Cảm ơn bạn đã ghé thăm Nature.com. Phiên bản trình duyệt bạn đang sử dụng có hỗ trợ CSS hạn chế. Để có trải nghiệm tốt nhất, chúng tôi khuyên bạn nên sử dụng trình duyệt được cập nhật (hoặc tắt Chế độ tương thích trong Internet Explorer). Trong thời gian chờ đợi, để đảm bảo hỗ trợ liên tục, chúng tôi sẽ hiển thị trang web mà không có kiểu dáng và JavaScript.
Khả năng sinh sản của chim phụ thuộc vào khả năng lưu trữ đủ lượng tinh trùng khả dụng trong một thời gian dài trong các ống chứa tinh trùng (SST). Cơ chế chính xác mà tinh trùng đi vào, cư trú và rời khỏi SST vẫn còn gây tranh cãi. Tinh trùng của gà mái Sharkasi cho thấy xu hướng kết tụ cao, tạo thành các bó sợi di động chứa nhiều tế bào. Do khó quan sát khả năng vận động và hành vi của tinh trùng trong ống dẫn trứng mờ đục, chúng tôi đã sử dụng thiết bị vi lưu với mặt cắt ngang kênh vi mô tương tự như của tinh trùng để nghiên cứu sự kết tụ và khả năng vận động của tinh trùng. Nghiên cứu này thảo luận về cách các bó tinh trùng hình thành, cách chúng di chuyển và vai trò có thể có của chúng trong việc kéo dài thời gian cư trú của tinh trùng trong SST. Chúng tôi đã nghiên cứu vận tốc và hành vi lưu biến của tinh trùng khi dòng chảy chất lỏng được tạo ra trong kênh vi lưu bằng áp suất thủy tĩnh (tốc độ dòng chảy = 33 µm/s). Tinh trùng có xu hướng bơi ngược dòng (tính chất lưu biến dương) và vận tốc của bó tinh trùng giảm đáng kể so với tinh trùng đơn lẻ. Người ta quan sát thấy các bó tinh trùng di chuyển theo hình xoắn ốc và tăng chiều dài cũng như độ dày khi có thêm nhiều tinh trùng đơn lẻ được tập hợp lại. Người ta quan sát thấy các bó tinh trùng tiến lại gần và bám vào thành bên của các kênh vi lưu để tránh bị cuốn trôi bởi vận tốc dòng chảy > 33 µm/s. Người ta quan sát thấy các bó tinh trùng tiến lại gần và bám vào thành bên của các kênh vi lưu để tránh bị cuốn trôi bởi vận tốc dòng chảy > 33 µm/s. Vì vậy, bạn có thể sử dụng các công cụ hỗ trợ và quản lý tài sản của mình để có được một khoản vay hợp lý каналов, чтобы избежать сметания со скоростью потока жидкости> 33 mкм / с. Người ta quan sát thấy các bó tinh trùng tiếp cận và bám vào thành bên của các kênh vi lưu để tránh bị cuốn trôi khi tốc độ dòng chảy >33 µm/s.33 µm/s 扫过。33 µm/s Vì vậy, bạn có thể sử dụng một công cụ để có được một khoản vay hợp lý và một công cụ có thể giúp bạn có được một khoản tiền lớn канала, чтобы избежать сметания потоком жидкости со скоростью > 33 mкм/с. Người ta quan sát thấy các bó tinh trùng tiếp cận và bám vào thành bên của kênh vi lưu để tránh bị cuốn trôi bởi dòng chảy chất lỏng ở tốc độ >33 µm/s.Kính hiển vi điện tử quét và truyền qua cho thấy các bó tinh trùng được nâng đỡ bởi một lượng lớn vật chất đặc. Dữ liệu thu được chứng minh tính di động độc đáo của tinh trùng gà Sharkazi, cũng như khả năng kết tụ và tạo thành các bó di động của tinh trùng, góp phần hiểu rõ hơn về việc bảo quản tinh trùng lâu dài trong SMT.
Để thụ tinh ở người và hầu hết các loài động vật, tinh trùng và trứng phải đến đúng vị trí thụ tinh. Do đó, việc giao phối phải xảy ra trước hoặc vào thời điểm rụng trứng. Mặt khác, một số loài động vật có vú, chẳng hạn như chó, cũng như các loài không phải động vật có vú, chẳng hạn như côn trùng, cá, bò sát và chim, lưu trữ tinh trùng trong cơ quan sinh sản của chúng trong một thời gian dài cho đến khi trứng sẵn sàng để thụ tinh (thụ tinh không đồng bộ 1). Chim có khả năng duy trì khả năng sống của tinh trùng có thể thụ tinh cho trứng trong vòng 2-10 tuần2.
Đây là một đặc điểm độc đáo giúp phân biệt chim với các loài động vật khác, vì nó mang lại xác suất thụ tinh cao sau một lần thụ tinh nhân tạo trong vài tuần mà không cần giao phối và rụng trứng đồng thời. Cơ quan lưu trữ tinh trùng chính, được gọi là ống lưu trữ tinh trùng (SST), nằm trong các nếp gấp niêm mạc bên trong tại chỗ nối tử cung - âm đạo. Cho đến nay, cơ chế tinh trùng đi vào, lưu trú và rời khỏi ngân hàng tinh trùng vẫn chưa được hiểu đầy đủ. Dựa trên các nghiên cứu trước đây, nhiều giả thuyết đã được đưa ra, nhưng chưa có giả thuyết nào được xác nhận.
Forman4 đưa ra giả thuyết rằng tinh trùng duy trì nơi cư trú của chúng trong khoang SST thông qua chuyển động dao động liên tục ngược chiều dòng chảy của chất lỏng qua các kênh protein nằm trên các tế bào biểu mô SST (tính lưu biến). ATP bị cạn kiệt do hoạt động roi liên tục cần thiết để giữ tinh trùng trong lòng SST và khả năng vận động cuối cùng giảm dần cho đến khi tinh trùng được dòng chảy chất lỏng đưa ra khỏi ngân hàng tinh trùng và bắt đầu một hành trình mới xuống ống dẫn trứng để thụ tinh cho trứng (Forman4). Mô hình lưu trữ tinh trùng này được hỗ trợ bởi việc phát hiện bằng phương pháp miễn dịch tế bào học các aquaporin 2, 3 và 9 có trong các tế bào biểu mô SST. Cho đến nay, các nghiên cứu về tính lưu biến của tinh dịch gà và vai trò của nó trong việc lưu trữ SST, chọn lọc tinh trùng qua âm đạo và cạnh tranh tinh trùng còn thiếu. Ở gà, tinh trùng đi vào âm đạo sau khi giao phối tự nhiên, nhưng hơn 80% tinh trùng bị đẩy ra khỏi âm đạo ngay sau khi giao phối. Điều này cho thấy âm đạo là nơi chính để chọn lọc tinh trùng ở chim. Ngoài ra, người ta cũng báo cáo rằng chưa đến 1% tinh trùng được thụ tinh trong âm đạo cuối cùng đến được SST2. Trong thụ tinh nhân tạo cho gà con qua đường âm đạo, số lượng tinh trùng đến được SST có xu hướng tăng lên sau 24 giờ thụ tinh. Cho đến nay, cơ chế chọn lọc tinh trùng trong quá trình này vẫn chưa rõ ràng, và khả năng vận động của tinh trùng có thể đóng vai trò quan trọng trong việc hấp thụ tinh trùng vào SST. Do thành ống dẫn trứng dày và không trong suốt, việc theo dõi trực tiếp khả năng vận động của tinh trùng trong ống dẫn trứng của chim rất khó khăn. Vì vậy, chúng ta vẫn thiếu kiến ​​thức cơ bản về cách tinh trùng di chuyển đến SST sau khi thụ tinh.
Gần đây, tính chất lưu biến đã được công nhận là một yếu tố quan trọng kiểm soát sự vận chuyển tinh trùng trong cơ quan sinh dục của động vật có vú. Dựa trên khả năng di chuyển ngược chiều của tinh trùng di động, Zaferani et al8 đã sử dụng hệ thống vi lưu Corra để phân lập thụ động tinh trùng di động từ các mẫu tinh dịch được nuôi nhốt. Loại phân loại tinh dịch này rất cần thiết cho điều trị vô sinh y tế và nghiên cứu lâm sàng, và được ưu tiên hơn các phương pháp truyền thống tốn nhiều thời gian và công sức, đồng thời có thể ảnh hưởng đến hình thái và cấu trúc của tinh trùng. Tuy nhiên, cho đến nay, chưa có nghiên cứu nào được thực hiện về ảnh hưởng của dịch tiết từ cơ quan sinh dục của gà đối với khả năng vận động của tinh trùng.
Bất kể cơ chế nào duy trì tinh trùng được lưu trữ trong SST, nhiều nhà nghiên cứu đã quan sát thấy rằng tinh trùng cư trú kết tụ lại với nhau trong SST của gà 9, 10, chim cút 2 và gà tây 11 để tạo thành các bó tinh trùng kết tụ. Các tác giả cho rằng có mối liên hệ giữa sự kết tụ này và việc lưu trữ tinh trùng lâu dài trong SST.
Tingari và Lake12 đã báo cáo về mối liên hệ chặt chẽ giữa tinh trùng trong tuyến tiếp nhận tinh trùng của gà và đặt câu hỏi liệu tinh trùng của chim có kết tụ theo cùng một cách như tinh trùng của động vật có vú hay không. Họ tin rằng mối liên kết sâu sắc giữa các tinh trùng trong ống dẫn tinh có thể là do căng thẳng gây ra bởi sự hiện diện của một lượng lớn tinh trùng trong một không gian nhỏ.
Khi đánh giá hành vi của tinh trùng trên các lam kính treo tươi, có thể quan sát thấy các dấu hiệu kết tụ thoáng qua, đặc biệt là ở rìa các giọt tinh dịch. Tuy nhiên, sự kết tụ thường bị gián đoạn bởi chuyển động quay liên tục, điều này giải thích tính chất thoáng qua của hiện tượng này. Các nhà nghiên cứu cũng nhận thấy rằng khi thêm chất pha loãng vào tinh dịch, các cụm tế bào kéo dài dạng "sợi chỉ" xuất hiện.
Những nỗ lực ban đầu nhằm mô phỏng tinh trùng được thực hiện bằng cách rút một sợi dây mỏng ra khỏi một giọt chất lỏng đang treo, kết quả là một túi hình dạng giống tinh trùng nhô ra từ giọt tinh dịch. Các tinh trùng ngay lập tức xếp thành hàng song song bên trong túi, nhưng toàn bộ đơn vị nhanh chóng biến mất do hạn chế về không gian 3D. Do đó, để nghiên cứu sự kết tụ tinh trùng, cần phải quan sát trực tiếp khả năng vận động và hành vi của tinh trùng trong các ống lưu trữ tinh trùng được phân lập, điều này rất khó thực hiện. Vì vậy, cần phải phát triển một dụng cụ mô phỏng tinh trùng để hỗ trợ các nghiên cứu về khả năng vận động và hành vi kết tụ của tinh trùng. Brillard và cộng sự¹³ báo cáo rằng chiều dài trung bình của các ống lưu trữ tinh trùng ở gà con trưởng thành là 400–600 µm, nhưng một số ống lưu trữ tinh trùng có thể dài tới 2000 µm. Mero và Ogasawara14 đã chia tuyến sinh tinh thành các ống chứa tinh trùng mở rộng và không mở rộng, cả hai đều có cùng chiều dài (~500 µm) và chiều rộng cổ (~38 µm), nhưng đường kính lòng ống trung bình lần lượt là 56,6 và 11,2 µm. Trong nghiên cứu hiện tại, chúng tôi đã sử dụng thiết bị vi lưu với kích thước kênh là 200 µm × 20 µm (W × H), có tiết diện gần giống với SST được khuếch đại. Ngoài ra, chúng tôi đã kiểm tra khả năng vận động và hành vi kết tụ của tinh trùng trong chất lỏng chảy, phù hợp với giả thuyết của Foreman rằng chất lỏng do các tế bào biểu mô SST tạo ra giữ tinh trùng trong lòng ống theo hướng ngược chiều (lưu biến).
Mục đích của nghiên cứu này là khắc phục những khó khăn trong việc quan sát khả năng vận động của tinh trùng trong ống dẫn trứng và tránh những khó khăn trong việc nghiên cứu tính chất lưu biến và hành vi của tinh trùng trong môi trường động. Một thiết bị vi lưu được sử dụng để tạo áp suất thủy tĩnh nhằm mô phỏng khả năng vận động của tinh trùng trong cơ quan sinh dục của gà.
Khi nhỏ một giọt mẫu tinh trùng pha loãng (1:40) vào thiết bị vi kênh, có thể xác định được hai loại chuyển động của tinh trùng (tinh trùng đơn lẻ và tinh trùng liên kết). Ngoài ra, tinh trùng có xu hướng bơi ngược dòng (độ nhớt dương; video 1, 2). Mặc dù các bó tinh trùng có vận tốc thấp hơn so với tinh trùng đơn lẻ (p < 0,001), nhưng chúng làm tăng tỷ lệ tinh trùng thể hiện tính hướng động dương (p < 0,001; Bảng 2). Mặc dù các bó tinh trùng có vận tốc thấp hơn so với tinh trùng đơn lẻ (p < 0,001), nhưng chúng làm tăng tỷ lệ tinh trùng thể hiện tính hướng động dương (p < 0,001; Bảng 2). Хотя пучки сперматозоидов имели более низкую скорость, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), они увеличивали процент сперматозоидов, демонстрирующих положительный реотаксис (p < 0,001; таблица 2). Mặc dù các bó tinh trùng có vận tốc thấp hơn so với tinh trùng đơn lẻ (p < 0,001), nhưng chúng làm tăng tỷ lệ tinh trùng thể hiện tính hướng động dương (p < 0,001; Bảng 2).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度（p < 0,001).尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 （p <0.001) , 但 增加 了 显示 阳性 流变性 精子百分比 （p <0,001 ； 2。。。。。。）)）)）) Хотя скорость пучков сперматозоидов была ниже, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), они увеличивали процент сперматозоидов с положительной реологией (p < 0,001; таблица 2). Mặc dù tốc độ của các bó tinh trùng thấp hơn so với tốc độ của từng tinh trùng riêng lẻ (p < 0,001), nhưng chúng làm tăng tỷ lệ tinh trùng có đặc tính lưu biến dương tính (p < 0,001; Bảng 2).Tỷ lệ đáp ứng dương tính đối với tinh trùng đơn lẻ và chùm tinh trùng được ước tính lần lượt là khoảng 53% và 85%.
Người ta quan sát thấy rằng tinh trùng của gà Sharkashi ngay sau khi xuất tinh tạo thành các bó thẳng, bao gồm hàng chục cá thể. Các bó này tăng chiều dài và độ dày theo thời gian và có thể tồn tại trong ống nghiệm vài giờ trước khi tan biến (video 3). Các bó sợi này có hình dạng giống như tinh trùng của loài echidna hình thành ở cuối mào tinh hoàn. Tinh dịch gà Sharkashi được phát hiện có xu hướng kết tụ cao và tạo thành bó lưới trong vòng chưa đầy một phút sau khi thu thập. Các bó này rất linh động và có khả năng bám vào bất kỳ bức tường hoặc vật thể tĩnh nào gần đó. Mặc dù các bó tinh trùng làm giảm tốc độ của tế bào tinh trùng, nhưng rõ ràng là về mặt vĩ mô, chúng làm tăng tính thẳng của chúng. Chiều dài của các bó thay đổi tùy thuộc vào số lượng tinh trùng được thu thập trong các bó. Hai phần của bó được phân lập: phần đầu, bao gồm phần đầu tự do của tinh trùng kết tụ, và phần cuối, bao gồm đuôi và toàn bộ phần cuối xa của tinh trùng. Sử dụng camera tốc độ cao (950 khung hình/giây), người ta quan sát thấy các đầu tinh trùng tự do kết dính ở phần đầu của bó, chịu trách nhiệm cho sự chuyển động của bó do chuyển động dao động của chúng, kéo các đầu còn lại vào bó theo chuyển động xoắn ốc (Video 4). Tuy nhiên, trong các chùm tinh trùng dài, người ta quan sát thấy một số đầu tinh trùng tự do bám vào thân và phần cuối của chùm hoạt động như cánh quạt giúp đẩy chùm tinh trùng đi.
Trong dòng chảy chậm của chất lỏng, các bó tinh trùng di chuyển song song với nhau, tuy nhiên, chúng bắt đầu chồng chéo lên nhau và bám vào mọi thứ đứng yên để không bị cuốn trôi bởi dòng chảy khi tốc độ dòng chảy tăng lên. Các bó hình thành khi một nhóm tế bào tinh trùng tiến lại gần nhau, chúng bắt đầu di chuyển đồng bộ và quấn quanh nhau, sau đó bám vào một chất dính. Hình 1 và 2 cho thấy cách các tinh trùng tiến lại gần nhau, tạo thành một điểm nối khi đuôi quấn quanh nhau.
Các nhà nghiên cứu đã sử dụng áp suất thủy tĩnh để tạo dòng chảy chất lỏng trong một kênh dẫn siêu nhỏ nhằm nghiên cứu tính chất lưu biến của tinh trùng. Một kênh dẫn siêu nhỏ có kích thước 200 µm × 20 µm (chiều rộng × chiều cao) và chiều dài 3,6 µm đã được sử dụng. Các kênh dẫn siêu nhỏ được đặt giữa các bình chứa có gắn ống tiêm ở hai đầu. Thuốc nhuộm thực phẩm được sử dụng để làm cho các kênh dễ nhìn thấy hơn.
Buộc các dây cáp kết nối và phụ kiện vào tường. Video được quay bằng kính hiển vi tương phản pha. Mỗi hình ảnh đều thể hiện hình ảnh hiển vi tương phản pha và hình ảnh bản đồ. (A) Sự kết nối giữa hai dòng chảy cản trở dòng chảy do chuyển động xoắn ốc (mũi tên đỏ). (B) Sự kết nối giữa bó ống và thành kênh (mũi tên đỏ), đồng thời chúng được kết nối với hai bó khác (mũi tên vàng). (C) Các bó tinh trùng trong kênh vi lưu bắt đầu kết nối với nhau (mũi tên đỏ), tạo thành một mạng lưới các bó tinh trùng. (D) Sự hình thành mạng lưới các bó tinh trùng.
Khi một giọt tinh trùng pha loãng được đưa vào thiết bị vi lưu và tạo ra dòng chảy, người ta quan sát thấy chùm tinh trùng di chuyển ngược chiều dòng chảy. Các bó tinh trùng bám sát vào thành của các kênh vi lưu, và các đầu tinh trùng tự do ở phần đầu của các bó cũng bám sát vào thành (video 5). Chúng cũng bám vào bất kỳ hạt tĩnh nào trên đường đi, chẳng hạn như mảnh vụn, để chống lại việc bị cuốn trôi bởi dòng chảy. Theo thời gian, những chùm tinh trùng này trở thành những sợi dài giữ lại các tinh trùng đơn lẻ khác và các chùm ngắn hơn (Video 6). Khi dòng chảy bắt đầu chậm lại, các hàng tinh trùng dài bắt đầu hình thành một mạng lưới các hàng tinh trùng (Video 7; Hình 2).
Ở vận tốc dòng chảy cao (V > 33 µm/s), chuyển động xoắn ốc của các sợi tơ tăng lên nhằm mục đích bắt giữ nhiều tinh trùng riêng lẻ, tạo thành các bó giúp chống lại lực trôi dạt của dòng chảy tốt hơn. Ở vận tốc dòng chảy cao (V > 33 µm/s), chuyển động xoắn ốc của các sợi tơ tăng lên nhằm mục đích bắt giữ nhiều tinh trùng riêng lẻ, tạo thành các bó giúp chống lại lực trôi dạt của dòng chảy tốt hơn. При высокой скорости потока (V > 33 мкм/с) спиралевидные движения нитей усиливаются, поскольку они một người có thể kiếm được nhiều tiền hơn сперматозоидов, образующих пучки, которые лучше противостоят дрейфующей силе потока. Ở tốc độ dòng chảy cao (V > 33 µm/s), chuyển động xoắn ốc của các sợi tăng lên khi chúng cố gắng bắt giữ nhiều tinh trùng riêng lẻ, tạo thành các bó có khả năng chống lại lực trôi dạt của dòng chảy tốt hơn.在高流速(V > 33 µm/s)时螺纹的螺旋运动增加,以试图捕捉许多形成束的单个精子,从而更好地抵抗流动的漂移力。在 高 流速 (v> 33 µm/s) 时 , 的 螺旋 运动 增加 , 以 试图 许多 形成 束 单 个 精子 , 从而 更地 抵抗 的 漂移力。。。。。。。。。。 При высоких скоростях потока (V > 33 мкм/с) спиральное движение нитей увеличивается в попытке захватить множество отдельных сперматозоидов, образующих пучки, чтобы лучше сопротивляться силам дрейфа потока. Ở tốc độ dòng chảy cao (V > 33 µm/s), chuyển động xoắn ốc của các sợi tăng lên nhằm mục đích bắt giữ nhiều tinh trùng riêng lẻ, tạo thành các bó để chống lại lực trôi dạt của dòng chảy tốt hơn.Họ cũng đã thử gắn các kênh siêu nhỏ vào thành bên.
Các bó tinh trùng được xác định là các cụm đầu tinh trùng và đuôi cuộn tròn bằng kính hiển vi quang học (LM). Các bó tinh trùng với nhiều cấu trúc tập hợp khác nhau cũng được xác định là các cụm đầu xoắn và roi, nhiều đuôi tinh trùng hợp nhất, đầu tinh trùng gắn vào đuôi, và đầu tinh trùng có nhân bị uốn cong như nhiều nhân hợp nhất. Kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM). Kính hiển vi điện tử quét (SEM) cho thấy các bó tinh trùng là các cụm đầu tinh trùng được bao bọc và các cụm tinh trùng cho thấy một mạng lưới các đuôi được quấn quanh gắn liền với nhau.
Hình thái và cấu trúc siêu hiển vi của tinh trùng, sự hình thành các bó tinh trùng được nghiên cứu bằng kính hiển vi quang học (cắt nửa), kính hiển vi điện tử quét (SEM) và kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM). Các tiêu bản tinh trùng được nhuộm bằng acridine orange và kiểm tra bằng kính hiển vi huỳnh quang.
Nhuộm tiêu bản tinh trùng bằng acridine orange (Hình 3B) cho thấy đầu tinh trùng dính lại với nhau và được bao phủ bởi chất tiết, dẫn đến sự hình thành các chùm lớn (Hình 3D). Các bó tinh trùng bao gồm các cụm tinh trùng với một mạng lưới các đuôi gắn liền (Hình 4A-C). Các bó tinh trùng được cấu tạo từ đuôi của nhiều tinh trùng dính lại với nhau (Hình 4D). Chất tiết (Hình 4E,F) bao phủ đầu của các bó tinh trùng.
Sự hình thành bó tinh trùng: Sử dụng kính hiển vi tương phản pha và tiêu bản tinh trùng nhuộm bằng acridine orange, cho thấy đầu của các tinh trùng dính lại với nhau. (A) Sự hình thành búi tinh trùng ban đầu bắt đầu với một tinh trùng (vòng tròn trắng) và ba tinh trùng (vòng tròn vàng), với hình xoắn ốc bắt đầu từ đuôi và kết thúc ở đầu. (B) Ảnh chụp hiển vi của tiêu bản tinh trùng nhuộm bằng acridine orange cho thấy các đầu tinh trùng dính lại với nhau (mũi tên). Chất tiết bao phủ đầu tinh trùng. Độ phóng đại × 1000. (C) Sự phát triển của một chùm tia lớn được vận chuyển bởi dòng chảy trong kênh vi lỏng (sử dụng camera tốc độ cao ở 950 khung hình/giây). (D) Ảnh chụp hiển vi của tiêu bản tinh trùng nhuộm bằng acridine orange cho thấy các búi lớn (mũi tên). Độ phóng đại: ×200.
Ảnh hiển vi điện tử quét của một chùm tinh trùng và một tiêu bản tinh trùng nhuộm bằng acridine orange. (A, B, D, E) là ảnh hiển vi điện tử quét màu kỹ thuật số của tinh trùng, và C và F là ảnh hiển vi của tiêu bản tinh trùng nhuộm acridine orange cho thấy sự bám dính của nhiều tinh trùng quấn quanh màng đuôi. (AC) Các cụm tinh trùng được thể hiện dưới dạng mạng lưới các đuôi bám dính (mũi tên). (D) Sự bám dính của một số tinh trùng (với chất kết dính, viền hồng, mũi tên) quấn quanh đuôi. (E và F) Các cụm đầu tinh trùng (con trỏ) được bao phủ bởi chất kết dính (con trỏ). Các tinh trùng tạo thành các bó với một số cấu trúc giống như xoáy (F). (C) Độ phóng đại ×400 và (F) ×200.
Sử dụng kính hiển vi điện tử truyền qua, chúng tôi nhận thấy các bó tinh trùng có đuôi gắn liền (Hình 6A, C), đầu gắn liền với đuôi (Hình 6B), hoặc đầu gắn liền với đuôi (Hình 6D). Đầu của các tinh trùng trong bó cong, mặt cắt thể hiện hai vùng nhân (Hình 6D). Trong bó bị rạch, tinh trùng có đầu xoắn với hai vùng nhân và nhiều vùng roi (Hình 5A).
Ảnh hiển vi điện tử màu kỹ thuật số cho thấy các đuôi nối trong bó tinh trùng và chất kết dính nối các đầu tinh trùng. (A) Đuôi gắn liền của một số lượng lớn tinh trùng. Lưu ý hình dạng của đuôi trong cả hình chiếu dọc (mũi tên) và hình chiếu ngang (mũi tên). (B) Đầu (mũi tên) của tinh trùng được nối với đuôi (mũi tên). (C) Một số đuôi tinh trùng (mũi tên) được gắn liền. (D) Chất kết dính (AS, màu xanh lam) nối bốn đầu tinh trùng (màu tím).
Kính hiển vi điện tử quét được sử dụng để phát hiện đầu tinh trùng trong các bó tinh trùng được bao phủ bởi dịch tiết hoặc màng (Hình 6B), cho thấy các bó tinh trùng được neo giữ bởi vật liệu ngoại bào. Vật liệu kết dính tập trung ở đầu tinh trùng (cấu trúc giống đầu sứa; Hình 5B) và lan rộng về phía xa, tạo ra màu vàng rực rỡ dưới kính hiển vi huỳnh quang khi nhuộm bằng acridine orange (Hình 6C). Chất này có thể nhìn thấy rõ ràng dưới kính hiển vi quét và được coi là chất kết dính. Các lát cắt bán mỏng (Hình 5C) và các tiêu bản tinh trùng được nhuộm bằng acridine orange cho thấy các bó tinh trùng chứa các đầu tinh trùng xếp chặt và đuôi cuộn tròn (Hình 5D).
Các ảnh hiển vi khác nhau cho thấy sự tập hợp của đầu tinh trùng và đuôi gấp khúc bằng nhiều phương pháp khác nhau. (A) Ảnh hiển vi điện tử truyền qua màu kỹ thuật số mặt cắt ngang của một bó tinh trùng cho thấy đầu tinh trùng cuộn tròn với nhân hai phần (màu xanh lam) và một số phần roi (màu xanh lục). (B) Ảnh hiển vi điện tử quét màu kỹ thuật số cho thấy một cụm đầu tinh trùng giống sứa (mũi tên) dường như bị bao phủ. (C) Mặt cắt bán mỏng cho thấy các đầu tinh trùng tập hợp (mũi tên) và đuôi cuộn (mũi tên). (D) Ảnh hiển vi của một mẫu tinh trùng được nhuộm bằng acridine orange cho thấy các cụm đầu tinh trùng (mũi tên) và đuôi cuộn dính (mũi tên). Lưu ý rằng một chất dính (S) bao phủ đầu của tinh trùng. (D) Độ phóng đại × 1000.
Sử dụng kính hiển vi điện tử truyền qua (Hình 7A), người ta cũng nhận thấy đầu tinh trùng bị xoắn và nhân có hình xoắn ốc, điều này được xác nhận bằng cách nhuộm tiêu bản tinh trùng bằng acridine orange và kiểm tra bằng kính hiển vi huỳnh quang (Hình 7B).
(A) Ảnh hiển vi điện tử truyền qua màu kỹ thuật số và (B) Tiêu bản tinh trùng nhuộm acridine orange cho thấy đầu cuộn tròn và sự gắn kết của đầu và đuôi tinh trùng (mũi tên). (B) Độ phóng đại × 1000.
Một phát hiện thú vị là tinh trùng của cá Sharkazi tập hợp lại thành các bó sợi di động. Đặc tính của các bó sợi này cho phép chúng ta hiểu được vai trò tiềm năng của chúng trong việc hấp thụ và lưu trữ tinh trùng trong SST.
Sau khi giao phối, tinh trùng đi vào âm đạo và trải qua quá trình chọn lọc gắt gao, dẫn đến chỉ một số lượng tinh trùng hạn chế đi vào SST15,16. Cho đến nay, cơ chế tinh trùng đi vào và đi ra khỏi SST vẫn chưa rõ ràng. Ở gia cầm, tinh trùng được lưu trữ trong SST trong một thời gian dài từ 2 đến 10 tuần, tùy thuộc vào loài6. Vẫn còn nhiều tranh cãi về tình trạng của tinh dịch trong quá trình lưu trữ ở SST. Chúng đang chuyển động hay ở trạng thái nghỉ? Nói cách khác, làm thế nào các tế bào tinh trùng duy trì vị trí của chúng trong SST lâu như vậy?
Forman4 đề xuất rằng sự cư trú và phóng thích tinh trùng trong SST có thể được giải thích dựa trên khả năng vận động của tinh trùng. Các tác giả đưa ra giả thuyết rằng tinh trùng duy trì vị trí của chúng bằng cách bơi ngược dòng chất lỏng do biểu mô SST tạo ra và tinh trùng bị phóng thích khỏi SST khi vận tốc của chúng giảm xuống dưới điểm mà chúng bắt đầu di chuyển ngược lại do thiếu năng lượng. Zaniboni5 đã xác nhận sự hiện diện của aquaporin 2, 3 và 9 ở phần đỉnh của tế bào biểu mô SST, điều này có thể gián tiếp hỗ trợ mô hình lưu trữ tinh trùng của Foreman. Trong nghiên cứu hiện tại, chúng tôi nhận thấy rằng gần một nửa số tinh trùng của Sharkashi cho thấy tính lưu biến dương trong chất lỏng chảy và các bó tinh trùng kết tụ làm tăng số lượng tinh trùng cho thấy tính lưu biến dương, mặc dù sự kết tụ làm chậm chúng lại. Cơ chế di chuyển của tế bào tinh trùng lên ống dẫn trứng của chim đến vị trí thụ tinh vẫn chưa được hiểu đầy đủ. Ở động vật có vú, dịch nang trứng có tác dụng hóa học thu hút tinh trùng. Tuy nhiên, chất dẫn dụ hóa học được cho là hướng tinh trùng tiếp cận những khoảng cách xa hơn7. Do đó, các cơ chế khác chịu trách nhiệm cho việc vận chuyển tinh trùng. Khả năng định hướng và di chuyển ngược chiều dòng dịch ống dẫn trứng được tiết ra sau khi giao phối của tinh trùng được báo cáo là một yếu tố chính trong việc nhắm mục tiêu tinh trùng ở chuột. Parker 17 cho rằng tinh trùng vượt qua ống dẫn trứng bằng cách bơi ngược chiều dòng lông mao ở chim và bò sát. Mặc dù chưa được chứng minh bằng thực nghiệm ở chim, Adolphi18 là người đầu tiên phát hiện ra rằng tinh trùng chim cho kết quả dương tính khi tạo ra một lớp chất lỏng mỏng giữa lam kính và phiến kính bằng một dải giấy lọc. Hino và Yanagimachi [19] đặt phức hợp buồng trứng-ống dẫn trứng-tử cung của chuột vào một vòng tưới và tiêm 1 µl mực vào eo để hình dung dòng chảy chất lỏng trong ống dẫn trứng. Họ nhận thấy chuyển động co và giãn rất tích cực trong ống dẫn trứng, trong đó tất cả các giọt mực đều di chuyển đều đặn về phía bóng của ống dẫn trứng. Các tác giả nhấn mạnh tầm quan trọng của dòng chảy dịch ống dẫn trứng từ phần dưới lên phần trên đối với sự nâng đỡ của tinh trùng và quá trình thụ tinh. Brillard20 báo cáo rằng ở gà và gà tây, tinh trùng di chuyển bằng chuyển động chủ động từ cửa âm đạo, nơi chúng được lưu trữ, đến chỗ nối tử cung-âm đạo, nơi chúng được lưu trữ. Tuy nhiên, chuyển động này không cần thiết giữa chỗ nối tử cung-âm đạo và phễu dẫn trứng vì tinh trùng được vận chuyển bằng sự dịch chuyển thụ động. Biết được những khuyến nghị trước đây và kết quả thu được trong nghiên cứu hiện tại, có thể giả định rằng khả năng di chuyển ngược dòng của tinh trùng (tính lưu biến) là một trong những đặc tính mà quá trình chọn lọc dựa trên đó. Điều này quyết định sự di chuyển của tinh trùng qua âm đạo và sự xâm nhập của chúng vào ống dẫn trứng để lưu trữ. Như Forman4 đã gợi ý, điều này cũng có thể tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình tinh trùng đi vào ống dẫn trứng và môi trường sống của nó trong một khoảng thời gian và sau đó thoát ra khi tốc độ của chúng bắt đầu chậm lại.
Mặt khác, Matsuzaki và Sasanami 21 cho rằng tinh trùng chim trải qua những thay đổi về khả năng vận động từ trạng thái ngủ đông sang trạng thái vận động trong đường sinh sản của cả con đực và con cái. Sự ức chế khả năng vận động của tinh trùng cư trú trong SST được cho là nguyên nhân giải thích thời gian lưu trữ lâu dài của tinh trùng và sau đó là sự trẻ hóa sau khi rời khỏi SST. Trong điều kiện thiếu oxy, Matsuzaki và cộng sự 1 đã báo cáo sự sản sinh và giải phóng lactate cao trong SST, điều này có thể dẫn đến ức chế khả năng vận động của tinh trùng cư trú. Trong trường hợp này, tầm quan trọng của đặc tính lưu biến của tinh trùng được thể hiện ở sự chọn lọc và hấp thụ tinh trùng, chứ không phải ở khả năng lưu trữ của chúng.
Hiện tượng kết tụ tinh trùng được coi là lời giải thích hợp lý cho thời gian lưu trữ tinh trùng dài trong ống dẫn trứng, vì đây là kiểu lưu giữ tinh trùng phổ biến ở gia cầm2,22,23. Bakst et al. 2 quan sát thấy hầu hết tinh trùng dính vào nhau, tạo thành các cụm bó, và hiếm khi tìm thấy tinh trùng đơn lẻ trong dịch tiết tinh trùng của chim cút. Mặt khác, Wen et al. 24 quan sát thấy nhiều tinh trùng phân tán hơn và ít cụm tinh trùng hơn trong lòng ống dẫn trứng ở gà. Dựa trên những quan sát này, có thể giả định rằng khả năng kết tụ tinh trùng khác nhau giữa các loài chim và giữa các tinh trùng trong cùng một lần xuất tinh. Ngoài ra, Van Krey et al. 9 cho rằng sự phân ly ngẫu nhiên của tinh trùng kết tụ là nguyên nhân dẫn đến sự thâm nhập dần dần của tinh trùng vào lòng ống dẫn trứng. Theo giả thuyết này, tinh trùng có khả năng kết tụ thấp hơn sẽ bị đẩy ra khỏi ống dẫn trứng trước. Trong bối cảnh này, khả năng kết tụ của tinh trùng có thể là một yếu tố ảnh hưởng đến kết quả cạnh tranh tinh trùng ở các loài chim có tỷ lệ thụ tinh thấp. Ngoài ra, thời gian tinh trùng kết tụ phân ly càng lâu thì khả năng sinh sản càng được duy trì.
Mặc dù sự tập hợp tinh trùng và sự kết tụ thành bó đã được quan sát thấy trong một số nghiên cứu2,22,24, nhưng chúng chưa được mô tả chi tiết do sự phức tạp trong việc quan sát động học của chúng trong SST. Một số nỗ lực đã được thực hiện để nghiên cứu sự kết tụ tinh trùng trong ống nghiệm. Sự kết tụ rộng rãi nhưng tạm thời đã được quan sát thấy khi sợi dây mỏng được lấy ra khỏi giọt tinh dịch treo lơ lửng. Điều này dẫn đến việc một bong bóng dài nhô ra từ giọt, mô phỏng tuyến sinh dục. Do những hạn chế về không gian 3D và thời gian nhỏ giọt ngắn, toàn bộ khối nhanh chóng bị hư hỏng9. Trong nghiên cứu hiện tại, sử dụng gà Sharkashi và chip vi lưu, chúng tôi đã có thể mô tả cách các chùm tinh trùng này hình thành và cách chúng di chuyển. Các bó tinh trùng hình thành ngay sau khi thu thập tinh dịch và được phát hiện di chuyển theo hình xoắn ốc, cho thấy tính lưu biến dương khi có mặt trong dòng chảy. Hơn nữa, khi quan sát bằng mắt thường, các bó tinh trùng được quan sát thấy làm tăng tính tuyến tính của chuyển động so với tinh trùng riêng lẻ. Điều này cho thấy sự kết tụ tinh trùng có thể xảy ra trước khi thâm nhập SST và việc sản xuất tinh trùng không bị giới hạn trong một khu vực nhỏ do căng thẳng như đã được đề xuất trước đây (Tingari và Lake12). Trong quá trình hình thành búi tinh trùng, các tinh trùng bơi đồng bộ cho đến khi chúng tạo thành một điểm nối, sau đó đuôi của chúng quấn quanh nhau và đầu của tinh trùng vẫn tự do, nhưng đuôi và phần xa của tinh trùng dính lại với nhau bằng một chất dính. Do đó, phần đầu tự do của dây chằng chịu trách nhiệm cho chuyển động, kéo theo phần còn lại của dây chằng. Kính hiển vi điện tử quét của các bó tinh trùng cho thấy các đầu tinh trùng được gắn kết được bao phủ bởi rất nhiều chất dính, cho thấy rằng các đầu tinh trùng được gắn kết trong các bó nghỉ, điều này có thể đã xảy ra sau khi đến vị trí lưu trữ (SST).
Khi nhuộm tiêu bản tinh trùng bằng acridine orange, chất kết dính ngoại bào xung quanh tế bào tinh trùng có thể được quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang. Chất này cho phép các bó tinh trùng bám dính vào bất kỳ bề mặt hoặc hạt nào xung quanh để chúng không bị trôi theo dòng chảy xung quanh. Do đó, quan sát của chúng tôi cho thấy vai trò của sự bám dính của tinh trùng dưới dạng các bó di động. Khả năng bơi ngược dòng và bám vào các bề mặt gần đó cho phép tinh trùng tồn tại lâu hơn trong SST.
Rothschild25 đã sử dụng camera đo tế bào máu để nghiên cứu sự phân bố nổi của tinh dịch bò trong một giọt dung dịch huyền phù, chụp ảnh hiển vi thông qua camera có cả trục quang học dọc và ngang của kính hiển vi. Kết quả cho thấy tinh trùng bị hút về phía bề mặt của buồng. Các tác giả cho rằng có thể có sự tương tác thủy động lực học giữa tinh trùng và bề mặt. Xét đến điều này, cùng với khả năng tạo thành các búi dính của tinh dịch gà Sharkashi, có thể làm tăng khả năng tinh dịch bám vào thành SST và được bảo quản trong thời gian dài.
Bccetti và Afzeliu26 báo cáo rằng lớp glycocalyx của tinh trùng là cần thiết cho sự nhận biết và kết tụ giao tử. Forman10 quan sát thấy rằng sự thủy phân các liên kết α-glycosidic trong lớp phủ glycoprotein-glycolipid bằng cách xử lý tinh dịch gia cầm với neuraminidase dẫn đến giảm khả năng sinh sản mà không ảnh hưởng đến khả năng vận động của tinh trùng. Các tác giả cho rằng tác động của neuraminidase lên lớp glycocalyx làm suy giảm sự bám dính của tinh trùng tại chỗ nối tử cung-âm đạo, do đó làm giảm khả năng sinh sản. Quan sát của họ không thể bỏ qua khả năng xử lý bằng neuraminidase có thể làm giảm khả năng nhận biết tinh trùng và trứng. Forman và Engel10 phát hiện ra rằng khả năng sinh sản bị giảm khi gà mái được thụ tinh trong âm đạo bằng tinh dịch đã được xử lý bằng neuraminidase. Tuy nhiên, thụ tinh trong ống nghiệm với tinh trùng đã được xử lý bằng neuraminidase không ảnh hưởng đến khả năng sinh sản so với gà đối chứng. Các tác giả kết luận rằng những thay đổi trong lớp phủ glycoprotein-glycolipid bao quanh màng tinh trùng làm giảm khả năng thụ tinh của tinh trùng bằng cách làm suy yếu quá trình giữ lại tinh trùng tại chỗ nối tử cung-âm đạo, từ đó làm tăng sự mất mát tinh trùng do tốc độ di chuyển của tinh trùng tại chỗ nối tử cung-âm đạo, nhưng không ảnh hưởng đến khả năng nhận diện giữa tinh trùng và trứng.
Ở gà tây, Bakst và Bauchan 11 đã tìm thấy các túi nhỏ và mảnh màng trong lòng ống dẫn tinh (SST) và quan sát thấy một số hạt này đã hợp nhất với màng tinh trùng. Các tác giả cho rằng những mối quan hệ này có thể góp phần vào việc lưu trữ tinh trùng lâu dài trong SST. Tuy nhiên, các nhà nghiên cứu không chỉ rõ nguồn gốc của các hạt này, liệu chúng được tiết ra bởi các tế bào biểu mô ống dẫn tinh (CCT), được sản xuất và tiết ra bởi hệ thống sinh sản của nam giới, hay được sản xuất bởi chính tinh trùng. Ngoài ra, các hạt này chịu trách nhiệm cho sự kết tụ. Grützner et al27 báo cáo rằng các tế bào biểu mô mào tinh hoàn sản xuất và tiết ra một loại protein đặc hiệu cần thiết cho sự hình thành các ống dẫn tinh đơn lỗ. Các tác giả cũng báo cáo rằng sự phân tán của các bó này phụ thuộc vào sự tương tác của các protein mào tinh hoàn. Nixon et al28 phát hiện ra rằng phần phụ tiết ra một loại protein, osteonectin giàu cysteine ​​có tính axit; SPARC tham gia vào sự hình thành các búi tinh trùng ở nhím mỏ ngắn và thú mỏ vịt. Sự tán xạ của các chùm tia này có liên quan đến sự mất mát của loại protein này.
Trong nghiên cứu hiện tại, phân tích cấu trúc siêu hiển vi bằng kính hiển vi điện tử cho thấy tinh trùng bám dính vào một lượng lớn vật chất đặc. Các chất này được cho là chịu trách nhiệm cho sự kết tụ giữa và xung quanh các đầu tinh trùng bám dính, nhưng ở nồng độ thấp hơn ở vùng đuôi. Chúng tôi cho rằng chất kết tụ này được bài tiết ra từ hệ thống sinh sản của con đực (mào tinh hoàn hoặc ống dẫn tinh) cùng với tinh dịch, vì chúng ta thường quan sát thấy tinh dịch tách ra khỏi dịch bạch huyết và huyết tương tinh dịch trong quá trình xuất tinh. Người ta đã báo cáo rằng khi tinh trùng chim đi qua mào tinh hoàn và ống dẫn tinh, chúng trải qua những thay đổi liên quan đến sự trưởng thành, hỗ trợ khả năng liên kết protein và thu nhận các glycoprotein liên kết với màng huyết tương. Sự tồn tại của các protein này trên màng tinh trùng cư trú trong SST cho thấy các protein này có thể ảnh hưởng đến việc đạt được sự ổn định màng tinh trùng 30 và quyết định khả năng sinh sản của chúng 31. Ahammad et al32 báo cáo rằng tinh trùng thu được từ các bộ phận khác nhau của hệ thống sinh sản nam (từ tinh hoàn đến ống dẫn tinh xa) cho thấy sự gia tăng dần về khả năng sống dưới điều kiện bảo quản trong môi trường lỏng, bất kể nhiệt độ bảo quản, và khả năng sống ở gà cũng tăng lên trong ống dẫn trứng sau khi thụ tinh nhân tạo.
Các chùm tinh trùng của gà Sharkashi có đặc điểm và chức năng khác biệt so với các loài khác như nhím gai, thú mỏ vịt, chuột rừng, chuột hươu và chuột lang. Ở gà Sharkashi, sự hình thành các bó tinh trùng làm giảm tốc độ bơi của chúng so với tinh trùng đơn lẻ. Tuy nhiên, các bó này lại làm tăng tỷ lệ tinh trùng dương tính về mặt lưu biến học và tăng khả năng tự ổn định của tinh trùng trong môi trường năng động. Do đó, kết quả của chúng tôi xác nhận giả thuyết trước đây rằng sự kết tụ tinh trùng trong SST có liên quan đến việc lưu trữ tinh trùng lâu dài. Chúng tôi cũng đưa ra giả thuyết rằng xu hướng hình thành chùm tinh trùng có thể kiểm soát tỷ lệ mất tinh trùng trong SST, điều này có thể làm thay đổi kết quả cạnh tranh tinh trùng. Theo giả thuyết này, tinh trùng có khả năng kết tụ thấp sẽ giải phóng SST trước, trong khi tinh trùng có khả năng kết tụ cao sẽ tạo ra phần lớn con cái. Sự hình thành các bó tinh trùng đơn lỗ có lợi và ảnh hưởng đến tỷ lệ cha mẹ - con cái, nhưng sử dụng một cơ chế khác. Ở loài thú lông nhím và thú mỏ vịt, tinh trùng được sắp xếp song song với nhau để tăng tốc độ di chuyển của chùm tinh trùng. Các chùm tinh trùng của thú lông nhím di chuyển nhanh hơn khoảng ba lần so với tinh trùng đơn lẻ. Người ta tin rằng sự hình thành các chùm tinh trùng như vậy ở thú lông nhím là một sự thích nghi tiến hóa để duy trì sự thống trị, vì con cái thường giao phối với nhiều con đực. Do đó, tinh trùng từ các lần xuất tinh khác nhau cạnh tranh gay gắt để thụ tinh cho trứng.
Tinh trùng kết tụ của gà Sharkasi dễ dàng quan sát bằng kính hiển vi tương phản pha, điều này được coi là có lợi vì nó cho phép dễ dàng nghiên cứu hành vi của tinh trùng trong ống nghiệm. Cơ chế hình thành búi tinh trùng thúc đẩy sinh sản ở gà Sharkasi cũng khác với cơ chế được thấy ở một số động vật có vú nhau thai thể hiện hành vi hợp tác của tinh trùng như chuột rừng, nơi một số tinh trùng tiếp cận trứng, giúp các cá thể có quan hệ huyết thống khác tiếp cận và làm tổn thương trứng của chúng để chứng minh bản thân. Hành vi vị tha. Tự thụ tinh 34. Một ví dụ khác về hành vi hợp tác ở tinh trùng được tìm thấy ở chuột hươu, nơi tinh trùng có thể nhận biết và kết hợp với các tinh trùng có quan hệ di truyền gần nhất và hình thành các nhóm hợp tác để tăng tốc độ của chúng so với các tinh trùng không có quan hệ huyết thống35.
Kết quả thu được trong nghiên cứu này không mâu thuẫn với lý thuyết của Foman về việc lưu trữ tinh trùng lâu dài trong dịch nuôi cấy tinh trùng (SWS). Các nhà nghiên cứu báo cáo rằng các tế bào tinh trùng tiếp tục di chuyển trong dòng chảy của các tế bào biểu mô lót dịch nuôi cấy tinh trùng (SST) trong một thời gian dài, và sau một khoảng thời gian nhất định, nguồn năng lượng dự trữ của các tế bào tinh trùng bị cạn kiệt, dẫn đến giảm tốc độ, cho phép đẩy các chất có trọng lượng phân tử nhỏ ra ngoài. Năng lượng của tinh trùng được giải phóng theo dòng chảy của chất lỏng từ lòng ống dẫn trứng (SST) trong khoang của ống dẫn trứng. Trong nghiên cứu hiện tại, chúng tôi quan sát thấy một nửa số tinh trùng đơn lẻ có khả năng bơi ngược dòng chất lỏng, và sự bám dính của chúng trong bó làm tăng khả năng thể hiện tính lưu biến dương tính. Hơn nữa, dữ liệu của chúng tôi phù hợp với dữ liệu của Matsuzaki et al. 1, người đã báo cáo rằng sự tăng tiết lactate trong SST có thể ức chế khả năng vận động của tinh trùng cư trú. Tuy nhiên, kết quả của chúng tôi mô tả sự hình thành các dây chằng vận động của tinh trùng và hành vi lưu biến của chúng trong môi trường động bên trong một kênh vi mô nhằm làm sáng tỏ hành vi của chúng trong SST. Các nghiên cứu trong tương lai có thể tập trung vào việc xác định thành phần hóa học và nguồn gốc của chất kết dính, điều này chắc chắn sẽ giúp các nhà nghiên cứu phát triển những phương pháp mới để bảo quản tinh dịch lỏng và kéo dài thời gian thụ thai.
Mười lăm con gà trống Sharkasi cổ trần (đồng hợp tử trội; Na Na) 30 tuần tuổi được chọn làm nguồn cung cấp tinh trùng trong nghiên cứu. Những con gà này được nuôi tại Trang trại Gia cầm Nghiên cứu thuộc Khoa Nông nghiệp, Đại học Ashit, tỉnh Ashit, Ai Cập. Gà được nhốt trong lồng riêng (30 x 40 x 40 cm), được chiếu sáng theo chu kỳ (16 giờ sáng và 8 giờ tối) và cho ăn khẩu phần chứa 160 g protein thô, 2800 kcal năng lượng chuyển hóa, 35 g canxi và 5 gam phốt pho dễ hấp thụ trên mỗi kg thức ăn.
Theo dữ liệu 36, ​​37, tinh dịch được thu thập từ nam giới bằng phương pháp xoa bóp bụng. Tổng cộng 45 mẫu tinh dịch được thu thập từ 15 người đàn ông trong 3 ngày. Tinh dịch (n = 15/ngày) được pha loãng ngay lập tức theo tỷ lệ 1:1 (v:v) với dung dịch pha loãng tinh dịch gia cầm Belsville, có chứa kali diphosphat (1,27 g), natri glutamat monohydrat (0,867 g), fructose (0,5 d), natri axetat khan (0,43 g), tris(hydroxymethyl)aminometan (0,195 g), kali citrat monohydrat (0,064 g), kali monophosphat (0,065 g), magie clorua (0,034 g) và H2O (100 ml), pH = 7,5, độ thẩm thấu 333 mOsm/kg38. Các mẫu tinh dịch pha loãng được kiểm tra dưới kính hiển vi quang học để đảm bảo chất lượng tinh dịch tốt (độ ẩm), sau đó được bảo quản trong bể nước ở 37°C cho đến khi sử dụng trong vòng nửa giờ sau khi thu thập.
Động học và đặc tính lưu biến của tinh trùng được mô tả bằng cách sử dụng hệ thống thiết bị vi lưu. Các mẫu tinh dịch được pha loãng thêm theo tỷ lệ 1:40 trong dung dịch pha loãng tinh dịch gia cầm Beltsville, được nạp vào thiết bị vi lưu (xem bên dưới), và các thông số động học được xác định bằng hệ thống Phân tích Tinh dịch Vi tính hóa (CASA) đã được phát triển trước đó để đặc trưng hóa vi lưu. (Khoa Cơ khí, Khoa Kỹ thuật, Đại học Assiut, Ai Cập). Plugin có thể được tải xuống tại: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39. Vận tốc đường cong (VCL, μm/s), vận tốc tuyến tính (VSL, μm/s) và vận tốc quỹ đạo trung bình (VAP, μm/s) đã được đo. Video về tinh trùng được quay bằng kính hiển vi tương phản pha đảo ngược Optika XDS-3 (với vật kính 40x) được kết nối với camera Tucson ISH1000 ở tốc độ 30 khung hình/giây trong 3 giây. Sử dụng phần mềm CASA để nghiên cứu ít nhất ba khu vực và 500 quỹ đạo chuyển động của tinh trùng trên mỗi mẫu. Video đã ghi được xử lý bằng phần mềm CASA tự chế. Định nghĩa về khả năng vận động trong phần mềm CASA dựa trên tốc độ bơi của tinh trùng so với tốc độ dòng chảy, và không bao gồm các thông số khác như chuyển động sang hai bên, vì điều này được cho là đáng tin cậy hơn trong dòng chảy chất lỏng. Chuyển động lưu biến được mô tả là sự chuyển động của tế bào tinh trùng ngược chiều dòng chảy của chất lỏng. Số lượng tinh trùng có đặc tính lưu biến được chia cho số lượng tinh trùng di động; tinh trùng ở trạng thái nghỉ và tinh trùng chuyển động đối lưu được loại trừ khỏi phép đếm.
Tất cả các hóa chất được sử dụng đều được lấy từ Elgomhoria Pharmaceuticals (Cairo, Ai Cập) trừ khi có ghi chú khác. Thiết bị được sản xuất theo mô tả của El-sherry et al. 40 với một số sửa đổi. Các vật liệu được sử dụng để chế tạo các vi kênh bao gồm các tấm kính (Howard Glass, Worcester, MA), chất cản quang âm SU-8-25 (MicroChem, Newton, CA), cồn diacetone (Sigma Aldrich, Steinheim, Đức) và polyacetone -184 (Dow Corning, Midland, Michigan). Các vi kênh được chế tạo bằng phương pháp in thạch bản mềm. Đầu tiên, một mặt nạ bảo vệ trong suốt với thiết kế vi kênh mong muốn được in trên máy in độ phân giải cao (Prismatic, Cairo, Ai Cập và Pacific Arts and Design, Markham, ON). Khuôn mẫu được tạo ra bằng cách sử dụng các tấm kính làm chất nền. Các tấm được làm sạch trong acetone, isopropanol và nước khử ion, sau đó được phủ một lớp SU8-25 dày 20 µm bằng phương pháp phủ quay ly tâm (3000 vòng/phút, 1 phút). Các lớp SU-8 sau đó được sấy khô nhẹ nhàng (65°C, 2 phút và 95°C, 10 phút) và chiếu tia UV trong 50 giây. Sau khi chiếu tia UV, nung ở 65°C và 95°C trong 1 phút và 4 phút để tạo liên kết chéo cho các lớp SU-8 đã tiếp xúc, tiếp theo là ngâm trong cồn diacetone trong 6,5 phút. Nướng bánh quế ở nhiệt độ cao (200°C trong 15 phút) để làm cứng thêm lớp SU-8.
Vật liệu PDMS được điều chế bằng cách trộn monome và chất làm cứng theo tỷ lệ khối lượng 10:1, sau đó khử khí trong bình hút ẩm chân không và đổ lên khung chính SU-8. PDMS được làm cứng trong lò nung (120°C, 30 phút), sau đó các kênh được cắt ra, tách khỏi khuôn mẫu và đục lỗ để gắn ống vào đầu vào và đầu ra của kênh dẫn vi mô. Cuối cùng, các kênh dẫn vi mô PDMS được gắn cố định vào lam kính hiển vi bằng máy xử lý corona cầm tay (Electro-Technic Products, Chicago, IL) như đã mô tả ở nơi khác. Kênh dẫn vi mô được sử dụng trong nghiên cứu này có kích thước 200 µm × 20 µm (chiều rộng × chiều cao) và dài 3,6 cm.
Luồng chất lỏng được tạo ra bởi áp suất thủy tĩnh bên trong kênh vi mô được thực hiện bằng cách duy trì mực chất lỏng trong bể chứa đầu vào cao hơn chênh lệch độ cao Δh39 trong bể chứa đầu ra (Hình 1).
trong đó f là hệ số ma sát, được định nghĩa là f = C/Re đối với dòng chảy tầng trong kênh hình chữ nhật, trong đó C là hằng số phụ thuộc vào tỷ lệ kích thước của kênh, L là chiều dài của kênh vi mô, Vav là vận tốc trung bình bên trong kênh vi mô, Dh là đường kính thủy lực của kênh, g là gia tốc trọng trường. Sử dụng phương trình này, vận tốc trung bình của kênh có thể được tính bằng phương trình sau: