C), quyruqlara bağlı başların (Şəkil 6B) və ya quyruqlara bağlı başların (Şəkil 6D) olduğunu aşkar etdik. Dəstədəki spermatozoidlərin başları əyridir və iki nüvə bölgəsində yerləşir (Şəkil 6D). Kəsik dəstəsində spermatozoidlərin iki nüvə bölgəsi və çoxsaylı bayraqcıq bölgələri olan bükülmüş başı var idi (Şəkil 5A).
Sperma dəstəsindəki birləşdirici quyruqları və sperma başlarını birləşdirən ilişmə materialını göstərən rəqəmsal rəngli elektron mikroqraf. (A) Çox sayda spermatozoidin birləşmiş quyruğu. Quyruğun həm portret (ox), həm də mənzərə (ox) proyeksiyalarında necə göründüyünə diqqət yetirin. (B) Spermanın başı (ox) quyruğa (ox) birləşdirilib. (C) Bir neçə sperma quyruğu (ox) birləşdirilib. (D) Aqlütinasiya materialı (AS, mavi) dörd sperma başını (bənövşəyi) birləşdirir.
Skaner elektron mikroskopiyası ifrazat və ya membranlarla örtülmüş sperma dəstələrində sperma başlarını aşkar etmək üçün istifadə edilmişdir (Şəkil 6B), bu da sperma dəstələrinin hüceyrədənkənar materialla lövbərləndiyini göstərir. Aqqlütinləşdirilmiş material sperma başında (meduza başı kimi birləşmə; Şəkil 5B) cəmləşmiş və distal istiqamətdə genişlənmiş, akridin narıncı ilə boyandıqda flüoresan mikroskopiya altında parlaq sarı görünüş vermişdir (Şəkil 6C). Bu maddə skaner mikroskopu altında aydın görünür və bağlayıcı hesab olunur. Yarı nazik kəsiklər (Şəkil 5C) və akridin narıncı ilə boyanmış sperma yaxmalarında sıx şəkildə yığılmış başlar və qıvrılmış quyruqlar olan sperma dəstələri göstərilmişdir (Şəkil 5D).
Müxtəlif metodlardan istifadə edərək sperma başlarının və qatlanmış quyruqların aqreqasiyasını göstərən müxtəlif fotomikroqrafiyalar. (A) İki hissəli nüvə (mavi) və bir neçə bayraqvari hissə (yaşıl) olan qıvrılmış sperma başını göstərən sperma dəstəsinin en kəsikli rəqəmsal rəng ötürücü elektron mikroqrafı. (B) Örtülmüş kimi görünən meduzaya bənzər sperma başlarının dəstəsini (oxlar) göstərən rəqəmsal rəngli skanlama elektron mikroqrafı. (C) Aqreqasiya olunmuş sperma başlarını (oxlar) və qıvrılmış quyruqları (oxlar) göstərən yarı nazik kəsik. (D) Sperma başlarının aqreqasiyasını (oxlar) və qıvrılmış yapışqan quyruqları (oxlar) göstərən akridin narıncı ilə boyanmış sperma yaxmasının mikroqrafı. Qeyd edək ki, yapışqan maddə (S) spermatozoidin başını örtür. (D) × 1000 böyütmə.
Transmissiya elektron mikroskopiyasından (Şəkil 7A) istifadə edərək, akridin narıncı ilə boyanmış və flüoresan mikroskopiyasından istifadə edilərək araşdırılmış sperma yaxmaları ilə təsdiqləndiyi kimi, sperma başlarının bükülmüş və nüvələrinin spiral formasına malik olduğu da qeyd edildi (Şəkil 7B).
(A) Rəqəmsal rəng ötürücü elektron mikroqrafı və (B) Akridin narıncı rənglə boyanmış sperma yaxması, burulmuş başları və sperma başlarının və quyruqlarının birləşməsi (oxlar). (B) × 1000 böyütmə.
Maraqlı bir tapıntı, Sharkazinin spermasının birləşərək hərəkətli filamentli dəstələr əmələ gətirməsidir. Bu dəstələrin xüsusiyyətləri, onların SST-də spermatozoidlərin udulması və saxlanmasında mümkün rolunu anlamağa imkan verir.
Cütləşmədən sonra sperma vaginaya daxil olur və intensiv seçim prosesindən keçir və nəticədə yalnız məhdud sayda sperma SST-yə daxil olur15,16. Bu günə qədər spermanın SST-yə daxil olub-olma mexanizmləri aydın deyil. Quşçuluqda spermatozoidlər növlərdən asılı olaraq SST-də 2 həftədən 10 həftəyə qədər uzun müddət saxlanılır6. SST-də saxlanılarkən spermanın vəziyyəti ilə bağlı mübahisələr davam edir. Onlar hərəkətdədirlər, yoxsa dinc vəziyyətdədirlər? Başqa sözlə, sperma hüceyrələri SST-dəki mövqelərini bu qədər uzun müddət necə qoruyurlar?
Forman4, SST-nin yerləşməsi və xaric edilməsinin sperma hərəkətliliyi baxımından izah edilə biləcəyini irəli sürdü. Müəlliflər, spermanın SST epiteli tərəfindən yaradılan maye axınına qarşı üzərək mövqelərini qoruduğunu və sürətlərinin enerji çatışmazlığı səbəbindən geriyə doğru hərəkət etməyə başladıqları nöqtədən aşağı düşdükdə SST-dən xaric edildiyini fərz edirlər. Zaniboni5, SST epitel hüceyrələrinin apikal hissəsində 2, 3 və 9 akvaporinlərinin mövcudluğunu təsdiqlədi ki, bu da dolayı yolla Foremanın sperma saxlama modelini dəstəkləyə bilər. Hazırkı tədqiqatda, Sharkashi spermatozoidlərinin demək olar ki, yarısının axan mayedə müsbət reologiya göstərdiyini və aglutinasiyanın onları yavaşlatmasına baxmayaraq, aglutinasiyanın müsbət reologiya göstərən spermatozoidlərin sayını artırdığını aşkar etdik. Sperma hüceyrələrinin quşun fallop borusundan mayalanma yerinə necə hərəkət etdiyi tam olaraq aydın deyil. Məməlilərdə follikulyar maye kemoatraksiyonu spermatozoidləri cəlb edir. Lakin, kemoatraktantların spermatozoidləri uzun məsafələrə yaxınlaşdırdığına inanılır7. Buna görə də, sperma daşınmasından digər mexanizmlər də məsuldur. Spermanın cütləşmədən sonra ifraz olunan fallop borusu mayesinə qarşı istiqamətlənmə və axma qabiliyyətinin siçanlarda sperma hədəfində əsas amil olduğu bildirilir. Parker 17, spermatozoidlərin quşlarda və sürünənlərdə kirpikli cərəyana qarşı üzərək yumurtalıqları keçdiyini irəli sürdü. Quşlarda eksperimental olaraq nümayiş etdirilməsə də, Adolphi18, filtr kağızı zolağı ilə örtük və sürüşmə arasında nazik bir maye təbəqəsi yaradıldıqda quş spermasının müsbət nəticələr verdiyini aşkar edən ilk şəxs oldu. Reologiya. Hino və Yanagimachi [19] perfuziya halqasına siçan yumurtalığı-boru-uşaqlıq kompleksini yerləşdirdilər və fallop borularında maye axınını görüntüləmək üçün isthmusa 1 µl mürəkkəb yeritdilər. Onlar fallop borusunda çox aktiv bir daralma və relaksasiya hərəkəti gördülər, burada bütün mürəkkəb topları fallop borusunun ampulasına doğru sabit şəkildə hərəkət edirdi. Müəlliflər spermanın qalxması və mayalanma üçün aşağı fallop borularından yuxarı fallop borularına boru mayesinin axınının vacibliyini vurğulayırlar. Brillard20, toyuq və hinduşkalarda spermatozoidlərin saxlanıldıqları vaginal girişdən aktiv hərəkətlə saxlanıldıqları uşaqlıq-vaginal qovşağına miqrasiya etdiyini bildirmişdir. Lakin, bu hərəkət uşaqlıq-vaginal qovşaq və infundibulum arasında tələb olunmur, çünki spermatozoidlər passiv yerdəyişmə yolu ilə daşınır. Əvvəlki tövsiyələri və mövcud tədqiqatda əldə edilən nəticələri bilərək, spermatozoidlərin yuxarı axın hərəkəti qabiliyyətinin (reologiya) seçim prosesinin əsaslandığı xüsusiyyətlərdən biri olduğunu güman etmək olar. Bu, spermatozoidlərin vaginadan keçməsini və saxlanmaq üçün CCT-yə daxil olmasını müəyyən edir. Forman4-ün təklif etdiyi kimi, bu, spermanın müəyyən bir müddət ərzində SST-yə və onun yaşayış mühitinə daxil olması və sonra sürətləri yavaşlamağa başladıqda çıxması prosesini də asanlaşdıra bilər.
Digər tərəfdən, Matsuzaki və Sasanami 21, quş spermatozoidlərinin erkək və dişi reproduktiv traktlarda hərəkətlilik dəyişikliklərinə məruz qaldığını irəli sürdülər. SST-də rezident sperma hərəkətliliyinin inhibə edilməsi, spermanın uzun müddət saxlanmasını və SST-dən çıxdıqdan sonra cavanlaşmasını izah etmək üçün irəli sürülmüşdür. Hipoksik şəraitdə Matsuzaki və digərləri 1 SST-də laktatın yüksək istehsalı və ifraz olunduğunu bildirmişlər ki, bu da rezident sperma hərəkətliliyinin inhibə edilməsinə səbəb ola bilər. Bu halda, sperma reologiyasının əhəmiyyəti spermatozoidlərin saxlanmasında deyil, onların seçilməsində və udulmasında əks olunur.
Spermanın aqqlütinasiya modeli, SST-də spermanın uzun müddət saxlanması üçün ağlabatan bir izahat hesab olunur, çünki bu, quşlarda spermanın saxlanmasının ümumi bir modelidir2,22,23. Bakst və digərləri 2 əksər spermatozoidlərin bir-birinə yapışaraq fasikulyar aqreqatlar əmələ gətirdiyini və bildirçin CCM-də tək spermatozoidlərin nadir hallarda tapıldığını müşahidə etmişdir. Digər tərəfdən, Wen və digərləri 24 toyuqlarda SST lümenində daha çox səpələnmiş spermatozoid və daha az spermatozoid dəstəsi müşahidə etmişdir. Bu müşahidələrə əsasən, sperma aqqlütinasiyasına meylliliyin quşlar arasında və eyni ejakulyatdakı spermatozoidlər arasında fərqli olduğunu güman etmək olar. Bundan əlavə, Van Krey və digərləri 9 aqqlütinasiya olunmuş spermatozoidlərin təsadüfi dissosiasiyasının spermatozoidlərin fallopiya borusunun lümeninə tədricən nüfuz etməsindən məsul olduğunu irəli sürmüşlər. Bu hipotezə görə, daha aşağı aqqlütinasiya qabiliyyətinə malik spermatozoidlər əvvəlcə SST-dən xaric edilməlidir. Bu kontekstdə, spermatozoidlərin aqqlütinasiya qabiliyyəti çirkli quşlarda sperma rəqabətinin nəticəsinə təsir edən amil ola bilər. Bundan əlavə, aqqlütinasiya olunmuş sperma nə qədər uzun müddət dissosiasiya edərsə, məhsuldarlıq bir o qədər uzun müddət saxlanılır.
Spermatozoidlərin aqreqasiyası və dəstələrə aqreqasiyası bir neçə tədqiqatda müşahidə olunsa da2,22,24, SST daxilində kinematik müşahidələrinin mürəkkəbliyinə görə ətraflı təsvir edilməmişdir. Sperma aqlütinasiyasını in vitro öyrənmək üçün bir neçə cəhd edilmişdir. Nazik məftil sallanmış toxum damlasından çıxarıldıqda geniş, lakin keçici aqreqasiya müşahidə edilmişdir. Bu, toxum vəzini təqlid edərək damladan uzanan bir qabarcığın çıxmasına gətirib çıxarır. 3D məhdudiyyətləri və qısa damcı qurutma müddətləri səbəbindən bütün blok tez bir zamanda sıradan çıxdı9. Hazırkı tədqiqatda, Sharkashi toyuqları və mikrofluidik çiplərdən istifadə edərək, bu dəstələrin necə əmələ gəldiyini və necə hərəkət etdiyini təsvir edə bildik. Sperma dəstələri sperma toplanmasından dərhal sonra əmələ gəlmiş və spiral şəklində hərəkət etdiyi, axında olduqda müsbət reologiya göstərdiyi aşkar edilmişdir. Bundan əlavə, makroskopik olaraq baxıldıqda, sperma dəstələrinin təcrid olunmuş spermatozoidlərlə müqayisədə hərəkətliliyin xəttiliyini artırdığı müşahidə edilmişdir. Bu, spermanın SST-yə nüfuz etməzdən əvvəl aqqlütinasiyasının baş verə biləcəyini və əvvəllər təklif edildiyi kimi (Tingari və Lake12) stress səbəbindən sperma istehsalının kiçik bir sahə ilə məhdudlaşmadığını göstərir. Tuft əmələ gəlməsi zamanı spermatozoidlər bir qovşaq əmələ gətirənə qədər sinxron şəkildə üzürlər, sonra quyruqları bir-birinin ətrafına sarılır və spermatozoidin başı sərbəst qalır, lakin quyruq və spermatozoidin distal hissəsi yapışqan maddə ilə bir-birinə yapışır. Buna görə də, bağın sərbəst başı hərəkətdən məsuldur və bağın qalan hissəsini sürükləyir. Sperma dəstələrinin skan edilmiş elektron mikroskopiyası, çoxlu yapışqan materialla örtülmüş birləşmiş sperma başlarını göstərdi ki, bu da sperma başlarının saxlama yerinə (SST) çatdıqdan sonra baş verə biləcək istirahət dəstələri şəklində birləşdiyini göstərir.
Sperma yaxması akridin narıncı ilə boyandıqda, sperma hüceyrələrinin ətrafındakı hüceyrə xarici yapışqan materialı flüoresan mikroskop altında görmək olar. Bu maddə sperma dəstələrinin ətrafdakı səthlərə və ya hissəciklərə yapışmasına və yapışmasına imkan verir ki, onlar ətrafdakı axınla birlikdə sürüşməsinlər. Beləliklə, müşahidələrimiz spermatozoidlərin yapışmasının hərəkətli dəstələr şəklində rolunu göstərir. Onların cərəyana qarşı üzmək və yaxınlıqdakı səthlərə yapışmaq qabiliyyəti spermanın SST-də daha uzun müddət qalmasına imkan verir.
Rothschild25, suspenziya damlasında mal-qara spermasının üzən paylanmasını öyrənmək üçün hemositometriya kamerasından istifadə edərək, mikroskopun həm şaquli, həm də üfüqi optik oxu olan bir kamera vasitəsilə fotomikroqraflar çəkdi. Nəticələr göstərdi ki, spermatozoidlər kameranın səthinə cəlb olunur. Müəlliflər sperma ilə səth arasında hidrodinamik qarşılıqlı təsirlərin ola biləcəyini irəli sürürlər. Bunu, Sharkashi cücə spermasının yapışqan dəstələr əmələ gətirmə qabiliyyəti ilə birlikdə nəzərə alsaq, spermanın SST divarına yapışması və uzun müddət saxlanması ehtimalını artıra bilər.
Bccetti və Afzeliu26 sperma qlikokaliksinin qamet tanıma və aglütinasiya üçün tələb olunduğunu bildirmişlər. Forman10 müşahidə etmişdir ki, quş spermasını neyraminidaza ilə müalicə etməklə qlikoprotein-qlikolipid örtüklərində α-qlikozidik rabitələrin hidrolizi sperma hərəkətliliyinə təsir etmədən məhsuldarlığın azalmasına səbəb olur. Müəlliflər neyraminidazanın qlikokaliks üzərindəki təsirinin uşaqlıq-vaginal birləşmədə spermanın sekvestrasiyasına mənfi təsir göstərdiyini və bununla da məhsuldarlığın azaldığını irəli sürürlər. Onların müşahidələri neyraminidaza müalicəsinin sperma və oosit tanıma qabiliyyətini azalda biləcəyi ehtimalını nəzərdən qaçıra bilməz. Forman və Engel10 müəyyən etmişdirlər ki, toyuqlar neyraminidaza ilə müalicə olunmuş sperma ilə intravaginal olaraq mayalandırıldıqda məhsuldarlıq azalır. Lakin, neyraminidaza ilə müalicə olunmuş sperma ilə IVF, nəzarət toyuqları ilə müqayisədə məhsuldarlığa təsir göstərməmişdir. Müəlliflər sperma membranının ətrafındakı qlikoprotein-qlikolipid örtüyündəki dəyişikliklərin uşaqlıq-vaginal birləşmədə spermanın sekvestrasiyasına mane olmaqla spermanın mayalanma qabiliyyətini azaltdığı, bu da öz növbəsində uşaqlıq-vaginal birləşmənin sürəti səbəbindən sperma itkisini artırdığı, lakin sperma və yumurtanın tanınmasına təsir etmədiyi qənaətinə gəliblər.
Bakst və Bauchan 11 hinduşkalarında SST-nin lümenində kiçik veziküllər və membran fraqmentləri tapdılar və bu qranulların bəzilərinin sperma membranı ilə birləşdiyini müşahidə etdilər. Müəlliflər bu əlaqələrin SST-də spermatozoidlərin uzunmüddətli saxlanmasına töhfə verə biləcəyini irəli sürürlər. Lakin tədqiqatçılar bu hissəciklərin mənbəyini, CCT epitel hüceyrələri tərəfindən ifraz olunduğunu, kişi reproduktiv sistemi tərəfindən istehsal olunduğunu və ifraz olunduğunu və ya spermanın özü tərəfindən istehsal olunduğunu dəqiqləşdirmədilər. Həmçinin, bu hissəciklər aglütinasiyadan məsuldur. Grützner və digərləri27 epididimal epitel hüceyrələrinin tək məsaməli toxum yollarının əmələ gəlməsi üçün tələb olunan spesifik bir zülal istehsal etdiyini və ifraz etdiyini bildirdilər. Müəlliflər həmçinin bu dəstələrin dağılmasının epididimal zülalların qarşılıqlı təsirindən asılı olduğunu bildirirlər. Nikson və digərləri28 adneksaların turşu sisteinlə zəngin osteonektin olan bir zülal ifraz etdiyini aşkar etdilər; SPARC qısa dimdikli exidnalarda və platypuslarda sperma dəstələrinin əmələ gəlməsində iştirak edir. Bu şüaların səpələnməsi bu zülalın itirilməsi ilə əlaqələndirilir.
Hazırkı tədqiqatda elektron mikroskopiyasından istifadə edərək aparılan ultrastruktur analiz spermatozoidlərin çox miqdarda sıx materiala yapışdığını göstərdi. Bu maddələrin yapışqan başlar arasında və ətrafında kondensasiya edən, lakin quyruq bölgəsində daha aşağı konsentrasiyalarda olan aglütinasiyadan məsul olduğu düşünülür. Ejakulyasiya zamanı spermanın limfa və seminal plazmadan ayrıldığını tez-tez müşahidə etdiyimiz üçün bu aglütinasiya edən maddənin sperma ilə birlikdə erkək reproduktiv sistemindən (epididimis və ya vas deferens) xaric olduğunu güman edirik. Quş spermatozoidlərinin epididimis və vas deferensdən keçdikcə zülallara bağlanmaq və plazma lemması ilə əlaqəli qlikoproteinlər əldə etmək qabiliyyətini dəstəkləyən yetkinləşmə ilə əlaqəli dəyişikliklərə məruz qaldıqları bildirilib. Bu zülalların SST-də rezident sperma membranlarında davamlılığı, bu zülalların sperma membranının sabitliyinin əldə edilməsinə 30 təsir göstərə biləcəyini və onların məhsuldarlığını 31 təyin edə biləcəyini göstərir. Əhməd və digərləri32 bildirmişdir ki, kişi reproduktiv sisteminin müxtəlif hissələrindən (xayalardan distal vas deferens-ə qədər) əldə edilən spermatozoidlər, saxlama temperaturundan asılı olmayaraq, maye saxlama şəraitində canlılığın mütərəqqi artımını göstərir və toyuqlarda canlılıq süni mayalanmadan sonra fallop borularında da artır.
Sharkashi toyuq sperma dəstələri exidnalar, platypuslar, meşə siçanları, maral siçovulları və dəniz donuzları kimi digər növlərdən fərqli xüsusiyyətlərə və funksiyalara malikdir. Sharkasi toyuqlarında sperma dəstələrinin əmələ gəlməsi tək sperma dəstələri ilə müqayisədə onların üzmə sürətini azaltdı. Lakin, bu dəstələr reoloji cəhətdən müsbət spermaların faizini artırdı və spermaların dinamik mühitdə özlərini sabitləşdirmək qabiliyyətini artırdı. Beləliklə, nəticələrimiz SST-də spermanın aglutinasiyasının uzunmüddətli sperma saxlanması ilə əlaqəli olduğuna dair əvvəlki təklifi təsdiqləyir. Həmçinin, spermanın dəstələr əmələ gətirmə meylinin SST-də sperma itkisi sürətini idarə edə biləcəyini və bu da sperma rəqabətinin nəticəsini dəyişdirə biləcəyini fərz edirik. Bu fərziyyəyə görə, aşağı aglutinasiya qabiliyyətinə malik sperma əvvəlcə SST buraxır, yüksək aglutinasiya qabiliyyətinə malik sperma isə nəslin çox hissəsini istehsal edir. Tək məsaməli sperma dəstələrinin əmələ gəlməsi faydalıdır və valideyn-övlad nisbətinə təsir göstərir, lakin fərqli bir mexanizmdən istifadə edir. Ekhidna və platypuslarda spermatozoidlər şüanın irəliləmə sürətini artırmaq üçün bir-birinə paralel şəkildə düzülür. Ekhidna dəstələri tək spermatozoidlərdən təxminən üç dəfə daha sürətli hərəkət edir. Dişilər qeyri-mütənasib olduqları və adətən bir neçə erkəklə cütləşdikləri üçün ekhidnalarda bu cür spermatozoid dəstələrinin əmələ gəlməsinin dominantlığı qorumaq üçün təkamül adaptasiyası olduğuna inanılır. Buna görə də, müxtəlif boşalmalardan gələn spermatozoidlər yumurtanın mayalanması uğrunda şiddətli rəqabət aparırlar.
Şarkasi toyuqlarının aqqlütinləşdirilmiş spermatozoidlərini fazalı kontrast mikroskopiyası ilə asanlıqla görmək mümkündür, çünki bu, spermatozoidlərin in vitro davranışını asanlıqla öyrənməyə imkan verir. Şarkasi toyuqlarında sperma dəstəsinin əmələ gəlməsinin çoxalmasını təşviq etdiyi mexanizm, bəzi plasental məməlilərdə, məsələn, meşə siçanlarında müşahidə ediləndən fərqlidir, burada bəzi spermatozoidlər yumurtalara çatır və digər əlaqəli fərdlərin yumurtalarına çatmasına və zədələnməsinə kömək edir. özünüzü sübut etmək üçün. altruistik davranış. Özünü mayalandırma 34. Spermatozoidlərdə kooperativ davranışın başqa bir nümunəsi maral siçanlarında tapılmışdır, burada spermatozoidlər ən genetik cəhətdən əlaqəli spermatozoidləri müəyyən edə və birləşə və əlaqəsiz spermatozoidlərlə müqayisədə sürətlərini artırmaq üçün kooperativ qruplar yarada bilmişlər35.
Bu tədqiqatda əldə edilən nəticələr Fomanın SWS-də spermatozoidlərin uzunmüddətli saxlanması nəzəriyyəsinə zidd deyil. Tədqiqatçılar bildirirlər ki, sperma hüceyrələri uzun müddət SST-ni örtən epitel hüceyrələrinin axınında hərəkət etməyə davam edir və müəyyən bir müddətdən sonra sperma hüceyrələrinin enerji ehtiyatları tükənir və bu da sürətin azalmasına səbəb olur ki, bu da kiçik molekulyar çəkili maddələrin xaric edilməsinə imkan verir. SST-nin lümenindən maye axını ilə spermatozoidlərin enerjisi Fallopiya borusunun boşluğu. Hazırkı tədqiqatda müşahidə etdik ki, tək spermanın yarısı axan mayelərə qarşı üzmək qabiliyyətini göstərir və dəstədəki yapışma onların müsbət reologiya göstərmək qabiliyyətini artırır. Bundan əlavə, məlumatlarımız SST-də artan laktat ifrazının rezident sperma hərəkətliliyini maneə törədə biləcəyini bildirən Matsuzaki və digərlərinin məlumatları ilə uyğun gəlir. 1 Lakin, nəticələrimiz SST-də davranışlarını aydınlaşdırmaq üçün mikrokanal daxilində dinamik bir mühitin iştirakı ilə sperma hərəkətli bağlarının əmələ gəlməsini və onların reoloji davranışını təsvir edir. Gələcək tədqiqatlar, şübhəsiz ki, tədqiqatçılara maye spermanın saxlanması və məhsuldarlıq müddətinin artırılması üçün yeni yollar inkişaf etdirməyə kömək edəcək aglütinasiyaedici maddənin kimyəvi tərkibini və mənşəyini müəyyən etməyə yönələ bilər.
Tədqiqatda sperma donorları kimi 30 həftəlik çılpaq boyunlu on beş erkək şarkasi (homoziqot dominant; Na Na) seçildi. Quşlar Misirin Aşit qubernatorluğundakı Aşit Universitetinin Kənd Təsərrüfatı Fakültəsinin Tədqiqat Quşçuluq Fermasında yetişdirildi. Quşlar fərdi qəfəslərdə (30 x 40 x 40 sm) saxlanıldı, işıq proqramına (16 saat işıq və 8 saat qaranlıq) məruz qaldı və hər biri 160 q xam protein, 2800 kkal metabolizə olunan enerji, 35 q kalsium olan bir pəhrizlə bəslənildi. Hər kiloqram pəhriz üçün 5 qram mövcud fosfor.
36, 37 məlumatlarına görə, erkəklərdən qarın masajı ilə sperma toplanmışdır. 3 gün ərzində 15 kişidən cəmi 45 sperma nümunəsi toplanmışdır. Sperma (n = 15/gün) dərhal 1:1 (h:h) nisbətində kalium difosfat (1.27 q), mononatrium qlütamat monohidrat (0.867 q), fruktoza (0.5 gün) susuz natrium asetat (0.43 q), tris(hidroksimetil)aminometan (0.195 q), kalium sitrat monohidrat (0.064 q), kalium monofosfat (0.065 q), maqnezium xlorid (0.034 q) və H2O (100 ml) ehtiva edən Belsville Poultry Semen Durulayıcısı ilə durulaşdırılmışdır, pH = 7,5, osmolyarlıq 333 mOsm/kq38. Seyreltilmiş sperma nümunələri əvvəlcə sperma keyfiyyətinin (nəmliyinin) yaxşı olduğundan əmin olmaq üçün işıq mikroskopu altında araşdırıldı və sonra toplandıqdan sonra yarım saat ərzində istifadəyə qədər 37°C-də su hamamında saxlanıldı.
Spermatozoidlərin kinematikası və reologiyası mikrofluidik cihazlar sistemi istifadə edilərək təsvir edilmişdir. Sperma nümunələri Beltsville Quş Sperması Durulayıcısında 1:40 nisbətinə qədər durulaşdırıldı, mikrofluidik cihaza yükləndi (aşağıya baxın) və kinetik parametrlər əvvəllər mikrofluidik xarakteristikası üçün hazırlanmış Kompüterləşdirilmiş Sperma Analizi (CASA) sistemi istifadə edilərək təyin edildi. Maye mühitdə spermatozoidlərin hərəkətliliyi (Mexanika Mühəndisliyi Bölümü, Mühəndislik Fakültəsi, Assiut Universiteti, Misir). Plagini bu ünvandan yükləyə bilərsiniz: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39. Əyri sürət (VCL, μm/s), xətti sürət (VSL, μm/s) və orta trayektoriya sürəti (VAP, μm/s) ölçüldü. Spermatozoidlərin videoları Tucson ISH1000 kamerasına 30 kadr/s sürətlə 3 saniyə ərzində qoşulmuş tərs Optika XDS-3 fazalı kontrast mikroskopu (40x obyektivli) istifadə edilərək çəkildi. Nümunə üçün ən azı üç sahəni və 500 sperma trayektoriyasını öyrənmək üçün CASA proqram təminatından istifadə edin. Yazılan video evdə hazırlanmış CASA istifadə edilərək işlənmişdir. CASA plaginində hərəkətliliyin tərifi spermanın axın sürətinə nisbətən üzmə sürətinə əsaslanır və yan-yana hərəkət kimi digər parametrləri əhatə etmir, çünki bunun maye axınında daha etibarlı olduğu aşkar edilmişdir. Reoloji hərəkət sperma hüceyrələrinin maye axını istiqamətinə qarşı hərəkəti kimi təsvir edilir. Reoloji xüsusiyyətlərə malik spermatozoidlər hərəkətli spermatozoidlərin sayına bölündü; istirahətdə olan və konvektiv hərəkət edən spermatozoidlər saymadan çıxarıldı.
İstifadə olunan bütün kimyəvi maddələr, başqa cür qeyd edilmədiyi təqdirdə, Elgomhoria Pharmaceuticals (Qahirə, Misir) şirkətindən əldə edilmişdir. Cihaz, El-sherry və digərləri tərəfindən təsvir edildiyi kimi, bəzi dəyişikliklərlə istehsal edilmişdir. 40. Mikrokanalların hazırlanması üçün istifadə olunan materiallara şüşə lövhələr (Howard Glass, Worcester, MA), SU-8-25 mənfi müqavimətli (MicroChem, Newton, CA), diaseton spirti (Sigma Aldrich, Steinheim, Almaniya) və poliaseton daxildir. -184, Dow Corning, Midland, Michigan). Mikrokanallar yumşaq litoqrafiya istifadə edilərək hazırlanır. Əvvəlcə yüksək qətnaməli printerdə istənilən mikrokanal dizaynına malik şəffaf qoruyucu üz maskası çap edilmişdir (Prismatic, Cairo, Egypt and Pacific Arts and Design, Markham, ON). Ustalar substrat kimi şüşə lövhələrdən istifadə edilərək hazırlanmışdır. Plitələr aseton, izopropanol və deionlaşdırılmış suda təmizlənmiş və sonra spin örtüklə (3000 dövr/dəq, 1 dəq) 20 µm SU8-25 təbəqəsi ilə örtülmüşdür. Daha sonra SU-8 təbəqələri yavaşca quruduldu (65°C, 2 dəq və 95°C, 10 dəq) və 50 saniyə UB şüalarına məruz qoyuldu. Açıq SU-8 təbəqələrini çarpaz birləşdirmək üçün məruz qaldıqdan sonra 65°C və 95°C-də 1 dəq və 4 dəqiqə bişirin, ardınca 6,5 ​​dəqiqə diaseton spirtində hazırlayın. SU-8 təbəqəsini daha da bərkitmək üçün vafliləri bərk bişirin (200°C, 15 dəq).
PDMS, monomer və sertləşdiricini 10:1 çəki nisbətində qarışdırmaqla hazırlanmış, sonra vakuum quruducuda qazsızlaşdırılmış və SU-8 əsas çərçivəsinə tökülmüşdür. PDMS sobada (120°C, 30 dəq) bərkidilmişdir, sonra kanallar kəsilmiş, əsasdan ayrılmış və boruların mikrokanalın giriş və çıxışına qoşulması üçün perforasiya edilmişdir. Nəhayət, PDMS mikrokanalları başqa yerdə təsvir edildiyi kimi portativ korona prosessoru (Electro-Technic Products, Çikaqo, IL) istifadə edərək mikroskop slaydlarına daimi olaraq birləşdirilmişdir. Bu tədqiqatda istifadə edilən mikrokanalın ölçüsü 200 µm × 20 µm (W × H) və uzunluğu 3,6 sm-dir.
Mikrokanalın içərisindəki hidrostatik təzyiq tərəfindən induksiya edilən maye axını, giriş rezervuarındakı maye səviyyəsinin çıxış rezervuarındakı hündürlük fərqi Δh39-dan yuxarıda saxlanılması ilə əldə edilir (Şəkil 1).
burada f sürtünmə əmsalıdır və düzbucaqlı kanalda laminar axın üçün f = C/Re kimi təyin olunur, burada C kanalın aspekt nisbətindən asılı olaraq sabitdir, L mikrokanalın uzunluğudur, Vav mikrokanal daxilindəki orta sürətdir, Dh kanalın hidravlik diametridir, g isə cazibə qüvvəsinin sürətlənməsidir. Bu tənlikdən istifadə edərək, orta kanal sürəti aşağıdakı tənlikdən istifadə etməklə hesablana bilər: