Cảm ơn bạn đã ghé thăm Nature.com. Phiên bản trình duyệt bạn đang sử dụng có hỗ trợ CSS hạn chế. Để có trải nghiệm tốt nhất, chúng tôi khuyên bạn nên sử dụng trình duyệt đã cập nhật (hoặc tắt Chế độ tương thích trong Internet Explorer). Trong thời gian chờ đợi, để đảm bảo hỗ trợ liên tục, chúng tôi sẽ hiển thị trang web mà không có kiểu dáng và JavaScript.
Khả năng sinh sản của chim phụ thuộc vào khả năng lưu trữ đủ tinh trùng sống trong một thời gian dài trong ống chứa tinh trùng (SST). Cơ chế chính xác mà tinh trùng đi vào, cư trú trong và rời khỏi SST vẫn còn gây tranh cãi. Tinh trùng của gà mái sharkasi cho thấy xu hướng kết tụ cao, hình thành các bó sợi di động chứa nhiều tế bào. Do khó quan sát khả năng vận động và hành vi của tinh trùng trong ống dẫn trứng mờ đục, chúng tôi đã sử dụng một thiết bị vi lưu có mặt cắt ngang kênh vi mô tương tự như tinh trùng để nghiên cứu khả năng kết tụ và vận động của tinh trùng. Nghiên cứu này thảo luận về cách các bó tinh trùng hình thành, cách chúng di chuyển và vai trò có thể có của chúng trong việc kéo dài thời gian cư trú của tinh trùng trong SST. Chúng tôi đã nghiên cứu vận tốc tinh trùng và hành vi lưu biến khi dòng chất lỏng được tạo ra trong một kênh vi lưu bằng áp suất thủy tĩnh (tốc độ dòng chảy = 33 µm/giây). Tinh trùng có xu hướng bơi ngược dòng (lưu biến dương) và vận tốc của bó tinh trùng giảm đáng kể so với tinh trùng đơn lẻ. Các bó tinh trùng được quan sát thấy di chuyển theo hình xoắn ốc và tăng chiều dài và độ dày khi có nhiều tinh trùng đơn lẻ được tuyển dụng. Các bó tinh trùng được quan sát thấy đang tiếp cận và bám vào thành bên của các kênh vi lưu chất để tránh bị cuốn theo vận tốc dòng chảy của chất lỏng > 33 µm/giây. Các bó tinh trùng được quan sát thấy đang tiếp cận và bám vào thành bên của các kênh vi lưu chất để tránh bị cuốn theo vận tốc dòng chảy của chất lỏng > 33 µm/giây. Vì vậy, bạn có thể sử dụng các công cụ hỗ trợ và quản lý tài sản của mình để có được một khoản vay hợp lý каналов, чтобы избежать сметания со скоростью потока жидкости> 33 mкм / с. Các bó tinh trùng được quan sát thấy tiếp cận và bám vào thành bên của các kênh vi lưu chất để tránh bị cuốn trôi ở tốc độ dòng chảy chất lỏng >33 µm/giây.33 µm/s 扫过。33 µm/s Vì vậy, bạn có thể sử dụng một công cụ để có được một khoản vay hợp lý và một công cụ có thể giúp bạn có được một khoản tiền lớn канала, чтобы избежать сметания потоком жидкости со скоростью > 33 мкм/с. Các bó tinh trùng được quan sát thấy tiếp cận và bám vào thành bên của kênh vi lưu chất để tránh bị dòng chất lỏng chảy trôi ở tốc độ >33 µm/giây.Kính hiển vi điện tử quét và truyền qua cho thấy các bó tinh trùng được hỗ trợ bởi vật liệu dày đặc dồi dào. Dữ liệu thu được chứng minh khả năng di chuyển độc đáo của tinh trùng gà Sharkazi, cũng như khả năng kết tụ và tạo thành các bó di động của tinh trùng, góp phần hiểu rõ hơn về quá trình lưu trữ tinh trùng lâu dài trong SMT.
Để đạt được sự thụ tinh ở người và hầu hết các loài động vật, tinh trùng và trứng phải đến đúng thời điểm thụ tinh. Do đó, giao phối phải diễn ra trước hoặc tại thời điểm rụng trứng. Mặt khác, một số loài động vật có vú, chẳng hạn như chó, cũng như các loài không phải động vật có vú, chẳng hạn như côn trùng, cá, bò sát và chim, lưu trữ tinh trùng trong cơ quan sinh sản của chúng trong một thời gian dài cho đến khi trứng của chúng sẵn sàng để thụ tinh (thụ tinh không đồng bộ 1 ). Chim có thể duy trì khả năng sống của tinh trùng có khả năng thụ tinh cho trứng trong 2-10 tuần2.
Đây là một đặc điểm độc đáo giúp phân biệt chim với các loài động vật khác, vì nó cung cấp khả năng thụ tinh cao sau một lần thụ tinh trong nhiều tuần mà không cần giao phối và rụng trứng đồng thời. Cơ quan lưu trữ tinh trùng chính, được gọi là ống lưu trữ tinh trùng (SST), nằm ở các nếp niêm mạc bên trong tại ngã ba tử cung - âm đạo. Cho đến nay, các cơ chế mà tinh trùng đi vào, cư trú và thoát ra khỏi ngân hàng tinh trùng vẫn chưa được hiểu đầy đủ. Dựa trên các nghiên cứu trước đây, nhiều giả thuyết đã được đưa ra, nhưng không có giả thuyết nào trong số đó được xác nhận.
Forman4 đưa ra giả thuyết rằng tinh trùng duy trì nơi cư trú của chúng trong khoang SST thông qua chuyển động dao động liên tục ngược với hướng dòng chất lỏng chảy qua các kênh protein nằm trên các tế bào biểu mô SST (lưu biến học). ATP bị cạn kiệt do hoạt động roi liên tục cần thiết để giữ tinh trùng trong lòng SST và khả năng vận động cuối cùng giảm xuống cho đến khi tinh trùng được đưa ra khỏi ngân hàng tinh trùng theo dòng chất lỏng và bắt đầu một hành trình mới xuống ống dẫn trứng đi lên để thụ tinh cho tinh trùng. Trứng (Forman4). Mô hình lưu trữ tinh trùng này được hỗ trợ bởi việc phát hiện bằng phương pháp miễn dịch tế bào học các aquaporin 2, 3 và 9 có trong các tế bào biểu mô SST. Cho đến nay, các nghiên cứu về lưu biến học tinh dịch gà và vai trò của nó trong việc lưu trữ SST, lựa chọn tinh trùng âm đạo và cạnh tranh tinh trùng vẫn còn thiếu. Ở gà, tinh trùng đi vào âm đạo sau khi giao phối tự nhiên, nhưng hơn 80% tinh trùng được đẩy ra khỏi âm đạo ngay sau khi giao phối. Điều này cho thấy âm đạo là vị trí chính để lựa chọn tinh trùng ở chim. Ngoài ra, có báo cáo rằng ít hơn 1% tinh trùng được thụ tinh trong âm đạo sẽ đi vào SST2. Trong quá trình thụ tinh nhân tạo cho gà con trong âm đạo, số lượng tinh trùng đạt đến SST có xu hướng tăng lên 24 giờ sau khi thụ tinh. Cho đến nay, cơ chế lựa chọn tinh trùng trong quá trình này vẫn chưa rõ ràng và khả năng vận động của tinh trùng có thể đóng vai trò quan trọng trong quá trình hấp thụ tinh trùng SST. Do thành ống dẫn trứng dày và mờ đục nên rất khó theo dõi trực tiếp khả năng vận động của tinh trùng trong ống dẫn trứng của chim. Do đó, chúng ta thiếu kiến ​​thức cơ bản về cách tinh trùng chuyển sang SST sau khi thụ tinh.
Gần đây, lưu biến học đã được công nhận là một yếu tố quan trọng kiểm soát quá trình vận chuyển tinh trùng trong cơ quan sinh dục của động vật có vú. Dựa trên khả năng di chuyển ngược dòng của tinh trùng di động, Zaferani và cộng sự đã sử dụng hệ thống vi lưu chất Corra để cô lập thụ động tinh trùng di động từ các mẫu tinh dịch được nuôi nhốt. Kiểu phân loại tinh dịch này rất cần thiết cho việc điều trị vô sinh y khoa và nghiên cứu lâm sàng, và được ưa chuộng hơn các phương pháp truyền thống tốn nhiều thời gian và công sức, đồng thời có thể làm ảnh hưởng đến hình thái và tính toàn vẹn của cấu trúc tinh trùng. Tuy nhiên, cho đến nay, chưa có nghiên cứu nào được tiến hành về tác động của dịch tiết từ cơ quan sinh dục của gà đối với khả năng di chuyển của tinh trùng.
Bất kể cơ chế nào duy trì tinh trùng được lưu trữ trong SST, nhiều nhà nghiên cứu đã quan sát thấy rằng tinh trùng thường trú kết tụ đầu với đầu trong SST của gà 9, 10, chim cút 2 và gà tây 11 để tạo thành các bó tinh trùng kết tụ. Các tác giả cho rằng có mối liên hệ giữa sự kết tụ này và việc lưu trữ tinh trùng lâu dài trong SST.
Tingari và Lake12 đã báo cáo một mối liên hệ chặt chẽ giữa tinh trùng trong tuyến tiếp nhận tinh trùng của gà và đặt câu hỏi liệu tinh trùng của loài chim có kết tụ theo cùng cách như tinh trùng của động vật có vú hay không. Họ tin rằng các kết nối sâu sắc giữa tinh trùng trong ống dẫn tinh có thể là do căng thẳng gây ra bởi sự hiện diện của một số lượng lớn tinh trùng trong một không gian nhỏ.
Khi đánh giá hành vi của tinh trùng trên các phiến kính treo tươi, có thể thấy các dấu hiệu ngưng kết thoáng qua, đặc biệt là ở các cạnh của giọt tinh dịch. Tuy nhiên, sự ngưng kết thường bị nhiễu loạn bởi hành động quay liên quan đến chuyển động liên tục, điều này giải thích bản chất thoáng qua của hiện tượng này. Các nhà nghiên cứu cũng nhận thấy rằng khi chất pha loãng được thêm vào tinh dịch, các tập hợp tế bào "giống như sợi" kéo dài xuất hiện.
Những nỗ lực ban đầu để mô phỏng tinh trùng được thực hiện bằng cách tháo một sợi dây mỏng ra khỏi giọt tinh dịch treo, tạo ra một túi dài giống tinh trùng nhô ra từ giọt tinh dịch. Tinh trùng ngay lập tức xếp thành hàng song song bên trong túi, nhưng toàn bộ đơn vị này nhanh chóng biến mất do giới hạn 3D. Do đó, để nghiên cứu sự kết tụ của tinh trùng, cần phải quan sát khả năng vận động và hành vi của tinh trùng trực tiếp trong các ống chứa tinh trùng riêng biệt, điều này rất khó thực hiện. Do đó, cần phải phát triển một dụng cụ mô phỏng tinh trùng để hỗ trợ các nghiên cứu về khả năng vận động và hành vi kết tụ của tinh trùng. Brillard và cộng sự13 đã báo cáo rằng chiều dài trung bình của các ống chứa tinh trùng ở gà con trưởng thành là 400–600 µm, nhưng một số SST có thể dài tới 2000 µm. Mero và Ogasawara14 đã chia các tuyến sinh tinh thành các ống chứa tinh trùng to và không to, cả hai đều có cùng chiều dài (~500 µm) và chiều rộng cổ (~38 µm), nhưng đường kính lòng ống trung bình là 56,6 và 56,6 µm. . , tương ứng là 11,2 μm. Trong nghiên cứu hiện tại, chúng tôi đã sử dụng một thiết bị vi lưu có kích thước kênh là 200 µm × 20 µm (W × H), có mặt cắt ngang khá giống với SST khuếch đại. Ngoài ra, chúng tôi đã kiểm tra khả năng di chuyển và hành vi kết dính của tinh trùng trong chất lỏng đang chảy, điều này phù hợp với giả thuyết của Foreman rằng chất lỏng do các tế bào biểu mô SST tạo ra giữ tinh trùng trong lòng ống theo hướng ngược dòng (lưu biến).
Mục đích của nghiên cứu này là khắc phục các vấn đề trong việc quan sát khả năng di chuyển của tinh trùng trong ống dẫn trứng và tránh những khó khăn trong việc nghiên cứu lưu biến và hành vi của tinh trùng trong môi trường động. Một thiết bị vi lưu được sử dụng để tạo áp suất thủy tĩnh để mô phỏng khả năng di chuyển của tinh trùng trong bộ phận sinh dục của gà.
Khi một giọt mẫu tinh trùng pha loãng (1:40) được nạp vào thiết bị vi kênh, có thể xác định được hai loại chuyển động của tinh trùng (tinh trùng cô lập và tinh trùng bị ràng buộc). Ngoài ra, tinh trùng có xu hướng bơi ngược dòng (lưu biến dương; video 1, 2). Mặc dù các bó tinh trùng có vận tốc thấp hơn so với tinh trùng đơn lẻ (p < 0,001), nhưng chúng làm tăng tỷ lệ tinh trùng có độ võng dương tính (p < 0,001; Bảng 2). Mặc dù các bó tinh trùng có vận tốc thấp hơn so với tinh trùng đơn lẻ (p < 0,001), nhưng chúng làm tăng tỷ lệ tinh trùng có độ võng dương tính (p < 0,001; Bảng 2). Хотя пучки сперматозоидов имели более низкую скорость, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), они увеличивали процент сперматозоидов, демонстрирующих положительный реотаксис (p < 0,001; таблица 2). Mặc dù các bó tinh trùng có vận tốc thấp hơn so với tinh trùng đơn lẻ (p < 0,001), nhưng chúng làm tăng tỷ lệ tinh trùng có phản ứng di chuyển dương tính (p < 0,001; Bảng 2).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度（p < 0,001).尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 （p <0.001) , 但 增加 了 显示 阳性 流变性 精子百分比 （p <0,001 ； 2。。。。。。）)）)）) Хотя скорость пучков сперматозоидов была ниже, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), они увеличивали процент сперматозоидов с положительной реологией (p < 0,001; таблица 2). Mặc dù tốc độ của các bó tinh trùng thấp hơn tốc độ của các tinh trùng đơn lẻ (p < 0,001), nhưng chúng làm tăng tỷ lệ tinh trùng có lưu biến dương (p < 0,001; Bảng 2).Độ lưu biến dương tính đối với tinh trùng đơn lẻ và chùm tinh trùng ước tính lần lượt là khoảng 53% và 85%.
Người ta quan sát thấy tinh trùng của gà Sharkasi ngay sau khi xuất tinh tạo thành các bó tuyến tính, bao gồm hàng chục cá thể. Các chùm này tăng dần về chiều dài và độ dày theo thời gian và có thể tồn tại trong ống nghiệm trong vài giờ trước khi tiêu tan (video 3). Các bó sợi này có hình dạng giống như tinh trùng của thú lông nhím hình thành ở cuối mào tinh hoàn. Tinh dịch gà Sharkashi được phát hiện có xu hướng kết tụ cao và tạo thành bó lưới trong vòng chưa đầy một phút sau khi thu thập. Các chùm này rất năng động và có thể bám vào bất kỳ thành nào gần đó hoặc các vật thể tĩnh. Mặc dù các bó tinh trùng làm giảm tốc độ của các tế bào tinh trùng, nhưng rõ ràng là về mặt vĩ mô, chúng làm tăng tính tuyến tính của chúng. Chiều dài của các bó thay đổi tùy thuộc vào số lượng tinh trùng thu được trong các bó. Hai phần của bó đã được phân lập: phần đầu, bao gồm phần đầu tự do của tinh trùng đã kết tụ và phần cuối, bao gồm phần đuôi và toàn bộ đầu xa của tinh trùng. Sử dụng máy ảnh tốc độ cao (950 fps), các đầu tự do của tinh trùng kết tụ được quan sát thấy ở phần đầu của bó, chịu trách nhiệm cho chuyển động của bó do chuyển động dao động của chúng, kéo những đầu còn lại vào bó theo chuyển động xoắn ốc (Video 4). Tuy nhiên, ở các chùm dài, người ta quan sát thấy một số đầu tinh trùng tự do bám vào thân và phần cuối của chùm hoạt động như các cánh để giúp đẩy chùm.
Trong khi ở dòng chảy chậm của chất lỏng, các bó tinh trùng di chuyển song song với nhau, tuy nhiên, chúng bắt đầu chồng lên nhau và dính vào mọi thứ đứng yên, để không bị dòng chảy cuốn trôi khi tốc độ dòng chảy tăng lên. Các bó hình thành khi một số ít tế bào tinh trùng tiếp cận nhau, chúng bắt đầu di chuyển đồng bộ và quấn quanh nhau, sau đó dính vào một chất dính. Hình 1 và 2 cho thấy cách tinh trùng tiếp cận nhau, tạo thành một mối nối khi các đuôi quấn quanh nhau.
Các nhà nghiên cứu đã áp dụng áp suất thủy tĩnh để tạo ra dòng chảy chất lỏng trong một kênh nhỏ để nghiên cứu lưu biến tinh trùng. Một kênh nhỏ có kích thước 200 µm × 20 µm (W × H) và chiều dài 3,6 µm đã được sử dụng. Sử dụng các kênh nhỏ giữa các hộp đựng có gắn ống tiêm ở hai đầu. Màu thực phẩm được sử dụng để làm cho các kênh dễ nhìn thấy hơn.
Buộc các dây cáp kết nối và phụ kiện vào tường. Video được quay bằng kính hiển vi tương phản pha. Với mỗi hình ảnh, kính hiển vi tương phản pha và hình ảnh lập bản đồ được trình bày. (A) Kết nối giữa hai luồng cản trở dòng chảy do chuyển động xoắn ốc (mũi tên đỏ). (B) Kết nối giữa bó ống và thành kênh (mũi tên đỏ), đồng thời chúng được kết nối với hai bó khác (mũi tên vàng). (C) Các bó tinh trùng trong kênh vi lưu bắt đầu kết nối với nhau (mũi tên đỏ), tạo thành một lưới các bó tinh trùng. (D) Hình thành mạng lưới các bó tinh trùng.
Khi một giọt tinh trùng pha loãng được nạp vào thiết bị vi lưu và tạo ra dòng chảy, chùm tinh trùng được quan sát thấy di chuyển ngược với hướng dòng chảy. Các bó vừa khít với thành của các kênh vi mô, và các đầu tự do ở phần đầu của các bó vừa khít với chúng (video 5). Chúng cũng bám vào bất kỳ hạt tĩnh nào trên đường đi của chúng, chẳng hạn như mảnh vụn, để chống lại việc bị dòng nước cuốn trôi. Theo thời gian, các chùm này trở thành các sợi dài bẫy các tinh trùng đơn lẻ khác và các chùm ngắn hơn (Video 6). Khi dòng chảy bắt đầu chậm lại, các hàng tinh trùng dài bắt đầu hình thành một mạng lưới các hàng tinh trùng (Video 7; Hình 2).
Ở vận tốc dòng chảy cao (V > 33 µm/s), chuyển động xoắn ốc của các sợi được tăng lên như một nỗ lực để bắt nhiều tinh trùng riêng lẻ tạo thành bó có khả năng chống lại lực trôi của dòng chảy tốt hơn. Ở vận tốc dòng chảy cao (V > 33 µm/s), chuyển động xoắn ốc của các sợi được tăng lên như một nỗ lực để bắt nhiều tinh trùng riêng lẻ tạo thành bó có khả năng chống lại lực trôi của dòng chảy tốt hơn. При высокой скорости потока (V > 33 мкм/с) спиралевидные движения нитей усиливаются, поскольку они пытаются поймать множество отдельных сперматозоидов, образующих пучки, которые лучше противостоят дрейфующей силе потока. Ở lưu lượng cao (V > 33 µm/s), chuyển động xoắn ốc của các sợi tăng lên khi chúng cố gắng bắt nhiều tinh trùng riêng lẻ tạo thành các bó có khả năng chống lại lực trôi của dòng chảy tốt hơn.在高流速(V > 33 µm/s)时螺纹的螺旋运动增加,以试图捕捉许多形成束的单个精子,从而更好地抵抗流动的漂移力。在 高 流速 (v> 33 µm/s) 时 , 的 螺旋 运动 增加 , 以 试图 许多 形成 束 单 个 精子 , 从而 更地 抵抗 的 漂移力。。。。。。。。。。 При высоких скоростях потока (V > 33 мкм/с) спиральное движение нитей увеличивается в попытке захватить множество отдельных сперматозоидов, образующих пучки, чтобы лучше сопротивляться силам дрейфа потока. Ở lưu lượng cao (V > 33 µm/s), chuyển động xoắn ốc của các sợi tăng lên nhằm cố gắng bắt giữ nhiều tinh trùng riêng lẻ tạo thành bó để chống lại lực trôi của dòng chảy tốt hơn.Họ cũng đã thử gắn các kênh siêu nhỏ vào thành bên.
Các bó tinh trùng được xác định là các cụm đầu tinh trùng và đuôi cong bằng kính hiển vi quang học (LM). Các bó tinh trùng với nhiều tập hợp khác nhau cũng được xác định là đầu xoắn và tập hợp roi, nhiều đuôi tinh trùng hợp nhất, đầu tinh trùng gắn vào đuôi và đầu tinh trùng có nhân cong là nhiều nhân hợp nhất. kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM). kính hiển vi điện tử quét (SEM) cho thấy các bó tinh trùng là các tập hợp đầu tinh trùng có vỏ bọc và các tập hợp tinh trùng cho thấy một mạng lưới đuôi quấn chặt.
Hình thái và cấu trúc siêu nhỏ của tinh trùng, sự hình thành bó tinh trùng được nghiên cứu bằng kính hiển vi quang học (nửa mặt cắt), kính hiển vi điện tử quét (SEM) và kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM), mẫu tinh trùng được nhuộm bằng acridine cam và kiểm tra bằng kính hiển vi huỳnh quang.
Nhuộm phết tinh trùng bằng acridine orange (Hình 3B) cho thấy đầu tinh trùng dính chặt với nhau và được bao phủ bởi chất tiết, dẫn đến sự hình thành các chùm lớn (Hình 3D). Các bó tinh trùng bao gồm các tập hợp tinh trùng có mạng lưới đuôi gắn liền (Hình 4A-C). Các bó tinh trùng bao gồm các đuôi của nhiều tinh trùng dính chặt với nhau (Hình 4D). Các chất tiết (Hình 4E,F) bao phủ đầu của các bó tinh trùng.
Sự hình thành bó tinh trùng Sử dụng kính hiển vi tương phản pha và vết bẩn tinh trùng nhuộm màu cam acridine, cho thấy đầu của tinh trùng dính vào nhau. (A) Sự hình thành chùm tinh trùng sớm bắt đầu với một tinh trùng (vòng tròn màu trắng) và ba tinh trùng (vòng tròn màu vàng), với vòng xoắn bắt đầu từ đuôi và kết thúc ở đầu. (B) Ảnh chụp vi mô của vết bẩn tinh trùng nhuộm màu cam acridine cho thấy đầu tinh trùng dính chặt (mũi tên). Dịch tiết bao phủ đầu. Độ phóng đại × 1000. (C) Sự phát triển của một chùm tia lớn được vận chuyển bằng dòng chảy trong kênh vi lưu (sử dụng máy ảnh tốc độ cao ở tốc độ 950 fps). (D) Ảnh chụp vi mô của vết bẩn tinh trùng nhuộm màu cam acridine cho thấy các chùm lớn (mũi tên). Độ phóng đại: × 200.
Ảnh chụp bằng kính hiển vi điện tử quét của chùm tinh trùng và vết tinh trùng nhuộm màu cam acridine. (A, B, D, E) là ảnh chụp bằng kính hiển vi điện tử quét màu kỹ thuật số của tinh trùng, và C và F là ảnh chụp bằng kính hiển vi của vết tinh trùng nhuộm màu cam acridine cho thấy sự bám dính của nhiều tinh trùng bao quanh màng đuôi. (AC) Các tập hợp tinh trùng được hiển thị dưới dạng mạng lưới các đuôi dính (mũi tên). (D) Sự bám dính của một số tinh trùng (có chất kết dính, đường viền màu hồng, mũi tên) bao quanh đuôi. (E và F) Các tập hợp đầu tinh trùng (con trỏ) được phủ bằng vật liệu kết dính (con trỏ). Các tinh trùng tạo thành các bó với một số cấu trúc giống như xoáy (F). (C) Độ phóng đại ×400 và (F) ×200.
Sử dụng kính hiển vi điện tử truyền qua, chúng tôi thấy rằng các bó tinh trùng có đuôi gắn liền (Hình 6A, C), đầu gắn liền với đuôi (Hình 6B) hoặc đầu gắn liền với đuôi (Hình 6D). Đầu của tinh trùng trong bó cong, thể hiện ở mặt cắt hai vùng nhân (Hình 6D). Trong bó rạch, tinh trùng có đầu xoắn với hai vùng nhân và nhiều vùng roi (Hình 5A).
Ảnh chụp bằng kính hiển vi điện tử màu kỹ thuật số cho thấy các đuôi kết nối trong bó tinh trùng và vật liệu kết dính kết nối các đầu tinh trùng. (A) Đuôi gắn liền của một số lượng lớn tinh trùng. Lưu ý cách đuôi trông như thế nào trong cả phép chiếu dọc (mũi tên) và ngang (mũi tên). (B) Đầu (mũi tên) của tinh trùng được kết nối với đuôi (mũi tên). (C) Một số đuôi tinh trùng (mũi tên) được gắn vào. (D) Vật liệu kết dính (AS, màu xanh) kết nối bốn đầu tinh trùng (màu tím).
Kính hiển vi điện tử quét được sử dụng để phát hiện đầu tinh trùng trong các bó tinh trùng được bao phủ bởi chất tiết hoặc màng (Hình 6B), cho thấy các bó tinh trùng được neo giữ bằng vật liệu ngoại bào. Vật liệu kết dính tập trung ở đầu tinh trùng (bộ phận giống đầu sứa; Hình 5B) và mở rộng ra xa, tạo ra màu vàng rực rỡ dưới kính hiển vi huỳnh quang khi nhuộm bằng acridine orange (Hình 6C). Chất này có thể nhìn thấy rõ dưới kính hiển vi quét và được coi là chất kết dính. Các lát mỏng (Hình 5C) và vết bẩn tinh trùng nhuộm bằng acridine orange cho thấy các bó tinh trùng chứa đầu dày đặc và đuôi cong (Hình 5D).
Nhiều ảnh chụp hiển vi cho thấy sự kết tụ của đầu tinh trùng và đuôi gấp bằng nhiều phương pháp khác nhau. (A) Ảnh chụp hiển vi điện tử truyền màu kỹ thuật số cắt ngang của một bó tinh trùng cho thấy đầu tinh trùng cuộn tròn với nhân gồm hai phần (màu xanh lam) và một số phần roi (màu xanh lá cây). (B) Ảnh chụp hiển vi điện tử quét màu kỹ thuật số cho thấy một cụm đầu tinh trùng giống sứa (mũi tên) dường như bị che phủ. (C) Phần cắt mỏng cho thấy đầu tinh trùng kết tụ (mũi tên) và đuôi cong (mũi tên). (D) Ảnh chụp hiển vi của một vết bẩn tinh trùng nhuộm bằng acridine cam cho thấy sự kết tụ của đầu tinh trùng (mũi tên) và đuôi cong dính (mũi tên). Lưu ý rằng một chất dính (S) bao phủ đầu tinh trùng. (D) Độ phóng đại × 1000.
Khi sử dụng kính hiển vi điện tử truyền qua (Hình 7A), người ta cũng nhận thấy rằng đầu tinh trùng bị xoắn và nhân có hình xoắn ốc, điều này được xác nhận bằng xét nghiệm tinh trùng nhuộm màu cam acridine và kiểm tra bằng kính hiển vi huỳnh quang (Hình 7B).
(A) Ảnh chụp bằng kính hiển vi điện tử truyền màu kỹ thuật số và (B) Mẫu tinh trùng nhuộm màu cam Acridine cho thấy đầu xoắn và sự bám dính của đầu và đuôi tinh trùng (mũi tên). (B) Độ phóng đại × 1000.
Một phát hiện thú vị là tinh trùng của Sharkazi tập hợp lại để tạo thành các bó sợi di động. Các đặc tính của các bó này cho phép chúng ta hiểu được vai trò có thể có của chúng trong quá trình hấp thụ và lưu trữ tinh trùng trong SST.
Sau khi giao phối, tinh trùng đi vào âm đạo và trải qua quá trình chọn lọc nghiêm ngặt, dẫn đến chỉ có một số lượng hạn chế tinh trùng đi vào SST15,16. Cho đến nay, các cơ chế mà tinh trùng đi vào và thoát ra khỏi SST vẫn chưa rõ ràng. Ở gia cầm, tinh trùng được lưu trữ trong SST trong thời gian dài từ 2 đến 10 tuần, tùy thuộc vào loài6. Vẫn còn nhiều tranh cãi về tình trạng của tinh dịch trong quá trình lưu trữ trong SST. Chúng đang chuyển động hay đang nghỉ ngơi? Nói cách khác, làm thế nào các tế bào tinh trùng duy trì vị trí của chúng trong SST trong thời gian dài như vậy?
Forman4 cho rằng sự cư trú và phóng tinh trùng SST có thể được giải thích theo khả năng vận động của tinh trùng. Các tác giả đưa ra giả thuyết rằng tinh trùng duy trì vị trí của chúng bằng cách bơi ngược dòng chất lỏng do biểu mô SST tạo ra và tinh trùng bị đẩy ra khỏi SST khi vận tốc của chúng giảm xuống dưới điểm mà chúng bắt đầu di chuyển về phía sau do thiếu năng lượng. Zaniboni5 đã xác nhận sự hiện diện của aquaporin 2, 3 và 9 ở phần đỉnh của các tế bào biểu mô SST, điều này có thể gián tiếp hỗ trợ mô hình lưu trữ tinh trùng của Foreman. Trong nghiên cứu hiện tại, chúng tôi phát hiện ra rằng gần một nửa số tinh trùng của Sharkashi cho thấy lưu biến dương trong chất lỏng đang chảy và các bó tinh trùng kết tụ làm tăng số lượng tinh trùng cho thấy lưu biến dương, mặc dù sự kết tụ làm chậm chúng lại. Cách các tế bào tinh trùng di chuyển lên ống dẫn trứng của chim đến vị trí thụ tinh vẫn chưa được hiểu đầy đủ. Ở động vật có vú, chất lỏng nang trứng thu hút tinh trùng theo cơ chế hóa học. Tuy nhiên, các chất hấp dẫn hóa học được cho là hướng tinh trùng đến gần những khoảng cách xa7. Do đó, các cơ chế khác chịu trách nhiệm cho quá trình vận chuyển tinh trùng. Khả năng định hướng và chảy ngược lại của tinh trùng đối với dịch ống dẫn trứng được giải phóng sau khi giao phối đã được báo cáo là một yếu tố chính trong việc nhắm mục tiêu vào tinh trùng ở chuột. Parker 17 cho rằng tinh trùng đi qua ống dẫn trứng bằng cách bơi ngược dòng lông mao ở chim và bò sát. Mặc dù chưa được chứng minh bằng thực nghiệm ở chim, Adolphi18 là người đầu tiên phát hiện ra rằng tinh trùng ở chim cho kết quả dương tính khi tạo một lớp chất lỏng mỏng giữa tấm kính và phiến kính bằng một dải giấy lọc. Lưu biến học. Hino và Yanagimachi [19] đã đặt một phức hợp buồng trứng-ống dẫn trứng-tử cung ở chuột vào một vòng tưới máu và tiêm 1 µl mực vào eo để hình dung dòng chảy của chất lỏng trong ống dẫn trứng. Họ nhận thấy một chuyển động co bóp và giãn nở rất tích cực trong ống dẫn trứng, trong đó tất cả các viên mực đều di chuyển đều về phía bóng của ống dẫn trứng. Các tác giả nhấn mạnh tầm quan trọng của dòng chảy dịch vòi trứng từ ống dẫn trứng dưới lên ống dẫn trứng trên để nâng tinh trùng lên và thụ tinh. Brillard20 đã báo cáo rằng ở gà và gà tây, tinh trùng di chuyển bằng chuyển động chủ động từ cửa âm đạo, nơi chúng được lưu trữ, đến chỗ nối tử cung-âm đạo, nơi chúng được lưu trữ. Tuy nhiên, chuyển động này không bắt buộc giữa chỗ nối tử cung-âm đạo và phễu vì tinh trùng được vận chuyển bằng cách dịch chuyển thụ động. Biết được những khuyến nghị trước đây và kết quả thu được trong nghiên cứu hiện tại, có thể cho rằng khả năng di chuyển ngược dòng (lưu biến) của tinh trùng là một trong những đặc tính mà quá trình chọn lọc dựa trên. Điều này quyết định quá trình tinh trùng đi qua âm đạo và đi vào CCT để lưu trữ. Như Forman4 đã đề xuất, điều này cũng có thể tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình tinh trùng đi vào SST và môi trường sống của nó trong một khoảng thời gian và sau đó thoát ra khi tốc độ của chúng bắt đầu chậm lại.
Mặt khác, Matsuzaki và Sasanami 21 cho rằng tinh trùng chim trải qua những thay đổi về khả năng vận động từ trạng thái ngủ đông sang khả năng vận động trong đường sinh sản của con đực và con cái. Việc ức chế khả năng vận động của tinh trùng trú ngụ trong SST đã được đề xuất để giải thích thời gian lưu trữ tinh trùng lâu và sau đó trẻ hóa sau khi rời khỏi SST. Trong điều kiện thiếu oxy, Matsuzaki và cộng sự 1 đã báo cáo sản xuất và giải phóng lactate cao trong SST, điều này có thể dẫn đến ức chế khả năng vận động của tinh trùng trú ngụ. Trong trường hợp này, tầm quan trọng của lưu biến tinh trùng được phản ánh trong quá trình lựa chọn và hấp thụ tinh trùng, chứ không phải trong quá trình lưu trữ của chúng.
Mẫu tinh trùng kết tụ được coi là lời giải thích hợp lý cho thời gian lưu trữ tinh trùng lâu dài trong SST, vì đây là mẫu tinh trùng lưu giữ phổ biến ở gia cầm2,22,23. Bakst và cộng sự 2 quan sát thấy rằng hầu hết tinh trùng bám vào nhau, tạo thành các tập hợp bó, và tinh trùng đơn lẻ hiếm khi được tìm thấy trong CCM chim cút. Mặt khác, Wen và cộng sự 24 quan sát thấy nhiều tinh trùng phân tán hơn và ít cụm tinh trùng hơn trong khoang SST ở gà. Dựa trên những quan sát này, có thể cho rằng xu hướng kết tụ tinh trùng khác nhau giữa các loài chim và giữa các tinh trùng trong cùng một lần xuất tinh. Ngoài ra, Van Krey và cộng sự 9 cho rằng sự phân ly ngẫu nhiên của tinh trùng đã kết tụ chịu trách nhiệm cho sự thâm nhập dần dần của tinh trùng vào khoang ống dẫn trứng. Theo giả thuyết này, tinh trùng có khả năng kết tụ thấp hơn sẽ bị trục xuất khỏi SST trước. Trong bối cảnh này, khả năng kết tụ của tinh trùng có thể là một yếu tố ảnh hưởng đến kết quả cạnh tranh tinh trùng ở những con chim bẩn. Ngoài ra, tinh trùng kết tụ càng lâu thì khả năng sinh sản càng được duy trì lâu hơn.
Mặc dù quá trình kết tụ và tập hợp tinh trùng thành các bó đã được quan sát thấy trong một số nghiên cứu2,22,24, nhưng chúng vẫn chưa được mô tả chi tiết do tính phức tạp của quá trình quan sát động học của chúng trong SST. Một số nỗ lực đã được thực hiện để nghiên cứu quá trình kết tụ tinh trùng trong ống nghiệm. Quá trình kết tụ rộng rãi nhưng tạm thời đã được quan sát thấy khi tháo sợi dây mỏng ra khỏi giọt hạt đang treo lơ lửng. Điều này dẫn đến thực tế là một bong bóng dài nhô ra khỏi giọt, bắt chước tuyến tinh hoàn. Do hạn chế 3D và thời gian sấy nhỏ giọt ngắn, toàn bộ khối nhanh chóng bị hư hỏng9. Trong nghiên cứu hiện tại, bằng cách sử dụng gà Sharkashi và chip vi lưu, chúng tôi đã có thể mô tả cách các chùm tinh trùng này hình thành và cách chúng di chuyển. Các bó tinh trùng hình thành ngay sau khi thu thập tinh dịch và được phát hiện di chuyển theo hình xoắn ốc, cho thấy lưu biến dương khi có trong dòng chảy. Hơn nữa, khi quan sát dưới góc độ vĩ mô, các bó tinh trùng đã được quan sát thấy làm tăng tính tuyến tính của khả năng di chuyển so với tinh trùng riêng lẻ. Điều này cho thấy rằng sự kết tụ tinh trùng có thể xảy ra trước khi thâm nhập SST và rằng quá trình sản xuất tinh trùng không bị giới hạn ở một khu vực nhỏ do căng thẳng như đã đề xuất trước đây (Tingari và Lake12). Trong quá trình hình thành chùm, tinh trùng bơi đồng bộ cho đến khi chúng tạo thành một mối nối, sau đó đuôi của chúng quấn vào nhau và đầu của tinh trùng vẫn tự do, nhưng đuôi và phần xa của tinh trùng dính vào nhau bằng một chất dính. Do đó, đầu tự do của dây chằng chịu trách nhiệm cho chuyển động, kéo phần còn lại của dây chằng. Kính hiển vi điện tử quét các bó tinh trùng cho thấy các đầu tinh trùng đã bám được bao phủ bởi nhiều vật liệu dính, cho thấy rằng các đầu tinh trùng đã bám vào các bó nghỉ, điều này có thể xảy ra sau khi đến vị trí lưu trữ (SST).
Khi nhuộm mẫu tinh trùng bằng acridine orange, vật liệu kết dính ngoại bào xung quanh các tế bào tinh trùng có thể được nhìn thấy dưới kính hiển vi huỳnh quang. Chất này cho phép các bó tinh trùng bám vào và bám chặt vào bất kỳ bề mặt hoặc hạt xung quanh nào để chúng không trôi theo dòng chảy xung quanh. Do đó, quan sát của chúng tôi cho thấy vai trò của sự kết dính tinh trùng dưới dạng các bó di động. Khả năng bơi ngược dòng và bám vào các bề mặt gần đó cho phép tinh trùng ở lại lâu hơn trong SST.
Rothschild25 đã sử dụng một máy ảnh đo tế bào máu để nghiên cứu sự phân bố nổi của tinh dịch bò trong một giọt huyền phù, chụp ảnh vi mô qua một máy ảnh có cả trục quang học dọc và ngang của kính hiển vi. Kết quả cho thấy tinh trùng bị thu hút vào bề mặt của buồng. Các tác giả cho rằng có thể có sự tương tác thủy động giữa tinh trùng và bề mặt. Có tính đến điều này, cùng với khả năng hình thành các búi dính của tinh dịch gà Sharkashi, có thể làm tăng khả năng tinh dịch sẽ bám vào thành SST và được lưu trữ trong thời gian dài.
Bccetti và Afzeliu26 báo cáo rằng glycocalyx của tinh trùng là cần thiết cho sự nhận biết và kết dính giao tử. Forman10 quan sát thấy rằng thủy phân các liên kết α-glycosidic trong lớp phủ glycoprotein-glycolipid bằng cách xử lý tinh dịch gia cầm bằng neuraminidase dẫn đến giảm khả năng sinh sản mà không ảnh hưởng đến khả năng di chuyển của tinh trùng. Các tác giả cho rằng tác động của neuraminidase lên glycocalyx làm suy yếu khả năng cô lập tinh trùng tại điểm nối tử cung-âm đạo, do đó làm giảm khả năng sinh sản. Quan sát của họ không thể bỏ qua khả năng điều trị bằng neuraminidase có thể làm giảm khả năng nhận biết tinh trùng và trứng. Forman và Engel10 phát hiện ra rằng khả năng sinh sản bị giảm khi gà mái được thụ tinh trong âm đạo bằng tinh dịch được xử lý bằng neuraminidase. Tuy nhiên, IVF với tinh trùng được xử lý bằng neuraminidase không ảnh hưởng đến khả năng sinh sản so với gà đối chứng. Các tác giả kết luận rằng những thay đổi trong lớp phủ glycoprotein-glycolipid xung quanh màng tinh trùng làm giảm khả năng thụ tinh của tinh trùng bằng cách làm suy yếu khả năng cô lập tinh trùng tại điểm nối tử cung-âm đạo, từ đó làm tăng tình trạng mất tinh trùng do tốc độ của điểm nối tử cung-âm đạo, nhưng không ảnh hưởng đến khả năng nhận biết tinh trùng và trứng.
Ở gà tây, Bakst và Bauchan 11 đã tìm thấy các túi nhỏ và các mảnh màng trong lòng SST và quan sát thấy một số hạt này đã hợp nhất với màng tinh trùng. Các tác giả cho rằng những mối quan hệ này có thể góp phần vào việc lưu trữ tinh trùng lâu dài trong SST. Tuy nhiên, các nhà nghiên cứu không chỉ rõ nguồn gốc của các hạt này, liệu chúng được tiết ra bởi các tế bào biểu mô CCT, được sản xuất và tiết ra bởi hệ thống sinh sản của con đực hay do chính tinh trùng sản xuất. Ngoài ra, các hạt này chịu trách nhiệm cho sự kết tụ. Grützner và cộng sự27 đã báo cáo rằng các tế bào biểu mô mào tinh sản xuất và tiết ra một loại protein cụ thể cần thiết cho sự hình thành các đường dẫn tinh một lỗ. Các tác giả cũng báo cáo rằng sự phân tán của các bó này phụ thuộc vào sự tương tác của các protein mào tinh. Nixon và cộng sự28 phát hiện ra rằng phần phụ tiết ra một loại protein, osteonectin giàu cysteine ​​có tính axit; SPARC có liên quan đến sự hình thành các chùm tinh trùng ở thú lông nhím mỏ ngắn và thú mỏ vịt. Sự phân tán của các chùm tia này có liên quan đến sự mất mát của loại protein này.
Trong nghiên cứu hiện tại, phân tích siêu cấu trúc sử dụng kính hiển vi điện tử cho thấy tinh trùng bám vào một lượng lớn vật liệu đặc. Những chất này được cho là chịu trách nhiệm cho sự kết dính ngưng tụ giữa và xung quanh các đầu bám dính, nhưng ở nồng độ thấp hơn ở vùng đuôi. Chúng tôi cho rằng chất kết dính này được bài tiết từ hệ thống sinh sản của nam giới (mào tinh hoàn hoặc ống dẫn tinh) cùng với tinh dịch, vì chúng tôi thường quan sát thấy tinh dịch tách khỏi bạch huyết và huyết tương trong quá trình xuất tinh. Người ta đã báo cáo rằng khi tinh trùng chim đi qua mào tinh hoàn và ống dẫn tinh, chúng trải qua những thay đổi liên quan đến quá trình trưởng thành hỗ trợ khả năng liên kết với protein và thu được glycoprotein liên kết với màng huyết tương. Sự tồn tại của các protein này trên màng tinh trùng thường trú trong SST cho thấy rằng các protein này có thể ảnh hưởng đến việc thu được độ ổn định của màng tinh trùng 30 và xác định khả năng sinh sản của chúng 31 . Ahammad et al32 đã báo cáo rằng tinh trùng lấy từ nhiều bộ phận khác nhau của hệ thống sinh sản nam (từ tinh hoàn đến ống dẫn tinh xa) cho thấy khả năng sống tăng dần trong điều kiện bảo quản lỏng, bất kể nhiệt độ bảo quản, và khả năng sống ở gà cũng tăng lên trong ống dẫn trứng sau khi thụ tinh nhân tạo.
Chùm tinh trùng gà Sharkashi có đặc điểm và chức năng khác với các loài khác như thú lông nhím, thú mỏ vịt, chuột gỗ, chuột hươu và chuột lang. Ở gà Sharkashi, sự hình thành các bó tinh trùng làm giảm tốc độ bơi của chúng so với tinh trùng đơn lẻ. Tuy nhiên, các bó này làm tăng tỷ lệ tinh trùng có tính lưu biến dương tính và tăng khả năng tự ổn định của tinh trùng trong môi trường động. Do đó, kết quả của chúng tôi xác nhận đề xuất trước đó rằng sự kết tụ tinh trùng trong SST có liên quan đến việc lưu trữ tinh trùng lâu dài. Chúng tôi cũng đưa ra giả thuyết rằng xu hướng hình thành chùm tinh trùng có thể kiểm soát tốc độ mất tinh trùng trong SST, điều này có thể làm thay đổi kết quả của quá trình cạnh tranh tinh trùng. Theo giả định này, tinh trùng có khả năng kết tụ thấp sẽ giải phóng SST trước, trong khi tinh trùng có khả năng kết tụ cao sẽ sinh ra hầu hết con cái. Sự hình thành các bó tinh trùng một lỗ có lợi và ảnh hưởng đến tỷ lệ cha mẹ-con cái, nhưng sử dụng một cơ chế khác. Ở thú lông nhím và thú mỏ vịt, tinh trùng được sắp xếp song song với nhau để tăng tốc độ về phía trước của chùm tia. Các bó thú lông nhím di chuyển nhanh hơn khoảng ba lần so với tinh trùng đơn lẻ. Người ta tin rằng sự hình thành các chùm tinh trùng như vậy ở thú lông nhím là một sự thích nghi tiến hóa để duy trì sự thống trị, vì con cái là loài lăng nhăng và thường giao phối với nhiều con đực. Do đó, tinh trùng từ các lần xuất tinh khác nhau cạnh tranh dữ dội để thụ tinh cho trứng.
Tinh trùng kết tụ của gà sharkasi dễ hình dung bằng kính hiển vi tương phản pha, được coi là có lợi vì nó cho phép dễ dàng nghiên cứu hành vi của tinh trùng trong ống nghiệm. Cơ chế hình thành chùm tinh trùng thúc đẩy sinh sản ở gà sharkasi cũng khác với cơ chế thấy ở một số động vật có vú có nhau thai đại diện cho hành vi hợp tác của tinh trùng như chuột gỗ, trong đó một số tinh trùng tiếp cận trứng, giúp những cá thể có quan hệ họ hàng khác tiếp cận và làm hỏng trứng của chúng. để chứng minh bản thân. hành vi vị tha. Tự thụ tinh 34. Một ví dụ khác về hành vi hợp tác ở tinh trùng được tìm thấy ở chuột hươu, trong đó tinh trùng có thể xác định và kết hợp với tinh trùng có quan hệ di truyền gần nhất và tạo thành nhóm hợp tác để tăng tốc độ của chúng so với tinh trùng không liên quan35.
Kết quả thu được trong nghiên cứu này không mâu thuẫn với lý thuyết của Foman về việc lưu trữ tinh trùng lâu dài trong SWS. Các nhà nghiên cứu báo cáo rằng các tế bào tinh trùng tiếp tục di chuyển trong dòng tế bào biểu mô lót SST trong một thời gian dài và sau một thời gian nhất định, năng lượng dự trữ của các tế bào tinh trùng bị cạn kiệt, dẫn đến tốc độ giảm, cho phép đẩy các chất có trọng lượng phân tử nhỏ ra ngoài. năng lượng của tinh trùng với dòng chất lỏng chảy ra khỏi lòng SST Khoang của ống dẫn trứng. Trong nghiên cứu hiện tại, chúng tôi quan sát thấy rằng một nửa số tinh trùng đơn lẻ cho thấy khả năng bơi ngược dòng chất lỏng và sự kết dính của chúng trong bó làm tăng khả năng thể hiện lưu biến dương tính của chúng. Hơn nữa, dữ liệu của chúng tôi phù hợp với dữ liệu của Matsuzaki et al. 1, những người đã báo cáo rằng tiết lactat tăng lên trong SST có thể ức chế khả năng vận động của tinh trùng tại chỗ. Tuy nhiên, kết quả của chúng tôi mô tả sự hình thành các dây chằng vận động của tinh trùng và hành vi lưu biến của chúng khi có môi trường động bên trong một kênh siêu nhỏ nhằm mục đích làm sáng tỏ hành vi của chúng trong SST. Nghiên cứu trong tương lai có thể tập trung vào việc xác định thành phần hóa học và nguồn gốc của chất kết dính, điều này chắc chắn sẽ giúp các nhà nghiên cứu phát triển những phương pháp mới để lưu trữ tinh dịch lỏng và tăng thời gian sinh sản.
Mười lăm con gà sharkasi đực cổ trần 30 tuần tuổi (trội đồng hợp tử; Na Na) được chọn làm vật hiến tinh trong nghiên cứu. Những con chim được nuôi tại Trại gia cầm nghiên cứu của Khoa Nông nghiệp, Đại học Ashit, Tỉnh Ashit, Ai Cập. Những con chim được nuôi trong các lồng riêng lẻ (30 x 40 x 40 cm), được áp dụng chương trình chiếu sáng (16 giờ sáng và 8 giờ tối) và được cho ăn chế độ ăn có chứa 160 g protein thô, 2800 kcal năng lượng chuyển hóa, 35 g canxi mỗi loại. 5 gam phốt pho khả dụng trên một kilôgam thức ăn.
Theo số liệu 36, 37, tinh dịch được thu thập từ những con đực bằng cách xoa bóp bụng. Tổng cộng có 45 mẫu tinh dịch được thu thập từ 15 con đực trong 3 ngày. Tinh dịch (n = 15/ngày) được pha loãng ngay lập tức theo tỷ lệ 1:1 (v:v) với Belsville Poultry Semen Diluent, có chứa kali diphosphate (1,27 g), monosodium glutamate monohydrate (0,867 g), fructose (0,5 d) anhydrous natri. acetate (0,43 g), tris(hydroxymethyl)aminomethane (0,195 g), kali citrate monohydrate (0,064 g), kali monophosphate (0,065 g), magiê clorua (0,034 g) và H2O (100 ml), pH = 7, 5, độ thẩm thấu 333 mOsm/kg38. Các mẫu tinh dịch pha loãng đầu tiên được kiểm tra dưới kính hiển vi quang học để đảm bảo chất lượng tinh dịch tốt (độ ẩm), sau đó được bảo quản trong bồn nước ở nhiệt độ 37°C cho đến khi sử dụng trong vòng nửa giờ sau khi lấy mẫu.
Động học và lưu biến của tinh trùng được mô tả bằng hệ thống thiết bị vi lưu. Các mẫu tinh dịch được pha loãng thêm đến 1:40 trong Beltsville Avian Semen Diluent, được nạp vào thiết bị vi lưu (xem bên dưới) và các thông số động học được xác định bằng hệ thống Phân tích tinh dịch bằng máy tính (CASA) trước đây được phát triển để mô tả đặc điểm vi lưu. về khả năng di chuyển của tinh trùng trong môi trường lỏng (Khoa Kỹ thuật cơ khí, Khoa Kỹ thuật, Đại học Assiut, Ai Cập). Có thể tải xuống plugin tại: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39. Vận tốc đường cong (VCL, μm/s), vận tốc tuyến tính (VSL, μm/s) và vận tốc quỹ đạo trung bình (VAP, μm/s) đã được đo. Video về tinh trùng được quay bằng kính hiển vi tương phản pha Optika XDS-3 đảo ngược (với vật kính 40x) được kết nối với camera Tucson ISH1000 ở tốc độ 30 khung hình/giây trong 3 giây. Sử dụng phần mềm CASA để nghiên cứu ít nhất ba vùng và 500 quỹ đạo tinh trùng trên mỗi mẫu. Video đã ghi được xử lý bằng CASA tự chế. Định nghĩa về khả năng di chuyển trong plug-in CASA dựa trên tốc độ bơi của tinh trùng so với tốc độ dòng chảy và không bao gồm các thông số khác như chuyển động sang hai bên, vì điều này được cho là đáng tin cậy hơn trong dòng chảy chất lỏng. Chuyển động lưu biến được mô tả là chuyển động của các tế bào tinh trùng ngược với hướng dòng chảy chất lỏng. Tinh trùng có đặc tính lưu biến được chia cho số lượng tinh trùng di chuyển; tinh trùng ở trạng thái nghỉ và tinh trùng chuyển động đối lưu bị loại khỏi số lượng.
Tất cả các hóa chất được sử dụng đều được lấy từ Elgomhoria Pharmaceuticals (Cairo, Ai Cập) trừ khi có ghi chú khác. Thiết bị được sản xuất theo mô tả của El-sherry et al. 40 với một số sửa đổi. Các vật liệu được sử dụng để chế tạo các kênh vi mô bao gồm các tấm kính (Howard Glass, Worcester, MA), chất cản âm SU-8-25 (MicroChem, Newton, CA), cồn diacetone (Sigma Aldrich, Steinheim, Đức) và polyacetone. -184, Dow Corning, Midland, Michigan). Các kênh vi mô được chế tạo bằng phương pháp quang khắc mềm. Đầu tiên, một chiếc khẩu trang bảo vệ trong suốt có thiết kế kênh vi mô mong muốn được in trên máy in có độ phân giải cao (Prismatic, Cairo, Ai Cập và Pacific Arts and Design, Markham, ON). Các bản gốc được tạo ra bằng cách sử dụng các tấm kính làm chất nền. Các tấm được làm sạch bằng acetone, isopropanol và nước khử ion, sau đó được phủ một lớp 20 µm SU8-25 bằng phương pháp tráng quay (3000 vòng/phút, 1 phút). Các lớp SU-8 sau đó được sấy khô nhẹ (65°C, 2 phút và 95°C, 10 phút) và tiếp xúc với bức xạ UV trong 50 giây. Nướng sau khi tiếp xúc ở 65°C và 95°C trong 1 phút và 4 phút để liên kết chéo các lớp SU-8 đã tiếp xúc, sau đó phát triển trong cồn diacetone trong 6,5 phút. Nướng cứng bánh quế (200°C trong 15 phút) để làm đông cứng thêm lớp SU-8.
PDMS được chuẩn bị bằng cách trộn monome và chất làm cứng theo tỷ lệ khối lượng 10:1, sau đó khử khí trong bình hút ẩm chân không và đổ vào khung chính SU-8. PDMS được xử lý trong lò (120°C, 30 phút), sau đó các kênh được cắt ra, tách khỏi kênh chính và đục lỗ để có thể gắn các ống ở đầu vào và đầu ra của kênh vi mô. Cuối cùng, các kênh vi mô PDMS được gắn cố định vào các phiến kính hiển vi bằng bộ xử lý corona di động (Electro-Technic Products, Chicago, IL) như đã mô tả ở nơi khác. Kênh vi mô được sử dụng trong nghiên cứu này có kích thước 200 µm × 20 µm (W × H) và dài 3,6 cm.
Dòng chảy chất lỏng tạo ra bởi áp suất thủy tĩnh bên trong kênh vi mô đạt được bằng cách duy trì mức chất lỏng trong bể chứa đầu vào cao hơn chênh lệch độ cao Δh39 trong bể chứa đầu ra (Hình 1).
trong đó f là hệ số ma sát, được định nghĩa là f = C/Re đối với dòng chảy tầng trong kênh hình chữ nhật, trong đó C là hằng số phụ thuộc vào tỷ lệ khía cạnh của kênh, L là chiều dài của kênh vi mô, Vav là vận tốc trung bình bên trong kênh vi mô, Dh là đường kính thủy lực của kênh, g – gia tốc trọng trường. Sử dụng phương trình này, vận tốc trung bình của kênh có thể được tính bằng phương trình sau: